一种促生长抗氧化的发酵型黄芪复方饲料添加剂

1.本发明属于中兽药技术领域，具体涉及一种促生长抗氧化的饲料添加剂的应用，特别涉及一种促生长抗氧化的发酵型黄芪复方饲料添加剂及其制备方法。


背景技术：

2.2020年全省水产养殖面积898万亩，水产品总产量490万吨，渔业产值1774亿元，渔业经济总产值3597亿元，分别位居全国第三、第五、第一和第三，其中淡水渔业产值1221.6亿元，连续多年位居全国第一。2020年全省农业产值中渔业占22.3％，比2015年提高0.6个百分点，高于全国平均水平，占比居全国前列。2020年全省渔民人均收入达2.98万元，比2015年增长43.5％，居全国第一。但是水产养殖行业中的饲料喂养会对水域造成一定的影响，如何开发一种绿色的饲料喂养也已成为消费者最为关心的热点。消费者不但追求无污染、无残留、无副作用，能增强机体免疫力，安全可靠、营养丰富的无公害绿色食品，而且更关注纯天然饲料饲养的禽类产品。近年来，国内许多学者对中草药添加剂进行了大量的研究，发现中草药添加剂不但能够增强畜禽的免疫器官，而且对提高机体免疫力有一定作用。因为天然中草药具有天然性、多靶点、多功能性、毒副作用小、无环境污染、无残留、无副作用，又能增强机体免疫力等特点，已成为国内外研究饲料添加剂的研究热点。中药作为一种天然替抗产品，具有低毒、功能性强、经济实用、不良反应小、无残留和无耐药性等优点，可提高饲料转化率，增强机体抗病力、抗氧化应激能力、抗菌抗病毒功能，增强繁殖性能，提高产品品质。
3.黄芪是豆科草本植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具有补中益气、固表止汗、利水消肿、托毒排脓、敛疮生肌的功效，现代药理研究表明黄芪具有增强免疫、抑制病毒、抗辐射和抗癌及利尿等作用。应用于化妆品时可促进皮肤新陈代谢、滋养美白、延缓衰老。黄芪复方是由黄芪、茯苓、当归等组成的临床经验方，以黄芪为君药，具有滋养美白保湿延缓衰老等功效，方中药材的化学成分众多，其中黄酮类化合物具有抗菌消炎、抗病毒等功效，且也是一种很强的抗氧化剂，可有效清除体内的氧自由基，阻止细胞的衰老、退化。黄芪、甘草、黄芩、白术、党参、绞股蓝等中药材可作为饲料添加剂，起到促进畜禽生长性能和增强免疫功能的作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种促生长抗氧化的发酵型黄芪复方饲料添加剂的制备方法。
5.为解决本发明的技术问题，本发明的技术方案一种促生长抗氧化的发酵型黄芪复方饲料添加剂，具体制备方法包括如下步骤：
6.①
按重量配比称取黄芪复方原料，将称取的微生物与中草药混合，进行超微粉碎，得到粒径小于25μm的中药粉末；黄芪复方原料由下述质量份的原料制成：黄芪10～40份、枸杞子5～20份、麦冬5～20份、五味子1～15份、茯苓5～20份、当归2～15份、沙棘2～20份、杭
白菊5～20份；
7.②
将中药粉末放入密封罐中，均匀喷洒混合溶剂(na hco3、乙醇和水)，然后通入水蒸汽，在蒸汽压力7mpa、温度105℃的条件下保持10s，卸去压力。其中na hco3的质量分数为0.3％，乙醇的体积分数为70％，剩余为水，中药粉末和混合溶剂的质量比为30∶1；
8.③
将步骤2处理好的中药粉末溶解在乙醇的水溶液中进行超声波萃取，乙醇的水溶液中乙醇的体积分数为30％，料液比为1∶30，超声功率为80w，温度为40℃，萃取时间40min；
9.④
萃取后，采用膜过滤、喷雾干燥，得到中药提取物，采用解淀粉芽孢杆菌fj18生物发酵技术发酵中药提取物，其中解淀粉芽孢杆菌fj18》2.5
×
102cfu/kg；
10.⑤
向步骤
④
