一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法及其应用

1.本发明涉及一种具有降脂活性蛋白的制备方法，特别是涉及一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法及其应用，它属于功能性食品或药品技术领域。


背景技术：

2.高粱丝黑穗病菌(sphacelothecareiliana)，俗称高粱黑粉菌，属于担子菌门，黑粉菌纲，是重要的植物病原真菌。高粱黑粉菌虽然是植物病原菌，但作为典型的黑色食品和食用菌，具有很高的营养价值和保健作用。高粱丝黑穗病菌也应用于民间常用中药，具有很多功效，例如调经、止血、预防结肠炎和冠心病；高粱丝黑穗病菌具有很强的抗肿瘤活性，对肿瘤细胞有很强的抑制力，对人体有抗衰老作用、促进蛋白质与核酸的合成、抵抗放射线的破坏并增加白细胞含量，有抗溃疡、抗炎症、降血糖、增强记忆、抗凝血的作用。高粱丝黑穗病菌是一种具有很高营养价值的食用菌，含有丰富的多糖、膳食纤维、微量元素、维生素、蛋白质、氨基酸，尤其是人体必须氨基酸含量丰富。
3.但国内外对黑粉菌研究的热点主要是作为植物病原菌侵染机理和分类上，对高粱黑粉菌的开发利用主要是加工成各类食品及添加剂。专利号200410082983.4、申请日为2004年12月15日的中国专利，公开了一种高粱黑粉真菌营养添加剂制备方法及其产品。专利号为200810229729.0、申请日为2008年12月15日的中国专利，公开了一种高粱黑粉真菌米肠。但高粱黑粉菌中分离的用于减肥、调节血脂的化合物，并用于制备降脂的药物至今未见有公开报道。
4.肥胖和高血脂在世界范围内发病率不断上升，是一种进行性发展且后期会严重危害身体健康甚至生命的疾病。研究表明，降低血脂水平是改善高血脂的有效方法。在对内体外降脂实验研究中，我们发现和发明了具有降脂活性的高粱黑粉菌蛋白质的制备方法和降脂用途。研究证明，它的体内外降脂作用呈一定的量效关系。高粱黑粉菌蛋白质属于天然植物来源的蛋白，可以减少脂肪和碳水化合物的吸收，从而具有降脂功效。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法及其应用，它从高粱黑粉菌中分离处具降脂活性的物质，采用了水提醇沉的方法，并且研究它的降脂生物活性，开拓了高粱黑粉菌食用及药用价值的新用途问题。
6.为了达到上述目的本发明是通过下述技术方案实现的。
7.一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法，其步骤如下：
8.(1)浸提：取高粱黑粉菌的脱脂粉与蒸馏水混合后，经naoh溶液调节ph值、磁力搅拌得到粗提液；
9.(2)粗提物制备：取粗提液，采用hcl溶液调节ph值，静置8
‑
12h，离心，收集沉淀，得粗提物；
10.(3)分离提纯：取粗提物，调节ph至7，透析袋中透析，于真空冷冻干燥机中冷冻干
燥得高粱黑粉菌蛋白干燥粉末。
11.优选的，步骤(1)中高粱黑粉菌的脱脂粉制备方法如下：取鲜高粱黑粉菌去杂，60℃烘箱烘干，粉碎机粉碎，以料液比1:5与沸程60～90℃的石油醚混合分离油脂，通风厨中挥干，60目过筛，得到脱脂粉。
12.优选的，步骤(1)高粱黑粉菌脱脂粉与蒸馏水以1:10的质量比例进行混合，调节ph值为8.0。
13.优选的，步骤(1)中磁力搅拌是在室温条件下磁力搅拌30min，8000r/min离心10min。
14.优选的，步骤(1)中所述的naoh溶液是质量百分比浓度为1mol/l的溶液。
15.优选的，步骤(2)调节ph值为4.6，离心转速为8000r/min，时间为10min。
16.优选的，步骤(2)中所述的hcl溶液是质量百分比浓度为1mol/l的溶液。
17.优选的，步骤(3)中所述的透析方法是4℃下、6～8kd透析袋中透析72h。
18.一种所述从高粱黑粉菌中分离出的蛋白在制备治疗具有降脂和减肥食品或药品上的应用。
19.由于采用上述技术方案，使得本发明具有如下特点和效果：
20.本发明提供了所述蛋白的制备方法，所述的蛋白通过促进肝脏ampk磷酸化，干预脂代谢，降低血脂。经内外降脂实验证明，本发明提供的蛋白具有降低体脂含量、降低血清脂质水平和减轻体重的作用，对于开发新型的减肥、降血脂等天然食品和治疗药物具有重要意义。本发明的制备方法简单，成本低，提取纯度高，重现性好，可实现工业化生产，所述蛋白在制备降脂功能食品及药物方面具有良好的应用前景。
附图说明
21.图1是高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1纯化前后的纯度对比图。
22.图2是小鼠肝脏组织病理切片(he染色，
×
200)空白组图。
23.图3是小鼠肝脏组织病理切片(he染色，
×
200)模型组图。
24.图4是小鼠肝脏组织病理切片(he染色，
×
200)低计量组图。
25.图5是小鼠肝脏组织病理切片(he染色，
×
200)中剂量组图。
