用于动物健康的饲料组合物的制作方法

用于动物健康的饲料组合物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年2月7日提交的美国临时专利申请号62/971,503和2020年9月24日提交的美国临时专利申请号63/082,634的优先权，将每篇文献的公开内容通过引用以其全文并入本文。
技术领域
3.本文尤其提供了饲料和饲料添加剂组合物，其包含可用于改善动物健康和/或性能、增加可用贮存期的耐氧埃氏巨型球菌(megasphaera elsdenii)菌株直接饲喂微生物(dfm)，以及制备和使用这些饲料和饲料添加剂组合物的方法。


背景技术：

4.在单胃和反刍动物物种中，胃肠道和消化系统相关的微生物区系不仅参与消化和吸收，而且还与免疫和中枢神经系统相互作用以调节健康。消化道的内部涂覆有粘稠的薄层粘液，并且数百万的细菌和其他微生物包埋在该粘液层中。当细菌处于平衡(即，有益细菌的数量超过有害细菌)时，可以说消化道处于健康状态。健康的微生物群为宿主提供多种益处，包括对广谱病原体的定殖抗力、必需营养素的生物合成和吸收以及维持健康的消化道上皮和适当控制的全身免疫的免疫刺激。在“微生态失衡”或共生遭破坏的情况下，微生物群功能可能会丧失或紊乱，导致对病原体的易感性增加、代谢特征改变或促炎信号的诱导，其可能会导致局部或全身炎症或自身免疫。因此，动物胃肠道的微生物群在许多疾病和障碍(例如反刍动物的酸中毒)的发病机制中起着重要作用。
5.目前市场上大多数用于人类的益生菌或用于动物营养的直接饲喂微生物(dfm)可以在氧气存在的情况下生长和/或耐受氧气暴露。此类微生物的实例包括芽孢杆菌属(bacilli)(是一类含有两个目的需氧菌)和乳杆菌属(lactobacillus)(是兼性厌氧菌属)。然而，越来越多的下一代益生菌/dfm是对氧气敏感的专性厌氧菌。这些产品在加工、运输和储存期间的稳定性是个问题，主要是由于不能耐受氧气而导致贮存期较短。使用稳定剂进行配制和包封可以在一定程度上改善稳定性，尽管即便如此，这些产品仍表现出显著低于含有需氧微生物的相应产品的贮存期。例如，(ms生物科技公司(msbiotec)，沃米戈(wamego)，堪萨斯州(ks))含有专性厌氧菌埃氏巨型球菌ncimb41125的纯培养物，并且是用于在治疗反刍动物的酸中毒中使用的有效dfm产品。然而，液体配制的lactipro在4℃下的贮存期只有约两周，并且这种产品的不稳定性限制了lactipro在市场上(特别是在世界上缺乏冷藏条件的地区)的使用。因此，需要用于在治疗反刍动物的与微生态失衡相关的病症(例如酸中毒)中使用的厌氧细菌，这些厌氧细菌表现出对氧气的耐受性、在氧气暴露后增加的活力以及增加的贮存期和储存期。
6.本文公开的主题解决了这些需求且还提供了额外的益处。


技术实现要素：

7.本文尤其提供了包含耐氧埃氏巨型球菌菌株直接饲喂微生物(dfm)的组合物，以及制备和使用这些组合物以促进动物的一项或多项指标的改善的方法，该一项或多项指标是例如增加的体重/胴体增重、增加的饲料摄入量、降低的饲料转化率(fcr)、降低的医疗成本、降低的死亡率、减少的从饲草/草/青贮饲料饮食过渡为高精料饮食的时间、和/或降低的瘤胃酸中毒的发生率。本文公开的厌氧细菌组合物在暴露于氧气后另外表现出增加的贮存期和活力。
8.因此，在一些方面，本文提供了包含直接饲喂微生物(dfm)的饲料添加剂组合物，该饲料添加剂组合物包含至少一种生物学纯的耐氧埃氏巨型球菌菌株。在一些实施例中，耐氧埃氏巨型球菌在以下中包含至少一个突变：(a)编码包含seq id no:4的转录调节因子perr的基因；或(b)紧邻编码转录调节因子perr的基因的上游。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，至少一个突变是(a)导致perr蛋白中氨基酸变化的核苷酸取代；和/或(b)导致移码突变的核苷酸插入。在一些实施例中，核苷酸取代位于选自由以下组成的组的核苷酸位置处：386、155、253、-99和-125，该核苷酸位置对应于由seq id no:4的多核苷酸序列编码的基因。在一些实施例中，核苷酸取代包含g386t、c155t、c253t、t-99c或g-125a。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，氨基酸变化包含对应于由seq id no:5编码的多肽的c129f、t52m或h85y。在一些实施例中，perp蛋白包含由seq id no:6编码的多肽。在一些实施例中，核苷酸插入位于选自由以下组成的组的核苷酸位置处：30、277和64，该核苷酸位置对应于seq id no:4。在一些实施例中，插入是位置30处的a、位置277处的a、或位置64处的g。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，组合物包含以下中的一种或多种(a)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1265的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1265保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(westerdijk fungal biodiversity institute，wfdi)，保藏号为cbs 146328；(b)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-a01的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(c)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-b01的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(d)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-e01的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(e)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-c02的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(f)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-c05的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(g)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-h05的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(h)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-b03的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(i)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141-c10的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(j)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141-d10的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(k)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1141保藏于
wfdi，保藏号为cbs146325；(l)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141e的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1141e保藏于wfdi，保藏号为cbs146326；(m)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141f的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1141f保藏于wfdi，保藏号为cbs146327；(n)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1265e的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1265e保藏于wfdi，保藏号为cbs146329；和/或(o)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1265f的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1265f保藏于wfdi，保藏号为cbs 146330。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，组合物包含以下中的一种或多种(a)埃氏巨型球菌菌株acd1265或具有埃氏巨型球菌菌株acd1265的所有鉴别特征的活菌株；(b)埃氏巨型球菌菌株acd1096-a01或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-a01的所有鉴别特征的活菌株；(c)埃氏巨型球菌菌株acd1096-b01或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-b01的所有鉴别特征的活菌株；(d)埃氏巨型球菌菌株acd1096-e01或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-e01的所有鉴别特征的活菌株；(e)埃氏巨型球菌菌株acd1096-c02或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-c02的所有鉴别特征的活菌株；(f)埃氏巨型球菌菌株acd1096-c05或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-c05的所有鉴别特征的活菌株；(g)埃氏巨型球菌菌株acd1096-h05或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-h05的所有鉴别特征的活菌株；(h)埃氏巨型球菌菌株acd1096-b03或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-b03的所有鉴别特征的活菌株；(i)埃氏巨型球菌菌株acd1141-c10或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141-c10的所有鉴别特征的活菌株；(j)埃氏巨型球菌菌株acd1141-d10或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141-d10的所有鉴别特征的活菌株；(k)埃氏巨型球菌菌株acd1141或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141的所有鉴别特征的活菌株；(l)埃氏巨型球菌菌株acd1141e或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141e的所有鉴别特征的活菌株；(m)埃氏巨型球菌菌株acd1141f或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141f的所有鉴别特征的活菌株；(n)埃氏巨型球菌菌株acd1265e或具有埃氏巨型球菌菌株acd1265e的所有鉴别特征的活菌株；和/或(o)埃氏巨型球菌菌株acd1265f或具有埃氏巨型球菌菌株acd1265f的所有鉴别特征的活菌株，将该一种或多种菌株(a)单独培养；或(b)与衍生自这些菌株中的一种或多种的培养上清液组合。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，组合物包含以下中的一种或多种(i)细菌菌株，其具有与包含seq id no:1的埃氏巨型球菌菌株acd1265的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(ii)细菌菌株，其具有与包含seq id no:2的埃氏巨型球菌菌株acd1096-a01的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，或(iii)细菌菌株，其具有与包含seq id no:3的埃氏巨型球菌菌株acd1141的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，将该一种或多种菌株(a)单独培养；或(b)与衍生自这些菌株中的一种或多种的培养上清液组合。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，耐氧埃氏巨型球菌在暴露于氧气至少约7-12天后保持活力。在一些实施例中，至少约5.73x102至约1.16x108cfu/ml的埃氏巨型球菌在暴露于氧气7-12天后保持活力。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，耐氧埃氏巨型球菌在暴露于氧气后至少10天后保持活力。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，组合物进一步包含至少一种
酵母菌株和/或酵母提取物。在一些实施例中，该酵母菌株来自酵母属(saccharomyces)或毕赤酵母属(pichia)或曲霉属(aspergillus)。在一些实施例中，酵母是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)或库德里阿兹威毕赤酵母(pichia kudriavzevii)或布拉氏酵母(saccharomyces boulardii)或米曲霉(aspergillus oryzae)。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，相比于单独存在，当存在至少一种酵母菌株和/或酵母提取物时，耐氧埃氏巨型球菌表现出增加的耐氧性。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，饲料添加剂组合物进一步包含一种或多种赋形剂。在一些实施例中，赋形剂包含多糖、蛋白质、抗氧化剂、或无机固体或无机油中的一种或多种。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，与缺乏一种或多种赋形剂的组合物相比，该一种或多种赋形剂改善或提高饲喂牛稳定性大于约50％。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，组合物进一步包含一种或多种酶。在一些实施例中，该一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶和β-葡聚糖酶。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，每种埃氏巨型球菌菌株以至少约1x103cfu/g饲料添加剂组合物到至少约1x10
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cfu/g饲料添加剂组合物的浓度存在。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，将组合物配制成液体或固体。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，组合物治疗或预防反刍动物的酸中毒。
9.在另一方面，本文提供了预混物，其包含本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种和至少一种矿物质和/或至少一种维生素。
10.在另外的方面，本文提供了饲料，其包含本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种或本文公开的预混物中的任一种。
11.在其他方面，本文提供了试剂盒，其包含a)本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种；以及b)用于向动物施用的书面说明。在一些实施例中，试剂盒进一步包含一种或多种酶。在一些实施例中，该一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶和β-葡聚糖酶。
12.在仍其他方面，本文提供了一种用于改善动物的一项或多项指标的方法，该一项或多项指标选自由以下组成的组：增加的体重/胴体增重、增加的饲料摄入量、降低的饲料转化率(fcr)、降低的医疗成本、减少的过渡期、减少使用抗生素和降低的死亡率，该方法包括向该动物施用有效量的本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种、本文公开的预混物中的任一种、或本文公开的饲料中的任一种，从而改善该动物的一项或多项指标。在一些实施例中，动物是反刍动物。在一些实施例中，动物是母牛、山羊、绵羊、水牛、鹿或哺乳动物的反刍亚目的其他成员。在一些实施例中，动物是奶牛或肉牛。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，该方法进一步治疗、预防动物瘤胃酸中毒或降低该动物瘤胃酸中毒的发生率。在一些实施例中，动物是马属(equus)的成员。在一些实施例中，动物是马、骡子、驴或斑马。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，该方法降低以包含一种或多种高能量谷物的饮食饲喂的马属动物的胃溃疡的发生率。在一些实施例中，所述高能量谷物是燕麦和/或玉米。
13.在一些方面，本文提供了一种用于治疗、预防反刍动物的瘤胃酸中毒或降低反刍动物的瘤胃酸中毒的发生率的方法，该方法包括向该动物施用有效量的本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种、本文公开的预混物中的任一种、或本文公开的饲料中的任一种，从而治疗、预防该动物的瘤胃酸中毒或降低该动物的瘤胃酸中毒的发生率。在一些实施例中，所述施用将动物瘤胃的ph升高或维持在高于ph 5.6。在本文所述的任一实施例的一些实施
例中，反刍动物是母牛、山羊、绵羊、水牛、鹿或哺乳动物的反刍亚目的其他成员。在一些实施例中，反刍动物是奶牛或肉牛。
14.在另一方面，本文提供了一种用于制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括将以下进行组合：(a)至少一种生物学纯的耐氧埃氏巨型球菌菌株；和(b)至少一种酵母菌株和/或酵母提取物。在一些实施例中，耐氧埃氏巨型球菌在以下中包含至少一个突变：(a)编码包含seq id no:4的转录调节因子perr的基因；或(b)紧邻编码转录调节因子perr的基因的上游。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，至少一个突变是(a)导致perr蛋白中氨基酸变化的核苷酸取代；和/或(b)导致移码突变的核苷酸插入。在一些实施例中，核苷酸取代位于选自由以下组成的组的核苷酸位置处：386、155、253、-99和-125，该核苷酸位置相对于由seq id no:4的多核苷酸序列编码的基因。在一些实施例中，核苷酸取代包含g386t、c155t、c253t、t-99c或g-125a。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，氨基酸变化包含相对于由seq id no:5编码的多肽的c129f、t52m或h85y。在一些实施例中，perp蛋白包含由seq id no:6编码的多肽。在一些实施例中，核苷酸插入位于选自由以下组成的组的核苷酸位置处：30、277和64，该核苷酸位置相对于seq id no:4。在一些实施例中，插入是位置30处的a、位置277处的a、或位置64处的g。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，耐氧埃氏巨型球菌包含(i)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1265的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1265保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(wfdi)，保藏号为cbs 146328；(ii)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-a01的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(iii)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-b01的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(iv)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-e01的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(v)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-c02的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(vi)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-c05的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(vii)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-h05的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(viii)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-b03的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(ix)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141-c10的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(x)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141-d10的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(xi)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1141保藏于wfdi，保藏号为cbs 146325；(xii)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141e的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1141e保藏于wfdi，保藏号为cbs 146326；(xiii)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141f的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1141f保藏于wfdi，保藏号为cbs 146327；(xiv)埃氏巨型球菌
菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1265e的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1265e保藏于wfdi，保藏号为cbs 146329；和/或(xv)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1265f的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1265f保藏于wfdi，保藏号为cbs 146330。在一些实施例中，埃氏巨型球菌菌株是(i)埃氏巨型球菌菌株acd1265或具有埃氏巨型球菌菌株acd1265的所有鉴别特征的活菌株；(ii)埃氏巨型球菌菌株acd1096-a01或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-a01的所有鉴别特征的活菌株；(iii)埃氏巨型球菌菌株acd1096-b01或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-b01的所有鉴别特征的活菌株；(iv)埃氏巨型球菌菌株acd1096-e01或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-e01的所有鉴别特征的活菌株；(v)埃氏巨型球菌菌株acd1096-c02或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-c02的所有鉴别特征的活菌株；(vi)埃氏巨型球菌菌株acd1096-c05或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-c05的所有鉴别特征的活菌株；(vii)埃氏巨型球菌菌株acd1096-h05或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-h05的所有鉴别特征的活菌株；(viii)埃氏巨型球菌菌株acd1096-b03或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-b03的所有鉴别特征的活菌株；(ix)埃氏巨型球菌菌株acd1141-c10或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141-c10的所有鉴别特征的活菌株；(x)埃氏巨型球菌菌株acd1141-d10或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141-d10的所有鉴别特征的活菌株；(xi)埃氏巨型球菌菌株acd1141或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141的所有鉴别特征的活菌株；(xii)埃氏巨型球菌菌株acd1141e或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141e的所有鉴别特征的活菌株；(xiii)埃氏巨型球菌菌株acd1141f或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141f的所有鉴别特征的活菌株；(xiv)埃氏巨型球菌菌株acd1265e或具有埃氏巨型球菌菌株acd1265e的所有鉴别特征的活菌株；和/或(xv)埃氏巨型球菌菌株acd1265f或具有埃氏巨型球菌菌株acd1265f的所有鉴别特征的活菌株，将该一种或多种菌株(a)单独培养；或(b)与衍生自这些菌株中的一种或多种的培养上清液组合。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，酵母菌株来自酵母属或毕赤酵母属或曲霉属。在一些实施例中，酵母是酿酒酵母或库德里阿兹威毕赤酵母或布拉氏酵母或米曲霉。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种赋形剂组合。在一些实施例中，赋形剂包含多糖、蛋白质、抗氧化剂、或无机固体或无机油中的一种或多种。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种酶与饲料添加剂组合物组合。在一些实施例中，该一种或多种酶选自由以下组成的组：植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶和β-葡聚糖酶。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，将至少约1x103cfu/g到至少约1x109cfu/g埃氏巨型球菌与至少一种酵母菌株和/或酵母提取物组合以形成饲料添加剂组合物。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，该方法进一步包括将饲料添加剂组合物配制成液体或固体。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，该方法进一步包括将饲料添加剂组合物包装。
15.在又一方面，本文提供了一种用于制备预混物的方法，该方法包括将本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种与至少一种矿物质和/或至少一种维生素组合。在一些实施例中，该方法进一步包括将该预混物包装。
16.在其他方面，本文提供了一种用于提高埃氏巨型球菌菌株的耐氧性的方法，该方法包括在以下中引入至少一个突变：(a)编码包含seq id no:4的转录调节因子perr的基
因；或(b)紧邻编码转录调节因子perr的基因的上游。在一些实施例中，至少一个突变是(a)导致perr蛋白中氨基酸变化的核苷酸取代；和/或(b)导致移码突变的核苷酸插入。在一些实施例中，核苷酸取代位于选自由以下组成的组的核苷酸位置处：386、155、253、-99和-125，该核苷酸位置相对于包含seq id no:4的多核苷酸序列的基因。在一些实施例中，核苷酸取代包含g386t、c155t、c253t、t-99c或g-125a。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，氨基酸变化包含相对于由seq id no:5编码的多肽的c129f、t52m或h85y。在一些实施例中，perp蛋白包含由seq id no:6编码的多肽。在一些实施例中，核苷酸插入位于选自由以下组成的组的核苷酸位置处：30、277和64，该核苷酸位置相对于seq id no:4。在一些实施例中，插入是位置30处的a、位置277处的a、或位置64处的g。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，该方法进一步包括将埃氏巨型球菌菌株与至少一种酵母菌株和/或酵母提取物组合。在一些实施例中，该酵母菌株来自酵母属或毕赤酵母属或曲霉属。在一些实施例中，酵母是酿酒酵母或库德里阿兹威毕赤酵母或布拉氏酵母或米曲霉。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，该方法进一步包括将埃氏巨型球菌菌株与一种或多种赋形剂组合。在一些实施例中，赋形剂包含多糖、蛋白质、抗氧化剂、或无机固体或无机油中的一种或多种。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，埃氏巨型球菌菌株在暴露于氧气至少约7-12天后保持活力。在一些实施例中，至少约5.73x104至约1.16x108cfu/ml的埃氏巨型球菌在暴露于氧气7-12天后保持活力。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，埃氏巨型球菌菌株在暴露于氧气至少30天后保持活力。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，将所述突变经由随机诱变或定点诱变引入。
17.在另外的方面，本文提供了一种用于增加包含埃氏巨型球菌的饲料添加剂组合物的贮存期的方法，该方法包括将本文公开的任一饲料添加剂组合物的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的一种或多种与至少一种酵母菌株和/或酵母提取物一起配制。在一些实施例中，该酵母菌株来自酵母属或毕赤酵母属或曲霉属。在一些实施例中，酵母是酿酒酵母或库德里阿兹威毕赤酵母或布拉氏酵母或米曲霉。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，该方法进一步包括将埃氏巨型球菌菌株与一种或多种赋形剂组合。在一些实施例中，赋形剂包含多糖、蛋白质、抗氧化剂、或无机固体或无机油中的一种或多种。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，饲料添加剂组合物具有至少约7-12天的贮存期。在一些实施例中，饲料添加剂组合物具有至少约30天的贮存期。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，将饲料添加剂组合物配制成液体或固体。
18.在一些方面，本文提供了一种生物学纯的埃氏巨型球菌菌株，该埃氏巨型球菌菌株包含(a)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1265的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1265保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(wfdi)，保藏号为cbs 146328；(b)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-a01的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(c)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-b01的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(d)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-e01的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(e)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-c02的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(f)
埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-c05的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(g)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-h05的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(h)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1096-b03的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(i)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141-c10的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(j)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141-d10的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(k)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1141保藏于wfdi，保藏号为cbs146325；(l)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141e的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1141e保藏于wfdi，保藏号为cbs146326；(m)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1141f的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1141f保藏于wfdi，保藏号为cbs146327；(n)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1265e的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1265e保藏于wfdi，保藏号为cbs146329；和/或(o)埃氏巨型球菌菌株，其具有与埃氏巨型球菌菌株acd1265f的16s核糖体dna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列，该埃氏巨型球菌菌株acd1265f保藏于wfdi，保藏号为cbs 146330。在一些实施例中，该菌株是(a)埃氏巨型球菌菌株acd1265或具有埃氏巨型球菌菌株acd1265的所有鉴别特征的活菌株；(b)埃氏巨型球菌菌株acd1096-a01或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-a01的所有鉴别特征的活菌株；(c)埃氏巨型球菌菌株acd1096-b01或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-b01的所有鉴别特征的活菌株；(d)埃氏巨型球菌菌株acd1096-e01或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-e01的所有鉴别特征的活菌株；(e)埃氏巨型球菌菌株acd1096-c02或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-c02的所有鉴别特征的活菌株；(f)埃氏巨型球菌菌株acd1096-c05或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-c05的所有鉴别特征的活菌株；(g)埃氏巨型球菌菌株acd1096-h05或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-h05的所有鉴别特征的活菌株；(h)埃氏巨型球菌菌株acd1096-b03或具有埃氏巨型球菌菌株acd1096-b03的所有鉴别特征的活菌株；(i)埃氏巨型球菌菌株acd1141-c10或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141-c10的所有鉴别特征的活菌株；(j)埃氏巨型球菌菌株acd1141-d10或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141-d10的所有鉴别特征的活菌株；(k)埃氏巨型球菌菌株acd1141或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141的所有鉴别特征的活菌株；(l)埃氏巨型球菌菌株acd1141e或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141e的所有鉴别特征的活菌株；(m)埃氏巨型球菌菌株acd1141f或具有埃氏巨型球菌菌株acd1141f的所有鉴别特征的活菌株；(n)埃氏巨型球菌菌株acd1265e或具有埃氏巨型球菌菌株acd1265e的所有鉴别特征的活菌株；和/或(o)埃氏巨型球菌菌株acd1265f或具有埃氏巨型球菌菌株acd1265f的所有鉴别特征的活菌株。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，该菌株包含(i)细菌菌株，其具有与包含seq id no:1的埃氏巨型球菌菌株acd1265的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列；(ii)细菌菌株，其具有与包含seq id no:2的埃氏巨型球菌菌株acd1096-a01的
16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列或(iii)细菌菌株，其具有与包含seq id no:3的埃氏巨型球菌菌株acd1141的16s核糖体rna序列呈现出至少97.0％序列相似性的16s核糖体rna序列。
19.一种用于减少反刍动物从饲草/草/青贮饲料饮食过渡为高精料饮食所需的时间且不增加酸中毒的发生率的方法，该方法包括向该动物施用有效量的本文公开的饲料添加剂组合物中的任一种、本文公开的预混物中的任一种、或本文公开的饲料中的任一种，从而减少该动物过渡为高精料饮食所需的时间且不增加酸中毒的发生率。在一些实施例中，反刍动物是母牛、山羊、绵羊、水牛、鹿或哺乳动物的反刍亚目的其他成员。在一些实施例中，反刍动物是奶牛或肉牛。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，与未施用有效量的本文公开的任一饲料添加剂组合物、本文公开的任一预混物、或本文公开的任一饲料的反刍动物过渡所需的时间相比，该所需的时间平均减少大于约60％。
20.在仍另外的方面，本文提供了试剂盒，其包含本文公开的任一生物学纯的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的一种或多种以及用于向动物施用的书面说明。在一些实施例中，试剂盒进一步包含一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，试剂盒进一步包含一种或多种酶。在本文所述的任一实施例的一些实施例中，试剂盒进一步包含一种或多种赋形剂。在一些实施例中，赋形剂包含多糖、蛋白质、抗氧化剂、或无机固体或无机油中的一种或多种。在本文公开的任一实施例的一些实施例中，生物学纯的埃氏巨型球菌菌株和/或酵母菌株是冻干的或冷冻干燥的。
21.本文所述的方面和实施例中的每个能够一起使用，除非明确地或清楚地从实施例或方面的上下文中排除。
22.在整个说明书中，引用了各种专利、专利申请和其他类型的出版物(例如，期刊文章、电子数据库条目等)。出于所有目的，本文所引用的所有专利、专利申请和其他出版物的公开内容通过引用以其全文特此并入。
附图说明
23.图1描绘了显示埃氏巨型球菌菌株acd1265与其亲本acd1009的耐氧性的mpn评估的柱状图。将三种埃氏巨型球菌菌株的过夜培养物暴露于空气中长达12天。第0天是没有氧气暴露的厌氧对照。y轴是通过mpn方法计算的cfu/ml。
24.图2描绘了显示衍生自亲本acd1096的埃氏巨型球菌变体菌株的耐氧性的mpn评估的柱状图。将埃氏巨型球菌菌株的过夜培养物暴露于空气中长达3天。第0天是没有氧气暴露的厌氧对照。y轴是通过mpn方法计算的cfu/ml。
25.图3描绘了显示衍生自亲本acd1141的埃氏巨型球菌变体菌株的耐氧性的mpn评估的柱状图。将埃氏巨型球菌菌株的过夜培养物暴露于空气中长达3天。第0天是没有氧气暴露的厌氧对照。y轴是通过mpn方法计算的cfu/ml。
26.图4描绘了显示通过mpn评估的进化埃氏巨型球菌菌株acd1141e/f和acd1265e/f的耐氧性的柱状图。第0天是没有氧气暴露的厌氧对照。y轴是通过mpn方法计算的cfu/ml。
27.图5描绘了显示当与饲料以及酿酒酵母sc3和可溶性多糖一起混合四小时后，埃氏巨型球菌活力计数(cfu/g)的柱状图。
28.图6描绘了显示在饲料中与可溶性多糖混合4小时后，埃氏巨型球菌的乳酸利用率
的柱状图。
具体实施方式
29.如本文更详细描述的，诸位发明人已经惊奇地发现了几种耐氧埃氏巨型球菌菌株。与亲本菌株相比，这些变体显示出大大改善的耐氧性以及在氧气暴露后增加的活力。不受理论束缚，菌株的全基因组序列比较鉴定了perr基因中或附近的核苷酸变化，这些变化可能导致增强的耐氧特征。perr是与某些种类的细菌中的氧化应激反应相关的转录调节因子。耐氧变体菌株埃氏巨型球菌保留了用作dfm的其他希望的特性，例如利用乳酸的能力。另外，诸位发明人出乎意料地发现，通过将菌株与一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物组合培养可以进一步增强本文公开的变体菌株埃氏巨型球菌的耐氧特征。
30.i.定义
31.术语“基因”是指表达特定蛋白质的核酸分子，包括编码序列之前(5'非编码序列)和之后(3'非编码序列)的调控序列。“天然基因”是指自然界中发现的具有其自身调控序列的基因。“内源基因”是指位于生物体基因组的天然位置中的天然基因。“外来”基因是指通常不在宿主生物体中被发现，但通过基因转移引入宿主生物体中的基因。外来基因可以包含插入非天然生物体中的天然基因或嵌合基因。“转基因”是通过转化程序引入基因组中的一种基因。
