凝结芽孢杆菌BC99在制备缓解结肠炎制品或免疫调节制品方面的用途的制作方法

凝结芽孢杆菌bc99在制备缓解结肠炎制品或免疫调节制品方面的用途
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及凝结芽孢杆菌bc99在制备缓解腹泻/结肠炎制品或免疫调节制品方面的用途。


背景技术：

2.凝结芽孢杆菌（bacillus coagulans），革兰阳性，属于硬（或厚）壁菌门。凝结芽孢杆菌分类学上属于芽孢杆菌属，细胞呈杆状，革兰氏阳性菌，端生芽孢，无鞭毛。分解糖类生成l-乳酸，为同型乳酸发酵菌。最适生长温度为45-50℃，最适ph为6.6-7.0。
3.专利申请202110285874.6中记载的一株益生凝结芽孢杆菌bc99被证实具有较强的抑制病原菌的能力，对多种抗生素敏感，生物安全性高，具备潜在的益生功能。该菌株制备的菌粉在咖啡、茶饮料和豆奶粉中应用，表现出热稳定性好，芽孢存活率高。
4.然而，上述现有技术并未报道该凝结芽孢杆菌bc99在其他病原菌方面的抑制作用，也未给出该菌株在缓解消化道病症方面的用途。
5.本领域需要拓宽凝结芽孢杆菌bc99的应用范围。


技术实现要素：

6.基于本领域现有技术存在的上述不足和需求，本发明的目的在于凝结芽孢杆菌bc99在抑制福氏志贺氏菌和/或利用ellman试剂或丙酸酮盐或古老糖和/或制备缓解腹泻/结肠炎药物或免疫调节药物和/或调节肠道菌群方面的用途。
7.本发明的技术方案如下：凝结芽孢杆菌bc99在抑制福氏志贺氏菌和/或利用ellman试剂或丙酸酮盐或古老糖和/或制备缓解腹泻制品或缓解结肠炎制品或免疫调节制品或调节肠道菌群制品方面的用途，所述凝结芽孢杆菌bc99的保藏号为cgmcc no.21801。
8.本发明的凝结芽孢杆菌bc99为中国发明专利申请202110285874.6记载的保藏号为cgmcc no.21801的凝结芽孢杆菌bc99。中国发明专利申请202110285874.6的全部内容通过引用的方式并入本文中。
9.所述缓解腹泻指降低腹泻发生率。
10.所述利用ellman试剂或丙酸酮盐或古老糖指：采用凝结芽孢杆菌bc99利用ellman试剂检测巯基存在，或采用凝结芽孢杆菌bc99将丙酮酸盐转化为短链脂肪酸，或采用凝结芽孢杆菌bc99水解代谢古老糖产生短链脂肪酸。
11.所述凝结芽孢杆菌bc99可以利用ellman试剂检测巯基存在，或利用丙酮酸盐或古老糖合成短链脂肪酸，并作为能量物质被结肠上皮吸收。所述缓解结肠炎包括：降低体重减轻程度、降低疾病活动指数、恢复结肠长度、或降低脾脏系数。
12.所述免疫调节包括：提升il-10水平和/或降低il-6水平或tnf-α水平。
13.所述肠道菌群选自：双歧杆菌属、乳杆菌属、异杆菌属、螺杆菌属、脱硫弧菌属或普雷沃氏菌属。
14.所述调节肠道菌群包括：增加双歧杆菌属、乳杆菌属、异杆菌属或螺杆菌属的微生物丰度，和/或，降低脱硫弧菌属或普雷沃氏菌属的微生物丰度。
15.所述凝结芽孢杆菌bc99对福氏志贺氏菌的抑菌圈直径为32mm。
16.所述制品选自：药物或食品；所述食品优选保健食品。
17.所述食品选自：益生菌固体饮料、冲泡饮料、压片糖果、休闲零食、软糖、调制乳粉、发酵制品、发酵饮料、发酵乳、豆制品、果蔬制品。
18.所述凝结芽孢杆菌bc99已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），其微生物保藏号为cgmcc no.21801；分类命名为：凝结芽孢杆菌bacillus coagulans；保藏时间：2021年02月01日。
