一种抑制黄曲霉污染及其毒素污染的方法及应用

1.本发明涉及中药材质量安全和食品安全领域，尤其涉及一种抑制中黄曲霉污染及其毒素污染的方法及应用。


背景技术：

2.黄曲霉(aspergillus flavus，a.flavus)是一种广泛分布于热带、亚热带地区的腐生性丝状真菌，易侵染花生、小麦、玉米等多种农产品和草本植物，是农业和医疗产品的主要安全问题。它能产生不同种类的次生代谢物，如黄曲霉毒素(afs)、分生孢子色素、环吡嗪酸、黄曲霉素和曲酸等，而afs对作物质量和食品安全均有巨大影响。afs主要包括afb1、afb2、afg1、afg2，具有致癌性、致畸性和遗传毒性，其中afb1毒性和致癌性最强。许多研究证明，食用被afs污染的食品会损害人体健康，如肝细胞癌、急性中毒、免疫系统紊乱等。近年来，人们越来越关注在植物中afs的防控，目前，许多方法已被用于减少afs污染，如物理防治、化学防治及生物防治等，而afs污染仍常用化学药剂来控制。但使用化学药剂具有许多缺点，如毒性、在食物链中残留、更有可能产生耐药性。生物防治是一种高效、环保的方法，因此，寻找开发一株新的生防菌株来预防a.flavus生长和随后的afs污染是非常必要的。
[0003]“假单胞菌bbh16-1菌株”为本发明团队前期研究的成果，已经申请专利，申请号：202110204065.8，保藏在中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：m2020971，申请人为了解决上述问题，对“假单胞菌bbh16-1菌株”做了进一步的研究，利用假单胞菌bbh16-1菌株防治黄曲霉污染及其毒素污染，发现假单胞菌bbh16-1菌株在抑制黄曲霉及其毒素污染具有显著效果，可用于抑制食品、中药材等中的黄曲霉及其毒素。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是提供一种防治黄曲霉污染及其毒素污染的方法。
[0005]
本发明的另一目的是提供一种假单胞菌bbh16-1菌株在制备黄曲霉及其毒素污染抑制剂中的应用。
[0006]
本发明所述方法是利用假单胞菌bbh16-1菌株防治黄曲霉污染及其毒素污染。
[0007]
优选的，本发明所述方法是利用假单胞菌bbh16-1菌株防治中药材、食品、饲料黄曲霉污染及其毒素污染。
[0008]
进一步优选的，本发明所述方法是利用假单胞菌bbh16-1菌株防治薏苡仁黄曲霉污染及其毒素污染。
[0009]
本发明所述假单胞菌bbh16-1菌株在制备黄曲霉及其毒素污染抑制剂中的应用。
[0010]
优选的，本发明所述假单胞菌bbh16-1菌株在制备中药材中黄曲霉及其毒素污染抑制剂中的应用。
[0011]
进一步优选的，本发明所述假单胞菌bbh16-1菌株在制备薏苡仁中黄曲霉及其毒素污染抑制剂中的应用。
[0012]
进一步优选的，本发明所述假单胞菌bbh16-1菌株在制备食品中黄曲霉及其毒素
污染抑制剂中的应用。
[0013]
进一步优选的，本发明所述假单胞菌bbh16-1菌株在制备饲料中黄曲霉及其毒素污染抑制剂中的应用。
[0014]
有益效果：
[0015]
1.本发明是申请人对“假单胞菌bbh16-1菌株”做进一步研究的成果，利用假单胞菌bbh16-1菌株防治黄曲霉污染及其毒素污染，发现假单胞菌bbh16-1菌株在抑制黄曲霉及其毒素污染具有显著效果，可用于抑制食品、中药材、饲料等中的黄曲霉及其毒素。
[0016]
2.通过对假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus生长的影响实验证实，将假单胞菌bbh16-1菌株与a.flavus共培养或对扣培养，均能显著抑制a.flavus菌丝的生长，其抑制率为67.7％。
[0017]
3.通过对假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus微观结构的影响实验，说明假单胞菌bbh16-1菌株不仅能抑制a.flavus菌丝的生长，且能显著降低其产孢能力。
[0018]
4.通过对假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus产生afs的影响实验，说明假单胞菌bbh16-1菌株处理后afs产量与培养时间呈现负相关趋势，且a.flavus在培养过程中不能产生afm1。
[0019]
5.通过对假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus生长发育和产生afs关键基因的表达情况实验，说明假单胞菌bbh16-1菌株处理后a.flavus不会随时间的推移逐渐增长。
附图说明
[0020]
图1为本发明实施例中假单胞菌bbh16-1菌株和a.flavus对扣培养和共培养示意图；
[0021]
图2为本发明实施例中假单胞菌bbh16-1菌株和a.flavus共培养对a.flavus菌丝的生长影响示意图；
[0022]
图3为本发明实施例中假单胞菌bbh16-1菌株和a.flavus对扣培养对a.flavus菌丝的生长影响示意图；
[0023]
图4为本发明实施例中假单胞菌bbh16-1菌株产生的挥发性物质对a.flavus生长影响影响示意图；
[0024]
图5为本发明实施例中假单胞菌bbh16-1菌株与a.flavus对扣培养示意图；
[0025]
图6为本发明实施例中假单胞菌bbh16-1菌株与a.flavus水装片微观视图；