32.术语“编码序列”是指编码特异性氨基酸序列的核苷酸序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、内部或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性、或者翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、rna加工位点、效应子结合位点和茎环结构。
33.术语“可操作地连接”是指核酸序列在单个核酸分子上的缔合，使得一个核酸片段的功能受到另一个的影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达时，它与编码序列可操作地连接(即编码序列在启动子的转录控制下)。编码序列可以在有义或反义方向上可操作地连接到调控序列。
34.术语“调控序列”或“控制序列”在本文中可互换使用，并且是指能够增加或减少生物体内特定基因表达的核苷酸序列区段。调控序列的实例包括但不限于启动子、信号序列、操纵子等。如上所述，调控序列能以有义或反义方向可操作地连接到目的编码序列/基因。
[0035]“启动子”或“启动子序列”是指参与结合rna聚合酶以启动基因转录的调控序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。用于本发明的优选的启动子是里氏木霉(trichoderma reesei)cbh1，其是诱导型启动子。
[0036]“3'非编码序列”是指位于编码序列下游的dna序列，并包括编码能够影响mrna加工或基因表达(如转录终止)的调控信号的序列。
[0037]
如本文所用，“微生物(microorganism或microbe)”是指细菌、真菌、病毒、原生动物、和其他微生物或微观生物体。
[0038]
]如本文所用，术语“厌氧微生物”或“厌氧菌”是指对氧气敏感并且在氧气的存在下不会生长的微生物。厌氧微生物或厌氧菌是不需要氧气来生长的任何生物体。厌氧微生物包括专性厌氧菌和兼性厌氧菌两者。“专性厌氧菌”是在暴露于大气氧气水平时就会死亡的那些微生物。“兼性厌氧菌”是如果存在氧气则可以进行需氧呼吸，但是如果不存在氧气
e01、acd1096-c02、acd1096-c05、acd1096-h05、acd1096-b03、acd1141-c10、和acd1141-d10、acd1141、acd1141e、acd1141f、acd1265e以及acd1265f的所有鉴别特征的菌株。此外，每种单独的菌株(acd1265、acd1096-a01、acd1096-b01、acd1096-e01、acd1096-c02、acd1096-c05、acd1096-h05、acd1096-b03、acd1141-c10、和acd1141-d10、acd1141、acd1141e、acd1141f、acd1265e以及acd1265f)或这些菌株的任何组合也可以提供本文所述的益处中的一种或多种。还将清楚的是，添加其他微生物菌株、载剂、添加剂、酶、酵母等也将在动物中提供一种或多种益处或改善一项或多项指标，并且不会构成实质上不同的dfm。
[0045]
术语“分离的”意指处于在自然界中不存在的形式的或环境中的物质，并且不反映分离物被纯化的程度，而是表示与天然形式或天然环境的分离或分开。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)至少部分地从与其天然相关的天然存在的成分中的一种或多种或全部中去除的任何物质，包括但不限于任何细胞(如宿主细胞)、酶、工程化的酶、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的物质经人工改造的任何物质；或(4)通过增加物质相对于与其天然相关的其他组分的量而修饰的任何物质。
[0046]
术语“16s rrna”或“16s核糖体rna”意指构成原核生物核糖体小亚基的rrna。在细菌中，该序列可用于鉴定和表征运算分类单元。
[0047]
术语“百分比同一性”是如通过比较序列所确定的两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也意指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性程度，视情况而定，如通过此类序列串之间匹配的核苷酸或氨基酸的数目所确定的。可通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，这些方法包括但不限于以下文献中描述的那些：computational molecular biology[计算分子生物学](lesk,a.m.编辑)oxford university press,ny[牛津大学出版社，纽约州](1988)；biocomputing:informatics and genome projects[生物计算：信息学和基因组项目](smith,d.w.编辑),academic press,ny[学术出版社，纽约州](1993)；computer analysis of sequence data,part i[序列数据的计算机分析，第i部分](griffin,a.m.和griffin,h.g.编辑)humana press,nj[胡玛纳出版社，新泽西州](1994)；sequence analysis in molecular biology[分子生物学的序列分析](von heinje,g.编辑),academic press[学术出版社](1987)；sequence analysis primer[序列分析引物](gribskov,m.和devereux,j.编辑)stockton press,ny[斯托克顿出版社，纽约州](1991)。确定同一性和相似性的方法被编入公开可用的计算机程序中。同一性百分比可使用本领域已知的标准技术来确定。有用的算法包括blast算法(参见，altschul等人,j mol biol[分子生物学杂志]，215:403-410,1990；以及karlin和altschul，proc natl acad sci usa[美国国家科学院院刊]，90:5873-5787,1993)。blast程序使用若干搜索参数，其中大部分被设置为默认值。ncbi blast算法找到在生物相似性方面最相关的序列，但是不推荐用于少于20个残基的查询序列(altschul等人,nucleic acids res[核酸研究],25:3389-3402,1997；以及schaffer等人,nucleic acids res[核酸研究],29:2994-3005,2001)。用于核酸序列搜索的示例性默认blast参数包括：相邻字阈值＝11；e值截止值＝10；评分矩阵＝nuc.3.1(匹配＝1，错配＝-3)；空位开放＝5；以及空位延伸＝2。用于氨基酸序列搜索的示例性默认blast参数包括：字长＝3；e值截止值＝10；评分矩阵＝blosum62；空位开放＝11；以及空位延伸＝1。
[0048]
如本文所用，关于核苷酸或氨基酸残基位置，“对应于”(corresponding to或
corresponds to或correspond to)或“对应”是指(i)在核酸或蛋白质或肽中所列举位置处的核苷酸或氨基酸残基；或(ii)与在核酸或蛋白质或肽中所列举的残基类似、同源或等同的核酸或氨基酸残基。如本文所用，“对应区域”通常是指相关蛋白质或参考蛋白质中的类似位置。
[0049]
如本文所用，“预防(prevent、preventing、prevention)”及其语法变体是指部分或完全延迟或阻碍障碍或病症(如坏死性肠炎)和/或其伴随症状中的一种或多种的发生或复发，或阻止动物获得或重新获得障碍或病症或降低动物获得或重新获得障碍或病症或其伴随症状中的一种或多种的风险的方法。
[0050]
如本文所用，关于特定性状、特征、特性、生物过程、或现象的术语“减少”是指特定性状、特征、特性、生物过程、或现象的减少。性状、特征、特性、生物过程、或现象可以降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或大于100％。
[0051]
如本文所用，术语“反刍动物”是指具有四个腔的胃的哺乳动物。这些包括前胃(由瘤胃、网胃和瓣胃构成)，和称为皱胃的第四腔。反刍动物的非限制性实例包括属于山羊属、牛属、鹿属和绵羊属的哺乳动物。反刍动物包括但不限于鹿、羚羊、水牛、牛(包括肉牛和奶牛)、绵羊、骆驼和山羊。
[0052]
如本文所用，“瘤胃酸中毒”或“酸中毒”或“乳酸酸中毒”是指由过度食用容易发酵的碳水化合物引起的反刍动物的代谢疾病。当瘤胃ph长时间低于5.6时，通常会诊断为酸中毒。酸中毒可发生为急性或亚急性。“急性酸中毒”是由快速淀粉发酵引起的，导致瘤胃ph长时间急剧下降。症状包括但不限于饲料摄入量减少、反刍减少、心率增加、呼吸率增加、腹泻、普遍嗜睡和死亡。“亚急性酸中毒”是指通过吸收和缓冲引起的产酸和除酸之间的暂时不平衡，其表现为多次出现瘤胃ph降低至低于5.6，随后ph又恢复至高于5.6。长期亚急性酸中毒的症状包括但不限于饲料摄入量减少、饲料效率降低、体重减轻或增重减少、胴体质量降低、跛行、脱水、肝脓肿、发热、粪便中残留谷物和腹泻。
[0053]
如本文所用，“施用(administer或administering)”意指如通过饲喂或通过灌胃将一种或多种微生物菌株、外源性饲料酶和/或菌株以及外源性饲料酶引入动物的行为。
[0054]
如本文所用，“有效量”意指改善动物的一项或多项指标的dfm和/或外源性酶的数量。对动物的一项或多项指标(如但不限于增加的体重增重、降低的饲料转化率(fcr)、和/或降低的死亡率中的任何一项)的改善可以如本文所述的或通过本领域已知的其他方法测量。可以通过提供自由采食的含有dfm和外源性酶的饲料向动物施用有效量。dfm和外源性酶也能以一剂或多剂施用。
[0055]
如本文所用，术语“饲料”在本文中与“喂养料”同义使用。饲料广义上是指用于滋养动物并用于维持动物(包括新生或年幼和发育中的动物)的正常或加速生长的液体或固体材料。该术语包括适合于动物(例如像反刍动物，如牛)摄入的化合物、制剂、混合物、或组合物。在一些实施例中，饲料或饲料组合物包含基础食物组合物和一种或多种饲料添加剂或饲料添加剂组合物。如本文所用，术语“饲料添加剂”是指出于用另外的组分强化基础饲料以促进饲料摄入、治疗或预防疾病、或改变代谢的目的而包括的组分。饲料添加剂包括预混物。
[0056]
如本文所用，术语“抗氧化剂”是指当存在于含有可氧化的底物分子(例如可氧化
的生物学分子)的混合物或结构时，显著延迟或预防可氧化的底物分子氧化的物质。抗氧化剂可以通过清除生物学上重要的活性自由基或其他活性氧物种，或通过预防它们的形成，或通过将自由基或其他活性氧物种催化转化为活性较低的物种来起作用。
[0057]
如本文所提及的，“预混物”可以是由微量成分组成的组合物，这些微量成分如但不限于维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物、和其他必需成分中的一种或多种。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。
[0058]
如本文所用，“改善动物的一项或多项指标”是指对与动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)的生长和/或健康相关的量度的改善，通过以下参数中的一个或多个测量：体重/胴体增重、饲料摄入量、饲料转化(包括饲料:增重和增重:饲料两者)、饲料转化率(fcr)、降低的医疗成本、降低的死亡率、减少的从饲草/草/青贮饲料饮食过渡为高精料饮食的时间、和/或降低的瘤胃酸中毒的发生率。如本文所用，“指标的改善”或“改善的指标”是列出的至少一个参数的改善。
[0059]
如本文所用，“高精料饮食”是与饲草/草/青贮饲料饮食相比含有高水平淀粉的饮食。
[0060]
如本文所用，术语“饲料转化率”是指饲喂给动物以使动物体重增加规定量的饲料量。改善的饲料转化率意指较低的饲料转化率。“较低的饲料转化率”或“改善的饲料转化率”或“降低的饲料转化率”意指在饲料中使用饲料添加剂组合物导致饲喂给动物以使动物体重增加指定量所需的饲料量与在饲料不包含所述饲料添加剂组合物时使动物体重增加相同量所需的饲料量相比较低。
[0061]
某些范围在本文中以数值前加术语“约”呈现。术语“约”在本文用于为其后面的准确数字以及接近或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在判定数字是否接近或近似于特定叙述的数字时，接近或近似的未叙述的数字可以是在呈现其的上下文中提供特定叙述的数字的实质性等效物的数字。例如，关于数值，术语“约”是指数值的-10％至+10％的范围，除非术语在上下文中另有特别定义。
[0062]
除非上下文另有明确指示，否则如本文所用，单数术语“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物。
[0063]
如本文所用，“任选的”或“任选地”意指随后的情况或对范围的限制发生或不发生，并且意指该描述包括其中该情况或对范围的限制发生的情形以及其中其不发生的情形。例如，任选地含有另外的外源性酶的组合物意指酶可以存在或不存在于组合物中。
[0064]
进一步注意的是，权利要求书可以经撰写以排除任何任选的要素。因此，该陈述旨在作为使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。
[0065]
仍需注意的是，如本文所用的术语“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”是指组合物，其中该术语之后的一种或多种组分在存在其他已知的一种或多种组分的情况下为总组合物的小于30％重量的总量，并且不会影响或干扰一种或多种组分的作用或活性。
[0066]
进一步注意到，如本文所用的术语“包含(comprising)”意指包括但不限于在术语“包含”之后的一种或多种组分。在术语“包含”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，但是包含该一种或多种组分的组合物可以进一步包括其他非强制性或任选的一种或多
种组分。
[0067]
还要注意的是，如本文所用的术语“由
……
组成(consisting of)”意指包括且限于术语“由
……
组成”之后的一种或多种组分。因此，术语“由
……
组成”之后的一种或多种组分是必需的或强制性的，且组合物中不存在一种或多种其他组分。
[0068]
在本说明书通篇中给出的每一最大数值限度旨在包括每一较低数值限度，如同此类较低数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一最小数值限度将包括每一较高数值限度，如同此类较高数值限度在本文中明确写出一样。在本说明书通篇中给出的每一数值范围将包括落入此类较宽数值范围内的每一较窄数值范围，如同此类较窄数值范围在本文中全部明确写出一样。
[0069]
除非本文另外定义，否则本文所用的所有技术与科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0070]
术语的其他定义可在本说明书通篇出现。
[0071]
ii.组合物
[0072]
a.菌株
[0073]
直接饲喂微生物(dfm)是指在动物(例如反刍动物)处于应激时期(疾病、口粮变化、环境或生产挑战)时或作为日常营养方案的一部分以预防疾病(例如酸中毒)和促进消化过程中的营养素利用而向动物饲喂的有益微生物。“益生菌”是这类饲料添加剂的另一种说法。在对照研究中已证明益生菌或dfm可以改善动物的性能。在一些实施例中，dfm包括直接饲喂的细菌和/或基于酵母的产品两者，并且在特定实施例中，包括有活力的微生物。术语“有活力的微生物”意指具有代谢活性或能够分化和/或繁殖的微生物。
[0074]
含有dfm的组合物(例如饲料添加剂组合物、预混物组合物、试剂盒、饲料、喂养料或生物学纯的组合物)可以包括含有耐氧埃氏巨型球菌的一种或多种菌株(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种菌株中的任一种)的组合物。埃氏巨型球菌(即m.elsdenii)是厌氧非运动性革兰氏阴性双球菌，其利用乳酸作为优选的碳源，并且常见于反刍动物的消化道中。埃氏巨型球菌是适应饲喂高谷物饮食的牛瘤胃中主要利用乳酸的生物体。当牛从高饲草转换为高精料饮食时，埃氏巨型球菌的数量通常不足以预防称为乳酸酸中毒的病症(参见，例如，美国专利申请公开号2009/0246177，通过引用并入本文)。
[0075]
本文提供的用于在所述组合物、方法和试剂盒中使用的耐氧埃氏巨型球菌菌株包括埃氏巨型球菌acd1265、埃氏巨型球菌acd1096-a01、埃氏巨型球菌acd1096-b01、埃氏巨型球菌acd1096-e01、埃氏巨型球菌acd1096-c02、埃氏巨型球菌acd1096-c05、埃氏巨型球菌acd1096-h05、埃氏巨型球菌acd1096-b03、埃氏巨型球菌acd1141-c10、埃氏巨型球菌acd1141-d10、埃氏巨型球菌acd1141、埃氏巨型球菌acd1141e、埃氏巨型球菌acd1141f、埃氏巨型球菌acd1265e和埃氏巨型球菌acd1265f，这些菌株在本文中也分别称为acd1265、acd1096-a01、acd1096-b01、acd1096-e01、acd1096-c02、acd1096-c05、acd1096-h05、acd1096-b03、acd1141-c10、和acd1141-d10、acd1141、acd1141e、acd1141f、acd1265e、和acd1265f。
[0076]
埃氏巨型球菌acd1265、埃氏巨型球菌acd1141、埃氏巨型球菌acd1141e、埃氏巨型球菌acd1141f、埃氏巨型球菌acd1265e和埃氏巨型球菌acd1265f于2019年12月18日保藏于韦斯特迪克真菌生物多样性研究所(wfdi)，uppsalalaan 8，3584ct，荷兰乌得勒支
bordetii)、inexpectata念珠菌(monilia inexpectata)、mycocandida inexpectata、inexpectata假念珠菌(pseudomonilia inexpectata)、树突状毛孢子菌(trichosporon dendriticum)、枝状假丝酵母(candida dendritica)、非洲卡斯太拉尼氏真菌属(castellania africana)、巴尔卡尼卡卡斯太拉尼氏真菌属(castellania balcanica)、克鲁索斯念珠菌(monilia krusoides)、味噌假生膜菌(pseudomycoderma miso)、卡氏假丝酵母(candida castellanii)、塔玛丽恩迪假丝酵母(candida tamarindi)、罗望子原假丝酵母(procandida tamarindii)、东方伊萨酵母(issatchenkia orientalis)、叶状假丝酵母(candida lobate)、嗜热内芽生菌(endoblastomyces thermophilus)、requinyii假丝酵母(candida requinyii)、苏斯伊假丝酵母(candida soosii)、东方毕赤酵母(pichia orientalis)、酸性嗜热假丝酵母(candida acidothermophilum)、芸苔假丝酵母(candida brassicae)、醇嗜热假丝酵母(candida ethanothermophilum)、梅林假丝酵母(candida melinii)、hinoensis假丝酵母(candida hinoensis)或solicola假丝酵母(candida solicola)。
[0081]
在一些实施例中，一种或多种酵母菌株以约107cfu/g至约10
10
cfu/g(例如约107cfu/g、108cfu/g、109cfu/g或10
10
cfu/g中的任一种)的浓度存在于组合物中。
[0082]
在其他实施例中，组合物中埃氏巨型球菌(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种)微生物与酵母微生物的比率可以包括1:1至1:10，例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10中的任一种，如通过cfu确定的。
[0083]
在一些实施例中，本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种在以下中可以含有至少一个突变：编码转录调节因子perr的基因(例如由seq id no:4编码的perr基因)；或紧邻编码转录调节因子perr的基因的上游。如本文所用，术语“突变”或“取代”可互换使用以表示不是天然存在于相应的野生型核苷酸或氨基酸序列中的核苷酸或氨基酸序列的变化。perr是属于fur调节因子家族的金属调节因子，其可以作为h2o2的特定传感器起作用。特别地，当与dna结合时，perr抑制编码过氧化物防御酶(kata、ahpc)、dna保护蛋白(mrga)、金属稳态蛋白(hemaxcdbl、fur、zosa)及其自身合成(perr)的基因(duarte和latour,future med.chem[未来医学化学],(2013)5(11),1177-1179)。还显示丙酮丁醇梭菌(c.acetobutylicum)中过氧化物阻遏物(perr)-同源蛋白质的缺失导致耐氧性延长、有氧条件下生长受限、对h2o2的抗性更高、以及氧气的快速消耗(hillmann等人,2008,molecular microbiology[分子微生物学]68:848-60)。
[0084]
在任一所公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的perr基因可以具有一个或多个突变(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个中的任一者)，该一个或多个突变预防perr多肽(例如seq id no:6的多肽)的表达或使perr多肽相对于未突变的(即野生型)perr多肽的功能性无功能或功能性降低(例如约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的功能性降低，包括这些值之间的所有百分比)。突变可以位于基因本身内(例如，在内含子或外显子内)或转录调控区域中基因的上游(例如从基因起始密码子上游约-1至约-200个核苷酸)。对应于seq id no:4中的核酸序列，任一所公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的perr基因可以在以下位置中的一个或多个处具有突变：386(例如g386t)、155(例如c155t)、253(例如c253t)、-99(其中
“‑”
表示perr基因的起始密码子上游的核苷酸；例如t-99c)、和/或-125(例如g-125a)。在另外的实施例中，突变可以是
将核苷酸插入至基因和/或转录调控序列中，从而导致移码突变(例如无义或错义突变)。在一些实施例中，核苷酸插入可以位于以下核苷酸位置处：例如30(例如在位置30处插入的a)、277(例如在位置277处插入的a)、和/或64(例如在位置64处插入的g)，其中这些核苷酸位置对应于seq id no:4。
[0085]
b.外源性酶