19.凝结芽孢杆菌bc99具有较强的耐高温特性，较强的在肠道内存活的能力；对多种常见抗生素敏感，无抗生素耐性，安全性高；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌致病菌均具有显著的抑制作用，在中国专利申请202110285874.6 中首次公开。
20.进一步地，本发明研究发现，所述凝结芽孢杆菌bc99对产肠毒素大肠杆菌（etec）、肠致病性大肠杆菌（epec）、福氏志贺氏菌和单核增生李斯特菌等病原菌具有极其显著的抑制作用。说明凝结芽孢杆菌bc99可以预防或缓解由etec和epec引起的相关腹泻或者其他疾病感染，比如婴幼儿腹泻、旅行者腹泻等。可以预防或缓解由志贺氏菌感染引起的细菌性痢疾以及由单核增生李斯特菌引起的食物中毒等现状。
21.本发明研究通过小鼠结肠炎模型，进行了凝结芽孢杆菌bc99对缓解小鼠腹泻、改善结肠炎、提升免疫力和调节肠道菌群的功能研究。
22.本发明动物模型实验研究发现，所述凝结芽孢杆菌bc99能够预防和减缓小鼠腹泻，小鼠没有出现腹泻现状。能够显著降低dss诱导结肠炎小鼠的疾病活动指数（dai），减缓小鼠体重降低，减缓结肠长度变短，小鼠结肠长度的恢复到空白组的91%以上，以及降低小鼠的脾脏系数。
23.所述凝结芽孢杆菌bc99能够显著提升实验小鼠肠道免疫力，能够显著提高小鼠结肠组织抗炎因子的表达，使得小鼠结肠抗炎因子il-10的表达量完全恢复正常水平，能够降低促炎因子的表达。
24.所述凝结芽孢杆菌bc99能够具有调节肠道菌群的作用。可以提升observed species、chao1和ace指数，增加小鼠肠道微生物群落的丰富度。提升shannon指数，增加小鼠的肠道菌群多样性。能够增加肠道中有益微生物双歧杆菌属和乳杆菌属的丰度，降低肠道中有害微生物脱硫弧菌属和普雷沃氏菌属的丰度。
25.基于上述内容，本发明提供如下应用和产品：本发明提供了凝结芽孢杆菌bc99在制备各类食品或药品中的应用。
26.所述的食品包括但不限于益生菌固体饮料、冲泡饮料、压片糖果、休闲零食、软糖、调制乳粉、发酵制品、发酵饮料、发酵乳、豆制品、果蔬制品和功能性保健品。
27.所述食品特别包含在缓解结肠炎、调节肠道菌群和或提升免疫力的保健食品。
28.本发明提供的凝结芽孢杆菌bc99在制备的保健食品中可以作为活性成分，也可以作为辅料、添加剂，起到缓解结肠炎、调节肠道菌群和或提升免疫力的作用。
29.所述药物包括但不限于微生态制剂。所述药品的剂型为粉剂、颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
30.本发明的有益效果在于：本发明提供凝结芽孢杆菌bc99已经被证实具有较强的耐胃酸耐胆盐能力；对多种常见抗生素敏感，无抗生素耐性，安全性高；对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌致病菌均具有显著的抑制作用。此外进一步实验发现，该菌株对产肠毒素大肠杆菌（etec）、肠致病性大肠杆菌（epec）、福氏志贺氏菌和单核增生李斯特菌等病原菌具有极其显著的抑制作用。通过小鼠动物试验证明凝结芽孢杆菌bc99能有效预防和缓解腹泻，通过凝结芽孢杆菌bc99干预后，小鼠未发生腹泻情况。凝结芽孢杆菌bc99能够有效缓解结肠炎的作用，小鼠的疾病活动指数（dai）显著降低，小鼠体重降低减缓，而且小鼠的结肠长度恢复到空白组的91%以上。凝结芽孢杆菌bc99能够提升肠道免疫力，使得抗炎因子的水平il-10恢复到正常水平，同时具有增加肠道菌群丰富度和多样性，增加有益菌丰度，降低有害菌丰度。该菌株具有优良的益生特性和显著功效，将其应用到各类食品或药品领域中具有巨大的应用前景。
31.本发明证实了凝结芽孢杆菌bc99在促进有益微生物（例如，双歧杆菌属）生长、抑制有害微生物（例如，福氏志贺氏菌）生长，提升肠道免疫力（例如，提升il-10的表达水平）和有效缓解结肠炎（例如，恢复结肠长度）等方面均具有显著作用。该菌株具有优良生理特性和显著功效，将其应用到各类食品或药品领域中具有巨大的应用前景。