制得的发酵黄芪中药复方中添加白藜芦醇，发酵黄芪中药复方：白藜芦醇质量比为2：1。
11.优选的，所述步骤
①
黄芪复方原料由如下重量份原料制得：黄芪20份、枸杞子5份、麦冬5份、五味子4份、茯苓6份、当归4份、沙棘2份、杭白菊8份。
12.优选的，所述步骤
④
解淀粉芽孢杆菌fj18的发酵接种到种子培养基中：酵母膏5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 10.0g/l，ph7.0，于30℃，200rpm培养12小时；扩大培养基、发酵培养基，其组分和含量均为：蔗糖20g/l，酵母粉15g/l.kh2po4 1.0g/l，cacl2 0.8g/l；以naoh调节ph至8.0。种子液按0.5％(v/v)接种到扩大培养基、发酵培养基，于30℃，200rpm培养12小时；10000rpm离心15分钟后收集菌体细胞，以生理盐水洗涤l～2次，得解淀粉芽孢杆菌fj18的静息细胞。
13.优选的，解淀粉芽孢杆菌fj18的菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体；以二甲基亚砜、中药提取物、蔗糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液；反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为20％(v/v)，中药提取物0.5g/l，磷酸缓冲的摩尔浓度为150mmol/l，磷酸缓冲的ph 8.0，蔗糖浓度为50g/l；将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养24h后，采用膜过滤、喷雾干燥，得到黄芪复方发酵制剂，向复方制剂中添加白藜芦醇，黄芪复方制剂：白藜芦醇为2：1。
14.优选的，上述步骤
④
中，采用解淀粉芽孢杆菌fj18生物发酵技术发酵黄芪中药复方，其中解淀粉芽孢杆菌fj18》2.5
×
102cfu/kg。
15.优选的，向步骤
④
发酵后中药提取物中添加糖萜素、氨基酸、维生素和益生菌，并混合均匀，黄芪复方：糖萜素：氨基酸：维生素质量比为1：1-4：0.8-1.2：0.5-1.5。
16.所述的所述的促生长抗氧化的发酵型黄芪复方饲料添加剂在制备促进动物生长、增强免疫力、增强抗氧化应激能力饲料添加剂中的应用。
17.一种促进生长、增强抗氧化应激能力的动物饲料添加剂，所述的促生长抗氧化的发酵型黄芪复方饲料添加剂。利用解淀粉芽孢杆菌fj18发酵黄芪复方提取物。
18.步骤(1)：黄芪20份、枸杞子5份、麦冬5份、五味子45份、茯苓6份、当归4份、沙棘2份、杭白菊8份制成。按重量配比称取原料，将称取的微生物与中草药混合，进行超微粉碎，得到粒径小于25μm的中药粉末。
19.步骤(2)：将中药粉末放入密封罐中，均匀喷洒混合溶剂(na hco3、乙醇和水)，然后通入水蒸汽，在蒸汽压力7mpa、温度105℃的条件下保持10s，卸去压力。其中na hco3的质量分数为0.3％，乙醇的体积分数为70％，剩余为水，中药粉末和混合溶剂的质量比为30∶1。
20.步骤(3)：将步骤2处理好的中药粉末溶解在乙醇的水溶液中进行超声波萃取，乙醇的水溶液中乙醇的体积分数为30％，料液比为1∶30，超声功率为80w，温度为40℃，萃取时间40min。
21.步骤(4)：萃取后，采用膜过滤、喷雾干燥，得到中药提取物，向中药提取物中添加糖萜素、氨基酸、维生素和益生菌，并混合均匀。复合益生菌主要菌种为解淀粉芽孢杆菌fj18。
22.步骤(5)：以黄芪中药复方提取物为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到0.5g/l原料溶液。