[0086]
补充性酶可用作动物饲料特别是家禽和猪饲料的添加剂，作为提高营养素利用率和改善性能特征的手段。
[0087]
在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌菌株(如含有本文公开的任一耐氧埃氏巨型球菌菌株的dfm)和一种或多种外源性饲料酶。在另一实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含以下、由以下组成、或基本上由以下组成：一种或多种本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株、一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物、和一种或多种外源性饲料酶。在一个实施例中，外源性饲料酶包括但不限于木聚糖酶、淀粉酶、植酸酶、β-葡聚糖酶和蛋白酶。在再一实施例中，该组合物包含饲料添加剂。
[0088]
1.木聚糖酶
[0089]
木聚糖酶是将线性多糖β-1,4-木聚糖降解为木糖从而分解半纤维素(植物细胞壁的主要组分之一)的一类酶的名称。木聚糖酶，例如内切-β-木聚糖酶(ec 3.2.1.8)水解木聚糖主链。在一个实施例中，本文提供了组合物，其包含本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株组合物中的任一种和一种或多种木聚糖酶。在另外的实施例中，组合物进一步包含一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物。
[0090]
在一个实施例中，木聚糖酶可以是任何可商购获得的木聚糖酶。合适地，木聚糖酶可以是内切-1,4-p-d-木聚糖酶(分类为ec 3.2.1.8)或1,4β-木糖苷酶(ec 3.2.1.37)。在一个实施例中，本公开涉及与内切木聚糖酶(例如，内切-1,4-p-d-木聚糖酶)和另一种酶组合的dfm。本文提到的所有e.c.酶分类涉及在国际生物化学与分子生物学联合会(international union of biochemistry and molecular biology)命名委员会的enzyme nomenclature-recommendations[酶命名法-推荐](1992)-isbn 0-12-226164-3中提供的分类，将其并入本文。
[0091]
在另一实施例中，木聚糖酶可以是来自芽孢杆菌属、木霉属(trichodermna)、嗜热真菌属(therinomyces)、曲霉属和青霉属(penicillium)的木聚糖酶。在仍另一实施例中，木聚糖酶可以是axtra或avizyme中的木聚糖酶，两者都是可从丹尼斯科公司(danisco a/s)商购获得的产品。在一个实施例中，木聚糖酶可以是两种或更多种木聚糖酶的混合物。在仍另一实施例中，木聚糖酶是内切-1,4-β-木聚糖酶或1,4-β-木糖苷酶。在又另一实施例中，木聚糖酶来自选自由以下组成的组的生物体：芽孢杆菌属、木霉属、嗜热真菌属、曲霉属、青霉属、和腐质霉属(humicola)。在又另一实施例中，木聚糖酶可以是表10中引用的一种或多种木聚糖酶或一种或多种商业产品。
[0092]
表10：代表性的商业木聚糖酶
50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大于750的木聚糖酶单位/g组合物。
[0095]
在一个实施例中，组合物包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000和大于8000的木聚糖酶单位/g组合物。
[0096]
应当理解，一个木聚糖酶单位(xu)是在ph 5.3和50℃，每分钟从燕麦木聚糖(oat-spelt-xylan)底物释放0.5μmol的还原糖等价物(为木糖，通过二硝基水杨酸(dns)测定-还原糖方法)的酶的量(bailey等人,journal of biotechnology[生物技术杂志],第23卷,(3),1992年5月,257-270)。
[0097]
2.淀粉酶
[0098]
淀粉酶是一类能够将淀粉水解为较短链的寡糖(例如麦芽糖)的酶。然后与从原始的淀粉分子转移相比，葡萄糖部分可更容易地从麦芽糖转移到单甘油酯或糖基单甘油酯。术语淀粉酶包括α-淀粉酶(e.g.3.2.1.1)、g4形成淀粉酶(e.g.3.2.1.60)、β-淀粉酶(e.g.3.2.1.2)和γ-淀粉酶(e.c.3.2.1.3)。淀粉酶可以是细菌或真菌来源的，或是化学修饰的或蛋白质工程化的突变体。在一个实施例中，本文提供了组合物，其包含本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株组合物中的任一种和一种或多种淀粉酶。在另外的实施例中，组合物进一步包含一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物。
[0099]
在一个实施例中，淀粉酶可以是两种或更多种淀粉酶的混合物。在另一实施例中，淀粉酶可以是例如来自地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的α-淀粉酶的淀粉酶和例如来自解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)的α-淀粉酶的淀粉酶。在一个实施例中，α-淀粉酶可以是axtra或avizyme中的α-淀粉酶，两者都是可从丹尼斯科公司商购获得的产品。在另一实施例中，淀粉酶可以是抗胃蛋白酶α-淀粉酶，例如抗胃蛋白酶木霉属(例如里氏木霉)α淀粉酶。在英国申请号101 1513.7(其通过引用并入本文)和pct/ib2011/053018(其通过引用并入本文)中传授了一种合适的抗胃蛋白酶α-淀粉酶。
[0100]
在一个实施例中，用于在本发明中使用的淀粉酶可以是表11引用的一种或多种商业产品中的一种或多种淀粉酶。
[0101]
表11：代表性的商业淀粉酶
[0102][0103]
应当理解，一个淀粉酶单位(au)是在ph 6.5和37℃下，每分钟从非水溶性交联淀粉聚合物底物释放1mmol的糖苷键的酶的量(这在本文中可以称为对确定1au的测定)。
[0104]
在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含耐氧埃氏巨型球菌菌株(如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种)和淀粉酶。在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含多菌株dfm、木聚糖酶和淀粉酶。在一个实施例中，组合物包含10-50、50-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、400-450、450-500、500-550、550-600、600-650、650-700、700-750和大于750的淀粉酶单位/g组合物。
[0105]
在一个实施例中，组合物包含500-1000、1000-1500、1500-2000、2000-2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、5000-5500、5500-6000、6000-6500、6500-7000、7000-7500、7500-8000、8000-8500、8500-9000、9000-9500、9500-10000、10000-11000、11000-12000、12000-13000、13000-14000、14000-15000和大于15000的淀粉酶单位/g组合物。
[0106]
3.蛋白酶
[0107]
如本文所用，术语蛋白酶(protease)与肽酶或蛋白酶(proteinase)同义。蛋白酶可以是枯草杆菌蛋白酶(e.g.3.4.21.62)或芽孢杆菌溶素(e.g.3.4.24.28)或碱性丝氨酸蛋白酶(e.g.3.4.21.x)或角蛋白酶(e.g.3.4.x.x)。在一个实施例中，蛋白酶是枯草杆菌蛋白酶。适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。经化学修饰或蛋白质工程化的突变体也是合适的。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，例如碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。在一个实施例中，本文提供了组合物，其包含本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株组合物中的任一种和一种或多种蛋白酶。在另外的实施例中，组合物进一步包含一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物。
[0108]
碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是衍生自芽孢杆菌属物种的那些，例
11000、11000-12000、12000-13000、13000-14000、14000-15000和大于15000的蛋白酶单位/g组合物。
[0116]
4.植酸酶
[0117]
在一个实施例中，本文提供了组合物，其包含本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株组合物中的任一种和一种或多种植酸酶。在另外的实施例中，组合物进一步包含一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物。用于在本发明中使用的植酸酶可以分类为6-植酸酶(分类为e.c.3.1.3.26)或3-植酸酶(分类为e.c.3.1.3.8)。在一个实施例中，用于在本发明中使用的植酸酶可以是下表13中的一种或多种商业产品中的一种或多种植酸酶：
[0118]
表13：代表性的商业植酸酶
[0119][0120]
在一个实施例中，植酸酶是柠檬酸杆菌属(citrobacter)植酸酶，该柠檬酸杆菌属植酸酶衍生自例如弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)，优选地，例如如在wo 2006/038062(通过引用并入本文)和wo 2006/038128(通过引用并入本文)中公开的弗氏柠檬酸杆菌ncimb 41247及其变体，如在wo 2004/085638中公开的布氏柠檬酸杆菌(citrobacter braakii)yh-15，如在wo 2006/037328(通过引用并入本文)公开的布氏柠檬酸杆菌atcc 51113，以及例如如在wo 2007/112739(通过引用并入本文)和wo 2011/117396(通过引用并入本文)中公开的其变体；无丙二酸柠檬酸杆菌(citrobacter amalonaticus)，优选地，如在wo 2006037327(通过引用并入本文)中公开的无丙二酸柠檬酸杆菌atcc 25405或丙二酸盐阴性柠檬酸杆菌atcc 25407；吉伦氏柠檬酸杆菌(citrobacter gillenii)，优选地，如在wo 2006037327(通过引用并入本文)中公开的吉伦氏柠檬酸杆菌dsm 13694；或中间柠檬酸
杆菌(citrobacter intermedius)、柯氏柠檬酸杆菌(citrobacter koseri)、啮齿类柠檬酸杆菌(citrobacter murliniae)、鼠类柠檬酸杆菌(citrobacter rodentium)、塞氏柠檬酸杆菌(citrobacter sedlakii)、沃克曼氏柠檬酸杆菌(citrobacter werkmanii)、杨氏柠檬酸杆菌(citrobacter youngae)、柠檬酸杆菌物种多肽或其变体。
[0121]
在一些实施例中，植酸酶是以丹尼斯科公司phyzyme xp
tm
的名称销售的大肠杆菌植酸酶。替代性地，植酸酶可以是布丘氏菌属(buttiauxella)植酸酶，例如乡间布丘氏菌(buttiauxella agrestis)植酸酶，例如，在wo 2006/043178、wo 2008/097619、wo 2009/129489、wo 2008/092901、pct/us 2009/41011或pct/ib 2010/051804中教导的植酸酶，所有这些文献通过引用并入本文。
[0122]
在一个实施例中，植酸酶可以是来自哈夫尼亚菌属(hafnia)(例如来自蜂房哈夫尼亚菌(hafnia alvei))的植酸酶，如us 2008263688中教导的一种或多种植酸酶，将该文献通过引用并入本文。在一个实施例中，植酸酶可以是来自曲霉属(例如来自米曲霉(apergillus orzyae))的植酸酶。在一个实施例中，植酸酶可以是来自青霉属(例如来自绳状青霉(penicillium funiculosum))的植酸酶。
[0123]
优选地，植酸酶按以下范围存在于喂养料中：约200ftu/kg至约1000ftu/kg饲料、更优选地约300ftu/kg饲料至约750ftu/kg饲料、更优选地约400ftu/kg饲料至约500ftu/kg饲料。在一个实施例中，植酸酶以超过约200ftu/kg饲料、合适地超过约300ftu/kg饲料、合适地超过约400ftu/kg饲料的量存在于喂养料中。在一个实施例中，植酸酶以少于约1000ftu/kg饲料、合适地少于约750ftu/kg饲料的量存在于喂养料中。优选地，植酸酶按以下范围的量存在于饲料添加剂组合物中：约40ftu/g至约40,000ftu/g组合物、更优选地约80ftu/g组合物至约20,000ftu/g组合物、以及甚至更优选地约100ftu/g组合物至约10,000ftu/g组合物、以及甚至更优选地约200ftu/g组合物至约10,000ftu/g组合物。在一个实施例中，植酸酶以超过约40ftu/g组合物、合适地超过约60ftu/g组合物、合适地超过约100ftu/g组合物、合适地超过约150ftu/g组合物、合适地超过约200ftu/g组合物的量存在于饲料添加剂组合物中。在一个实施例中，植酸酶以少于约40,000ftu/g组合物、合适地少于约20,000ftu/g组合物、合适地少于约15,000ftu/g组合物、合适地少于约10,000ftu/g组合物的量存在于饲料添加剂组合物中。
[0124]
应当理解，如本文所用，1ftu(植酸酶单位)定义为在iso 2009植酸酶测定法(用于确定植酸酶活性的标准测定法)中定义的反应条件下，在一分钟内从底物释放1μmol无机正磷酸盐所需的酶量，并且1ftu可在国际标准iso/dis 30024:1-17,2009中找到。在一个实施例中，使用上述e.c.分类法对酶进行分类，并且e.c.分类法指定当在本文所传授的确定1ftu的测定中测试时具有该活性的酶。
[0125]
在一个实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含耐氧埃氏巨型球菌菌株(如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)和蛋白酶。在另一实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含耐氧埃氏巨型球菌菌株(如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)以及木聚糖酶和蛋白酶。在仍另一实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含耐氧埃氏巨型球菌菌株(如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)以及淀粉酶和蛋白酶。在仍另一实施例中，本公开涉及一种组合
物，其包含耐氧埃氏巨型球菌菌株(如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)以及蛋白酶和植酸酶。在仍另一实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含耐氧埃氏巨型球菌菌株(如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)以及木聚糖酶和淀粉酶。在仍另一实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含耐氧埃氏巨型球菌菌株(如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)以及木聚糖酶和植酸酶。在仍另一实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含耐氧埃氏巨型球菌菌株(如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)以及淀粉酶和植酸酶。在又另一实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含耐氧埃氏巨型球菌菌株(如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)以及木聚糖酶、淀粉酶和蛋白酶。在仍另一实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含耐氧埃氏巨型球菌菌株(如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)以及蛋白酶、木聚糖酶和植酸酶。在仍另一实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含耐氧埃氏巨型球菌菌株(如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)以及淀粉酶、木聚糖酶和植酸酶。在仍另一实施例中，本公开涉及一种组合物，其包含耐氧埃氏巨型球菌菌株(如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的任一种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)以及淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶和植酸酶。
[0126]
c.dfm配制品
[0127]
在一个实施例中，可以将耐氧埃氏巨型球菌dfm(或本文公开的含有dfm的组合物)中的任一种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物，以及进一步任选地一种或多种外源性酶配制成液体、干粉或颗粒。在一个实施例中，可以将耐氧埃氏巨型球菌dfm和外源性酶配制成单一混合物。在另一实施例中，可以将耐氧埃氏巨型球菌dfm和外源性酶配制成单独的混合物。在仍另一实施例中，耐氧埃氏巨型球菌dfm和外源性酶的单独的混合物可以同时或不同时施用。在仍另一实施例中，耐氧埃氏巨型球菌dfm和外源性酶的单独的混合物可以同时或依序施用。在又另一实施例中，可以施用包含耐氧埃氏巨型球菌dfm的第一混合物，随后施用包含外源性酶的第二混合物。在仍另一实施例中，可以施用包含外源性酶的第一混合物，随后施用包含耐氧埃氏巨型球菌dfm的第二混合物。
[0128]
干粉或颗粒可通过本领域的技术人员已知的方式，例如在顶喷式流化床包覆器中、在wurster型底喷式流化床中或者通过转鼓制粒(例如高剪切制粒)、挤出、锅式涂层、油分散体或在微成分混合器中进行制备。在其他实施例中，颗粒可以通过施用水或施用浸剂进行制备。
[0129]
在另一实施例中，可以对耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)和/或一种或多种酶进行涂覆，例如封装。合适地，可以将耐氧埃氏巨型球菌dfm和酶配制在相同的涂层内或封装在相同的胶囊内。替代性地，可将一种或多种酶配制在相同的涂层内或封装在相同的胶囊内，同时可将dfm配制在与这些酶分离的涂层中。
[0130]
在一些实施例中，可以在没有任何涂层的情况下提供耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)。在此类情况下，可以将dfm简单地与一种或多种酶混合。在其他的实施例中，可以对dfm或酶进行涂覆，例如封装，例如可以对所有酶中的
一种或多种进行涂覆，例如封装。可以将这些酶封装为(即包含一种或多种、两种或多种、三种或更多种或全部)酶的混合物，或者可以将它们单独封装(例如作为单一的酶)。在一个优选的实施例中，可以将所有酶涂覆(例如封装)在一起。在一个实施例中，涂层保护酶免受热影响并且可视为防热剂。
[0131]
在另一实施例中，可以将耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)和/或外源性饲料酶与饲料混合或在饮用水中施用。在一个实施例中，用于纳入到水中的剂量范围为约1
×
103cfu/动物/天至约1
×
10
10
cfu/动物/天，例如，约1
×
107cfu/动物/天。
[0132]
另外，可以将耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)进一步与一种或多种另外的dfm结合配制。如本文所述的另外的dfm可包含来自以下属中的一种或多种的微生物：乳杆菌属、乳球菌属(lactococcus)、链球菌属(streptococcus)、芽孢杆菌属、片球菌属(pediococcus)、肠球菌属(enterococcus)、明串珠菌属(leuconostoc)、肉食杆菌属(carnobacterium)、丙酸杆菌属(propionibacterium)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、梭菌属(clostridium)和巨球菌属(megasphaera)以及它们的组合。
[0133]
在一个实施例中，另外的dfm包含选自以下芽孢杆菌属物种的一种或多种细菌菌株：枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)、地衣芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)、短小芽孢杆菌(bacillus pumilis)和解淀粉芽孢杆菌。
[0134]
