本发明属于果汁加工技术领域，具体涉及一种根皮素联合超声对果汁进行杀菌的方法。
背景技术：
为了解决致病菌污染食品的问题，杀菌成为了食品生产过程中不可缺少的环节。目前，食品行业主要是以热杀菌为主。巴氏杀菌是热加工主要方式之一，通常用于食品工业实现微生物灭活以确保食品质量安全，延长食品保质期。然而，热处理导致了食品感官品质劣变和热敏性营养物质的破坏。研究发现热处理导致食品颜色褐变，抗坏血酸减少40％，总酚含量下降48％。如今，消费者对方便、安全的食品需求越来越大，更注重感官质量和营养价值。寻找非热杀菌技术以减少营养损失和食品感官品质恶化，从而进行商业应用十分重要。
超声波频率大于20khz，通过传声介质的作用产生巨大能量，从而破坏微生物。超声波杀菌的作用机理主要与空化效应有关，产生巨大能量，从而导致微生物死亡和酶的失活。超声波杀菌是一种新兴的非热杀菌技术，能够降低食品中微生物的数量，并且最大限度的减少因热导致的食品感官营养品质的劣变。超声技术是一种高效、绿色的食品加工技术，美国食品和药物管理局(fda)表明超声波作为新兴技术在未来有希望能够代替传统热杀菌，未来在食品工业中必定有极大的发展应用前景。
根皮素是一种具有二氢查耳酮结构的天然产物，生物活性较高，具有抗氧化、抗肿瘤、消炎、抗菌、调控脂肪等功能。根皮素对革兰氏阳性细菌有强大的抗菌活性，性质稳定，选择性压力小，对人体健康无害。研究发现对小鼠进行根皮素急性毒性试验和半数致死量(ld50)测定，结果表明根皮素ld50高于5.7g/kgbw。因此，根皮素是实际无毒的，国外已经将根皮素作为营养补充剂批准在食品中使用，美国食用香料制造者协会(fema)也认为根皮素为安全的食品香料(gras)。目前，中国也允许使用根皮素作为食品天然香料(gb2760-2014)。由此可以看出，根皮素是安全性较高的天然产物，对根皮素大规模在食品领域应用具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种果汁的非热杀菌技术，将超声杀菌与根皮素相结合，以解决非热杀菌技术杀菌效果不明显的问题以及热杀菌技术造成果汁感官营养品质劣变的问题。
针对上述目的，本发明采用的技术方案为：在果汁中加入根皮素，控制果汁中根皮素浓度为100～500μg/ml，常温静置处理0～50分钟；然后再对果汁进行超声处理，超声功率为300～1000w，超声时间为5～20分钟，超声时温度维持在30℃±2℃，得到灭菌的果汁。
上述方法中，优选控制果汁中根皮素浓度为300～400μg/ml。
上述方法中，优选常温静置处理30～35分钟。
上述方法中，优选超声功率为700～900w，超声时间为10～12分钟。
本发明的有益效果如下：
1、本发明是将根皮素作为杀菌增效剂，与超声杀菌进行结合，通过二者协同作用，实现增效杀菌效果，达到商业杀菌的目的，从而保障在工业生产中运用。
2、本发明利用超声与根皮素结合，作为非热杀菌技术在鲜榨果汁中进行杀菌应用，能够在保证较高杀菌效果的前提下，最大程度的减少因热造成的果汁感官品质及热敏性营养物质的破坏。因此，本发明在饮料和乳制品工业中具有广阔的应用前景，超声根皮素联合杀菌技术的应用将进一步促进鲜榨果汁产业的发展。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
在鲜榨苹果汁中加入根皮素，控制苹果汁中根皮素浓度为300μg/ml，常温静置处理30分钟；然后再对果汁进行超声处理，超声发生频率20khz，超声功率为700w，超声时间为10分钟，超声时温度维持在30℃±2℃，得到灭菌的苹果汁。
将本实施例中根皮素联合超声处理的苹果汁储存4周，第0天抗坏血酸含量为5.02mg/100ml，经过常温放置4周后抗坏血酸含量降低至4.27mg/100ml，降低了15％左右。而经过热处理(75℃杀菌10min)的苹果汁抗坏血酸含量降低了40％左右。经过根皮素联合超声处理后，苹果汁的总抗氧化能力(以抗坏血酸含量计)较热处理提高了50％左右，放置4周后，根皮素联合超声处理的苹果汁总抗氧化活性降低了10％左右，与热处理差异显著。
实施例2
在鲜榨苹果汁中加入根皮素，控制苹果汁中根皮素浓度为100μg/ml，常温静置处理50分钟；然后再对果汁进行超声处理，超声发生频率20khz，超声功率为300w，超声时间为20分钟，超声时温度维持在30℃±2℃，得到灭菌的苹果汁。
