一种兼具高效乳化性和抗氧化活性的乳清蛋白-刺梨多糖共聚物及其制备方法

1.本发明属于食品加工技术领域，具体涉及天然活性刺梨多糖共价接枝提高乳清蛋白乳化性及抗氧化活性的制备方法。


背景技术：

2.乳清蛋白具有较高的营养价值，可以被人体消化吸收。现今乳清蛋白被应用于食品原料、功能性食品、乳化剂等多个领域。乳清蛋白具有一定的乳化能力，但是其功能性质往往受到ph、温度、离子强度等因素影响。因此可以通过对乳清蛋白改性来提高其功能性质，拓展乳清蛋白的应用范围。
3.糖基化改性是一种常见的蛋白改性方法，通过蛋白与多糖的共价接枝可以改变蛋白的界面性质，从而提高蛋白的乳化能力。美拉德反应是一种简单有效的可以获得蛋白质-糖共聚物的方法。美拉德反应又称为羰氨缩合，其反应原理是蛋白质分子上的游离氨基与还原糖上的羰基反应生成席夫碱(schiff base)，席夫碱再经过重排形成酮胺化合物。通过美拉德反应可以改善蛋白的功能性质，提高蛋白的乳化性能，增强乳液的稳定性。
4.目前，美拉德反应制备蛋白质-多糖共聚物主要通过干热法，然而干热法耗时长且不利于大量制备。此外，糖基化改性多采用单糖、寡糖，使用多糖改性也主要集中于葡聚糖、阿拉伯胶等非活性多糖，这导致了共聚物的功能性质单一，在应用于乳液体系中受到限制。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的缺陷，提供一种乳清蛋白-刺梨多糖共聚物制备方法，可以提高乳清蛋白的乳化性和抗氧化性。
6.为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
7.一种兼具高效乳化性和抗氧化活性的乳清蛋白-刺梨多糖共聚物的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)刺梨多糖溶液的配制：将提取的刺梨多糖，加水搅拌，使多糖充分溶解；
9.(2)蛋白溶液的配制：将乳清蛋白，加水搅拌，使蛋白充分溶解；
10.(3)通过美拉德反应制备蛋白多糖共聚物：将乳清蛋白溶液和刺梨多糖溶液混合后，在55～75℃下反应1～9h，达到反应时间后，迅速冷却，即制得乳清蛋白-刺梨多糖共聚物。
11.优选地，所述刺梨多糖的提取，包括以下步骤：
12.首先，将刺梨粉碎，粉末用95％(v/v)乙醇进行脱脂；
13.然后，采用热水水提，将滤液经减压浓缩，并用无水乙醇进行沉淀，使乙醇浓度为80％(v/v)；
14.最后，用sevage试剂脱蛋白，直到无白色沉淀，脱除杂质后，再进行透析和冻干，即得刺梨多糖。葛根、桑葚多糖采用同样的方法制得。
15.优选地，所述脱脂的条件为：在70℃下搅拌脱脂3h；所述水提的条件为：加热搅拌90℃提取3h，离心，滤渣重提一次；所述sevage试剂为氯仿：正丁醇＝4：1体积比。
16.优选地，步骤(3)所述反应温度为65～70℃，反应时间为3～5h。
17.优选地，步骤(1)所述刺梨多糖溶液的浓度为10
±
5mg/ml，步骤(2)所述蛋白溶液的浓度为10
±
5mg/ml。
18.优选地，步骤(3)所述乳清蛋白与刺梨多糖的质量比为1：1。
19.上述方法制得的乳清蛋白-刺梨多糖共聚物兼具高效乳化性和抗氧化性可以作为乳化剂应用。
20.刺梨多糖在上消化道不易分解破坏，因此本发明用刺梨多糖共价接枝乳清蛋白制备的乳液可以最大限度保留其活性成分，待活性成分在体内释放后，可利用刺梨多糖的益生作用调节肠道健康。此外，刺梨多糖通过美拉德反应得到的共聚物，不仅能够提高乳清蛋白的乳化能力还能兼具抗氧化性能。本发明可以应用于食品体系中，作为一种多功能乳化剂，达到抑制油脂氧化、提高乳液氧化稳定性以及调节肠道菌群的作用。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
22.(1)通过该方法制备的乳清蛋白-天然活性刺梨多糖共聚物提高了乳清蛋白的乳化性、乳化稳定性。
23.(2)通过该方法制备的乳清蛋白-天然活性刺梨多糖共聚物提高了乳清蛋白的抗氧化能力。
附图说明
24.图1为不同天然活性多糖与乳清蛋白接枝后的乳化活性(ea)与乳化稳定性(es)图。