如本文所用，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌属”内的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(b.lentus)、短芽孢杆菌(b.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(b.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(b.clausii)、耐盐芽孢杆菌(b.halodurans)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、凝结芽孢杆菌(b.coagulans)、环状芽孢杆菌(b.circulans)、吉氏芽孢杆菌(b.gibsonii)、短小芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)。应认识到，芽孢杆菌属不断进行分类学重组。因此，该属旨在包括已被重新分类的物种，包括但不限于例如嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)(现在被命名为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(geobacillus stearothermophilus)”)或多粘芽孢杆菌(bacillus polymyxa)(现在被命名为“多粘类芽孢杆菌(paenibacillus polymyxa)”)的生物体。在压力环境条件下产生抗性内生孢子被认为是芽孢杆菌属的决定性特征，尽管该特性也适用于最近命名的脂环酸芽孢杆菌属(alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(aneurinibacillus)、厌氧气芽孢杆菌属(anoxybacillus)、短芽孢杆菌属(brevibacillus)、线芽孢杆菌属(filobacillus)、薄壁芽孢杆菌属(gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(halobacillus)、类芽孢杆菌属(paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(virgibacillus)。
[0135]
在另一方面，耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)可以进一步与以下乳球菌属物种组合：乳脂乳球菌(lactococcus cremoris)和乳酸
乳球菌(lactococcus lactis)以及它们的组合。
[0136]
耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)可以进一步与以下乳杆菌属物种组合：布氏乳杆菌(lactobacillus buchneri)、嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、开菲尔乳杆菌(lactobacillus kefiri)、双叉乳杆菌(lactobacillus bifidus)、短乳杆菌(lactobacillus brevis)、瑞士乳杆菌(lactobacillus helveticus)、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)、唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius)、弯曲乳杆菌(lactobacillus curvatus)、保加利亚乳杆菌(lactobacillus bulgaricus)、清酒乳杆菌(lactobacillus sakei)、罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)、发酵乳杆菌(lactobacillus fermentum)、香肠乳杆菌(lactobacillus farciminis)、乳酸乳杆菌(lactobacillus lactis)、德氏乳杆菌(lactobacillus delbreuckii)、植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)、类植物乳杆菌(lactobacillus paraplantarum)、香肠乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、卷曲乳杆菌(lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(lactobacillus gasseri)、约氏乳杆菌(lactobacillus johnsonii)和詹氏乳杆菌(lactobacillus jensenii)、以及它们的任何组合。
[0137]
本文公开的许多dfm菌株发现于乳杆菌属中。截至2020年3月，乳杆菌属包括261个物种，这些物种在表型、生态学和基因型方面极为多样化。鉴于全基因组测序和比较基因组学的最新进展，乳杆菌属最新被分为25个独立的属，属于先前指定的乳杆菌属物种的菌株被转移到新的物种和/或属中(参见zheng等人,2020,int.j.syst.evol.microbiol.[国际系统与进化微生物学杂志],70:2782-2858；pot等人,trends in food science&technology[食品科学与技术趋势]94(2019)105-113；和koutsoumanis等人,2020,efsa journal[efsa杂志],18(7):6174，将每篇文献的公开通过引用并入本文)。出于本公开的目的，将继续采用先前的乳杆菌属物种分类。然而，在一些实施例中，敏捷乳杆菌(lactobacillus agilis)也被分类为敏捷乳酸杆菌(ligilactobacillus agilis)。在其他实施例中，唾液乳杆菌也被分类为唾液乳酸杆菌(ligilactobacillus salivarius)。在另外的实施例中，罗伊氏乳杆菌也被分类为罗伊氏粘液乳杆菌(limosilactobacillus reuteri)。
[0138]
在又另一方面，耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)可以进一步与以下双歧杆菌属物种组合：乳酸双歧杆菌(bifidobacterium lactis)、两歧双歧杆菌(bifidobacterium bifidium)、长双歧杆菌(bifidobacterium longum)、动物双歧杆菌(bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(bifidobacterium infantis)、链状双歧杆菌(bifidobacterium catenulatum)、假小链双歧杆菌(bifidobacterium pseudocatenulatum)、青春双歧杆菌(bifidobacterium adolescentis)和角双歧杆菌(bifidobacterium angulatum)、以及它们的任何组合。
[0139]
替代性地，耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)可以与wo 2012110778中公开的产品中的一种或多种或这些产品中包含的微生物组合，并且总结如下：枯草芽孢杆菌(重新分类为贝莱斯芽孢杆菌)菌株2084登录号nrrlb-50013、
枯草芽孢杆菌(重新分类为贝莱斯芽孢杆菌)菌株lssao1登录号nrrl b-50104、和枯草芽孢杆菌(重新分类为贝莱斯芽孢杆菌)菌株15a-p4 atcc登录号pta-6507(来自enviva(以前称为)；枯草芽孢杆菌菌株c3102(来自)；枯草芽孢杆菌菌株pb6(来自)；短小芽孢杆菌(8g-134)；肠球菌ncimb 10415(sf68)(来自)；枯草芽孢杆菌菌株c3102(来自和)；地衣芽孢杆菌(来自)；肠球菌和片球菌(来自poultry)；乳杆菌、双歧杆菌和/或肠球菌(来自)；枯草芽孢杆菌菌株qst 713(来自)；解淀粉芽孢杆菌cect-5940(来自和plus)；屎肠球菌(enterococcus faecium)sf68(来自)；枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌(来自)；乳酸菌7屎肠球菌(来自)；芽孢杆菌菌株(来自)；酿酒酵母(来自yea-)；肠球菌(来自biomin)；乳酸片球菌、肠球菌、动物双歧杆菌动物亚种、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌唾液亚种(来自biomin)；香肠乳杆菌(来自)；肠球菌(来自oralin)；肠球菌(2个菌株)、乳酸乳球菌dsm 1103(来自probios-pioneer)；鼠李糖乳杆菌和香肠乳杆菌(来自)；枯草芽孢杆菌(来自)；肠球菌(来自)；酿酒酵母(来自levucell sb)；酿酒酵母(来自levucell sc 0&me)；乳酸片球菌(来自bactocell)；酿酒酵母(来自(以前为))；酿酒酵母ncyc sc47(来自sc47)；丁酸梭菌(clostridium butyricum)(来自miya-)；肠球菌(来自fecinor和fecinor)；酿酒酵母ncyc r-625(来自)；酿酒酵母(来自)；肠球菌和鼠李糖乳杆菌(来自)；枯草芽孢杆菌和米曲霉(来自pepsoygen-)；蜡样芽孢杆菌(来自)；蜡样芽孢杆菌东洋变体(bacillus cereus var.toyoi)ncimb40112/cncm i-1012(来自)，或其他dfm，例如地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(来自yc)、枯草芽孢杆菌(来自)、和来自的埃氏巨型球菌ncimb41125。
[0140]
耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)可以与可商购自丹尼斯科公司的pro组合。enviva是芽孢杆菌菌株2084登录号nrrl b-50013、芽孢杆菌菌株lssao1登录号nrrl b-50104和芽孢杆菌菌株15a-p4 atcc登录号pta-6507的组合(如在us 7,754,469 b中所传授的-通过引用并入本文)。
[0141]
优选地，本文所述的另外的dfm包含通常被认为是安全(gras)并且优选地经gras批准的微生物。
[0142]
本领域普通技术人员将很容易意识到来自本文所述属内的特定微生物物种和/或菌株，其用于食品和/或农业工业中并且其通常被认为适合于动物消耗。
[0143]
d.饲料添加剂组合物
[0144]
在一个实施例中，本文提供了饲料添加剂组合物，其包含一种或多种耐氧埃氏巨
型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)和任选地一种或多种外源性饲料酶。在一个实施例中，能以任何合适的方式配制饲料添加剂组合物，以确保配制品包含有活力的dfm和任选地活性酶。
[0145]
在一个实施例中，饲料添加剂组合物能以固体或液体制剂或其可替代物的形式使用。固体制剂的实例包括粉剂、糊剂、大丸粒、胶囊剂、胚珠剂、药丸、丸粒、片剂、尘剂和颗粒，其可以是可润湿的、喷雾干燥的或冷冻干燥的。液体制剂的实例包括但不限于水性、有机或水性-有机溶液、悬浮液和乳液。
[0146]
在另一实施例中，该饲料添加剂组合物能以固体形式使用。在一个实施例中，该固体形式是丸粒形式。固体形式的饲料添加剂组合物还可以含有以下中的一种或多种：赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙、和甘氨酸；崩解剂，例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐；制粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羟丙基纤维素(hpc)、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶；可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
[0147]
在其他实施例中，含有本文公开的耐氧埃氏巨型球菌(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的饲料添加剂组合物中的任一种可以另外地包含一种或多种赋形剂，该一种或多种赋形剂改善或提高埃氏巨型球菌在饲料组合物中的饲喂稳定性(例如饲喂牛稳定性)。如本文所用，短语“饲喂稳定性”意指在动物(例如牛)食用之前一段时间(例如，在食用之前约1小时至约24小时)，一旦与饲料成分彻底组合和/或混合后，存在于动物饲料中的微生物(例如，埃氏巨型球菌)的残余活性。在一些实施例中，混合可以在农场或饲料场的大型水平混合器中进行，其中可以将少量成分与饲料(例如玉米饲料)、青贮饲料和饲料的其他大组分(例如牛饲料)混合。在一些实施例中，在暴露于农场或饲料场的外部环境(例如从约-30℃至约45℃的温度和低湿度(例如从0％至100％湿度))后，评估饲喂稳定性(例如饲喂牛稳定性)。可以通过本领域已知的任何方式(例如计数和/或其他活性测量，如乳酸利用率)测量残余活性。
[0148]
赋形剂可以包括但不限于多糖、蛋白质、抗氧化剂和/或其他无机固体和油。在一些实施例中，可以在冷冻干燥或冻干之前将一种或多种赋形剂添加至含有耐氧埃氏巨型球菌的饲料添加剂组合物中。在其他实施例中，可以在使用之前(例如在使用之前小于约24小时、23小时、22小时、21小时、20小时、19小时、18小时、17小时、16小时、15小时、14小时、13小时、12小时、11小时、10小时、9小时、8小时、7小时、6小时、5小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30min中的任一种或在使用之前即时)将一种或多种赋形剂一起或单独添加至含有耐氧埃氏巨型球菌的饲料添加剂组合物中。在其他实施例中，将含有耐氧埃氏巨型球菌的饲料添加剂组合物放置在含有所述一种或多种赋形剂的溶液中，然后添加至饲料中，与饲料混合或组合。
[0149]
适于用作本文公开的任一饲料添加剂组合物中的赋形剂以改善或提高埃氏巨型球菌的饲喂稳定性(例如饲喂牛稳定性)的示例性多糖包括但不限于菊粉、黄原胶、壳聚糖、角叉菜胶、海藻酸盐、藻酸丙二醇酯、右旋糖酐、变形糖(mutan)、出芽短梗霉聚糖、淀粉、糊化的淀粉、半纤维素、阿拉伯糖基木聚糖、纤维素、纤维素衍生物(例如，甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素等)、果胶(柑橘果胶、苹果果胶和甜菜果胶)、阳离子淀粉、阳离子右旋糖酐、阳离子变形糖、乳化剂、甲壳素、结冷胶、韦兰胶(welan)、硬葡聚糖、左聚糖(levan)、
凝胶多糖、琥珀酰聚糖、鼠李聚糖胶(rhamsan gum)或天然来源的复合物多糖(例如但不限于，玉米蛋白粉、具溶解物的干酒糟(distillers dried grain solubles，ddgs)、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；淀粉-玉米、马铃薯、小麦、稻)、阿拉伯树胶、刺梧桐胶(gum karaya)、印度树胶、黄蓍胶、琼脂、种子胶(半乳甘露聚糖)、瓜耳胶、他拉胶(tara gum)、剌槐豆胶或肉桂胶。
[0150]
适于用作本文公开的任一饲料添加剂组合物中的赋形剂以改善或提高埃氏巨型球菌的饲喂牛稳定性的示例性蛋白质包括但不限于过氧化氢酶、乳蛋白(例如来自母牛、山羊、绵羊、骆驼或鲸的乳蛋白)或从此类非限制性来源例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、玉米(例如玉米醇溶蛋白)、小麦、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉(包括通过发酵产生的肉蛋白和乳品蛋白质)、或马铃薯获得的蛋白质。
[0151]
抗氧化剂可以分成两类，脂质抗氧化剂和水性抗氧化剂。脂质抗氧化剂的实例包括但不限于，类胡萝卜素(例如叶黄素、玉米黄质、β-隐藻黄素、番茄红素、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素)和生育酚(例如维生素e、母育酚、α-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚)和类视黄醇(例如维生素a、视黄醇和视黄醇棕榈酸酯)和脂溶性多酚，例如槲皮素。水性抗氧化剂的实例包括但不限于，抗坏血酸和及其氧化形式、“脱氢抗坏血酸”、尿酸及其氧化形式、“尿囊素”、胆红素、白蛋白和维生素c和水溶性多酚例如儿茶素，这些水性抗氧化剂对磷脂膜、异黄酮和原花青素具有高亲和力。适于用作本文公开的任一饲料添加剂组合物中的赋形剂以改善或提高埃氏巨型球菌的饲喂牛稳定性的其他示例性抗氧化剂包括但不限于，柠檬酸、半胱氨酸、核黄素、谷胱甘肽、泛醇、硫辛酸、硫氢化钠(na2s)、维生素b衍生物、硫胺素、氰钴胺、麦角钙化醇、胆钙化醇、维生素k衍生物、植物甲萘醌、甲基萘醌、槲皮素、维生素a衍生物、视黄醛、3,4-双脱氢视黄醇、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、γ-胡萝卜素、隐藻黄素、丁基羟基苯甲醚、丁基羟基甲苯、α-硫辛酸、类胡萝卜素、丙烯硫化物、司来吉兰、n-乙酰半胱氨酸、卵磷脂、酒石酸、咖啡酸、二芳基胺、硫代醚、醌类、单宁、氧杂蒽、原花青素、叶啉环(porphrin)、酚酞、靛酚、香豆素类、黄酮类、黄烷酮类及其异构体、衍生物和组合。
[0152]
适于使用的另外的赋形剂包括但不限于乙酸盐、赖氨酸或组氨酸以及无机固体和/或无机油。
[0153]
在一些实施例中，本文讨论的赋形剂中的一种或多种与缺乏所述一种或多种赋形剂的相同饲料组合物相比，改善或提高了埃氏巨型球菌在饲料组合物(任选地可以包括一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)中的饲喂牛稳定性约25％-75％、35％-85％、40％-90％、45％-95％、75％-95％、80％-95％、90％-95％、85％-95％或90％-100％、100％-500％、250％-750％、500％-1000％、750％-1250％、1000％-1500％、1250％-1750％、1500％-2000％、2000％-3000％、3000％-4000％、4000％-5000％、5000％-6000％、6000％-7000％、7000％-8000％、8000％-9000％、9000％-10,000％、10,000％-11,000％或11,000％-12,000％中的任一者，例如约25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、
800％、900％、1000％、1500％、2000％、2500％、3000％、3500％、4000％、4500％、5000％、5500％、6000％、6500％、7000％、7500％、8000％、8500％、9000％、9500％、10,000％、10,500％、11,000％、11,500％或12,000％或更多中的任一者。
[0154]
用于制备这些形式的营养上可接受的载剂的实例包括例如水、盐溶液、醇、硅酮、蜡类、凡士林、植物油、聚乙二醇、丙二醇、脂质体、糖类、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、表面活性剂、硅酸、粘性石蜡、芳香油、脂肪酸甘油单酯和脂肪酸甘油二酯、石油醚(petroethral)脂肪酸酯、羟甲基-纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等等。
[0155]
在一个实施例中，将饲料添加剂组合物配制成干粉或颗粒，如wo2007/044968(称为tpt颗粒)或wo 1997/016076或wo 1992/012645中所述(将每篇文献通过引用并入本文)。
[0156]
在一个实施例中，可以将饲料添加剂组合物配制成包含以下的颗粒饲料组合物：活性剂，其包含本文公开的一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)和任选地一种或多种外源性饲料酶以及至少一个涂层。在一个实施例中，颗粒的活性剂在加工后保留活性。在一个实施例中，颗粒的活性剂在加工后保留选自由以下组成的组的活性水平：50％-60％活性、60％-70％活性、70％-80％活性、80％-85％活性、85％-90％活性、和90％-95％活性。
[0157]
在另一实施例中，颗粒可以含有一个涂层。涂层可包含构成颗粒的至少55％w/w的水分水合材料。在另一实施例中，颗粒可以含有两个涂层。这两个涂层可以是水分水合涂层和防潮层涂层。在一些实施例中，该水分水合涂层可为颗粒的25％w/w至60％w/w并且该防潮层涂层可为颗粒的2％w/w至15％w/w。该水分水合涂层可选自无机盐、蔗糖、淀粉和麦芽糖糊精，并且该防潮层涂层可选自聚合物、树胶、乳清和淀粉。
[0158]
在又另一实施例中，颗粒可使用饲料制丸方法产生并且该饲料预处理方法可在70℃与95℃之间(如在85℃与95℃之间)进行长达若干分钟。在另一实施例中，该颗粒可使用蒸汽加热制丸方法产生，该方法可在85℃与95℃之间进行长达若干分钟。
[0159]
在一个实施例中，该颗粒可具有选自聚合物和树胶的防潮层涂层并且水分水合材料可为无机盐。水分水合涂层可占颗粒的25％至45％w/w并且防潮涂层可占颗粒的2％至20％w/w。
[0160]
在一个实施例中，活性剂在选自以下中的一种或多种条件后保留活性：(a)饲料制丸方法；(b)蒸汽加热饲料预处理方法；(c)储存；(d)作为未制丸混合物中的成分储存；和(e)作为包含至少一种选自以下的化合物的饲料基础混合物或饲料预混物中的成分储存：微量矿物质、有机酸、还原糖、维生素、氯化胆碱、和导致酸性或碱性饲料基础混合物或饲料预混物的化合物。
[0161]
在一些实施例中，可以使用稀释剂例如淀粉粉末、石灰石等稀释耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)。在一个实施例中，一种或多种dfm和这些酶可以处于适合食用的液体配制品中，优选地，这种液体食用品含有以下中的一种或多种：缓冲液、盐、山梨糖醇和/或甘油。在另一实施例中，可以通过将一种或多种酶施加(例如喷涂)于载体基材(例如碾碎的小麦)上来配制饲料添加剂组合物。
[0162]
在一个实施例中，可以将饲料添加剂组合物配制成预混物。仅举例而言，该预混物可包含一种或多种饲料组分，如一种或多种矿物质和/或一种或多种维生素。
[0163]
在一个实施例中，dfm和外源性饲料酶可用至少一种生理上可接受的载剂配制，该
载剂选自以下中的至少一种：麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、na2so4、滑石、pva、山梨糖醇、苯甲酸盐、山梨酸盐、甘油、蔗糖、丙二醇、1,3-丙二醇、葡萄糖、对羟基苯甲酸酯、氯化钠、柠檬酸盐、乙酸盐、磷酸盐、钙、偏亚硫酸氢盐、甲酸盐及其混合物。
[0164]
在另一实施例中，该饲料添加剂组合物可以作为水性悬浮液和/或酏剂递送。可将该饲料添加剂组合物与不同的甜味剂或调味剂、调色物质或染料进行组合，与乳剂和/或悬浮剂进行组合，以及与稀释剂(如水、丙二醇和甘油)进行组合，以及它们的组合。
[0165]
e.喂养料
[0166]