32.本发明凝结芽孢杆菌bc99的保藏信息如下：保藏编号：cgmcc no. 21801；分类命名：凝结芽孢杆菌bacillus coagulans；保藏日期：2021年02月01日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
附图说明
33.图1为本发明实验例2测试的凝结芽孢杆菌bc99的耐受能力。
34.图2 为本发明实验例6统计的不同组别小鼠dss造模期间的体重变化。
35.图3为本发明实验例6统计的不同组别小鼠疾病活动指数dai指数变化。
36.图4为本发明实验例6测量的不同组别小鼠的结肠长度。
37.图5 为本发明实验例6计算的不同组别小鼠的脾脏系数。
38.图6 为本发明实验例6观察的不同组别小鼠结肠组织he染色切片。
39.图3-图6中，ct组代表对照组，dss组代表模型组，bc99代表益生菌+dss组。
40.图7为本发明实验例7统计的不同组别小鼠结肠组织炎症因子的影响，图中ct组代表对照组，bc99组代表益生菌+dss组。
41.图8 为本发明实验例8检测的不同组小鼠粪便中微生物的丰度数据比较，图中空白组代表对照组，bc99组代表益生菌+dss组。
具体实施方式
42.下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
43.生物材料的来源本发明实施例使用的凝结芽孢杆菌bc99为中国发明专利申请202110285874.6记载的凝结芽孢杆菌bc99，其保藏号为cgmcc no.21801。
44.实验例3使用的产肠毒素大肠杆菌（etec）、肠致病性大肠杆菌（epec）、福氏志贺氏菌和单核增生李斯特菌购自广东省微生物菌种保藏中心。
45.实验例4-9使用的小鼠购自华中农业大学动物中心。
46.本发明的实施例提供凝结芽孢杆菌bc99在抑制福氏志贺氏菌和/或利用ellman试剂或丙酸酮盐或古老糖和/或制备缓解腹泻制品或缓解结肠炎制品或免疫调节制品或调节肠道菌群制品方面的用途，所述凝结芽孢杆菌bc99的保藏号为cgmcc no.21801。
47.任何人培养、扩繁、发酵、生产、制备、或利用保藏号为cgmcc no.21801的凝结芽孢杆菌bc99抑制福氏志贺氏菌或制备抑制福氏志贺氏菌制品，和/或，培养、扩繁、发酵、生产、制备、或采用保藏号为cgmcc no.21801的凝结芽孢杆菌bc99利用ellman试剂或丙酸酮盐或古老糖，和/或，培养、扩繁、发酵、生产、制备、或使用保藏号为cgmcc no.21801的凝结芽孢杆菌bc99制备缓解腹泻制品或缓解结肠炎制品或免疫调节制品或调节肠道菌群制品或缓解腹泻或缓解结肠炎或调节免疫或调节肠道菌群的行为均落入本发明的保护范围。
48.在具体的实施例中，所述缓解腹泻指降低腹泻发生率。
49.在一些实施例中，所述利用ellman试剂或丙酸酮盐或古老糖指：采用凝结芽孢杆菌bc99利用ellman试剂检测巯基存在，或采用凝结芽孢杆菌bc99将丙酮酸盐转化为短链脂肪酸，或采用凝结芽孢杆菌bc99水解代谢古老糖产生短链脂肪酸。
50.在另一些实施例中，所述缓解结肠炎包括：降低体重减轻程度、降低疾病活动指数、恢复结肠长度、或降低脾脏系数。
51.在另一些具体的实施例中，所述免疫调节包括：提升il-10水平和/或降低il-6水平或tnf-α水平。
52.在优选的实施例中，所述肠道菌群选自：双歧杆菌属、乳杆菌属、异杆菌属、螺杆菌属、脱硫弧菌属或普雷沃氏菌属。
53.在进一步的实施例中，所述调节肠道菌群包括：增加双歧杆菌属、乳杆菌属、异杆菌属或螺杆菌属的微生物丰度，和/或，降低脱硫弧菌属或普雷沃氏菌属的微生物丰度。
