一种富含水飞蓟宾和水飞蓟蛋白的发酵乳及其制备方法与流程

本发明涉及食品生物技术，尤其涉及一种富含水飞蓟宾和水飞蓟蛋白的发酵乳及其制备方法。

背景技术：

1、水飞蓟是菊科，水飞蓟属一年生或二年生草本植物，高可达1.2米。其性味苦凉，有清热解毒，疏肝利胆之功效。水飞蓟籽含有水飞蓟素，主要含于种皮中。水飞蓟素的主要成分为水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟亭。其中水飞蓟宾含量最高，占60％-70％，且活性最强。水飞蓟素有多种药理活性，可以防止肝细胞退化，促进肝的净化，帮助解毒，还可以促进受损肝细胞的修复。水飞蓟素主要通过抗脂质过氧化作用清除自由基，提高肝中谷胱甘肽(g-sh)水平，发挥保肝作用。水飞蓟素还具有降血脂、抗氧化、防止糖尿病、抗炎、保护心肌和抗血小板聚集、抑制多种肿瘤以及神经保护和免疫调节作用，可用来治疗阿尔茨海默症、败血症、烧伤及骨质疏松症等，是一种重要的医药原料。

2、水飞蓟籽中，除了含有水飞蓟素以外，还含有水飞蓟蛋白，且蛋白总含量约占种子干物质的55％。水飞蓟蛋白以清蛋白为主，还含有球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和复合蛋白。水飞蓟蛋白氨基酸种类齐全，以谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量最为丰富。水飞蓟蛋白的溶解性、营养性、乳化性、发泡性等均较好。

3、目前，水飞蓟籽主要用于药用成分水飞蓟素的提取，提取后残渣即丢弃。水飞蓟蛋白未有提取，且水飞蓟有药品类、保健品类产品，但是没有食品类产品。水飞蓟素的提取方法有多种，主要是有机溶剂提取法，常见方法是先将水飞蓟种子渣油，再以脱脂水飞蓟籽为原料，以乙醇、甲醇、丙酮、醋酸乙酯等有机溶剂为提取试剂，通过超声波辅助、加热回流、反复浸提、浓缩结晶等方法，获得水飞蓟素。显然，此方法不适用于食品工业。

技术实现思路

1、本发明的目的在于，针对目前水飞蓟素有机溶剂提取法不适用于水飞蓟食品类产品生产的问题，提出一种富含水飞蓟宾和水飞蓟蛋白的发酵乳的制备方法，该方法为食品生物技术，与传统有机试剂提取法相比较具有生物安全性和方法简便性；该方法还实现了水飞蓟宾和水飞蓟蛋白的同步提取；发酵步骤使用了专利菌株植物乳杆菌，其能够促进水飞蓟宾的提取效率，提高水飞蓟蛋白的溶出效果。发酵产品呈乳白色，具有乳制品清香，具有良好的营养作用和饮用口感。。

2、为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种富含水飞蓟宾和水飞蓟蛋白的发酵乳的制备方法，包括以下步骤：

3、步骤1称取水飞蓟籽(即水飞蓟种子)，向水飞蓟籽中加入水，使用胶体磨研磨，得到水飞蓟匀浆液；

4、步骤2将步骤1所得水飞蓟匀浆液静置，过滤分离出第一固液残渣和第一上清液；

5、步骤3将步骤2的第一固液残渣与nahco3溶液混合，混合均匀后，将混合液置于40-80℃下，恒温保持1-6小时；

6、步骤4将步骤3所得混合液静置，过滤分离得到第二固液残渣和第二上清液；

7、步骤5将步骤4的第二固液残渣与nahco3溶液混合，接着再加入蔗糖，混合均匀，将溶液于100℃下恒温加热2-20分钟；

8、步骤6将植物乳杆菌的菌种保藏液接种到无菌胰蛋白大豆培养基中，于27-37℃下过夜震荡培养，得到浓度>108cfu/ml的菌液；

9、步骤7取步骤6所得菌液加入到步骤5所得溶液中，混合均匀后，于27-37℃下恒温培养12-16小时，得到发酵液；

10、步骤8将步骤7所得发酵液静置，过滤分离出第三上清液，弃去剩余残渣；

11、步骤9将所述第一上清液、第二上清液和第三上清液合并，于100℃下恒温加热3-30min，得到富含水飞蓟宾和水飞蓟蛋白的发酵乳。

12、进一步地，步骤1中水飞蓟籽与水的用量比为1:40-60(g：ml)，优选为1:45-55(g：ml)。

13、进一步地，步骤3中nahco3溶液的施加量满足以下条件：nahco3溶液与步骤1中水飞蓟籽的比为40-60:1(ml：g)，优选为45-55:1(ml：g)。

14、进一步地，步骤3中混合均匀后，将混合液置于50-70℃下，恒温保持2-5小时。

15、进一步地，步骤5中nahco3溶液的施加量满足以下条件：nahco3溶液与步骤1中水飞蓟籽的比为10-30:1(ml：g)，优选为15-25:1(ml：g)。