实施例3
在鲜榨苹果汁中加入根皮素，控制苹果汁中根皮素浓度为400μg/ml，常温静置处理35分钟；然后再对果汁进行超声处理，超声发生频率20khz，超声功率为900w，超声时间为12分钟，超声时温度维持在30℃±2℃，得到灭菌的苹果汁。
实施例4
在鲜榨苹果汁中加入根皮素，控制苹果汁中根皮素浓度为500μg/ml，然后再对果汁进行超声处理，超声发生频率20khz，超声功率为1000w，超声时间为5分钟，超声时温度维持在30℃±2℃，得到灭菌的苹果汁。
为了确定本发明的杀菌方法，发明人进行了大量的实验室研究实验，具体试验如下：
1、实验菌种及材料
金黄色葡萄球菌staphylococcusaureuscicc21601和大肠杆菌escherichiacolicgmcc1.2463购于中国医学细菌保藏管理中心；营养肉汤培养基(nutritionbroth，nb)(100ml)：将蛋白胨0.5g、氯化钠0.5g、牛肉膏0.3g溶解于100ml水中，并用1mol/l氢氧化钠水溶液调整ph值至7.2±0.2；lb培养基(100ml)：将胰蛋白胨1g、酵母浸粉0.5g、氯化钠1g溶解于100ml水中，并用1mol/l氢氧化钠溶液调整ph值至7.2±0.2；violetredbileagar(vrba)和baird-parkeragar(bp)分别为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的鉴别培养基，购于奥博星生物技术有限公司；除vrba培养基外，所有培养基使用前均需121℃高压灭菌20min。
2、不同超声功率的灭菌效果
挑取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌单菌落分别于50mllb和nb培养基中，37℃培养12h。样品菌悬液浓度为106cfu/ml，50ml菌悬液分别用300、500、700w超声波处理10分钟。处理后，用生理盐水连续稀释样品，并将0.1ml稀释液涂于vrba和bp培养基上分别计数大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。实验结果如表1所示，超声功率与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的灭活效果呈正相关，700w超声对菌的失活率最高，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别减少了0.9和0.47logcfu/ml。超声对大肠杆菌的灭活效果明显优于对金黄色葡萄球菌，且不同功率之间对金黄色葡萄球菌灭活效果差异不大。
表1不同超声功率对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌减少量的影响
3、不同浓度根皮素的灭菌效果
挑取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌单菌落分别于50mllb和nb培养基中，37℃培养12h。样品菌悬液浓度为106cfu/ml。制备10mg/ml根皮素丙二醇溶液作为储备液，向菌悬液中加入根皮素储备液，使根皮素终浓度达到100、300、500μg/ml，对菌悬液进行不同浓度根皮素的处理，处理时间30分钟。将菌悬液进行梯度稀释，并将0.1ml稀释液涂于vrba和bp培养基上计数。实验结果如表2所示，300μg/ml根皮素处理菌悬液后，有较好的灭活效果，能使金黄色葡萄球菌减少2.4logcfu/ml。低、中剂量根皮素处理组对金黄色葡萄球菌灭活率差异有统计学意义(p<0.05)。但是与500μg/ml根皮素处理组相比，对金黄色葡萄球菌灭活效果没有显著差别。同样，300μg/ml根皮素对大肠杆菌具有一定的灭活效果，且高剂量组与中剂量组之间差异不显著。
表2不同根皮素浓度对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌减少量的影响
4、超声联合根皮素的灭菌效果