54.在一些实施例中， 所述凝结芽孢杆菌bc99对福氏志贺氏菌的抑菌圈直径为32mm。
55.在具体的实施例中，所述制品选自：药物或食品；所述食品优选保健食品。
56.在更具体的实施例中，所述食品选自：益生菌固体饮料、冲泡饮料、压片糖果、休闲零食、软糖、调制乳粉、发酵制品、发酵饮料、发酵乳、豆制品、果蔬制品。
57.本领域技术人员可根据实际生产需要，结合食品/药品领域生产工艺的常规技术手段或基本常识（例如，《食品生产概论》、《食品与食品生产百科全书》、《食品加工技术》、《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等），对食用辅料或药用辅料进行常规选择或调整，进而制成不同的剂型、不同存储条件、不同保质期的药物或食品，这对于本领域技术人员而言无技术障碍，是可以并容易做到的。
58.实验例1、凝结芽孢杆菌bc99的生理生化实验
全自动微生物分析系统和vitek bcl鉴定卡对凝结芽孢杆菌菌株bc99的生理生化特征进行鉴定。生理生化特征结果显示如下：该菌株能利用d-甘露糖、l-鼠李糖、麦芽三糖、d-松三糖、d-葡萄糖、d-半乳糖、n-乙酰-d-氨基葡萄糖、d-塔格糖、d-核糖、古老糖、d-海藻糖、α-半乳糖甘酶、苯丙氨酸芳胺酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、l-脯氨酸芳胺酶、甲基-α-d-吡喃葡萄糖苷酸化、β-葡糖甘酶、α-葡萄糖苷酶、β-半乳糖甘酶、酪氨酸芳胺酶、l-吡咯烷酮芳胺酶。丙酮酸盐、ellman试剂和七叶苷水解阳性。
59.凝结芽孢杆菌bc99可具体利用下述物质进行下述实验：（1）利用碳水化合物能力：d-甘露糖、l-鼠李糖、麦芽三糖、d-松三糖、d-葡萄糖、d-半乳糖、n-乙酰-d-氨基葡萄糖、d-塔格糖、d-核糖、古老糖、d-海藻糖阳性。
60.古老糖（palatinose）也称异麦芽酮糖，不能被人体吸收利用。而凝结芽孢杆菌bc99菌株能够水解代谢古老糖，产生短链脂肪酸，抑制肠道病原菌，调节肠道菌群，降低炎症反应，调节免疫，诱导癌细胞凋亡等生理功能。凝结芽孢杆菌bc99可以利用古老糖进行益生菌增殖，具有益生元活性。
61.（2）产酶实验：α-半乳糖甘酶、苯丙氨酸芳胺酶、丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶、l-脯氨酸芳胺酶、甲基-α-d-吡喃葡萄糖苷酸化、β-葡糖甘酶、α-葡萄糖苷酶、β-半乳糖甘酶、酪氨酸芳胺酶、l-吡咯烷酮芳胺酶阳性。
62.（3）利用盐类：丙酮酸盐阳性，可以利用丙酮酸盐合成短链脂肪酸。
63.（4）ellman试剂阳性，表明被检测样品中有巯基存在。ellman 试剂 (dtnb) 与巯基基团反应生成有色产物，一般用此显色反应测定溶液中的游离巯基。凝结芽孢杆菌bc99具有利用含巯基氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸）产生短链脂肪酸的能力。在氨基酸降解过程中伴随有氨化作用和脱巯基反应，释放出的巯基与ellman 试剂 (dtnb)发生特异性反应生成有色产物。许多细菌无法利用含巯基氨基酸而不能释放自由巯基，因此与ellman 试剂作用时会呈现ellman试剂阴性反应。
64.（5）苷类：七叶苷水解阳性，可以水解七叶苷为葡萄糖和七叶素。
65.（6）a组基础培养基，基础培养基配方是：酵母提取物2.5g/l、蛋白胨5g/l、吐温80（1g/l）、k2hpo4·
3h2o (2g/l)、mgcl
2 (0.50g/l)、znso4·
7h2o (0.2g/l)、cacl
2 (0.15g/l)、fecl3·