16、进一步地，步骤3和步骤5所述nahco3溶液的浓度为0.1-6％，优选为0.5-4％。本发明中如无特殊说明％均为质量百分含量。

17、进一步地，步骤5中蔗糖的施加量满足以下条件：蔗糖与步骤1中水飞蓟籽的质量比为0.5-3:1，优选为1-2:1。

18、进一步地，步骤5中混合均匀后，将溶液于100℃下恒温加热5-10分钟。

19、进一步的，步骤3、5中所述的nahco3为食品级小苏打，可在商店购买得到。

20、进一步的，步骤6所述植物乳杆菌为保藏于中国典型菌种保藏中心(武汉)的cctccm2021576菌株。

21、进一步的，步骤6于29-33℃下过夜震荡培养。

22、进一步的，步骤7菌液的施加量满足以下条件：菌液与步骤1中水飞蓟籽的比为1-5:1(ml：g)，优选为2-4:1(ml：g)。

23、进一步的，步骤7混合均匀后，于29-33℃下恒温培养13-15小时，得到发酵液。

24、进一步的，步骤9于100℃下恒温加热5-20min。

25、水飞蓟籽是一种植物中药材。水飞蓟籽的种皮中含有水飞蓟宾，是水飞蓟的药效成分，具有护肝、抗癌、修复肝损伤等作用。水飞蓟籽还含有水飞蓟蛋白，蛋白呈乳白色，可溶比例较高，所以水飞蓟也称奶蓟。本发明开发了一种富含水飞蓟宾和蛋白的植物乳杆菌发酵饮品。其制备过程分为三步，分别是水飞蓟籽的匀浆和静置处理、nahco3溶液加热处理、以及微生物发酵处理。最后，将所得溶液合并，进行短时高温灭菌处理，得到产品。发酵步骤使用了专利菌株植物乳杆菌，其能够促进水飞蓟宾的提取效率，提高水飞蓟蛋白的溶出效果。发酵产品呈乳白色，具有乳制品清香，具有良好的营养作用和饮用口感。本发明成果提供了一种水飞蓟的食品类产品，为人民群众通过膳食途径获取水飞蓟宾和水飞蓟蛋白提供了可能性。

26、本发明的另一个目的还公开了一种富含水飞蓟宾和水飞蓟蛋白的发酵乳，采用上述方法制备而成。

27、本发明一种富含水飞蓟宾和水飞蓟蛋白的发酵乳及其制备方法，与现有技术相比较具有以下优点：

28、1)水飞蓟宾和水飞蓟蛋白的同步提取。

29、本发明通过三步法制取水飞蓟发酵乳，实现了水飞蓟宾、水飞蓟蛋白的同步提取。其中，匀浆处理是水飞蓟蛋白制备的关键步骤，nahco3溶液加热处理是获得水飞蓟宾的关键步骤，微生物发酵进一步增加了水飞蓟宾和蛋白的提取率并增加了产品香气。传统的水飞蓟素或水飞蓟宾使用有机试剂进行提取，本发明为食品加工技术，与传统方法有本质区别。且传统方法不提取水飞蓟蛋白，本方法实现了水飞蓟宾和水飞蓟蛋白的同步提取。三步法提取获得的乳液为最终产品，每一步所获得的乳液和最终发酵乳，如图1所示。

30、2)所制备发酵乳中含有水飞蓟宾。

31、每g水飞蓟籽中含有水飞蓟宾约14-17mg，使用本发明的三步法所制备的溶液中，均含有水飞蓟宾。其中，步骤2、步骤4、步骤8所得第一上清液、第二上清液、第三上清液的高效液相色谱的检测结果如图2所示。在每g水飞蓟籽的处理中，第一上清液所得水飞蓟宾约为0.4-0.7mg，第二上清液所得水飞蓟宾约为8.5-9.5mg，第三上清液所得水飞蓟宾约为1.7-2.2mg。合计第一上清液、第二上清液、第三上清，所得水飞蓟宾约为10.6-12.4mg，占水飞蓟籽中水飞蓟宾总含量的62.3-88.6％。已有研究中，使用有机试剂提取法，所得的水飞蓟宾的提取率约为82-97％。本发明使用食品生物技术，在不使用有机试剂的前提下，也能提取得到62.3-88.6％的水飞蓟宾，说明了本发明方法的提取高效性。

32、图2三步法提取所得溶液的高效液相色谱检测结果。a为水飞蓟宾标样；b为步骤2所得第一上清液；c为步骤4所得第二上清液；d为步骤8所得第三上清液。1号峰为水飞蓟宾a，2号峰为水飞蓟宾b，水飞蓟宾a，b互为差向异构体。