挑取大肠杆菌和金黄色葡萄球菌单菌落分别于50mllb和nb培养基中，37℃培养12h。样品菌悬液浓度为106cfu/ml。经过超声或根皮素处理后对灭活菌数进行动力学拟合。采用威布尔模型和双相线性模型进行拟合，得到d值(十倍杀菌时间)，即微生物数量减少1logcfu/ml所需要的时间，以此作为评价杀菌效果的参数。并根据以下公式计算得到超声与根皮素协同杀菌效率：
式中：
du-p——超声根皮素联合处理预测d值
du——超声处理实验d值
dp——根皮素处理实验d值
实验结果见表3，我们计算出超声结合根皮素处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌后的dtheoretical值分别为7.9和5.8min。通过实验，超声结合根皮素处理大肠杆菌后建模分析的dexperimental值为7.0min，金黄色葡萄球菌为5.4min，低于dtheoretical值。数据表明，超声与根皮素存在协同灭活作用，两者相互作用效果大于两者的普通叠加，根皮素对超声杀菌有明显的增效。通过计算增效率来量化协同效果。超声结合根皮素处理对大肠杆菌的增效作用达到11.4％，对金黄色葡萄球菌的增效作用达到6.9％。
表3超声和根皮素之间的协同作用
5、不同杀菌方法对比试验
将新鲜富士苹果用清水洗净，分割成2cm左右的块状。采用家用榨汁机(美的mj-wje2802d)榨取苹果汁，模拟了工厂中苹果汁的生产方式。制作苹果汁的详细步骤为：苹果洗净后去核，切成2cm左右的小块，在质量浓度为0.5％的氯化钙水溶液中浸泡30秒护色处理，加入1％果胶酶提高出汁率，榨汁，过滤一层纱布，装入无菌瓶进行超声灭菌处理。处理后的浑浊苹果汁与体积浓度为95％的乙醇水溶液按体积比1:1混合，5000g离心5分钟，在420nm处测定上清液的吸光度。实验结果表明：由300w和500w超声处理后的苹果汁od420值快速增加。低功率超声处理苹果汁10分钟后od420值达到0.24以上，苹果汁的颜色越来越深。相比之下，700w超声使鲜榨苹果汁5分钟后的od420增加，最大od420维持在0.10左右。与中低功率处理后的褐变指数相比，700w超声处理后的褐变指数明显较低。
对50ml新鲜苹果汁(ph＝4.0±0.2)分别进行超声(超声发生频率20khz，超声功率为700w，超声时间为10分钟，超声时温度维持在30℃±2℃)、根皮素(控制苹果汁中根皮素浓度为300μg/ml，常温静置处理30分钟)和超声结合根皮素(控制苹果汁中根皮素浓度为300μg/ml，常温静置处理30分钟；然后再超声处理，超声发生频率20khz，超声功率为700w，超声时间为10分钟，超声时温度维持在30℃±2℃)处理。处理后的苹果汁在37℃放置4周，每周测定一次微生物指标。处理后的样品依次稀释，接种于pca计数细菌总数和pda平板上计数霉菌酵母总数。pca板37±2℃孵育24h，pda板30±2℃孵育24h，微生物计数以logcfu/ml表示。实验结果见表4，当苹果汁经过不同处理后，第0天鲜榨苹果汁中没有检测到微生物存在。当处理后的苹果汁在37℃下保存14天后，经热处理和超声根皮素联合处理的苹果汁中未检测到任何微生物。相比之下，仅通过超声或根皮素单独处理的苹果汁中细菌、霉菌和酵母菌开始生长，检测到微生物的存在。在37℃存放28天后，通过热处理和超声根皮素联合处理的苹果汁中没有微生物生长。仅通过超声或很皮素单独处理的苹果汁中细菌增加到180cfu/ml，霉菌和酵母菌增加到130cfu/ml。实验说明超声或者根皮素单独处理都不能较好的杀灭果汁中全部微生物，这是由于果汁中微生物复杂多样，革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的结构大不相同。而将根皮素作为超声杀菌增效剂，超声根皮素联合处理对鲜榨苹果汁微生物的灭活效果较好，弥补了二者杀菌不足的问题，发挥二者协同杀菌作用，实现增效杀菌，在贮藏期间，与热处理实现了相同的灭菌效果。另外，在储存期间，未在任何处理组中检测到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等致病菌的存在。综上，超声根皮素联合处理对于苹果汁具有良好的微生物灭活效果。
表4贮藏期间处理苹果汁的微生物指标