6h2o (0.003g/l)、l-半胱氨酸盐酸盐（0.5g/l）；b组基础培养基+2%（m/v）古老糖；c组基础培养基+2%（m/v）丙酮酸盐。不同处理的培养基中按2%（v/v）接种量接种过夜培养的凝结芽孢杆菌bc99，在42℃条件下摇床恒温培养36h后，得到不同组别的发酵液。分别取凝结芽孢杆菌bc99发 酵 液，10000r/min，离心15min后除去菌体留上清液，经0.22μm滤器过滤后，进行稀释，进样10μl进行cg-ms检测凝结芽孢杆菌bc99发酵液中各短链脂肪酸含量，每组3个重复取平均值计算结果。其中发酵液用ellman试剂检测时呈阳性反应，发酵液显示黑色，证明有巯基存在，而不添加ellman试剂的发酵液颜色不发生变化。试验结果如下表1：表1.不同组别短链脂肪酸含量（g/l）
实验例2、凝结芽孢杆菌bc99的耐受能力（1）模拟人工胃液制备：配制0.5%氯化钠溶液，加入0.3%胃蛋白酶，用1mol/l hcl调节ph值至2.5，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
66.（2）胆盐培养液：胆盐0.3%、巯基乙酸钠0.2%、mrs液体培养基，ph6.0～6.2，118℃，15min灭菌。
67.（3）耐受能力测试：制备凝结芽孢杆菌bc99菌悬液，分别取1ml，离心、收集菌体，然后加入1ml的上述不同处理液中，于37℃培养2.5h，用稀释平板法测定处理前后的活菌总数（cfu/ml），计算存活率。其中，存活率%=nt/n0
×
100%，式中n0表示菌株未经耐受的活菌数（cfu/ml），nt表示经过耐受之后的活菌数（cfu/ml）。
68.实验结果如图1所示，凝结芽孢杆菌bc99具有较强的耐受人工胃液和胆盐的能力，具有较强的通过胃肠道的能力，保持较高的存活率。
69.实验例3、凝结芽孢杆菌bc99抑制病原菌实验（1）凝结芽孢杆菌bc99发酵液制备：将凝结芽孢杆菌bc99按一定比例接种至液体mrs培养基中，42℃培养24h，得到发酵液。
70.（2）指标菌菌液制备：将指示菌株分别在lb固体平板培养基上活化，37℃培养24h，挑取菌苔至生理盐水制备菌悬液，调整菌悬液浓度至108cfu/ml。
71.（3）抑菌实验：将含有1.5%琼脂的肉汤培养基冷却至55℃左右，与指示菌株菌悬液按一定比例混匀，调节指示菌浓度（106cfu/ml），然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，在每孔中加入200μl拮抗菌液（108cfu），以200μl无菌mrs液体培养基作为空白对照，静置数分钟后，放入37℃恒温培养箱中，培养适宜时间后观察，用游标卡尺测量抑菌圈直径，每个菌三个重复，结果见表2。
72.表2. 对病原菌的拮抗能力
专利申请202110285874.6中已经实验表明，凝结芽孢杆菌bc99对常见的病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌有显著的抑制作用，进一步实验由表1结果可知，凝结芽孢杆菌bc99对以上四种病原菌具有极其显著的抑制作用。表现出凝结芽孢杆菌bc99对拮抗不同病原菌显示出极强的优势。
73.实验例4、凝结芽孢杆菌bc99对balb/c雄性小鼠毒性试验将凝结芽孢杆菌bc99芽孢重悬于pbs溶液中，制成浓度为5.0
×
109cfu/ml的菌悬液。取体重18～20g的健康雄性balb/c小鼠10只，适应环境5天后，每日给予该浓度菌悬液灌胃一次，观察一周，记录死亡和体重情况。
74.这些结果表明，灌胃浓度5.0
×
109cfu/ml的凝结芽孢杆菌bc99小鼠均健康存活，体重增加，无死亡现象产生。
75.实验例5、凝结芽孢杆菌bc99缓解小鼠腹泻的作用实验取sfp级c57bl/c雄性小鼠30只，体重18-20g。动物饲养室温温度 23
±