26.图6是小鼠肝脏组织病理切片(he染色，
×
200)高剂量组图。
27.图7是小鼠血液中tc情况图。
28.图8是小鼠血液中tg情况图。
29.图9是小鼠血液中hdl情况图。
30.图10是小鼠血液中ldl情况图。
31.图11是高粱黑粉菌蛋白对小鼠肝脏中p
‑
ampk的影响图。
具体实施方式
32.下面结合实施例对本发明进行进一步说明。以下实施例仅为本发明的几个具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。
33.下述实施例和试验例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
34.一种从高粱黑粉菌中分离蛋白的方法，其步骤如下：
35.(1)浸提：取鲜高粱黑粉菌去杂，60℃烘箱烘干，粉碎机粉碎，以料液比1:5与沸程60～90℃的石油醚混合分离油脂，通风厨中挥干，60目过筛，得到脱脂粉，取100质量份高粱黑粉菌的脱脂粉与1000质量份蒸馏水混合后，经质量百分比浓度为1mol/lnaoh溶液调节ph值为8.0、在室温条件下磁力搅拌30min，8000r/min离心10min，到粗提液；
36.(2)粗提物制备：取粗提液，采用质量百分比浓度为1mol/lhcl溶液调节ph值为4.6，静置8
‑
12h，离心转速为8000r/min，时间为10min，收集沉淀，得粗提物；
37.(3)分离提纯：取粗提物，调节ph至7，4℃下、6～8kd透析袋中透析72h，于真空冷冻干燥机中冷冻干燥得高粱黑粉菌蛋白干燥粉末。
38.本实施例从高粱黑粉菌中分离出的蛋白可以应用于制备治疗具有降脂和减肥食品或药品上。
39.以下通过试验数据进一步说明本发明的特点和效果，下述试验例中，未特殊说明的试验方法，均为常规方法。以下实施例所用蛋白均为本发明方法制备的蛋白。
40.试验例1
41.考马斯亮蓝法测蛋白含量试验
42.仪器：可见分光光度计，离心机，移液枪
43.样本制备：组织样品，称取约实施例0.03g高粱黑粉菌蛋白粉末，加入0.3ml提取液(蒸馏水)，冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清液，即待测液。
44.将粗提液稀释到10倍再进行测定，设定波长为600nm，蒸馏水调零在ep管中依次加入，见表1。
45.表1主要试验试剂用量及配置方法表
[0046][0047]
组织样本：
[0048]
蛋白含量(mg/g)＝[(
△
a+0.0044)/8.3429]/(w
×
v1/v)
×
d＝32.825mg/g
[0049]
样本前处理：配制6mol/l hcl溶液称取大约0.4g高粱黑粉菌蛋白粉，向瓶中加入2ml 6mol/l的盐酸。将其放在干燥箱内，在110
‑
120℃下水解24h，将水解液倒进蒸发皿中，放入沸水浴上加热以除去盐酸。再向蒸发皿内加入少量蒸馏水溶解残留物，继续在沸水浴上加热除去水分。
[0050]
试验例2
[0051]
纯化前后的蛋白采用测sds
‑
page电泳谱，进行纯度分析。配制sds浓度分别为12％和5％的分离胶与浓缩胶，取定量后的蛋白样品15
‑
20μg，按照体积加入上样缓冲液、dtt、marker，用沸水煮3
‑
10min，取上清进行电泳，至漠酪蓝指示剂跑至胶底，停止电泳。
[0052]
由图1可以看出，纯化后的高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1纯度可以达到80％以上，证明此方法可以获得较高纯度的高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1。
[0053]
试验例3
[0054]
降脂活性评价
[0055]
降脂活性测试，构建高脂诱导的c57bl/6小鼠的肥胖模型，通过观察及测量肝脏、肾脏及附睾脂肪组织的变化，计算小鼠体重、饮水量和饲料食用情况，结合各组小鼠体质指标、组织病理情况以及血液生化指标，探讨高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1对小鼠肥胖的降脂作用。
[0056]
本实验所用样品为上述提取到的高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1。辽宁长生生物技术股份有限公司提供清洁级雄性c57bl/6小鼠，鼠龄在7
‑
8周，体重18
‑
20g，级别为spf级。实验动物生产许可证号：scxk(辽)2015
‑
0001。小鼠在适宜的温湿条件室中保持12h光/暗循环，保证合适量的饲料和充足的水。所有小鼠在实验前要保证至少一周的时间适应环境条件。
[0057]
40只spf级雄性c57bl/6小鼠适应性饲喂一周后，随机分为5组：空白组、模型组、wm
‑
p1低剂量组(10mg/kg)、wm
‑
p1低剂量组(25mg/kg)和wm
‑
p1高剂量组(50mg/kg)，每组8只。饲养期间小鼠自由饮水，提供充足饲料，高脂饲料配方为70％普通饲料+15％猪油+15％蔗糖。每2d记录一次小鼠体重变化。