25.图2为不同天然活性多糖与乳清蛋白接枝后的氧自由基吸收能力(orac)。
26.图3为本发明不同条件下制备的乳清蛋白-天然活性刺梨多糖共聚物的外观图，左一到左五依次为在反应温度55、60、65、70、75℃时制得的乳清蛋白-刺梨多糖共聚物(wpi-rtfp)。
27.图4为不同温度条件下乳清蛋白-刺梨多糖共聚物的乳化活性(ea)与乳化稳定性(es)。
28.图5为不同温度条件下乳清蛋白-刺梨多糖共聚物的氧自由基吸收能力(orac)。
29.图6为不同时间条件下乳清蛋白-刺梨多糖共聚物的乳化活性(ea)与乳化稳定性(es)。
30.图7为不同时间条件下乳清蛋白-刺梨多糖共聚物的氧自由基吸收能力(orac)。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
32.实施例1
33.(1)将刺梨、葛根、桑葚粉碎，称500g粉末用3l 95％(v/v)乙醇进行脱脂，在70℃下搅拌脱脂3h，离心、烘干。然后，采用热水水提的方法，料液比为1:30，搅拌加热90℃提取3h，
离心，滤渣重提一次。将滤液经减压浓缩，设置温度为55℃。并用无水乙醇进行沉淀，直至乙醇浓度为80％(v/v)，4℃冰箱过夜，烘干。接下来，用sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)脱蛋白，直到无白色沉淀。并用500g ab-8树脂吸附15000ml溶液，使色素等杂质脱除。最后，将3000da透析袋透析得到的液体进行冻干，得到粗多糖。
34.(2)用去离子水分别配制蛋白、多糖溶液，搅拌3h，4℃过夜，使蛋白或多糖充分溶解，浓度均为10mg/ml。
35.(3)将乳清分离蛋白与多糖按照1：1比例混合均匀，蛋白初浓度恒定为10mg/ml。在70℃下反应3h。达到反应时间后，迅速冷却，4℃贮存以备用。
36.本发明对实施例1制备的共聚物进行乳化活力(ea)、乳化稳定性(es)以及氧自由基吸收能力(orac)检测。
37.该测试包括：
38.将2ml玉米油分别加入8ml 0.5％(w/v)实施例1中样品溶液中，用高速均质机均质(20000r/min，2min)。立刻从乳液底部吸取50μl乳液至10ml离心管中。吸取5ml 0.1％sds(w/v)于离心管中，混匀后，在500nm处测吸光值。静置10min后，测吸光值。以去离子水代替乳液作为空白对照。根据吸光值计算样品乳化活力指数(eai)和乳化稳定性指数(esi)。
39.用75mm ph＝7.4的磷酸盐缓冲液配制95.6nm的荧光素钠溶液和120mm的aaph溶液。在黑色96孔板中加入20μl的样品和200μl的荧光素钠，然后在荧光分光仪中震摇10s，孵育15min。孵育结束后，每孔加入20μl的aaph试剂。设置荧光分光仪激发波长为485nm、吸收波长为535nm，每隔3min记录一次荧光值，共循环35次。以磷酸缓冲液为空白对照，用trolox做标准曲线(6.25-100μm)，计算样品的orac值。
40.本发明实施例考察了不同天然活性多糖与乳清蛋白接枝后的乳化活性(ea)与乳化稳定性(es)，如图1。在用不同天然活性多糖制备的共聚物中，相较原始蛋白，乳清蛋白-桑葚多糖(wpi-mfp)的esi略有升高，乳清蛋白-刺梨多糖(wpi-rtfp)的eai和esi提高最为明显，而乳清蛋白-葛根多糖(wpi-plp)eai和esi下降。不同天然活性多糖与乳清蛋白接枝后的氧自由基吸收能力(orac)，如图2。在用不同天然活性多糖制备的共聚物中，相较原始蛋白，wpi-mfp、wpi-plp、wpi-rtfp共聚物的抗氧化性均有明显提高，且刺梨多糖的orac值提高最为明显。因此刺梨多糖是一种较为理想的可用于改性乳清蛋白，提高其乳化能力和抗氧化性的天然原料。
41.实施例2
