一种抗氧化发酵枸杞桑葚口服液及其制备方法

1.本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种抗氧化发酵枸杞桑葚口服液及其制备方法。


背景技术：

2.枸杞又名枸杞子、西方雪果是茄族植物枸杞的成熟果实，2002年3月国家卫生健康委员会公布的既是食品又是药品的物品名单中包括枸杞子。枸杞子中具有多种活性成分，如枸杞多糖、黄酮类化合物、生物碱、枸杞色素、氨基酸类等。大量研究表明，枸杞子中最具有提取利用价值的是枸杞多糖。枸杞的活性成分有多糖、黄酮、甜菜碱、蛋白质、不饱和脂肪酸及微量元素等。作为一味传统的滋补中药，枸杞具有极高的药用、食用和经济价值。枸杞子中富含枸杞多糖、类胡萝卜素、多酚等活性成分，具有抗氧化、提高免疫力等优良的生物活性。
3.桑葚又称桑果、桑子等，是桑树的成熟果实，成熟的鲜果色泽鲜艳、清香甘甜，桑葚果实中不仅富含人体所需的多种氨基酸、维生素以及锌、硒、钼、锰等微量元素，还含有白藜芦醇、花青素、黄酮类、多糖类等生物活性物质，能够起到促进新陈代谢、提高人体免疫力、预防心血管疾病、抗病毒、抗氧化和抗疲劳等作用。
4.口服液是以传统的中药汤剂为基础，采用各种提取方法提取其有效成分并结合罐装技术制成液体制，其相对于中药汤剂有携带方便、吸收更快、剂量更准确、口感更佳且易于批量生产便于储存等显著优点。目前口服液已经成为中药常用制剂。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种抗氧化发酵枸杞桑葚口服液及其制备方法，以解决现有技术中以口服液为载体的枸杞桑葚复配口服液是中药药品的一大空缺的问题。
6.本发明采用以下技术方案：一种抗氧化发酵枸杞桑葚口服液，由以下组分组成：枸杞汁、桑葚汁和活化的菌液，其活化的菌为植物乳杆菌和发酵乳杆菌，活化的菌液中活菌总浓度达到10
10
cfu/ml。
7.优选地，枸杞汁与桑葚汁质量比为2:1。
8.优选地，植物乳杆菌与发酵乳杆菌质量比为2：1。
9.本发明采用的另一技术方案，一种抗氧化发酵枸杞桑葚口服液的制备方法，包括以下步骤：
10.步骤1、挑选：挑选成熟无任何病虫害的枸杞干果；
11.步骤2、打浆与酶解：将所述步骤1中的枸杞干清洗干净放入搅拌机中匀浆至果粒充分破碎，立即置于沸水中水浴5min灭酶，灭酶后用无菌纱布过滤；
12.步骤3、均质：使用均质匀浆机将灭酶冷却后的枸杞汁于25℃均质；
13.步骤4、杀菌：将所述步骤3中的枸杞汁倒入锥形瓶中，用封口膜封住瓶口，置于压力蒸汽灭菌锅，最后冷却至室温备用；
14.步骤5、挑选桑葚干果，重复步骤1、步骤2、步骤3、步骤4制得桑葚汁；
15.步骤6、冻干菌种的活化：将乳酸菌菌粉接种于灭菌后的mrs培养基中活化，37℃培养24h，连续活化2次；
16.步骤7、将所述步骤6中活化的菌液加入所述步骤4的枸杞汁和所述步骤5 的桑葚汁的混合液中，于37℃厌氧环境下培养48h，制得枸杞桑葚口服液。
17.优选地，步骤3中使用500w均质匀浆机灭酶20min。
18.优选地，步骤4中，发酵温度为37℃，发酵时间为48h。
19.优选地，步骤4中，95℃进行10min灭菌。
20.优选地，步骤7中，将活化的菌液以4％的接种量接入枸杞汁和桑葚汁的混合液中。
21.本发明的有益效果是：
22.(1)本发明直接使用枸杞与桑葚进行复配，得到的发酵口服液营养丰富，且生产工艺简单、成本便宜；本发明的制备方法对抗氧化发酵口服液的品质的改善效果明显，发酵枸杞桑葚口服液具有耐缺氧、抗疲劳、抗氧化的功效。
23.(2)本发明采用微生物发酵的方法对口服液进行发酵，乳酸菌发酵作为一种绿色果蔬加工方式，不仅可以赋予果蔬汁独特的风味，还可以转化基质中的营养物质，提高产品生物活性，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
