乙醇梭菌蛋白在促进凡纳滨对虾生长、改善肠道菌群中的应用

1.本发明属于水产饲料应用技术领域，更具体地，涉及乙醇梭菌蛋白在促进凡纳滨对虾生长、改善肠道菌群中的应用。


背景技术：

2.凡纳滨对虾俗称南美白对虾，是广温、广盐性热带虾类。该虾肉质鲜美、单位产量高，是我国目前最主要的养殖对象之一。研究表明，凡纳滨对虾对蛋白质有较高的需求量，其对虾饲料最适蛋白水平为35％～40％。鱼粉作为一种海洋动物蛋白质原料，在水产动物日粮中具有不可替代性或特殊性。使用优质鱼粉是满足凡纳滨对虾高蛋白需求的主要方法。鱼粉是自于海洋鱼类的代表性原料,在营养素的组成模式如氨基酸组成模式、消化利用率等方面具有优势,这是鱼粉优于其他饲料原料的主要优势。据报道，全球渔获量的35％被用来作为生产鱼粉，但近年来由于鱼粉价格的上涨，导致了饲料的成本大大提高，所以降低鱼粉价格是节约养殖成本的重要关键。在全球水产养殖所用的饲料中，鱼粉一直处于不可替代的地位。按照目前的速度消耗，鱼粉资源将无法继续满足日益增长的水产养殖需求。对虾饲料也严重依赖鱼粉，对虾养殖成本约50％来自饲料投入，其中鱼粉成本又占较大比重，目前现行商用对虾饲料配方中鱼粉比例大约维持在25％以上水平，亟待寻找其他可利用蛋白源来有效替代对虾饲料中的鱼粉，以降低鱼粉在对虾饲料中的比例，降低饲料成本，减少养虾业对鱼粉的强烈依赖因此降低凡纳滨对虾饲料中的鱼粉含量和开发新型蛋白源，不仅可以降低饲料成本，还能减轻环境负担，对促进凡纳滨对虾饲料产业可持续发展具有重要作用。
3.动物性蛋白、植物性蛋白、微生物蛋白是重要的蛋白源，动物蛋白源如血粉、鸡肉粉、肉骨粉等蛋白质含量较高，可以替代部分鱼粉，但它们必需氨基酸如异亮氨酸和赖氨酸的含量不足，且动物蛋白源中脂肪的饱和度较高，影响了鱼类的适口性；植物性蛋白源如大豆、菜籽粕、植物分离蛋白等蛋白质含量较高且矿物元素和维生素含量丰富，可以部分替代鱼粉，但植物蛋白源中的抗营养因子如红细胞凝集素、胰蛋白酶抑制剂等会影响水产养殖动物的生长以及饲料的风味性；微生物蛋白常来自细菌、真菌、酵母菌、单细胞藻类等，单细胞蛋白即属于微生物蛋白的一种，其中蛋白质含量高、氨基酸比例均衡，但是消化率较低，安全性也需要进一步确认。单细胞蛋白，也称菌体蛋白、微生物蛋白，是指微藻、细菌和真藻在其生长过程中利用各种基质，在适宜的培养条件下培养细胞或丝状微生物的个体而获得的菌体蛋白。单细胞蛋白饲料具有生产效率高、原料丰富、生产占地面积小等优点。开发能够代替鱼粉的新型蛋白源，是对虾养殖业乃至整个水产行业当前和未来发展的方向，对于凡纳滨对虾产业的健康发展具有重大意义。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的上述问题，首先提供乙醇梭
菌蛋白作为鱼粉部分替代源的应用。
5.本发明的目的通过以下技术方案实现：
6.本发明首先提供乙醇梭菌蛋白作为鱼粉部分替代源在促进凡纳滨对虾生长性能中的应用，所述生长性能包括均末重、增重率和特定生长率。
7.本发明还提供乙醇梭菌蛋白作为鱼粉部分替代源在促进凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力中的应用。
8.本发明还提供乙醇梭菌蛋白作为鱼粉部分替代源在促进凡纳滨对虾血清免疫中的应用。
9.优选的，所述乙醇梭菌蛋白显著提高超氧化歧化酶、溶菌酶、谷草转氨酶、谷丙转氨酶和酚氧化酶的活性。
10.本发明还提供乙醇梭菌蛋白作为鱼粉部分替代源在调节凡纳滨对虾肠道菌群中的应用。
11.优选的，所述乙醇梭菌蛋白能够增加对虾肠道中益生菌的数量，并且改善肠道菌群多样性。
12.优选的，所述乙醇梭菌蛋白能够增加对虾肠道中浮霉菌门、ruegeria属的丰度。