42.(1)将刺梨粉碎，称500g粉末用3l 95％(v/v)乙醇进行脱脂，在70℃下搅拌脱脂3h，离心、烘干。然后，采用热水水提的方法，料液比为1:30，搅拌加热90℃提取3h，离心，滤渣重提一次。将滤液经减压浓缩，设置温度为55℃。并用无水乙醇进行沉淀，直至乙醇浓度为80％(v/v)，4℃冰箱过夜，烘干。接下来，用sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)脱蛋白，直到无白色沉淀。并用500g ab-8树脂吸附15000ml溶液，使色素等杂质脱除。最后，将3000da透析袋透析得到的液体进行冻干，得到粗多糖。
43.(2)用去离子水分别配制蛋白、多糖溶液，搅拌3h，4℃过夜，使蛋白或糖充分溶解，浓度均为10mg/ml。
44.(3)将乳清分离蛋白与刺梨多糖按照1:1比例混合均匀，蛋白初浓度恒定为10mg/ml。在一定温度条件下(55、60、65、70、75℃)反应3h。达到反应时间后，迅速冷却，4℃贮存以
备用。
45.本发明实施例考察了乳清蛋白(浓度5mg/ml)、乳清蛋白-刺梨多糖共聚物(在不同反应温度下制得)的乳化活力(ea)和乳化稳定性(es)，测试方法同实施例1，结果如图4所示。乳清蛋白-刺梨多糖在55～75℃的温度范围内，eai和esi随着温度上升而不断增大。但值得注意的是，在75℃时虽然检测出eai、esi最高，然而此时溶液浑浊不稳定(图3)，因此不能以此温度为最佳反应温度。反应温度在55℃、60℃时反应程度很低，此时对应温度下的乳化性能相对较差。乳清蛋白、乳清蛋白-刺梨多糖共聚物(在不同反应温度下制得)的氧自由基吸收能力(orac)，测试方法同实施例1，如图5。乳清蛋白-刺梨多糖在55～75℃的温度范围内，抗氧化性随着温度升高呈现出先增大后减小的趋势，且在65、70℃达到最大orac值。因此，在本实验条件下，乳清蛋白与刺梨多糖反应温度优选选择为65～70℃，并采用70℃温度做后续优化。
46.实施例3
47.(1)将刺梨粉碎，称500g粉末用3l 95％(v/v)乙醇进行脱脂，在70℃下搅拌脱脂3h，离心、烘干。然后，采用热水水提的方法，料液比为1:30，搅拌加热90℃提取3h，离心，滤渣重提一次。将滤液经减压浓缩，设置温度为55℃。并用无水乙醇进行沉淀，直至乙醇浓度为80％(v/v)，4℃冰箱过夜，烘干。接下来，用sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)脱蛋白，直到无白色沉淀。并用500g ab-8树脂吸附15000ml溶液，使色素等杂质脱除。最后，将3000da透析袋透析得到的液体进行冻干，得到粗多糖。
48.(2)用去离子水分别配制蛋白、多糖溶液，搅拌3h，4℃过夜，使蛋白或多糖充分溶解，浓度均为10mg/ml。
49.(3)将乳清分离蛋白与刺梨多糖按照1:1比例混合均匀，蛋白初浓度恒定为10mg/ml。在优化温度下反应一定时间(1、3、5、7、9h)。达到反应时间后，冰水浴迅速冷却，4℃贮存以备用。
50.本发明实施例考察了乳清蛋白(浓度5mg/ml)、乳清蛋白/刺梨多糖混合物(wpi/rtfp)、乳清蛋白-刺梨多糖共聚物(在不同反应时间下制得)的乳化活力(ea)和乳化稳定性(es)，测试方法同实施例1，结果如图6。乳清蛋白和刺梨多糖在70℃条件下加热1～9h，eai随着反应时间的增加先上升然后保持稳定，当反应时间过长时eai降低。而esi随着反应时间先增大后减小，在反应5h处有最大稳定性。乳清蛋白、乳清蛋白-刺梨多糖共聚物(在不同反应时间下制得)的氧自由基吸收能力(orac)，测试方法同实施例1，如图7。乳清蛋白和刺梨多糖在70℃条件下加热1～9h，抗氧化性随着时间延长先增大后减小，orac值在3、5h增高最为明显。因此，综合乳化性能和抗氧化性能选择5h为最佳反应时间。
51.综上，通过对不同时间、不同温度乳清蛋白-刺梨多糖共聚物的乳化性和抗氧化性的比较，确定了最终的反应条件。该条件制备的共聚物兼具较优良乳化性和抗氧化性：反应温度65～70℃、反应时间3～5h、质量比1:1(蛋白终浓度为5mg/ml)。
52.以上实施例仅为本发明较优的实施方式，仅用于解释本发明，而非限制本发明，本领域技术人员在未脱离本发明精神实质下所作的改变、替换、修饰等均应属于本发明的保护范围。