2℃，相对湿度在40%～60%，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下适应饲养5天后随机分组，每组10只，分为4组，包括对照组（ct组）、模型组（dss组）、和益生菌+dss组（bc99组），试验期14天。
76.适应饲养5天，所有小鼠不同组在适应期内均喂养常规饲料和饮水。适应期结束后，对照组（ct组），试验开始到结束期间每天自由进食和饮水；模型组（dss），前7天自由进食和饮水，第8天开始在小鼠饮水中添加3%（w/v）dss溶液；益生菌+dss组（bc99组）：前7天每天灌胃含2.0
×
109cfu/ml凝结芽孢杆菌bc99的pbs溶液0.2ml；从第8天开始，灌胃含2.0
×
109cfu/ml凝结芽孢杆菌bc99的pbs溶液0.2ml，同时自由饮用添加有3.5% dss溶液。
77.在试验造模和干预期间每天观察不同组小鼠的腹泻情况，与对照组相比，模型组小鼠在dss给药的第三天开始出现腹泻症状，在第5天，模型对照组小鼠出现水样粪便，给药7天后，小鼠腹泻症状有60%。而bc99组在整个干预实验过程中，小鼠未出现腹泻症状。说明凝结芽孢杆菌bc99能有效减缓和预防小鼠的腹泻发生率。
78.实验例6、凝结芽孢杆菌bc99对dss诱导结肠炎小鼠症状的缓解作用小鼠模型及处理方法同实验例5。造模期间，每日记录小鼠体重，收集粪便测试隐血情况，计算各组小鼠的疾病活动指数dai评分。实验结束后，摘眼取血引颈处死所有小鼠，解剖后记录结肠长度，脾脏重量，保存结肠盲肠样品。
79.（1）体重变化率和疾病活动指数（dai）评分造模期间各组小鼠的体重变化率如图2所示，其中小鼠体重变化率＝当天体重/初始体重
×
100%。
80.造模第4天，dss组小鼠体重开始下降，在造模第7天，dss组小鼠体重降低了22.17%，而bc99+dss组干预组小鼠体重在第5天开始下降，7天后，bc99+dss组干预组小鼠体重仅降低了5.21%，由此可见，小鼠通过凝结芽孢杆菌bc99干预后，小鼠的体重减轻程度是显著低于造模组。
81.疾病活动指数（dai）主要包括三个方面，分别是体重下降率，粪便性状和便血情况，其中体重下降率=1-体重变化率，dai＝体重下降百分比得分+便血分数+大便性状分数。具体评分项目的评分标准如表3所示。
82.表3. 动物疾病活动指数评分指标
造模期间各组小鼠的疾病活动指数（dai）评分如图3所示，造模结束时第7天，dss组小鼠的dai指数升高到9.6，而凝结芽孢杆菌bc99干预后，bc99组使小鼠的dai指数降低至3.1。由此可见，小鼠通过凝结芽孢杆菌bc99干预后，小鼠的疾病活动指数（dai）评分是显著低于造模组，降低比例是67.71%。
83.（2）结肠长度测量各组小鼠在造模结束解剖后，取整段结肠(盲肠末端至肛门)，测量结肠长度如图4所示。对照组（ct）小鼠的结肠表面光滑，呈现正常红色现象，粪便呈颗粒状，结肠长度为7.51cm；而模型组（dss）小鼠的结肠长度极显著缩短，存在肠壁水肿充血症状，粪便不成型，结肠长度仅为4.47cm；经过凝结芽孢杆菌bc99干预后，能显著增加结肠长度，对结肠炎小鼠的结肠长度有极显著的恢复作用，bc99组干预组小鼠的结肠长度达到6.87cm，小鼠结肠长度的恢复到91.48%。（3）脾脏系数影响各组小鼠在造模结束解剖后，小心取出小鼠完整脾脏观察并称重，计算脾脏系数，其中脾脏系数（%）=脾脏重量/小鼠体重
×
100%。
84.脾脏系数结果如图5所示，经过凝结芽孢杆菌bc99干预后，对降低小鼠脾脏系数具有极显著促进作用。
85.（4）结肠组织he染色将小鼠处死解剖后，取适量长度小鼠结肠组织，然后将其浸泡于4%多聚甲醛固定，脱水，包埋，he染色。通过在不同倍数下详细观察各组小鼠结肠组织切片情况，结果如图6所示。