13.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
14.本发明以凡纳滨对虾为研究对象，研究了乙醇梭菌蛋白作为鱼粉部分替代源对凡纳滨的影响，结果发现，其对凡纳滨生长性能、免疫性能、肌肉脂肪酸合成、肠道菌群等各方面均有积极影响，从而为实现乙醇梭菌蛋白作为鱼粉部分替代源提供了理论基础。
附图说明
15.图1为乙醇梭菌蛋白替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能的影响；
16.图2为乙醇梭菌蛋白替代鱼粉对凡纳滨对虾抗病免疫的影响；
17.图3为乙醇梭菌蛋白替代鱼粉对凡纳滨对虾免疫指标的影响；
18.图4为乙醇梭菌蛋白替代不同水平鱼粉对虾肠道菌群out的韦恩图比较；
19.图5为乙醇梭菌蛋白替代不同水平鱼粉对虾肠道菌群在门(a)和属(b)水平上的影响。
具体实施方式
20.下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
21.下述实施例以及实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料；所用的设备，如无特殊说明，均为常规实验设备。
22.实施例1
23.乙醇梭菌蛋白是一种优质的单细胞蛋白，其蛋白含量高，粗蛋白含量可达80％，富含多种微量元素，不含抗营养因子，富含18种氨基酸，其中含硫氨酸和赖氨酸含量相对较高，精氨酸相对缺乏，与传统的植物性蛋白质相比，不含抗营养因子，相比于动物性蛋白质，
具有较低的生物胺、沙门氏菌等，乙醇梭菌蛋白的生产具有绿色、节能、环保的特性。
24.以凡纳滨对虾为研究对象，研究饲料中不同添加水平的乙醇梭菌蛋白对凡纳滨对虾生长性能、饲料利用、免疫力及肠道菌群的影响，为开发新型饲料蛋白源提供技术支撑。以添加鱼粉作为对照，用乙醇梭菌蛋白分别等量替代15％、30％、45％的鱼粉蛋白，配平赖氨酸、蛋氨酸、精氨酸，制备4种饲料饲养凡纳滨对虾8周，研究饲料中乙醇梭菌蛋白替代鱼粉蛋白对凡纳滨对虾生长性能、饲料利用及免疫力的影响，为开发新型饲料蛋白源提供技术支撑。养殖实验为期8周，设4个处理(分别记为fm、cap15、cap30和cap45组)，每个处理3个重复，每个重复40尾虾。每天分别在7:00、11:00、17:00、21:00进行定量投喂，投喂量按体重的8-10％计算，投喂1h后观察摄食程度。养殖实验结束后，禁食24h，称重，记录存活尾数，计算存活率、增重率、特定生长率，同时采集凡纳滨对虾血淋巴、肠道和肝胰腺等组织样品，并分析测定消化酶、抗氧化力和免疫力等指标，用hiseq2500 pe250仪器(illumina,usa)对凡纳滨对虾的肠道菌群进行测定分析。进行攻毒实验，每个处理组选择30尾对虾进行攻毒，注射副溶血弧菌，连续观察72h，每隔4h统计一次死亡个体数，用于计算存活率。
25.表1乙醇梭菌蛋白常规营养组成
[0026][0027]
表2实验饲料组成及营养水平(干物质基础)％
[0028][0029][0030]
注：1每千克维生素预混料含：维生素a450000iu，维生素d3150000iu，维生素e5000mg，维生素k3500mg，维生素b1500mg，维生素b2700mg，维生素b6600mg，维生素b
12
2mg，泛酸钙2000mg，烟酸3500mg，生物素6mg，肌醇8000mg，叶酸150mg。每千克矿物质预混料含：镁20000mg，铁2000mg，锌8000mg，锰2000mg，铜1500mg，钴80mg，硒10mg，碘100mg。
[0031]