23.步骤(6)：将解淀粉芽孢杆菌fj18，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获得湿菌体，以复方提取物和糖基供体为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到原料溶液；
24.步骤(7)：将步骤(5)湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到步骤(6)的溶液中进行催化反应。
25.本发明研究黄芪复方制剂及与白黎芦醇对武昌鱼的生长的影响，发现白藜芦醇、白藜芦醇及黄芪复方制剂联用均具有显著促进武昌鱼生长的作用，同时联用白藜芦醇也大大增加了促进生长的作用。
26.本发明研究黄芪复方制剂及与白藜芦醇联用的抗氧化作用，发现通过与白藜芦醇联用，显著增加了黄芪复方制剂的抗氧化活性，活性增强了3～4倍。
27.本发明的有益效果为：
28.1、本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌fj18发酵黄芪复方制剂的制备方法。解淀粉芽孢杆菌fj18可对中药复方黄酮类化合物进行琥珀酰化修饰，提高了复方有效成分的生物利用度及药理活性。通过酶解发酵技术开发黄芪中药复方，研制高产高效黄芪中药复方饲料添加剂，提高武昌鱼免疫力，降低抗生素的大量使用。如何制备促进生长抗氧化的发酵型黄芪复方饲料添加剂是本发明的关键所在。
29.2.本发明所提供的生物转化制备黄芪复方制剂的方法。中药复方提取物为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到0.5g/l原料溶液；将解淀粉芽孢杆菌fj18，进行常规培养、发酵，发酵液过滤获得湿菌体，以复方提取物和糖基供体为原料，用磷酸缓冲溶液及非水相溶剂配制得到原料溶液；将湿菌体或用载体固定化后的湿菌体加入到原料溶液中进行催化反应。
30.3.本发明所提供的一种抗氧化活性增强3倍以上黄芪复方制剂的方法。武昌鱼的头部、肌肉和内脏分别称取0.4g置于研钵中,加入预冷的2m l浓度为0.05mol/l的p h值为7.8的磷酸缓冲液,将其置于冰浴中研磨粉碎后,将其移入容量为10m l的离心管中,然后再用6m l浓度为0.05mol/l的p h值为7.8的磷酸缓冲液对其进行冲洗,并一同倒入同一离心管中。将离心管置于离心机中于10000rpm下离心15min。然后将离心管中的上清液取出,移入10m l容量瓶中定容,然后将其置于4℃下保存,用于测定超氧化物歧化酶的活性。在560nm波长下,测定不同酶液量的吸光值。通过计算得出抑制nbt光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标,以抑制nbt光还原相对百分率为纵坐标,绘制出二者相关曲线。从而得出抑制nbt光还原相对百分率为50％时的超氧化物歧化酶的酶液量(μl),并以此规定为一个酶活力单位(u)。
附图说明
31.图1是实施例3黄芪复方对武昌鱼生长的影响。
32.图2是实施例3黄芪复方对武昌鱼的超氧化物歧化酶活性的影响。
具体实施方式
33.为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
34.实施例1
35.黄芪复方制剂的制备工艺
36.组方：黄芪20份、枸杞子5份、麦冬5份、五味子4份、茯苓6份、当归4份、沙棘2份、杭白菊8份。
37.制备工艺：
38.①
按重量配比称取原料，将称取的微生物与中草药混合，进行超微粉碎，得到粒径小于25μm的中药粉末。
39.②