86.小鼠模型及处理方法同实验例5。将小鼠处死解剖后，取各组小鼠结肠组织，通过elisa酶联免疫法测定每组小鼠结肠组织匀浆中抗炎因子 il-10和促炎因子il-6、 tnf-α的表达量。
87.结果见表4、图7所示：与对照组比，模型组结肠组织中抗炎因子il-10 的含量显著降低，促炎因子il-6、tnf-α的含量显著升高。与模型组相比较，经凝结芽孢杆菌bc99干预后，bc99组结肠组织中抗炎因子il-10 的含量极显著升高，促炎因子il-6、tnf-α的含量显著降低。与对照组相比，经凝结芽孢杆菌bc99干预后，bc99组的抗炎因子il-10的含量恢复到正常水平。实验表明，通过凝结芽孢杆菌bc99干预，能够调节小鼠肠道免疫能力，显著降低小鼠结肠组织中促炎因子的表达，显著提高抗炎因子的表达。
88.表4.凝结芽孢杆菌bc99对小鼠的免疫调节作用（pg/ml）
实验例8、凝结芽孢杆菌bc99对小鼠肠道菌群的调节作用小鼠模型及处理方法同实验例5。采用高通量illumina hiseq 测序平台，将下机数据进行分析后，结果见表5所示。使用qiime2软件，对样品alpha多样性指数进行评估。alpha多样性（alpha diversity）反映的是单个样品物种丰度（richness）及物种多样性（diversity）。observed species 指数、丰富度指数（chao1指数和ace 指数）来衡量不同小鼠分组的微生物群落丰富度，指数越大，物种越丰富；shannon指数是衡量微生物群落的多样性，shannon指数越大群落所含的信息量愈大，说明物种多样性越高。
89.研究结果表明，模型组小鼠observed species、chao1和ace指数均低于对照组，差异显著，说明结肠炎小鼠的肠道菌群丰富度显著下降；bc99组observed species、chao1和ace指数均高于模型组，且差异显著，其中observed species、chao1指数略微高于对照组，表明经过凝结芽孢杆菌bc99干预后，可恢复结肠炎小鼠肠道微生物群落的丰富度。多样性指数shannon高于模型组，差异显著；说明通过凝结芽孢杆菌bc99干预后，小鼠肠道微生物群落的多样性增高。由此可知，凝结芽孢杆菌bc99可以增加小鼠的肠道菌群丰富度和多样性。
90.表5. 不同组小鼠肠道菌群的丰度和多样性比较不同组小鼠粪便中微生物的丰度的检测分析结果如图8所示，与模型组相比较，经过凝结芽孢杆菌bc99干预后，bc99组中，双歧杆菌属、乳杆菌属、异杆菌属和螺杆菌属有益微生物丰度显著增加，而脱硫弧菌属和普雷沃氏菌属有害微生物的丰度显著降低。模型组中，双歧杆菌属和异杆菌属的丰度极低，几乎不存在。但是经过凝结芽孢杆菌bc99干预后，bc99组中双歧杆菌属、乳杆菌属和异杆菌属的丰度与对照组的丰度已经很接近。由此可以说明，凝结芽孢杆菌bc99干预后，能促进肠道中有益微生物的生长，增加肠道中有益微生物的丰度；抑制有害微生物的生长，降低肠道中有害微生物的丰度，从而起到调节肠道菌群的作用。
91.实验例9、凝结芽孢杆菌bc99对结肠炎小鼠短链脂肪酸含量的影响小鼠模型及处理方法同实验例5。实验结束前收集小鼠盲肠内容物，利用gc-ms测定小鼠粪便中短链脂肪酸含量。实验结果如表6所示。
92.实验结果表明，与空白组相比，模型组小鼠粪便中短链脂肪酸总量显著减少；与模型组相比，凝结芽孢杆菌bc99 显著提高了小鼠粪便中短链脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）的含
量，且丙酸含量与对照组差异不显著，乙酸、丁酸含量高于对照组。说明凝结芽孢杆菌bc99对于增加粪便中短链脂肪酸含量有重要作用，通过增加短链脂肪酸含量来改善结肠组织损伤，调节肠道菌群和机体的免疫能力。
93.表6. 小鼠粪便中短链脂肪酸含量（单位：μmol/g）