一、饲养8周后凡纳滨对虾生长性能如图1所示，当饲喂乙醇梭菌蛋白替代鱼粉的比例为15％和30％的饲料时，凡纳滨对虾的终末均重、增重率和特定生长率较鱼粉组升高，其中cap15组与fm相比差异显著，但各替代组中凡纳滨对虾饲料系数与鱼粉组无显著差异，该结果表明，适量乙醇梭菌蛋白替代鱼粉可有效提高凡纳滨对虾的生长性能。
[0032]
二、饲养8周后每个处理组选择30尾对虾进行攻毒，注射副溶血弧菌，攻毒结果如图2所示，乙醇梭菌蛋白替代鱼粉的比例为15％和30％组中，凡纳滨对虾抗副溶血弧菌感染能力较鱼粉组显著提高。该结果表明，适量乙醇梭菌蛋白替代鱼粉可有效提高凡纳滨对虾的抗病能力。
[0033]
三、如图3所示，饲喂乙醇梭菌蛋白替代不同比例鱼粉的饲料可以不同程度调节凡纳滨对虾的血清免疫和抗氧化酶活，与对照组相比，所有替代组凡纳滨对虾肝胰腺中酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性和丙二醛含量均显著下降，超氧化物歧化酶和溶菌酶活性显著升高，谷草转氨酶、谷丙转氨酶和酚氧化酶呈现先升高后下降趋势，在15％替代组达到最高。该结果表明，乙醇梭菌蛋白替代鱼粉可有效提高凡纳滨对虾体内的免疫酶活，有助于对虾免疫力的提高。
[0034]
四、如图4所示，饲喂乙醇梭菌蛋白替代不同水平鱼粉的凡纳滨对虾肠道出现不同数量和种类的微生物种群。由此可知，饲料中小球藻替代不同水平鱼粉能够调节凡纳滨对虾肠道中的微生物菌群。
[0035]
表2列出了4组中凡纳滨对虾肠道中菌群物种(sobs)，shannon，simpson，chao1和基于丰度的覆盖估计(ace)指数，以评估4组凡纳滨对虾肠道菌群的α多样性。与fm组相比，cap15组中凡纳滨对虾肠道菌群sobs指数显著升高，cap30组中凡纳滨对虾肠道菌群sobs和shannon的指数均显著升高(p《0.05)。4组中组凡纳滨对虾肠道菌群的simpson，chao1和ace指数无显著差异。该结果表明，饲料中适宜水平的乙醇梭菌蛋白替代鱼粉可改善凡纳滨对虾肠道菌群的多样性。
[0036]
表3乙醇梭菌蛋白替代不同水平鱼粉对凡纳滨对虾肠道菌群α多样性指数的影响
[0037][0038]
如图5所示，在门水平，凡纳滨对虾的肠道菌群丰富度排名前五位的是变形细菌门(proteobacteria)、拟杆菌门(bacteroidetes)、浮霉菌门(planctomycetes)、疣微菌门(verrucomicrobia)和放线菌门(actinobacteria)(图5a)。与对照组相比，所有替代组中凡纳滨对虾的肠道浮霉菌门细菌丰度均增加。在属水平上，凡纳滨对虾的肠道微生物群落丰富度最高的前5位是弧菌属(vibrio)、haloferula菌属、halocynthiibacter菌属、ruegeria菌属和blastopirellula菌属(图5b)。与对照组相比，cap30和cap45实验组的弧菌则比对照组减少，而实验组的haloferula和ruegeria比对照组增加。许多研究表明，弧菌作为水生动物中一种常见的菌群，已被确定为虾肠道的主要成员。在水产养殖中，弧菌是某些物种的主要致病菌之一。ruegeria，一种革兰氏阴性菌属，被广泛认为是降解甘油三酯的益生菌。在本研究中，饲喂乙醇梭菌蛋白后，与对照组相比，凡纳滨对虾肠道中弧菌属相对丰度均有所
下降而ruegeria的丰度均增加。以上结果表明，饲喂乙醇梭菌蛋白可以同时通过增加凡纳滨对虾肠道中潜在益生菌的含量和降低致病菌的含量来调节肠道菌群的组成，从而对虾产生有益的作用。
[0039]
综上，合理水平使用乙醇梭菌蛋白替代鱼粉对凡纳滨对虾生长性能、抗病免疫能力和肠道菌群的组成均有改善作用。
[0040]
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。