24.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
25.实施例1
26.一种抗氧化发酵枸杞桑葚口服液，其制备方法为：
27.(1)挑选成熟度好、无任何病虫害的枸杞干果；
28.(2)打浆与酶解：将清洗干净的枸杞放入搅拌机中破碎后，立即置于沸水中水浴5min灭酶，灭酶后用无菌纱布过滤；
29.(3)均质：用匀浆机将所述步骤2中的枸杞汁于25℃均质；
30.(4)杀菌：将所述步骤3中的枸杞汁倒入锥形瓶中，封住瓶口，置于压力蒸汽灭菌锅95℃进行10min灭菌，最后冷却至室温备用；
31.(5)挑选桑葚干果，重复步骤2、步骤3、步骤4制得桑葚汁；
32.(6)冻干菌的活化：将乳酸菌菌粉接种于灭菌后的mrs培养基中活化， 37℃培养24h，连续活化2次，活化后的菌液浓度达到10
10
cfu/ml；
33.(7)种子液的制备：将活化好的乳酸菌以4％的接种量接入枸杞桑葚汁(枸杞：桑葚＝2:1)中，于37℃厌氧环境下培养48h。
34.作为对上述方案的进一步描述，所述步骤(7)中，所述乳酸菌组成为植物乳杆菌与发酵乳杆菌质量比2:1。
35.对比例1
36.与实施例1的基本相同，区别在于：所述步骤(7)中，所述乳酸菌为植物乳杆菌。
37.对比例2
38.与实施例1的基本相同，区别在于：所述步骤(7)中，所述乳酸菌为发酵乳杆菌。
39.下面通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
40.对比例3
41.与实施例1的基本相同，区别在于：未进行步骤(6)、步骤(7)中，将枸杞汁与桑葚汁按照2:1的比例进行配比，装灌。
42.实验例1耐缺氧试验
43.为了验证本公开的制备方法对抗氧化发酵口服液的品质的改善效果，将分别对每组口服液的功效进行了测试。测试的方法包括：
44.每天下午1点给药，连续给药30天，通过灌胃方式给予小鼠药物，连续灌胃给药30天，于末次给药后,将各组小鼠分别放入盛有钠石灰的磨口瓶内,每瓶一只用凡士林封瓶口,盖严后立即计时,以停止呼吸为指标,观察小鼠因缺氧而死亡的时间。
45.以下为各组别给药情况：
46.实例1：给予实施例1枸杞桑葚口服液，5个小鼠均按照6.5ml/kg剂量给药；
47.实例2：给予对比例1枸杞桑葚口服液，5个小鼠均按照6.5ml/kg剂量给药；
48.实例3：给予对比例2枸杞桑葚口服液，5个小鼠均按照6.5ml/kg剂量给药；
49.实例4：给予对比例3枸杞桑葚口服液，5个小鼠均按照6.5ml/kg剂量给药；
50.本试验通过小鼠在常压室温密闭无氧环境下的存活时间来验证其的耐缺氧性。
51.表1小鼠耐缺氧试验平均存活时间表
52.组别样本数量平均存活时间(min)实例1538.588
±
1.199
#
实例2534.888
±
1.029
#
实例3530.092
±
1.153
#
实例4525.835
±
1.164
#
53.注：#即与空白组相比，有显著性差异(p《0.05)
54.由表1得出，相对于实例4，实例1、实例2、实例3的老鼠组在常压室温密闭环境下的存活时间显著提高，以高剂量组最为明显，且存活时间提高程度与口服液灌胃培养剂量水平呈正相关，由此可得，发酵枸杞桑葚口服液能延长小鼠在常压室温密闭环境内的存活时间，对小鼠具有耐缺氧的作用。据研究表明，其机理主要是通过增加血糖和肝糖原以及对中枢系统的双向调节实现的。本次实验结果为发酵枸杞桑葚口服液在耐缺氧性方面的研究提供了试验依据。
55.实验例2抗疲劳试验