[0026]
图7为本发明实施例中薏苡仁接种a.flavus的变化示意图；
[0027]
图8为本发明实施例中假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus产afs的变化的影响示意图；
[0028]
图9为本发明实施例中利用qpcr分析接菌后不同时间a.flavus在寄主体内的表达量示意图；
[0029]
图10为本发明实施例中利用qpcr分析接菌后不同时间afls的表达量示意图；
[0030]
图11为本发明实施例中利用qpcr分析接菌后不同时间aflr的表达量示意图。
具体实施方式
[0031]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完
整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032]
假单胞菌在土壤、水、食物和空气中广泛分布，大多为非致病性菌，对人和环境无害，且大多数假单胞菌具有抗微生物的活性，常用作生防菌防治植物病害。在以往的研究中，假单胞菌能降解afs，如假单胞菌(pseudomonas sp.)在48h后对afb1降解率达84.30％，恶臭假单胞菌(p.putida)对降解afb1起主要作用的为胞外蛋白等。本实施例通过利用假单胞菌bbh16(pseudomonas sp.)与a.flavus共培养，观察其微观结构的变化，检测afs的产量，并通过rt-qpcr分析发育相关基因和afs相关基因的表达情况。本实施例有助于阐明假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus生长发育和afs产生的抑制机制，为控制afs在食品、中药材和饲料中的污染提供依据。
[0033]
以下为本实施例中假单胞菌对a.flavus和afs产生抑制的原理进行说明。
[0034]
1、材料与方法
[0035]
1.1、菌株材料
[0036]
本实施例的假单胞菌分离自健康太子参植株根茎，经形态特征和分子鉴定等技术鉴定为假单胞菌bbh16-1菌株。黄曲霉购买自中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号：336678。
[0037]
1.2、主要仪器与试剂
[0038]
微量核酸测定仪(nanodrop 2000，美国赛默飞公司)，凝胶图形分析系统(britainggm/d2，英国symgene公司)，实时荧光定量分析仪(cfx96 real-time system)，super总rna提取试剂盒(上海普洛麦格生物产品有限公司)；m-mlv反转录试剂盒、tb green premix ex taqtmⅱ试剂盒(takara生物技术有限公司)。
[0039]
1.3、假单胞菌bbh16-1菌株与a.flavus共培养
[0040]
od
600
＝1.0的假单胞菌bbh16-1菌株菌液100μl涂布在lb固体培养基的平板上，将a.flavus采用打孔法定量，挑取菌饼接种在pda培养基中，将lb平板与pda平板对扣培养，以不涂布假单胞菌bbh16-1菌株做空白对照，在25℃暗培养3～5d，观察a.flavus菌落生长情况，测定a.flavus菌落生长直径，计算其抑菌率。
[0041]
od
600
＝1.0的假单胞菌bbh16-1菌株菌液5μl在距离培养皿边缘2cm处，将a.flavus菌饼接种于培养皿另一方边缘2cm处，以不接种假单胞菌bbh16-1菌株做空白对照，在25℃暗培养3～5d，观察a.flavus菌落生长情况，测定a.flavus菌落生长半径，计算其抑菌率。以上试验均重复3次。
[0042]
1.4、假单胞菌bbh16-1菌株与a.flavus对扣培养显微观察
[0043]
将假单胞菌bbh16-1菌株与a.flavus 25℃对扣培养4d后，制作水装片，在显微40倍镜下观察菌丝及孢子形态。
[0044]
1.5、染毒薏苡仁接菌方式
[0045]
本实施例以中药材薏苡仁进行具体说明。
[0046]
具体的，调节a.flavus孢子悬浮液，使其终浓度为5
×
105cfu，备用。od
600
＝1.0的假单胞菌bbh16-1菌株菌液100μl涂布在lb固体培养基的平板上，吸取1ml孢子液接种于含有40g已灭菌的薏苡仁药材的培养皿中，将lb平板与接菌的薏苡仁药材平板对扣培养，以不涂布假单胞菌bbh16-1菌株做空白对照，25℃下分别培养10d和20d，拍照观察，取样，放入-80℃备用。试验均重复3次。
[0047]
1.6、afs的提取检测方法
[0048]
提取方法：取染菌后的薏苡仁药粉5g，精密称定，置50ml锥形瓶中，精密加入80％乙腈20ml，振摇提取30min，10000r/min离心5min，取0.5ml上清液，用硫酸镁-ods(0.3g-0.05g)振摇净化，10000r/min离心2min，取上清过0.22μm滤膜。
[0049]
检测方法：色谱柱为agilent eclipse xdb-c18柱(5μm，4.6mm
×
250mm)柱；流动相为甲醇-0.25％磷酸水，梯度洗脱，见表1，流速为1.0ml/min，柱温30℃，进样量20μl；荧光检测器：激发波长365nm，发射波长440nm，75min。
[0050]
表1洗脱程序
[0051][0052][0053]
1.7、总rna的提取及cdna合成
[0054]