将中药粉末放入密封罐中，均匀喷洒混合溶剂(na hco3、乙醇和水)，然后通入水蒸汽，在蒸汽压力7mpa、温度105℃的条件下保持10s，卸去压力。其中na hco3的质量分数为0.3％，乙醇的体积分数为70％，剩余为水，中药粉末和混合溶剂的质量比为30∶1。
40.③
将步骤2处理好的中药粉末溶解在乙醇的水溶液中进行超声波萃取，乙醇的水溶液中乙醇的体积分数为30％，料液比为1∶30，超声功率为80w，温度为40℃，萃取时间40min。
41.④
萃取后，采用膜过滤、喷雾干燥，得到中药提取物。
42.实施例2
43.解淀粉芽孢杆菌fj18的发酵及静息细胞的制备
44.解淀粉芽孢杆菌fj18的发酵接种到种子培养基中：酵母膏5.0g/l，蛋白胨10.0g/l，nacl 10.0g/l，ph7.0，于30℃，200rpm培养12小时。扩大培养基、发酵培养基，其组分和含量均为：蔗糖20g/l，酵母粉15g/l.kh2po
4 1.0g/l，cacl
2 0.8g/l。以naoh调节ph至8.0。种子液按0.5％(v/v)接种到扩大培养基、发酵培养基，于30℃，200rpm培养12小时。10000rpm离心15分钟后收集菌体细胞，以生理盐水洗涤l～2次，得解淀粉芽孢杆菌fj18的静息细胞。
45.实施例3
46.黄芪复方发酵制剂的制备
47.将实施例2中的解淀粉芽孢杆菌菌体细胞发酵液过滤，得到湿菌体。以二甲基亚砜、实施1中中药提取物、蔗糖、磷酸缓冲配置原料溶液，即反应溶液。反应溶液中有机溶剂二甲基亚砜的比例为20％(v/v)，实施1中中药提取物0.5g/l，磷酸缓冲的摩尔浓度为150mmol/l，磷酸缓冲的ph 8.0，蔗糖浓度为50g/l。将上述所得的湿菌体分散于反应溶液中，加入到反应器中，于30℃，200rpm条件下培养24h后，采用膜过滤、喷雾干燥，得到黄芪复方发酵制剂。向复方制剂中添加白藜芦醇，黄芪复方制剂：白藜芦醇为2：1。
48.实施例4
49.黄芪复方发酵制剂对武昌鱼体重的影响
50.将在实验室驯养7d的试验鱼随机放入空白对照组、白藜芦醇组和黄芪复方白藜芦醇联用组,每一浓度设置3个平行,试验液用48h脱氯自来水进行稀释.在5l水族箱中分别加入4l实验溶液,每组投放15条武昌鱼,每2d测1次体重。实验条件:实验温度(23
±
1)℃,p h为7～9,总硬度为50mg
·
l-1
(以ca co3计),溶解氧不低于5mg
·
l-1
.实验期间不予喂食,每24h更换一次试验液,用曝气装置连续曝气,每天至少测定1次试验液的水温、ph、硬度、溶解氧含量。
51.实施例5
52.将实施例3的黄芪复方发酵制剂对武昌鱼组织sod活性的影响
53.武昌鱼的头部、肌肉和内脏分别称取0.4g置于研钵中,加入预冷的2m l浓度为0.05mol/l的p h值为7.8的磷酸缓冲液,将其置于冰浴中研磨粉碎后,将其移入容量为10m l的离心管中,然后再用6m l浓度为0.05mol/l的p h值为7.8的磷酸缓冲液对其进行冲洗,并一同倒入同一离心管中。将离心管置于离心机中于10000rpm下离心15min。然后将离心管中的上清液取出,移入10m l容量瓶中定容,然后将其置于4℃下保存,用于测定超氧化物歧化酶的活性。在560nm波长下,测定不同酶液量的吸光值。通过计算得出抑制nbt光还原的相对百分率。以酶液用量为横坐标,以抑制nbt光还原相对百分率为纵坐标,绘制出二者相关曲线。从而得出抑制nbt光还原相对百分率为50％时的超氧化物歧化酶的酶液量(μl),并以此规定为一个酶活力单位(u)。黄芪复方制剂与白藜芦醇联用显著增强了4倍sod活性。
54.本发明未尽事宜为公知技术。
55.上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。