56.本试验通过小鼠负重竭力游泳至死亡时间验证其抗疲劳性，连续灌胃给药30 天,给药情况与实验例1的相同，于末次给药后,将各组小鼠尾部加上体重2％悬挂物,置于游泳箱中开始游泳,以小鼠力竭为指标,观察小鼠因负重竭力而无法游泳的时间。具体实验情况如下表所示。
57.表2小鼠负重游泳平均存活时间表
58.组别样本数量平均存活时间(min)实例1534.597
±
1.734
#
实例2529.058
±
1.027
#
实例3522.624
±
0.705
#
实例4517.439
±
0.796
59.注：#即与空白组相比，有显著性差异(p《0.05)
60.由表2得出，相对于实例4，实例1、实例2、实例3的平均存活时间显著提升，其中以实施例1组最为显著，且存活时间提升程度与用口服液灌胃培养的按照小鼠体重及63mg/kg进行灌胃剂量呈正相关，故可知，实施例1组口服液能显著提高小鼠负重游泳的时长。
61.疲劳是一个复杂的受多因素影响的涉及许多生理生化因素的复杂过程，而运动时长与耐力是疲劳目前可知的最直接的一种表现方式，高强度运动会消耗体内的糖原，增加血液中的乳酸，体内的糖元储存量下降，影响中枢系统的atp供应，这是引起运动型疲劳的重要原因。本次实验结果可得，实施例1组发酵枸杞桑葚口服液具有抗疲劳作用。
62.实验例3 sod、mda含量测定
63.连续灌胃给药30天,于末次给药后,将各组小鼠依次进行抗疲劳和耐缺氧试验，sod和mda测定是在耐缺氧后进行测定，抗疲劳游泳试验只是让小鼠力竭，不会立即死亡，后面进行完耐缺氧后再取血做检测，取眼球血液于4000r/min，10min离心机离心后，取上层血浆，运用sod、mda试剂盒进行sod、mda含量测定。
64.实例1：给予实施例1枸杞桑葚口服液，5个小鼠均按照6.5ml/kg剂量给药；
65.实例2：给予对比例1枸杞桑葚口服液，5个小鼠均按照6.5ml/kg剂量给药；
66.实例3：给予对比例2枸杞桑葚口服液，5个小鼠均按照6.5ml/kg剂量给药；
67.实例4：给予对比例3枸杞桑葚口服液，5个小鼠均按照6.5ml/kg剂量给药；
68.表3样本中各指标浓度
[0069][0070][0071]
表4各组小鼠血清中sod平均浓度
[0072]
组别样本数量平均浓度(ng/ml)实例1544.973
±
0.912实例2541.675
±
1.438实例3535.718
±
1.171实例4534.714
±
1.576
[0073]
表3中实施例1-1为实施例1组中一号小鼠，以此类推，由表3和表4统计结果可知，与实例1组相比，各组小鼠血清sod浓度差异极显著(p《0.01),实例2组、实例3组、实例4组小鼠血清sod浓度均有明显下降，
[0074]
mda即丙二醛，是机体内脂质发生过氧化反应的重要代谢产物，与机体的抗氧化潜在能力息息相关，机体一旦产生mda,即会加剧膜的损伤，其对细胞显示出严重的毒性，测定血清内sod的浓度可以间接反映膜系统的受损程度与脂质的过氧化程度，其代表了机体自由基的生成情况。
[0075]
sod，即超氧化物歧化酶，属于生物体系中的抗氧化酶系，其可以显著的清除体内自由基，关系到机体的氧化与抗氧化平衡，机制主要为催化超氧阴离子自由基生产氧和过氧化氢，能帮助机体与细胞规避损害。
[0076]
本实验结果表明，与实例4组相比，实例1、实例2、实例3组小鼠体内血清的sod浓度明显增加，mda浓度明显降低，sod浓度随口服液灌胃培养的剂量增加呈正相关，mda浓度随口服液灌胃培养的机能呈负相关，由此可得发酵枸杞桑葚口服液在适当且统一的实验条件下由明显的抗氧化作用，可降低膜系统的受损程度阻止细胞的过氧化程度。
[0077]
实验例4总酚的测定
[0078]
(1)标准品的处理:
[0079]
准确称取0.1g没食子酸，用50ml蒸馏水溶解、定容至100ml，得到质量浓度为1000mg/l的没食子酸标准储备液，分别取标准储备液0、1.25、2.5、5、10、20、40ml于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，配制质量浓度为0、12.5、 25、50、100、200和400mg/l的系列标准溶液。
[0080]
(2)样品的处理:
[0081]
称取2g样品，加入蒸馏水20ml，溶解。以3000r/min转速离心10min后，取其上清液，稀释50倍。
[0082]
(3)测定与计算:
[0083]
取1ml标准液或样品液于15ml的试管中，分别加入lmlfc(福林酚)显色剂及3ml20％nagco，混合均匀，于50℃水浴反应30min。在765nm波长下测定吸光度，每个浓度做3个平行试验，取平均值，绘制标准曲线，得到吸光度值a与没食子酸标准溶液浓度(t,mg/ml)之间的回归方程，计算总酚含量。
[0084]
表5不同组别中的总酚含量
[0085]
组别样本数量总酚含量平均浓度(uggae/ml)实例15159.36
±
1.912实例25138.01
±
1.269实例35119.62
±
1.126实例45108.63
±
1.532
[0086]
发酵口服液中总酚含量经不同乳酸菌发酵前后的变化如表5所示。与实例4 组未发酵相比，实例1、实例2、实例3组总酚含量增加了8.83％～45.23％，许多研究表明发酵可以增加果汁中总酚的含量，其原因可能是发酵过程中产生的酶和羧酸可能破坏了细胞的结构，释放出酚类物质。
[0087]
实验例5 dpph自由基清除率的测定
[0088]
取不同质量浓度的样品溶液2ml，分别加入2ml浓度为8
×
10-4
mol/l的dpph 溶液并摇匀，待暗处反应0.5h后，于517nm波长下测定吸光度a，按公式计算川明参多糖对dpph
·
的清除率。
[0089][0090]
式中：a
样品
为加入cvp样品溶液的吸光度；a
dpph
为不加入样品的溶液的吸光度。
[0091]
表6不同组别中的dpph自由基清除率
[0092]
组别样本数量dpph自由基平均清除率实例1571.28％实例2565.03％实例3561.26％实例4554.92％
[0093]
发酵口服液中dpph自由基清除率经不同乳酸菌发酵前后的变化如表6所示，与实例4组相比，实例1、实例2、实例3组dpph自由基清除率明显增加，说明针对口服液的抗氧化功效而言，植物乳杆菌和发酵乳杆菌的复合添加提高了dpph 自由基清除率。总体来看，抗氧化活性变化与多酚含量的变化趋势相一致，说明发酵口服液抗氧化活性的增加可能与酚类化合物的产生有关。已有研究表明，酚类物质之间的相互转化可以明显改变其抗氧化活性，发酵过程中微生物将复杂的大分子酚类物质转化为小分子酚类物质，表现出较高的抗氧化活性。
[0094]
综上所述，本公开提供的制备方法较于现有的技术，工艺简单，经过微生物发酵后，获得延缓老化、营养健康、品质风味好的发酵口服液，填补了产品的空白；另外，目前市面上已知的枸杞与桑葚的产品已十分丰富，但枸杞与桑葚的复配发酵产品仍未见得，且以口服液为载体的枸杞桑葚复配口服液更是中药药品的一大空缺，本发明意在以桑葚为辅助，制备发酵枸杞桑葚口服液，并探究其是否具备耐缺氧性、抗疲劳性、抗衰老性的功效。
[0095]
以上实施例仅仅是为清楚地说明所举作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所以的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。