[0058]
1、小鼠模型建立
[0059]
高脂动物模型采用高脂饲料喂养，6w后当动物体重增加量高于实验前体重20％时，即视为肥胖小鼠造模成功。
[0060]
表2小鼠体重变化情况
[0061][0062]
*与空白组比较p﹤0.05
[0063]
#与模型组比较p﹤0.05
[0064]
2、对小鼠体脂的影响
[0065]
实验进行到第6周后的最后一天，采用活体动物体质分析仪echomri
‑
1100h检测各组小鼠的体脂肪、肌肉、自由水、总水含量。结果表明，高脂饮食小鼠的体脂肪含量显著高于空白组和样品组，而肌肉、自由水和总水无显著差异，推测体重差异可能由于脂肪含量不同引起的。样品组各项指标均与模型组有明显差异，计算其脂肪、肌肉、自由水、总水所占体重的百分比发现除脂肪含量有所差别外，其肌肉、自由水和总水含量无明显差异(p＞0.05)，说明样品组小鼠在体脂降低的同时其他机体指标并未受到明显影响。
[0066]
表3小鼠体脂分析
[0067][0068]
注：各组间相比，同一行结果上标记字母不同表示组间具有显著性差异，p＜0.05。
[0069]
3、小鼠肝脏、肾脏和附睾脂肪的情况
[0070]
完成体质实验后，当天各组小鼠进行麻醉(腹腔注射10％水合氯醛)，然后摘眼球取血，全血室温静置30min后，在4℃下3500r/min离心15min，取上清血清存放于
‑
80℃冰箱。小鼠采取颈椎脱臼处死，并取出完整的肝脏、肾脏和附睾脂肪组织。用滤纸清理干组织液后，称重并记录。
[0071]
表4小鼠肝脏、肾脏和附睾脂肪的重量
[0072][0073][0074]
注：各组间相比，同一行结果上标记字母不同表示组间具有显著性差异，p＜0.05。
[0075]
解剖结果显示，模型组小鼠由于脂肪的积累导致其肝脏和附睾脂肪重量显著高于其他两组，肾脏重量没有明显差异，说明高脂饮食主要增加肝脏及附睾脂肪的积累。
[0076]
4、肝脏病理切片
[0077]
由图2和图6可见，比较各组实验小鼠肝脏病理切片图，发现空白组的动物肝细胞未见任何病理改变，见图2；模型组，动物肝脏中央静脉周围可见大量肝细胞出现脂肪空泡变性，见图3；经低剂量组，高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1处理后，动物肝细胞变性程度明显减轻，仅少量肝细胞存在空泡变性，见图4；经中剂量组，高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1干预处理后，动物肝
细胞仍有明显可见的脂肪空泡，见图5；高剂量组，高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1处理组的动物肝细胞未见明显的空泡，见图6，结果表明，高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1干预可以逆转实验动物肝细胞脂肪变性的状态，且呈浓度依赖性。
[0078]
5、血清酶学检测
[0079]
采用自动血液分析仪检测血常规项目。采用7180型日立自动生化分析仪及试剂盒检测tc、tg、hdl
‑
c、ldl
‑
c四个血液生化指标。
[0080]
由图7和图8所示，小鼠血液中tc和tg情况。
[0081]
与模型组相比，低剂量、中剂量和高剂量组高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1的tc和tg水平显著降低(p<0.05)。可以推测，高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1对高脂饮食导致的肥胖小鼠具有降低总胆固醇和降低总甘油三酯的作用，并且呈剂量依赖性。
[0082]
由图9和图10所示，小鼠血液中hdl和ldl情况。
[0083]
与模型组相比，低剂量、中剂量和高剂量组高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1的hdl水平显著升高，而ldl水平显著降低(p<0.05)，并且具有明显的剂量
‑
效应关系。据此推测，低剂量、中剂量和高剂量组高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1对高脂饮食导致的肥胖小鼠具有良好的胆固醇调节作用。
[0084]
6肝脏组织的p
‑
ampk蛋白表达
[0085]
如图11所示，灌胃6周后高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1对小鼠肝脏糖异生关键蛋白酶p
‑
ampk蛋白表达量情况，与模型组相比，低剂量组、中剂量组合高剂量组的p
‑
ampk的含量能够显著的増加(p<0.05)，即能够增加p
‑
ampk表达。实验证明，高粱黑粉菌蛋白wm
‑
p1可在动物体内使ampk磷酸化，激活ampk，因此推测其可以干预肥胖小鼠的脂代谢。