在另一实施例中，本文提供了饲料添加剂组合物，其含有本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株dfm中的任一种(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)，可用作饲料或用于制备饲料。饲料可以是溶液的形式或作为固体，这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。当用作饲料或用于制备饲料(如功能性饲料)时，该饲料添加剂组合物可以与以下中的一种或多种结合使用：营养上可接受的载剂、营养上可接受的稀释剂、营养上可接受的赋形剂、营养上可接受的辅剂、营养活性成分。
[0167]
在一个实施例中，将本文公开的饲料添加剂组合物与饲料组分混合以形成喂养料。在一个实施例中，该饲料可以是秣料或其预混物、复合饲料或其预混物。在一个实施例中，可以将本文公开的饲料添加剂组合物与复合饲料、复合饲料组分、或复合饲料的预混物混合，或将其混合至秣料、秣料组分或秣料的预混物中。
[0168]
在一个实施例中，秣料可以获得自选自以下的植物中的一种或多种：苜蓿(紫苜蓿)、大麦、百脉根、芸苔属(brassicas)、chau moellier、羽衣甘蓝、油菜籽(低芥酸菜籽)、芜菁甘蓝(瑞典甘蓝)、萝卜、三叶草、杂种三叶草、红三叶草、地下三叶草、白三叶草、草、燕麦草、羊茅草、绊根草、雀麦草、石南荒原草、草地早熟禾(来自天然混合的草原草地)、野茅、黑麦草、猫尾草、玉米(玉蜀黍)、粟、燕麦、高粱、大豆、树(用作树-干草的修剪下的树嫩枝)、小麦、和豆科植物。
[0169]
复合饲料可以是提供所有每日所需营养素的完全饲料、提供口粮(蛋白质、能量)的一部分的精料或仅提供另外的微量营养素(如矿物质和维生素)的补充剂。用于复合饲料的主要成分是饲料谷物，这些饲料谷物包括玉米、大豆、高粱、燕麦、和大麦。
[0170]
如本文所提及的“预混物”可以是由微量成分构成的组合物，这些微量成分为如维生素、矿物质、化学防腐剂、抗生素、发酵产物和其他必需成分。预混物通常是适合于共混进商业口粮内的组合物。
[0171]
在一个实施例中，如本文公开的喂养料可包含一种或多种选自包含以下的组的饲料材料：谷类，如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦以及其组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱；来自谷类的副产品，如玉米蛋白粉、具溶解物的干酒糟(ddgs)、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；获得自以下来源的蛋白质：如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻；获得自植物和动物来源的油和脂肪；以及矿物质和维生素。
[0172]
在又另一实施例中，喂养料可包含至少一种高纤维饲料材料和/或至少一种高纤维饲料材料的至少一种副产品以提供高纤维喂养料。高纤维饲料材料的实例包括：小麦，大麦，黑麦，燕麦，来自谷类的副产品，如玉米蛋白粉、具溶解物的干酒糟(ddgs)、小麦麸、粗小
麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣。一些蛋白质来源也可视为高纤维：获得自来源如向日葵、羽扇豆、蚕豆和棉花的蛋白质。
[0173]
在仍另一实施例中，该饲料可以是以下中的一种或多种：复合饲料和预混物，包括丸粒、球丸(nut)或(牛用)饼状物；作物或作物残余物：玉米、大豆、高粱、燕麦、大麦、玉米秸秆、干椰肉、稻草、谷壳、甜菜残渣；鱼粉；新割的草和其他饲草植物；肉粉和骨粉；糖蜜；油饼和滤饼；寡糖；糖渍饲草植物：干草和青贮饲料；海草；种子和谷物，完整的或通过压碎、研磨等制备；发芽谷物及豆类；酵母提取物。
[0174]
在一个实施例中，将本文公开的饲料添加剂组合物与产品(例如喂养料)混合。替代性地，饲料添加剂组合物可包含在喂养料的乳液或原始成分中。在另一实施例中，使饲料添加剂组合物在待影响/处理的产品表面上可用或可用于待影响/处理的产品表面。在仍另一实施例中，本文公开的饲料添加剂组合物可以与受控量的耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物以及进一步任选地外源性酶)一起应用、散布、涂覆和/或浸渍于产品(例如喂养料或喂养料的原始成分)。
[0175]
在又另一实施例中，耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)和任选的酶可同时使用(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同的途径递送时)或者依序使用(例如它们可通过不同的途径递送)。
[0176]
在一个实施例中，将耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)和任选的酶同时应用于喂养料。在又另一实施例中，将耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)和任选的酶在递送至喂养料或喂养料的原始成分之前混合。
[0177]
在一个实施例中，本文公开的饲料添加剂组合物中的耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)能以合适的浓度添加，包括但不限于在最终饲料产品中提供约2
×
103cfu至约2
×
10
11
cfu、约2
×
106至约1
×
10
10
、和约3.75
×
107cfu至约1
×
10
10
cfu的日剂量的浓度。
[0178]
iii.方法
[0179]
a.用于改善动物的性能指标的方法
[0180]
本文进一步提供了用于提高动物的性能指标的方法。在另一实施例中，本公开涉及提高反刍动物的性能指标的方法。在仍另一实施例中，本公开涉及提高反刍动物(包括但不限于奶牛和肉牛)的性能指标的方法。
[0181]
本文提供了一些方法，这些方法包括向动物施用包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的组合物。在仍另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的组合物以提高该动物的性能。该有效量能以一剂或多剂向动物施用。在一个实施例中，该动物是反刍动物。在仍另一实施例中，该动物是肉牛或奶牛。
[0182]
在另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以提高平均每日饲料摄入量。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种耐氧埃氏巨
型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物，该平均每日饲料摄入量增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。
[0183]
在另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以提高平均每日增重。在一些实施例中，相对于未施用本文公开的一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物，该平均每日增重增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。
[0184]
在另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以提高总增重。在一些实施例中，相对于未施用一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物，总增重增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。
[0185]
在另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以提高饲料转化，该饲料转化可通过饲料:增重或增重:饲料来测量。在一些实施例中，相对于未施用一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物，饲料转化增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。
[0186]
在另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以提高
饲料效率。在一些实施例中，相对于未施用一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物，饲料效率增加了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、105％、或110％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。
[0187]
在另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以降低死亡率。在一些实施例中，相对于未施用一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物，死亡率降低了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。
[0188]
在另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以降低饲料转化率(fcr)。在一些实施例中，相对于未施用一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物，fcr降低了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。
[0189]
在另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以降低或预防病原体感染(例如但不限于，沙门氏菌属物种(salmonela sp.)、和/或大肠杆菌和/或牛链球菌(streptococcus bovis)的感染)。在一些实施例中，相对于未施用一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物，病原体感染减少了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。
[0190]
在另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以降低
或预防瘤胃酸中毒或亚急性酸中毒。在一些实施例中，相对于未施用一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物的瘤胃酸中毒或亚急性酸中毒的患病率，瘤胃酸中毒或亚急性酸中毒减少了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。
[0191]
在另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以减少或预防蹄叶炎。在一些实施例中，相对于未施用一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物的蹄叶炎的患病率，蹄叶炎减少了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。
[0192]
在仍另外的实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(例如马属的成员，例如，马、骡子、驴或斑马)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以降低或预防胃溃疡的发生率。在一些实施例中，相对于未施用一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物的胃溃疡的患病率，胃溃疡减少了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。在特定实施例中，该饲料或喂养料包括一种或多种高能量谷物(例如但不限于，燕麦和玉米)。在另一实施例中，该组合物进一步包括一种或多种外源性酶，例如蛋白酶、淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶和/或葡糖淀粉酶。
[0193]
可以将本文提供的本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm组合物(任选地包含一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)例如作为含有菌株的培养液、含有菌株的上清液或培养液的细菌产物来施用。将包含本文提供的耐氧埃氏巨型球菌dfm和本文提供的任选的外源性饲料酶的组合物施用于动物可以提高该动物的性能。在一个实施例中，将本文提供的耐氧埃氏巨型球菌和任选的一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物施用于动物可以增加平均每日饲料摄入量(adfi)、平均每日增重(adg)或饲料效率(增重:饲料；g:f)(统称为“性能指标”)。可以改善这些性能指标中的一项或多于一项。
[0194]
可以以许多方式中的一种将包含耐氧埃氏巨型球菌和任选的一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物以及进一步任选的外源性饲料酶的组合物施用于动物。例如，该组合物可以作为兽药以固体形式施用，可以分布在赋形剂中，优选地水，并直接饲喂给动物，能以干燥的形式与饲料材料物理上混合，也可以将该组合物形成为溶液，然后喷洒到饲料材料
上。向动物施用本文公开的组合物的方法被认为在技术人员的技能范围内。当与饲料材料组合使用时，该饲料材料可以包括玉米、大豆粉、副产品像具溶解物的干酒糟(ddgs)、以及维生素/矿物质补充剂。也可以使用其他饲料材料。
[0195]
因此，在至少一些实施例中，通过补充旨在用于动物的饲料，向动物施用有效量的包含耐氧埃氏巨型球菌和任选的一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物以及进一步任选的外源性饲料酶的组合物。如本文所用，“补充”是指将有效量的本文提供的细菌直接掺入旨在用于动物的饲料中的行为。因此，动物在饲喂时摄取本文提供的细菌。
[0196]
b.饲养动物的方法
[0197]
另外，本文提供了饲养(即养殖或培育(growing))动物的方法。在再一实施例中，本公开涉及饲养反刍动物(包括但不限于奶牛和肉牛)的方法。
[0198]
在另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以降低或减少过渡期。如本文所用，“过渡期”是指从动物的基于饲草/草/青贮饲料的饮食(例如，《60％精料)过渡为高精料(例如，》60％精料)饲养场饮食的时间段。在一些实施例中，相对于未施用一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物的过渡期，过渡期减少了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。
[0199]
在另一实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向动物(如反刍动物，例如肉牛或奶牛)施用有效量的包含一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(例如本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的任一种)和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的组合物以降低或减少生产期间提供给该动物的药物量。在一些实施例中，相对于向未施用一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm(和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物)的动物给予的药物量，药物量减少了约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％中的任一者，包括落入这些百分比之间的所有值。在一些实施例中，该组合物是饲料添加剂组合物。在其他实施例中，该组合物是饲料或喂养料。药物可以是任何通常施用的药物，并且包括但不限于抗生素(例如泰乐菌素)或离子载体(ionaphore)(例如莫能霉素)。
[0200]
另外，本文提供了用于减少反刍动物从饲草/草/青贮饲料饮食过渡为高精料饮食所需的时间且不增加酸中毒的发生率的方法。如上文所讨论的，当反刍动物从高饲草过渡为高精料饮食(例如含有玉米)时，存在于消化系统瘤胃组分中的埃氏巨型球菌的数量常常不足以预防称为乳酸酸中毒的病症。该方法包括向目前食用饲草/草/青贮饲料饮食的反刍动物施用有效量的含有耐氧埃氏巨型球菌中的任一种和任选地酵母的组合物(例如饲料添加剂组合物、饲料、喂养料和/或预混物组合物)。
[0201]
在一些实施例中，与在未施用含有耐氧埃氏巨型球菌的组合物的情况下从饲草/草/青贮饲料饮食过渡为高精料饮食的反刍动物相比，反刍动物能更快地从饲草/草/青贮饲料饮食过渡为高精料饮食(例如快约大于60％，例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％或100％，包括落入这些百分比之间的所有值)。此外(或除此之外)，与在未施用含有耐氧埃氏巨型球菌的组合物的情况下从饲草/草/青贮饲料饮食过渡为高精料饮食的反刍动物相比，当从饲草/草/青贮饲料饮食过渡为高精料饮食时，施用了有效量的本文公开的含有耐氧埃氏巨型球菌的组合物中的任一种(例如饲料添加剂组合物、饲料、喂养料和/或预混物组合物)的反刍动物表现出乳酸酸中毒的发生率降低(例如乳酸酸中毒发生率降低了大于约60％，例如60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，包括落入这些百分比之间的所有值)。
[0202]
c.用于制备饲料添加剂组合物的方法
[0203]
本文还提供了用于制备饲料添加剂组合物的方法，该方法包括将本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种中的任一者)与一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种中的任一者)酵母菌株和/或酵母提取物组合。在一些实施例中，该方法进一步包括将一种或多种精油(例如但不限于，肉桂醛和/或麝香草酚)和/或一种或多种外源性酶(例如但不限于，植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶和β-葡聚糖酶中的一种或多种)组合。将至少约1x103cfu/g到至少约1x109cfu/g埃氏巨型球菌(例如约1x103cfu/g、1x104cfu/g、1x105cfu/g、1x106cfu/g、1x107cfu/g、1x108cfu/g或1x109cfu/g中的任一者，包括落入这些值之间的所有浓度)与至少一种酵母菌株和/或酵母提取物组合以形成饲料添加剂组合物。此外，可以将至少约107cfu/g至约10
10
cfu/g(例如约107cfu/g、108cfu/g、109cfu/g或10
10
cfu/g中的任一者)酵母与一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm组合以形成饲料添加剂组合物。在另外的实施例中，该方法可以包括任选的将饲料添加剂组合物包装的步骤。
[0204]
本文进一步提供了用于制备预混物的方法，该方法包括将本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种中的任一者)、至少一种矿物质和/或至少一种维生素以及任选地一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种中的任一者)酵母菌株和/或酵母提取物组合。将至少约1x103cfu/g到至少约1x109cfu/g埃氏巨型球菌(例如约1x103cfu/g、1x104cfu/g、1x105cfu/g、1x106cfu/g、1x107cfu/g、1x108cfu/g或1x109cfu/g中的任一者，包括落入这些值之间的所有浓度)与至少一种酵母菌株和/或酵母提取物组合以形成预混物。此外，可以将至少约107cfu/g至约10
10
cfu/g(例如约107cfu/g、108cfu/g、109cfu/g或10
10
cfu/g中的任一者)酵母与一种或多种耐氧埃氏巨型球菌dfm组合以形成预混物。在另外的实施例中，该方法可以包括任选的将预混物包装的步骤。
[0205]
d.用于提高埃氏巨型球菌菌株的耐氧性的方法
[0206]
本文还提供了用于提高其他不耐氧(即厌氧)埃氏巨型球菌菌株的耐氧性的方法。该方法包括在编码转录调节因子perr的基因(例如由seq id no:4的核苷酸序列编码的基因)中或紧邻编码转录调节因子perr的基因的上游引入至少一个突变的步骤。
[0207]
在任一所公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的perr基因可以具有一个或多个突变(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个中的任一者)，该一个或多个突变预防perr多肽(例如seq id no:6的多肽)的表达或使perr多肽相对于未突变的(即野生型)perr多肽的功能性无功能或功能性降低(例如约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的功能性降低，包括这些值之间的所有百分比)。突变可
以位于基因本身内(例如，在内含子或外显子内)或转录调控区域中基因的上游(例如从基因起始密码子上游约-1至约-200个核苷酸)。对应于seq id no:4中的核酸序列，任一所公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的perr基因可以在以下位置中的一个或多个处具有突变：386(例如g386t)、155(例如c155t)、253(例如c253t)、-99(其中
“‑”
表示perr基因的起始密码子上游的核苷酸；例如t-99c)、和/或-125(例如g-125a)。在另外的实施例中，突变可以是将核苷酸插入至基因和/或转录调控序列中，从而导致移码突变(例如无义或错义突变)。在一些实施例中，核苷酸插入可以位于以下核苷酸位置处：例如30(例如在位置30处插入的a)、277(例如在位置277处插入的a)、和/或64(例如在位置64处插入的g)，其中这些核苷酸位置对应于seq id no:4。可以将该突变通过随机诱变或定点诱变引入到埃氏巨型球菌基因组中。
[0208]