33、本发明以nahco3溶液为提取水飞蓟宾的主要试剂，与传统有试剂方法相比，具有生物安全性和方法简便性。一方面食品级nahco3也是小苏打，碱性温和，容易购买，是可用于食品加工的添加剂，另一方面，nahco3能够和水飞蓟宾的酚羟基发生解离平衡，提高水飞蓟宾的溶解性，可以和水飞蓟籽中的脂肪酸发生皂化反应，有利于种子的脂肪组分释放水飞蓟宾，同时nahco3还能促进植物细胞壁的破碎和解构，有利于水飞蓟宾和水飞蓟蛋白的溶解与释放。但是，直接使用nahco3与水飞蓟籽匀浆液反应，nahco3可能因为种子中所含有的蛋白和脂肪酸而大量消耗，降低了其有效作用浓度，导致需要使用高浓度nahco3才能提取得到水飞蓟宾，不利于食品的制备。所以，本研究首先将水飞蓟匀浆后，离心处理，通过分离乳白上清液得到水飞蓟蛋白，将固液残渣通过nahco3处理，并优化nahco3的处理条件，得到水飞蓟宾。而微生物发酵，对食品制备有一定的增香作用，还能通过酶作用增加水飞蓟宾的溶解率。所以，本发明在nahco3处理后，增加微生物发酵处理，合并匀浆、nahco3处理和发酵处理所得到的上清液，制备得到水飞蓟发酵乳。虽然已有研究中有使用naoh溶液提取水飞蓟宾的研究，但是本发明与之前的研究有这本质的不同。一方面，以前的研究使用2mol/l的naoh提取水飞蓟宾，即强碱性溶液。本研究使用0.1-6％的nahco3处理水飞蓟籽，即0.0119mol/l-0.714mol/l的nahco3溶液处理，溶液碱性和离子强度较之前的naoh溶液弱很多，且nahco3是食品级添加剂，即食用小苏打。之所以有效，是因为本发明首先使用了一步匀浆步骤，将水飞蓟籽中的蛋白和脂肪酸通过匀浆处理而部分移出，水飞蓟宾含于种皮中，从而主要保留在剩余固液残渣中，进一步通过nahco3处理，辅助加热，从而使得种皮中的水飞蓟宾得以解离和释放。进一步的微生物发酵处理，也加强了水飞蓟宾的溶解和释放。

34、3)所制备水飞蓟发酵乳中含有水飞蓟蛋白。

35、每g水飞蓟籽中含有水飞蓟蛋白约320-370mg，其中可溶蛋白占60％，约192-222mg。本发明的三步法所制备的溶液中，均含有水飞蓟蛋白。其中，步骤2、步骤4、步骤8所得第一上清液、第二上清液、第三上清的蛋白质变性凝胶电泳的检测结果如图3所示。在每g水飞蓟籽的处理中，第一上清液所得水飞蓟可溶蛋白约为58.0-64.0mg，第二上清液所得水飞蓟可溶蛋白约为48.0-55.0mg，第三上清液所得水飞蓟可溶蛋白约为17.0-26.0mg。合计第一上清液、第二上清液、第三上清，所得水飞蓟可溶蛋白约为123-145mg，占水飞蓟籽中水飞蓟蛋白总含量的33.2-45.3％，占总可溶蛋白总含量的55.4-75.5％。这一结果说明本发明所得水飞蓟发酵乳含有水飞蓟蛋白，且具有较好的蛋白提取效率。本发明所使用的发酵菌，为保藏编号cctccm2021576的植物乳杆菌，是可供食品发酵使用的安全菌株具，具有显著促进水飞蓟蛋白溶解和释放的特点(与空白对照相比)。而且，该植物乳杆菌能够改善水飞蓟发酵乳口感，具有乳制品清香，为生产一种富含水飞蓟蛋白的发酵乳奠定了基础。

36、综上，本发明采用食品生物技术，开发了一种富含水飞蓟宾和蛋白的植物乳杆菌发酵饮品。本发明提出使用碱性溶液和微生物发酵的方法，加强水飞蓟素和蛋白在加工溶液中的溶解和释放。简单来说，制备过程分为三步，分别是水飞蓟籽的匀浆和离心处理、nahco3溶液加热处理、以及微生物发酵处理。通过高效液相色谱方法检测各步骤的水飞蓟宾产率，通过蛋白定量和电泳解析蛋白产率。结果发现，匀浆处理是水飞蓟蛋白制备的关键步骤，nahco3溶液加热处理是获得水飞蓟宾的关键步骤，植物乳杆菌发酵进一步增加了水飞蓟宾和蛋白的提取率并增加了产品香气。其中，nahco3通过与水飞蓟宾的酚羟基反应，提高了水飞蓟宾的水溶性，加速了水飞蓟宾的解离平衡，而nahco3又通过与种子中脂肪酸发生皂化反应，增加了种子脂肪中的水飞蓟宾和水飞蓟蛋白的溶解和释放。发酵乳除了含有理想的水飞蓟宾和水飞蓟蛋白含量以外，还具有酸甜口感和乳酸发酵清香，是一种较好的功能性发酵饮品。本发明产品为水飞蓟功能性食品的研发提供了思路，为通过膳食饮品的方式补充水飞蓟宾和蛋白提供了可能。