参照super总rna提取试剂盒说明书提取染菌薏苡仁的总rna并检测完整性，微量核酸定量分析仪检测浓度和纯度。以染菌薏苡仁的总rna为模板，合成cdna。
[0055]
1.8、统计学分析
[0056]
利用spss 26.0分析数据，graphpad prism 5.0统计作图。
[0057]
2、结果与分析
[0058]
2.1、假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus生长的影响
[0059]
测定假单胞菌bbh16-1菌株菌液对a.flavus菌落生长的变化，如图1所示，将假单胞菌bbh16-1菌株与a.flavus共培养或对扣培养，均能显著抑制a.flavus菌丝的生长，见图2、图3。而通过计算其抑菌率发现，对扣培养对a.flavus生长大于共培养，见图4，说明假单胞菌bbh16-1菌株产生的挥发性物质对a.flavus生长影响更大。
[0060]
2.2、假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus微观结构的影响
[0061]
将假单胞菌bbh16-1菌株与a.flavus对扣培养后，见图5，制作水装片，见图6。a.flavus由许多复杂的分枝菌丝构成，具隔膜，形成长而粗糙的分生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，表面产生许多小梗，小梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子；假单胞菌bbh16-1菌株处理后的a.flavus由许多复杂的分枝菌丝构成，具隔膜，形成长而粗糙的分
生孢子梗，顶端产生烧瓶形或近球形顶囊，但表面未见小梗产生，且无明显的分生孢子产生。说明假单胞菌bbh16-1菌株不仅能抑制a.flavus菌丝的生长，且能显著降低其产孢能力。
[0062]
2.3、假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus产生afs的影响
[0063]
将a.flavus接种至薏苡仁药材中，与假单胞菌bbh16-1菌株菌液对扣培养，见图7，通过提取afs，检测假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus产afs的变化，见图8。由图可知，接种a.flavus 10d时，在ck组中检测到afg2的产生，处理组中未见afs的产生；接种a.flavus 20d时，在ck组中检测到afb1、afb2、afg1和afb2的产生，而处理组中未见afs的产生或未达到其检测限度，且在处理10d和20d中均未检测到afm1的产生。说明假单胞菌bbh16-1菌株处理后afs产量与培养时间呈现负相关趋势，且a.flavus在培养过程中不能产生afm1。
[0064]
2.4、假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus生长发育和产生afs关键基因的表达情况
[0065]
检测假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus生长发育关键基因基因β-tubulin表达量的影响，以薏苡仁的tubulin基因作为内标，利用qpcr分析接菌后不同时间a.flavus在寄主体内的表达量，结果见图9。β-tubulin基因在空白组中随侵染时间的推移显著增加，处理组中随侵染时间的推移无显著变化，说明假单胞菌bbh16-1菌株处理后a.flavus不会随时间的推移逐渐增长。
[0066]
假单胞菌bbh16-1菌株对afs合成关键基因afls、aflr表达量的影响，以a.flavus的β-tubulin基因作为内标，利用qpcr分析接菌后不同时间afls、aflr的表达量。假单胞菌bbh16-1菌株处理10d和20d时，afls、aflr表达量均显著下调，afls和aflr在处理10d和20d中表达量显著下调结果见图10和11。
[0067]
3、结论与讨论
[0068]
生物防治因具有对环境友好、效率高等优点，近年来成为研究热点。假单胞菌bbh16-1菌株对a.flavus生长和afs的产生具有较好的抑制效果。
[0069]
基于本实施例，可发现，假单胞菌bbh16-1菌株能显著a.flavus菌丝的生长及其分生孢子的产生，且假单胞菌bbh16-1菌株处理后能抑制afs的产生。而aflr是一种编码47kda序列特异性锌指dna结合蛋白的转录因子，负责所有afs通路结构基因的转录激活，afls参与调控afs的生物合成，与aflr密切相关。采用qrt-pcr技术，发现afls和aflr在假单胞菌bbh16-1菌株处理a.flavus后显著下调，该结果与chen等的研究结果相似。说明假单胞菌bbh16-1菌株是通过下调afls和aflr表达进而抑制afs的生物合成。
[0070]
需要说明的是，以上参照附图所描述的各个实施例仅用以说明本发明而非限制本发明的范围，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的前提下对本发明进行的修改或者等同替换，均应涵盖在本发明的范围之内。此外，除上下文另有所指外，以单数形式出现的词包括复数形式，反之亦然。另外，除非特别说明，那么任何实施例的全部或一部分可结合任何其它实施例的全部或一部分来使用。