在另外的实施例中，用于提高埃氏巨型球菌菌株的耐氧性的方法可以进一步包括将埃氏巨型球菌菌株与至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种中的任一者)酵母菌株和/或酵母提取物组合。如实例中所示，将本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株与一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物一起培养和/或组合导致对氧气毒性的抗性增加，以及埃氏巨型球菌活力和生长的改善。
[0209]
由于通过本文公开的方法而产生的耐氧性提高的埃氏巨型球菌菌株可以在暴露于氧气(例如但不限于大气氧气水平)至少约2-45天、约7-12天或至少30天(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或更多天中的任一者)后保持活力。
[0210]
e.用于增加含有埃氏巨型球菌的组合物的贮存期的方法
[0211]
如本文所用，术语“贮存期”可以用活力表示，例如含有埃氏巨型球菌的组合物可以贮存的时间，其中埃氏巨型球菌微生物保持活力(即含有埃氏巨型球菌的组合物可以贮存且活力不低于用于在本文公开的方法中使用的有效性的最低可接受水平的时间段)。可以如在实例部分描述的或本领域公开的多种熟知的方式来评估埃氏巨型球菌的活力。该方法包括将本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种埃氏巨型球菌菌株中的任一者)与至少一种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种中的任一者)酵母菌株和/或酵母提取物一起配制。如实例中所示，将本文公开的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的一种或多种与一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物一起贮存导致含有埃氏巨型球菌的组合物(例如饲料、喂养料或饲料添加剂组合物)的贮存期改善。
[0212]
由于通过本文公开的方法而产生的贮存期增加的埃氏巨型球菌菌株可以在至少约2-45天、约7-12天或至少30天(例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或更多天中的任一者)后维持贮存期。
[0213]
iv.试剂盒
[0214]
本文进一步提供了含有本文公开的耐氧埃氏巨型球菌dfm中的一种或多种和任选地一种或多种酵母菌株和/或酵母提取物的试剂盒。
[0215]
这些试剂盒可以包括本文提供的耐氧埃氏巨型球菌菌株中的一种或多种(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种中的任一者)，这些菌株包括埃氏巨型球菌菌株acd1265(cbs146328)；埃氏巨型球菌菌株acd1096-a01；埃氏巨型球菌菌株acd1096-b01；埃
氏巨型球菌菌株acd1096-e01；埃氏巨型球菌菌株acd1096-c02；埃氏巨型球菌菌株acd1096-c05；埃氏巨型球菌菌株acd1096-h05；埃氏巨型球菌菌株acd1096-b03；埃氏巨型球菌菌株acd1141-c10；埃氏巨型球菌菌株acd1141-d10；埃氏巨型球菌菌株acd1141(cbs 146325)；埃氏巨型球菌菌株acd1141e(cbs 146326)；埃氏巨型球菌菌株acd1141f(cbs 146327)；埃氏巨型球菌菌株acd1265e(cbs 146329)；和/或埃氏巨型球菌菌株acd1265f，这些菌株保藏于wfdi，保藏号为cbs 146330。这些试剂盒可以任选地包括一种或多种酵母菌株(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种酵母菌株中的任一种)。
[0216]
这些试剂盒可以进一步包括正确储存、维护、和用于向动物(例如反刍动物)施用以改善一项或多项性能指标的说明书。这些试剂盒可以另外包括本文公开的外源性酶中的一种或多种(例如，植酸酶、蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶或β-葡聚糖酶中的一种或多种)和/或一种或多种精油。
[0217]
通过参照以下实例可以进一步理解本发明，这些实例是为了说明而提供的，而不是为了限制。
[0218]
实例
[0219]
实例1：埃氏巨型球菌菌株的分离
[0220]
这一实例描述了埃氏巨型球菌菌株的分离。将来自用常规或高精料饮食饲喂的肉牛的新鲜或冷冻瘤胃液用作菌株分离的来源。通过16s rdna测序确认埃氏巨型球菌菌株的分类。
[0221]
收集来自供体动物的瘤胃液并且去除喂养料。将收集的瘤胃液用作新鲜的接种物或在15％甘油中冷冻用于之后的接种。当瘤胃液用作培养基补充剂时，将其高压灭菌20min，并且通过在约3700g下离心30min进行澄清。将澄清的瘤胃液(20％)添加至含有10g/l乳酸作为碳源的分离培养基中。培养基还含有2g/l蛋白胨和矿物质溶液(40g/l kh2po4、120g/l(nh4)2so4、8g/l mgso4.7 h2o、2.4g/l cacl2.2h2o)。将溴甲酚紫(100ml的0.04％于在1l中)添加至培养基中作为ph指示剂。使用90％乳酸将培养基的ph调节至5.5。添加半胱氨酸(0.25g/l)作为还原剂。将瘤胃液的连续稀释液铺板在隔离板上。将板在39℃下厌氧孵育1至2天。将隔离板上生长的紫色菌落在同一板上划线两次。对纯化的菌落进行16s rdna分型。使用引物8f:5
’‑
aga gtt tga tym tgg ctc-3’(y＝c或t；m＝a或c)和1492r:5
’‑
cgg tta cct tgt tac gac tt-3’进行菌落pcr，并且使用桑格(sanger)方法对约1.5kb pcr产物进行测序。将该序列用于搜索ncbi nr数据库。大多数紫色菌落分型为埃氏巨型球菌，具有与在包括dsm20460和模式菌株atcc25940的公共数据库中的埃氏巨型球菌菌株显示出》99％同一性的最高命中(top hit)。
[0222]
实例2：埃氏巨型球菌菌株的表征
[0223]
这一实例描述了对分离的埃氏巨型球菌菌株的耐氧性和乳酸利用率的筛选和表征。
[0224]
在96孔板中一式两份培养四十六种埃氏巨型球菌菌株。使它们在来自bd公司(becton dickinson)(富兰克林湖，新泽西州)的梭菌强化培养基(rcm)中生长。使用埃氏巨型球菌atcc25940作为对照。将这些菌株在39℃下在rcm培养基中厌氧培养过夜。通过在rcm培养基中将od600调节至1.0来标准化种子培养物。将这些标准化培养物以1:10比率接种用于随后的测定，其中起始od是约0.1。对于耐氧性测试，将覆盖有透气膜的96深孔板中的标
准化培养物(在rcm中1od600，ph 6.8)在台面上暴露于空气长达6天。每天取20ul的等分试样，在96孔板以1:10比率在rcm(ph 6.8)中在39c下厌氧培养过夜。通过培养物的过夜生长指示存活细胞的恢复。对于乳酸利用率测定，将标准化培养物接种至基于瘤胃液的含有乳酸的分离培养基中，并且厌氧孵育约6小时或过夜。通过在约3700g下离心10min获得培养上清液，并且将其经由0.2um过滤器过滤。通过hplc测量乳酸浓度。
[0225]
通过使用具有bio-rad aminex hpx-87柱且柱温在40c下的waters2695hplc系统确定乳酸。流动相是在水中的0.01n硫酸，并且在等度条件下以0.6ml/min的流速运行hplc系统。注射体积是10ul，并且运行时间是45分钟。通过waters 2124折射率检测器在40c下和waters2996光电二极管阵列检测器在210nm下检测乳酸。通过外部校准标准对乳酸浓度进行定量。
[0226]
实例3：耐氧埃氏巨型球菌菌株与其亲本的比较
[0227]
这一实例描述了埃氏巨型球菌菌株acd1265的耐氧变体的分离。比较该耐氧埃氏巨型球菌菌株与其亲本acd1009的特性。
[0228]
从自特拉华州(delaware)农场收集的新鲜的瘤胃液中分离出亲本埃氏巨型球菌菌株acd1009。在需氧条件下通过在隔离板上将其亲本菌株(acd1009)划线来分离出耐氧埃氏巨型球菌菌株acd1265。将划线的板在39℃下厌氧孵育2-3天直至紫色菌落出现。通过在相同类型的隔离板上划线两次，将这些隔离板上生长的紫色菌落纯化。对纯化的菌落的耐氧性以及生长和乳酸利用率进行表征。
[0229]
比较acd1265与其亲本acd1009和几种其他菌株的耐氧性。将这些菌株在预还原的rcm培养基中在39℃下厌氧培养过夜。在预还原的rcm培养基中将每种菌株的最终od600调节至1.0。将0.5ml的每种调节了od600的培养物转移至96深孔板中，并且用透气膜密封。将含有培养物的板放在台面上暴露于空气长达6天。每天取每种样品的两份，通过在96孔培养板的rcm培养基中以1:10稀释度(250ul/孔)稀释并且在39c下厌氧生长过夜来测量其活力。监测生长，并且将结果(是或否)总结于下表中。
[0230]
表1.空气暴露后埃氏巨型球菌菌株的生长
[0231][0232][0233]
acd1265变体在空气中能够耐受暴露6天，然而其亲本acd1009在空气暴露后只能够生长1天。显著改善了acd1265的耐氧性。atcc25940模式菌株显示出与acd1009相似的耐受性。其他天然分离株具有不同程度的耐氧性。acd1141在氧气暴露两天后的生长显示出比atcc更高的耐氧性，然而acd1096更敏感，只耐受几个小时的氧气暴露。acd1141是更耐氧的
天然分离株。
[0234]
比较耐氧变体acd1265和其亲本acd1009的生长和乳酸利用率。在rcm培养基中在39℃下厌氧培养过夜后，acd1009的最终od600是约6-7，并且acd1265的最终od600是约4.5-5。过夜培养物acd1265的细胞密度是约20％-25％，比acd1009的细胞密度低。通过在rcm培养基中将od600调节至1.0来标准化培养物。如实例2中所述，将这些标准化的培养物以1:10比率(起始od 0.1)接种用于乳酸利用率测定。通过hplc分析培养物中剩余的乳酸的百分比(残余乳酸浓度除以培养基对照中的起始乳酸浓度)。在6小时孵育后，acd1009有30％残余乳酸，并且acd1265有39.5％残余乳酸。acd1265中乳酸利用率的轻微降低可能反映其20％-25％的生长降低。长时间孵育后，两种菌株的培养基中乳酸都耗尽。
[0235]
实例4：氧气暴露后活力的定量确定
[0236]
这一实例描述了耐氧菌株acd1265与其亲本acd1009和模式菌株atcc25940在氧气暴露后活力的定量评估。
[0237]
将最可能数(mpn)方法用于acd1009、acd1265和atcc25940耐氧性的定量评估。这一mpn研究使用微量滴定板用于连续稀释，每个样品具有4个重复的10x连续稀释，多达12孔。关于mpn方法的更多信息，参见以下参考文献：cochran,w.g.,(1950),estimation of bacterial densities by means of the"most probably number"[通过“最可能数”的方式预估细菌密度],biometrics[生物统计学],第105-116页。rowe,r.,todd,r.和waide,j.,(1977),microtechnique for most-probable-number analysis[用于最可能数分析的微量技术],applied and enviromental microbiology[应用与环境微生物学],第33卷,第3期,第675-680页。woodward.r.l.,(1957),how probable is the most probable number？[最可能数有多大可能？],journal of the american water works association[美国水利协会杂志],49,第1060-1068页。
[0238]
将acd1265、acd1009和atcc25940在39℃下在rcm培养基中厌氧培养过夜。acd1009的最终od600是约5.5，并且acd1265的最终od600是约4.5，atcc25940的最终od600是约6.7。对于氧气暴露，将1.4ml的每种过夜培养物转移至用透气膜密封的96深孔板中并且在台面上暴露于空气长达12天。每隔一段时间，取等分试样的样品通过mpn测量其在预还原的rcm培养基(ph 6.8)中的活力，并且将微量滴定板在39℃下厌氧孵育1-2天。通过视觉检查记录细菌的生长并且计算mpn。图1中的数据显示所有三种菌株在暴露于空气2天后均具有耐受性。在长时间空气暴露后，acd1009亲本菌株和atcc模式菌株完全丧失活力(1.28e+01是该方法的检测限)。然而，变体acd1265在暴露7至9天后保留1.16x108cfu/ml，并且在暴露12天后仍保留5.73x104cfu/ml。这显示变体acd1265比其亲本acd1009或atcc25940模式菌株更耐氧。
[0239]
实例5：埃氏巨型球菌菌株的基因组测序
[0240]
这一实例描述了分离的埃氏巨型球菌菌株和耐氧变体acd1265的基因组测序。全基因组序列分析显示出acd1265在perr基因处含有snp，这最可能有助于改善其耐氧性。
[0241]
将埃氏巨型球菌菌株的过夜培养物在室温下以4500x g离心10分钟。将所得的上清液丢弃，并且根据qiagen的mo bio的powermag微生物dna试剂盒(目录号：27200-4)处理细胞沉淀。简而言之，将细胞沉淀重悬于350ul的powermag微珠裂解液加rna酶a溶液中。将重悬液转移至powermag珠板。将板在珠搅拌器上以20hz振荡10分钟，每5分钟旋转一次板。
将板在室温下以4500x g离心6分钟。将上清液转移至干净的powermag 1ml收集板，并且将100ul的powermag irt溶液添加至每个孔，然后伴随短暂涡旋混合。然后将板在4℃下孵育10分钟。再次将板在室温下以4500x g离心9分钟，并且将450ul的上清液转移至kingfisher深孔板96板，并且与500ul的swiftmag珠组合。用3％-100％乙醇洗涤，通过kingfisher处理后，用溶液eb洗脱dna。将所得的gdna提交用于全基因组测序文库构建。
[0242]
使用illumina nextera flex系统(依诺米那公司(illumina)20018705)和分度板(依诺米那公司20018708)来处理用于测序的基因组dna。简而言之，评估分离的dna的质量和浓度。然后用nextera flex试剂盒处理dna。使用quantus dsone、高级分析片段分析仪和生物分析仪tapestation检查产生的文库的质量和浓度。将文库合并，相对于2nm归一化，并且在illumina nextseq上运行。运行产生25gb(千兆碱基)的数据。使用内部途径组装这些菌株的基因组测序数据。简而言之，根据质量过滤和修整读数，然后使用bfc进行校正。使用spades组装器组装校正的读数。组装后，通过prodigal预测开放阅读框(orf)，并且通过prokka注释。通过barrnap预测16s rrna基因，并且通过rdp成对比对工具针对经过审查的16s参考数据库鉴定最接近的物种，该数据库主要含有来自模式菌株和公共基因组的16s基因。通过bowtie2和samtool鉴定这些菌株的基因组组装之间的snp。然后根据基因注释将snp映射至相应的基因。
[0243]
在耐氧菌株acd1265(序列id ag8660041)和亲本acd1009(序列id ag8660040)之间仅鉴定出2个snp。一个snp位于编码命名为转录调节因子perr的蛋白质的基因，另一个snp位于远端非编码区域。亲本菌株acd1009在perr基因的位置386处具有碱g，然而acd1265具有碱t。这种突变将半胱氨酸(c)的密码子ugc变为苯丙氨酸(f)的另一个密码子uug。所有其他46个被测序的菌株都具有与来自acd1009的perr基因相同的核苷酸perr基因。两个perr基因的核苷酸和蛋白质序列在以下列出。不同的碱和氨基酸以红色突出显示。
[0244]
perr蛋白属于kegg直系同源家族k09825，已知其调节细菌的氧化应激反应(shetty等人,2013.comparative genome analysis of megasphaera sp.reveals niche specialization and its potential role in the human gut.[巨球菌属物种的对比基因组分析揭示生态位特化及其在人肠道中的潜在作用]plos one.[公共科学图书馆：综合]2013；8:e79353)。位置129处的氨基酸半胱氨酸在perr蛋白中似乎是高度保守的。在来自kegg数据库版本82的k09825家族的1,213个蛋白质序列中，1,170(96.5％)个蛋白质在该位置处具有半胱氨酸，并且只有5个具有苯丙氨酸。还报告了在专性厌氧菌丙酮丁醇梭菌中perr蛋白的缺失导致长期的耐氧性以及在需氧条件下生长受限(hillmann等人,2008.perr acts as a switch for oxygen tolerance in the strict anaerobe clostridium acetobutylicum.[perr在严格的厌氧菌丙酮丁醇梭菌中充当耐氧性的开关]mol microbiol.[分子微生物学]2008；68(4):848-860.doi:10.1111/j.1365-2958.2008.06192.x)。
[0245]
实例6：埃氏巨型球菌菌株的其他耐氧变体的分离和表征
[0246]
这一实例描述了从其他亲本菌株分离的更耐氧的埃氏巨型球菌变体。耐氧变体含有在perr基因中或perr基因的上游映射的突变。
[0247]
从自俄克拉何马州(oklahoma)农场的两只不同的牛收集的冷冻瘤胃液中分离出埃氏巨型球菌亲本菌株acd1096和acd1141。尽管两种菌株都是天然分离株，但acd1141比
acd1096显示出更高的耐氧性。如先前针对acd1265所述类似地分离出耐氧性提高的acd1096和acd1141变体。acd1096衍生的埃氏巨型球菌变体菌株在氧气暴露后活力的mpn评估在图2中显示。acd1141衍生的埃氏巨型球菌变体菌株在氧气暴露后活力的mpn评估在图3中显示。还确定了这些变体的全基因组序列，并且将perr相关的突变总结在表2中。
[0248]
表2.埃氏巨型球菌耐氧变体的突变的映射。
[0249][0250]
在acd1096衍生的菌株的9个变体中，其中7个变体比acd1096亲本显示出改善的耐氧性，并且在perr基因中或perr基因的上游具有突变。其中两个变体(d05和d06)显示出与亲本相似的耐氧性，并且在perr区域中不具有突变。显示出提高的耐氧性的acd1141的两个变体(c10和d10)在perr基因中或perr的上游也具有突变。
[0251]
实例7：进化的埃氏巨型球菌菌株的耐氧性的比较
[0252]
这一实例描述了通过定向进化来分离埃氏巨型球菌变体以及对进化的埃氏巨型球菌菌株的耐氧性进行比较。
[0253]
用1141和1265作为起始菌株通过在rcm培养基中的连续转移进行定向进化。在75至100代后，将细胞铺板用于分离。将1141e和1141f菌株从1141进化中分离，同时将1265e和1265f从1265进化中分离。比较1141e/f和1265e/f与起始菌株的耐氧性。将所有菌株在预还原的rcm培养基中在39℃下厌氧培养过夜。用预还原的rcm培养基将od600调节至1.0。将0.25ml的这些培养物中的每一种转移至用透气膜密封的96深孔板中，并且放在台面上暴露于空气长达5天。每天取每种样品的四份以通过mpn测量这些样品的活力(cfu/ml)。图4示出了这些菌株的耐空气性的顺序如下：1141f》1141e》1141；1265e》1265》1265f。如通过1天空气暴露后增加的生存期所示出的，与1141起始菌株相比，进化的1141e和1141f具有改善的耐氧性。与1265起始菌株相比，1265e具有轻微提高的耐氧性，并且1265f具有轻微降低的耐氧性。然而，1265e和1265f仍然显示出与1265相当的非常高的耐氧性，并且比1141或进化的
1141e/1141f菌株具有更高的耐氧性。
[0254]
实例8：酵母改善了在“瘤胃”条件下埃氏巨型球菌在氧气暴露后的活力
[0255]
这一实例表明酿酒酵母菌株ysc35用于改善在所谓的“瘤胃”条件下(在含有瘤胃液乳酸的培养基中，ph 5.5，39℃，短暂的时间段例如3小时的空气暴露)埃氏巨型球菌acd1096在氧气暴露后的活力。
[0256]
酵母菌株ysc35获得自内部青贮饲料酵母收集液。根据its测序将它分型为酿酒酵母。使用无菌移液器吸头，挑取少量酵母细胞并重悬于25μl的0.02m naoh中。在pcr机器上于99℃下将再重悬的样品煮沸10分钟。将2μl煮沸的样品添加至25μl含有引物its1(5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和its4(5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’)、以及1x q5热启动pcr酶混合物(英杰公司(invitrogen))的pcr反应混合物中。用exosap-it(赛默飞世尔公司(thermofisher))在37℃下清洁pcr产物4min，并且将清洁的pcr产品送去进行dna测序。在ncbi网站上搜索测序结果，并且鉴定出ysc35的最高命中为酿酒酵母。
[0257]
将埃氏巨型球菌acd1096和酿酒酵母ysc35在不同的生长条件(对于埃氏巨型球菌为厌氧39℃；对于酵母为需氧33℃下以250rpm振荡)下在rcm培养基(bd公司，富兰克林湖，新泽西州)中单独培养。在分光光度计ultraspec 3000(法玛西亚生物科技公司(pharmacia biotech)，新泽西州皮斯卡塔韦)中测量每种菌株的od600。如先前的实例中所述，将埃氏巨型球菌在含有10g/l dl-乳酸的基于瘤胃液的培养基中相对于od＝2归一化。将酵母细胞以16,000g离心1min，去除上清液，并且将沉淀重悬于相同的含有乳酸的培养基中。在共培养聚生体中，将埃氏巨型球菌和酿酒酵母细胞在深孔板(康宁(corning)96孔测定块，costar 3960)中以1:5的od比率组合。包括单一菌株对照。在氧气暴露处理中，将具有细胞培养物的板用无菌透气膜(赛默科技公司nunc密封胶带241205)覆盖，并且暴露于空气。类似地在没有氧气暴露下制备厌氧对照埃氏巨型球菌，并且进行厌氧孵育。在39℃下伴随空气暴露孵育3小时后，在预还原的磷酸盐缓冲盐水(1xpbs)中进行十倍连续稀释。将100ul的1:20000倍稀释的细胞在含有瘤胃液乳酸的琼脂板上铺板。将琼脂板在39℃下厌氧孵育约2天。埃氏巨型球菌在该分离琼脂培养基上厌氧生长良好，然而酿酒酵母在该琼脂培养基上不能厌氧生长。在这些板上的埃氏巨型球菌的选择性生长使我们确定了埃氏巨型球菌在me+酵母聚生体中的活菌计数。如表3中所示，埃氏巨型球菌acd1096菌株的活力在暴露于空气3小时后降低约1个对数。在具有酵母ysc35的聚生体中的埃氏巨型球菌在没有空气暴露下维持与厌氧埃氏巨型球菌对照差不多水平的活力。
[0258]
表3：在将100μl的1:20000倍稀释的细胞铺板后，在含有基于瘤胃液的乳酸的琼脂板上的埃氏巨型球菌1096的活菌计数。
[0259][0260]
实例9：酵母改善了在“瘤胃”条件下埃氏巨型球菌在氧气暴露后的乳酸利用率
[0261]
这一实例表明酿酒酵母菌株ysc35用于改善在所谓的“瘤胃”条件下(在含有瘤胃液乳酸的培养基中，ph 5.5，39℃，短暂的时间段例如3小时的空气暴露)埃氏巨型球菌
acd1096在氧气暴露后的乳酸利用率。
[0262]
如实例8中所述，使埃氏巨型球菌acd1096和酿酒酵母ysc35生长并对其进行处理。在39℃下伴随空气暴露孵育3小时后，除了活力铺板，还分析上清液的乳酸利用率。将细胞以3220g离心10分钟。将上清液通过0.2um 96孔过滤板(颇尔公司(pall)8119)过滤，并且加载到hplc上进行乳酸测量。通过使用具有bio-rad aminex hpx-87h柱且柱温在40℃下的waters 2695hplc系统确定乳酸。流动相是在水中的0.01n硫酸，并且在等度条件下以0.6ml/min的流速运行hplc系统。注射体积是10ul，并且运行时间是45分钟。通过waters 2124折射率检测器在40℃下和waters pda 2996光电二极管阵列检测器在210nm下检测乳酸。通过外部校准标准对乳酸浓度进行定量。培养上清液中的残余乳酸浓度总结在下表4中。没有任何细胞的培养基空白对照含有约93.5mm乳酸。仅含有ysc35酵母的培养基含有约90.4mm乳酸，表明在测定条件下酵母细胞不使用乳酸。厌氧孵育的埃氏巨型球菌acd1096克隆使用大多数乳酸，并且仅有约27.0mm残余乳酸。暴露于空气3小时的埃氏巨型球菌acd1096使用的乳酸没有厌氧巨球菌属细胞使用的多，并且有75.5mm剩余的乳酸。暴露于空气3小时的具有ysc35聚生体的埃氏巨型球菌acd1096比没有酵母的仅巨球菌属细胞使用更多的乳酸，并且仅有37.3mm剩余的乳酸。具有埃氏巨型球菌的聚生体中的酵母ysc35改善了埃氏巨型球菌的乳酸利用率。
[0263]
表4：实例9的培养上清液(mm)中的残余乳酸浓度
[0264][0265]
实例10：酵母改善了在“贮存期”条件下埃氏巨型球菌在氧气暴露后的活力
[0266]
这一实例表明酿酒酵母菌株ysc35用于改善在所谓的“贮存期”条件下(rcm培养基，ph 6.8，室温，长时间段例如21小时的空气暴露)埃氏巨型球菌acd1096在氧气暴露后的活力。
[0267]
将埃氏巨型球菌acd1096和酿酒酵母ysc35在不同的生长条件(对于埃氏巨型球菌为厌氧39℃；对于酵母为需氧33℃下以250rpm振荡)下在rcm培养基中单独培养。在分光光度计中测量每种菌株的od600。在rcm培养基中将埃氏巨型球菌相对于od＝2归一化。在共培养聚生体中，将埃氏巨型球菌和酿酒酵母细胞在深孔板(康宁96孔测定块，costar 3960)中以约1:5的od比率组合。包括单一菌株对照。在氧气暴露处理中，将具有细胞培养物的板用无菌透气膜(赛默科技公司nunc密封胶带241205)覆盖，并且暴露于空气。类似地在没有氧气暴露下制备厌氧对照埃氏巨型球菌，并且进行厌氧孵育。在室温下伴随空气暴露孵育21小时后，在1xpbs中进行十倍连续稀释。将100μl的1:1000倍稀释的细胞在基于选择性瘤胃液的乳酸琼脂板上铺板用于埃氏巨型球菌细胞的计数。将琼脂板在39℃下厌氧孵育约2天。表5中的数据显示在空气暴露21小时后，具有ysc35酵母的聚生体中的巨球菌属细胞比单独
的巨球菌属细胞具有至少多100倍的活菌计数。
[0268]
表5：在将100μl的1:1000x稀释的细胞铺板后，在含有基于瘤胃液的乳酸的琼脂板上的埃氏巨型球菌acd1096的活菌计数
[0269][0270]
实例11：酵母改善了在“贮存期”条件下埃氏巨型球菌在氧气暴露后的乳酸利用率
[0271]
这一实例表明酿酒酵母菌株ysc35用于改善在所谓的“贮存期”条件下(rcm培养基，ph 6.8，室温，长时间段例如21小时的空气暴露)埃氏巨型球菌acd1096在氧气暴露后的乳酸利用率。
[0272]
如实例10中所述，使埃氏巨型球菌acd1096和酿酒酵母ysc35生长并对其进行处理。在室温下伴随空气暴露孵育21小时后，以1:3x倍稀释率将细胞接种至含有10g/l dl-乳酸的基于瘤胃液的培养基中。将细胞在含有乳酸的培养基中在39℃下厌氧回收6小时，然后以3220g离心10分钟。如实例8中所述，将上清液通过0.2μm 96孔过滤板(颇尔公司8119)过滤，并且加载到hplc上进行乳酸测量。下表6中的数据示出了埃氏巨型球菌acd1096在空气暴露21小时后丧失了利用乳酸的能力。经空气暴露的埃氏巨型球菌acd1096的残余乳酸与空白培养基对照或仅酵母培养物的残余乳酸相同。在回收期间，具有酵母的聚生体中的埃氏巨型球菌acd1096能够利用大多数乳酸，并且仅剩余15.1mm乳酸。
[0273]
表6：实例11的培养上清液(mm)中的残余乳酸浓度
[0274][0275]
实例12：酵母改善了在“贮存期”条件下埃氏巨型球菌在氧气暴露后的活力
[0276]
这一实例表明库德里阿兹威毕赤酵母菌株ysc13用于改善在所谓的“贮存期”条件下(rcm培养基，ph 6.8，室温，长时间段例如22小时的空气暴露)埃氏巨型球菌acd1096在氧气暴露后的活力。
[0277]
酵母菌株ysc13获得自内部青贮饲料酵母收集液。根据its测序将它分型为库德里阿兹威毕赤酵母。使用无菌移液器吸头，挑取少量酵母细胞并重悬于25μl的0.02m naoh中。在pcr机器上于99℃下将再重悬的样品煮沸10分钟。将2μl煮沸的样品添加至25μl含有引物its1(5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和its4(5
’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’)、以及1x q5热启动pcr酶混合物(英杰公司)的pcr反应混合物中。用exosap-it(赛默飞世尔公司)在37℃下清洁pcr产物4min，并且将清洁的pcr产品送去进行dna测序。在ncbi网站上搜索测序结果，并且鉴定出ysc13的最高命中为库德里阿兹威毕赤酵母。
[0278]
将埃氏巨型球菌acd1096和库德里阿兹威毕赤酵母ysc13细胞在rcm培养基中单独培养(对于埃氏巨型球菌为厌氧39℃；对于酵母为需氧33℃下以250rpm振荡)。在分光光度计中测量每种菌株的od600。在rcm培养基中将埃氏巨型球菌相对于od＝2归一化。在共培养聚生体中，将埃氏巨型球菌和库德里阿兹威毕赤酵母细胞在深孔板(康宁96孔测定块，costar 3960)中以约1:5的od比率组合。包括单一菌株对照。在氧气暴露处理中，将具有细胞培养物的板用无菌透气膜(赛默科技公司nunc密封胶带241205)覆盖，并且暴露于空气。类似地在没有氧气暴露下制备厌氧对照埃氏巨型球菌，并且进行厌氧孵育。在室温下伴随空气暴露孵育22小时后，在1xpbs中进行十倍连续稀释。将100μl的1:100倍稀释的细胞在基于选择性瘤胃液的乳酸琼脂板上铺板用于埃氏巨型球菌细胞的计数。将琼脂板在39℃下厌氧孵育约2天。如表7中所示，在室温下空气暴露22小时后，在铺板的1:100稀释度下没有回收到埃氏巨型球菌acd1096的有活力的细胞，然而厌氧对照埃氏巨型球菌细胞具有太多菌落而无法计数。具有ysc13的酵母聚生体中的埃氏巨型球菌细胞在该稀释度下具有数百至数千个菌落。在空气暴露22小时后，库德里阿兹威毕赤酵母ysc13将埃氏巨型球菌acd1096的活力改善了至少1000倍。
[0279]
表7：在将100μl的1:100x稀释的细胞铺板后，在含有基于瘤胃液的乳酸琼脂板上的埃氏巨型球菌acd1096的活菌计数
[0280][0281]
实例13：酵母改善了在“贮存期”条件下埃氏巨型球菌在氧气暴露后的乳酸利用率
[0282]
这一实例表明库德里阿兹威毕赤酵母菌株ysc13用于改善在所谓的“贮存期”条件下(rcm培养基，ph 6.8，室温，长时间段例如22小时的空气暴露)埃氏巨型球菌acd1096在氧气暴露后的乳酸利用率。
[0283]
如实例12中所述，使埃氏巨型球菌acd1096和库德里阿兹威毕赤酵母菌株ysc13生长并对其进行处理。在室温下伴随空气暴露孵育22小时后，以1:10x倍稀释度将细胞接种至含有10g/l dl-乳酸的基于瘤胃液的培养基中。将细胞在含有乳酸的培养基中在39℃下厌氧回收7小时，然后以3220g离心10分钟。将上清液通过0.2um 96孔过滤板(颇尔公司8119)过滤，并且加载到hplc上进行乳酸测量。下表8中的数据示出了埃氏巨型球菌acd1096在空气暴露22小时后丧失了利用乳酸的能力。经空气暴露的埃氏巨型球菌acd1096的残余乳酸与空白培养基对照或仅酵母培养物的残余乳酸相同。具有酵母的聚生体中的埃氏巨型球菌acd1096保留了利用乳酸的能力。
[0284]
表8：实例13的培养上清液(mm)中的残余乳酸浓度
[0285][0286]
实例14：酵母改善了在“瘤胃”条件下另一埃氏巨型球菌菌株在氧气暴露后的乳酸利用率
[0287]
这一实例表明酿酒酵母菌株ysc35用于改善在所谓的“瘤胃”条件下(在含有瘤胃液乳酸的培养基，ph 5.5，39℃，短暂的时间段例如5.5小时的空气暴露)另一埃氏巨型球菌acd1141在氧气暴露后的乳酸利用率。
[0288]
埃氏巨型球菌acd1141是如前面的实例中所述从瘤胃分离的另一埃氏巨型球菌菌株。它比acd1096菌株表现出更高的耐氧性。除了在这一实验中进行5.5小时的更长时间空气暴露外，如之前实例9中所述培养和处理埃氏巨型球菌acd1141和酿酒酵母ysc35。下表9中的乳酸利用率数据示出了在该测定条件下，厌氧埃氏巨型球菌acd1141对照用完了所有乳酸。暴露于空气5.5小时的埃氏巨型球菌acd1141利用了大多数乳酸，并且有18.4mm乳酸剩余。具有酵母ysc35的聚生体中的埃氏巨型球菌acd1141比单独培养的埃氏巨型球菌acd1141利用了更多的乳酸，并且仅有7.3mm残余乳酸。这一实例示出了酵母可以改善聚生体中的更耐氧埃氏巨型球菌acd1141菌株在氧气暴露后的乳酸利用率。
[0289]
表9：实例14的培养上清液(mm)中的残余乳酸浓度
[0290][0291]
实例15：酵母改善了在“贮存期”条件下另一埃氏巨型球菌菌株在氧气暴露后的乳酸利用率
[0292]
这一实例表明酿酒酵母菌株ysc35用于改善在所谓的“贮存期”条件下(rcm培养基，ph 6.8，室温，长时间段例如48小时的空气暴露)另一埃氏巨型球菌acd1141在氧气暴露后的乳酸利用率。
[0293]
埃氏巨型球菌acd1141是更耐氧的埃氏巨型球菌菌株。如实例11中所述，使埃氏巨型球菌acd1141和酿酒酵母菌株ysc35生长并对其进行处理。在室温下伴随空气暴露孵育48小时后，以1:3x倍稀释度将细胞接种至含有10g/l dl-乳酸的基于瘤胃液的培养基中。将细
胞在含有乳酸的培养基中在39℃下厌氧回收6小时，然后以3220g离心10分钟。将上清液通过0.2μm 96孔过滤板(颇尔公司8119)过滤，并且加载到hplc上进行乳酸测量。下表10中的数据示出了在该测定条件下，埃氏巨型球菌acd1141保留了仅利用小部分的乳酸的能力，然而具有酿酒酵母菌株ysc35的聚生体中的埃氏巨型球菌acd1141具有显著改善的乳酸利用率(17.6mm残余乳酸，相较于单独巨球菌属的64.1mm残余乳酸)。
[0294]
表10：实例14的培养上清液(mm)中的残余乳酸浓度
[0295][0296]
实例16：商业酿酒酵母改善埃氏巨型球菌在氧气暴露后的乳酸利用率的用途
[0297]
这一实例描述了几种商业酿酒酵母菌株用于改善埃氏巨型球菌acd1141f在空气中氧气暴露18小时后的乳酸利用率的用途。
[0298]
埃氏巨型球菌acd1141f是acd1141的进化菌株，并且在rcm培养基中在39℃下厌氧培养。然后将细胞相对于od2归一化，并且以11,000xg离心1.5min，去除上清液并且将沉淀重悬于水中。将商业酵母在水中(100mg/10ml)于33℃下在200rpm振荡下再水合15分钟。将埃氏巨型球菌和酿酒酵母细胞在深孔板(康宁96孔测定块，costar3960)中以体积1:1共培养。包括单一菌株对照。在氧气暴露处理中，将具有细胞培养物的板用无菌透气膜(赛默科技公司nunc密封胶带241205)覆盖，并且暴露于空气。在室温下孵育18小时后，以1:3x倍稀释率将细胞接种至含有10g/l dl-乳酸的irfl培养基中。将细胞在irfl中在39℃下厌氧回收6小时，然后以3220g离心10分钟。将上清液通过0.2um(颇尔公司8119)过滤，并且加载到hplc上进行乳酸测量。
[0299]
如下表11所示，在室温下氧气暴露18小时后，在具有任一商业酿酒酵母菌株的聚生体中的埃氏巨型球菌1141f的乳酸利用率显著改善。两种zenith酵母(sc2和sc3)显示出最大的改善，并且两种乙醇酵母(sc1和sc10)显示出最小的改善。在测定条件下，所有仅酵母培养物均未显著利用乳酸。
[0300]
表11.实例16的培养上清液(mm)中的残余乳酸浓度
[0301][0302]
实例17：酵母在对饲料进行追料时对改善埃氏巨型球菌的活力的有益作用
[0303]
这一实例描述了商业酿酒酵母sc3(zenith酵母精料，英联马利集团)在对饲料进行追料时用于改善冷冻干燥的埃氏巨型球菌acd1265f的活力的用途。
[0304]
埃氏巨型球菌acd1265f是acd1265的进化菌株，并且在rcm培养基中在39℃下厌氧培养。制备冷冻干燥的acd1265f，并且将其用于饲料研究(对牛饲料进行dfm追料)中，该牛饲料由70％玉米、15％青贮饲料、10％干草和5％补充剂组成。将dfm(具有或不具有500mg酵母酿酒酵母sc3的1g埃氏巨型球菌acd1265f)在含有2.4％酵母提取物的10ml rcm2溶液中再水合约15min。在250ml烧瓶中将1ml再水合的dfm直接添加至10g高压灭菌饲料混合物的顶部。将开口烧瓶放进30℃、60％湿度的培养箱中0、1或2小时。在饲料暴露后，提取dfm并且将稀释液在厌氧室中在含有12.5μg/ml戊唑醇的rcm板上一式两份进行铺板。将板在39℃下厌氧孵育2天，并且对菌落进行计数。表12中示出了在对含有或不含酿酒酵母sc3的牛饲料进行追料后，埃氏巨型球菌acd1265f的活菌计数。在t0，提取的埃氏巨型球菌1265f计数在有或没有酵母的情况下是相似的。
[0305]
表12.在对含有或不含酿酒酵母sc3的牛饲料进行追料后，埃氏巨型球菌acd1265f的活菌计数(cfu/g)
[0306][0307]
在对饲料进行追料1或2小时后，含有酵母的dfm中提取的埃氏巨型球菌1265f计数比在不含酵母的dfm中提取的埃氏巨型球菌1265f计数高5或6倍。这示出了酵母在对牛饲料进行追料时对改善埃氏巨型球菌的活力具有有益作用。
[0308]
实例18：酵母在饲料中混合时对改善埃氏巨型球菌的活力的有益作用
[0309]
这一实例描述了商业酿酒酵母sc3(zenith酵母精料，英联马利集团)在饲料中混合时用于改善冷冻干燥的埃氏巨型球菌acd1141f或acd1265f的活力的用途。
[0310]
如实例17中所述，制备冷冻干燥的acd1141f和1265f，并且在含有或不含酿酒酵母sc3的情况下将其再水合。在250ml烧瓶中将1ml再水合的dfm添加至10g高压灭菌饲料混合物中，通过振荡混合30秒。将烧瓶在30℃、60％湿度的培养箱中开盖贮存0或2小时。除了没有在烧瓶中添加饲料混合物外，没有以相同的方式进行饲料对照。在饲料暴露后，提取dfm并且将稀释液在厌氧室中在含有12.5ug/ml戊唑醇的rcm板上一式两份进行铺板。将板在39℃下厌氧孵育2天，并且对菌落进行计数。在有或没有饲料暴露的情况下，在t0时1141f和1265f的活菌计数相似。这示出了从饲料提取巨球菌属的效率高于50％。在饲料中混合2小时后，在不具有酵母的情况下几乎检测不到巨球菌属的计数(1-3e+4cfu/g)。如表13所示，在酵母存在的情况下巨球菌属的计数高1-2个对数。
[0311]
表13.在含有或不含酿酒酵母sc3的牛饲料中混合后埃氏巨型球菌acd 1141f和acd 1265f的活菌计数(cfu/g)
[0312][0313]
总之，这一实例表明酵母在饲料中混合时对改善埃氏巨型球菌的活力的有益作用。
[0314]
实例19：酵母在饲料中混合时对改善埃氏巨型球菌的功能的有益作用
[0315]
这一实例描述了商业酿酒酵母sc3(zenith酵母精料，英联马利集团)在饲料中混合时用于改善冷冻干燥的埃氏巨型球菌acd1141f或acd1265f的乳酸利用功能的用途。
[0316]
在实例18中所述的以上饲料测试中，在厌氧室内用100ml rcm培养基提取经饲料暴露的细胞，并且将其在含有10g/l乳酸的基于瘤胃液的培养基(如实例1中所述)中进一步稀释，最终巨球菌属浓度为0.1g/l。将细胞用铝箔盖密封，并且在39℃下厌氧培养过夜。在约20小时孵育后，将残余乳酸通过hplc量化，并且数据示于表14中。不含dfm的培养基空白对照具有初始数量的乳酸。
[0317]
表14.在具有或不具有酿酒酵母sc3的情况下，过夜回收经饲料暴露的埃氏巨型球菌acd 1141f和acd 1265f后的残余乳酸(mm)
[0318][0319]
含有或不含饲料提取物的t0样品消耗了培养基中所有的乳酸。在酵母存在的情况下，经2小时饲料暴露的样品也消耗了所有的乳酸。然而，在不存在酵母的情况下，经2小时饲料暴露的样品没有消耗任何乳酸。这表明酵母改善了饲料暴露后巨球菌属的乳酸利用功能。这一实例示出了在空气暴露的饲料中混合时，将酵母添加至dfm中的巨球菌属的益处。
[0320]
实例20：可溶性多糖作为赋形剂在饲料中混合时改善埃氏巨型球菌的活力
[0321]
这一实例描述了可溶性多糖当与酿酒酵母sc3在饲料中一起混合很长时间(4小时)时进一步改善埃氏巨型球菌acd1141f和acd1265f的冷冻干燥共混物的活力的用途。
[0322]
将冷冻干燥的埃氏巨型球菌acd1141f和acd1265f共混作为混合物，并且将埃氏巨型球菌共混物用于该饲料稳定性测试。将含有1g的埃氏巨型球菌共混物和500mg的酿酒酵母sc3的dfm在含有另外的20mg可溶性多糖(0.2％)的10ml rcm2溶液中再水合，但对照中没有添加多糖。在250ml烧瓶中将1ml再水合的dfm添加至10g高压灭菌饲料混合物中，通过振荡混合30秒。将烧瓶在30℃、60％湿度的培养箱中开盖贮存0、2或4小时。在饲料暴露后，提取dfm并且将稀释液在厌氧室中在含有12.5ug/ml戊唑醇的rcm板上一式两份进行铺板。将板在39℃下厌氧孵育2天，并且对菌落进行计数。
[0323]
饲料提取物的巨球菌属活力计数示于图5中。初始巨球菌属计数是约1e+9cfu/g。在饲料中混合4小时后，无多糖赋形剂的对照具有约5e+5cfu/g。赋形剂黄原胶或菊粉示出增加了约1-2个对数的巨球菌属活力。测试的其他赋形剂(海藻酸盐、羧甲基纤维素cmc、右旋糖酐)没有显示巨球菌属活力的显著改善。
[0324]
实例21：可溶性多糖作为赋形剂在饲料中混合时改善埃氏巨型球菌的乳酸利用率
[0325]
这一实例描述了可溶性多糖当与酿酒酵母sc3在饲料中一起混合很长时间(4小时)时进一步改善埃氏巨型球菌acd1141f和acd1265f的冷冻干燥共混物的乳酸利用率的用途。
[0326]
在如实例20中所述的以上含有可溶性赋形剂的饲料测试中，在厌氧室内用100ml rcm培养基提取暴露于饲料的细胞，并且将其在含有10g/l乳酸的基于瘤胃液的培养基(如实例1中所述)中进一步稀释，最终巨球菌属浓度为0.1g/l。将细胞用铝箔盖密封，并且在39℃下厌氧培养过夜。在约20小时孵育后，将残余乳酸通过hplc量化，并且数据示于图6中。不含dfm的培养基空白对照具有初始数量的乳酸。
[0327]
含有或不含赋形剂的t0和t2小时dfm样品消耗了培养基中所有的乳酸。在黄原胶或菊粉存在的情况下，经t4小时饲料暴露的样品消耗了大多数或所有的乳酸。不含有赋形剂或含有其他赋形剂(海藻酸盐、羧甲基纤维素cmc、右旋糖酐)的样品没有消耗显著数量的乳酸。这与实例20中的活力数据一致。赋形剂黄原胶或菊粉在饲料中混合4小时后改善了巨球菌属的乳酸利用率。测试的其他赋形剂(海藻酸盐、羧甲基纤维素cmc、右旋糖酐)没有显示巨球菌属乳酸利用功能的显著改善。
[0328]
实例22：不溶性多糖作为赋形剂在饲料中混合时改善埃氏巨型球菌的活力
[0329]
这一实例描述了不溶性多糖当与酿酒酵母sc3在饲料中一起混合很长时间(4小时)时进一步改善埃氏巨型球菌acd1141f和acd1265f的冷冻干燥共混物的活力的用途。
[0330]
含有冷冻干燥的acd1141f和acd1265f混合物的埃氏巨型球菌共混物用于该饲料稳定性测试。将含有1g的埃氏巨型球菌共混物和500mg的酿酒酵母sc3的dfm在含有另外的50mg的不溶性多糖(0.5％)阿尔戈国际控股集团有限公司(argo)玉米淀粉或微晶纤维素的10ml rcm2溶液中再水合。将0.5％beneo菊粉用作阳性对照。在250ml烧瓶中将1ml再水合的dfm添加至10g高压灭菌饲料混合物中，通过振荡混合30秒。将烧瓶在30℃、60％湿度的培养箱中开盖贮存0、2或4小时。在饲料暴露后，提取dfm并且将稀释液在厌氧室中在含有12.5ug/ml戊唑醇的rcm板上一式两份进行铺板。将板在39℃下厌氧孵育2天，并且对菌落进行计数。饲料提取物的巨球菌属活力计数示于表15中。
[0331]
表15.在含有0.5％可溶性或不溶性赋形剂的牛饲料中混合后埃氏巨型球菌的活菌计数(cfu/g)。
[0332][0333]
初始巨球菌属计数为约1e+9cfu/g。在饲料中混合4小时后，含有不溶性赋形剂(淀粉或纤维素)的样品示出了与含有菊粉的阳性对照样品相似的巨球菌属活力。这表明不溶性多糖淀粉或纤维素与菊粉一样在饲料中混合时也可以改善巨球菌属的活力。
[0334]
实例23：不溶性多糖作为赋形剂在饲料中混合时改善埃氏巨型球菌的乳酸利用率
[0335]
这一实例描述了不溶性多糖当与酿酒酵母sc3在饲料中一起混合很长时间(4小时)时进一步改善埃氏巨型球菌acd1141f和acd1265f的冷冻干燥共混物的乳酸利用率的用途。
[0336]
在实例22中所述的以上含有不溶性赋形剂的饲料测试中，在厌氧室内用100ml rcm培养基提取暴露于饲料的细胞，并且将其在含有10g/l乳酸的基于瘤胃液的培养基(如实例1中所述)中进一步稀释，最终巨球菌属浓度为0.1g/l。将细胞用铝箔盖密封，并且在39℃下厌氧培养过夜。在约20小时孵育后，将残余乳酸通过hplc量化。培养基空白对照具有初始数量的乳酸。所有含有0.5％不溶性多糖(淀粉或纤维素)作为赋形剂的样品消耗了所有的乳酸，其作为含有0.5％可溶性菊粉的阳性对照。在经4小时饲料暴露的样品以及经2小时或t0饲料暴露的样品中不存在残余乳酸。与实例22中的活力数据一致，不溶性多糖淀粉或纤维素与菊粉一样改善了巨球菌属的乳酸利用率。
[0337]
序列
[0338]
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[0339]
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