一种基于微流控技术的壳聚糖修饰花色苷纳米脂质体及其应用

本发明属于分子生物工程技术及花色苷应用领域，涉及微流控技术在花色苷脂质体制备上的方法设计，以及黑果腺肋花楸为例的花色苷的食品营养学应用。

背景技术：

1、花色苷作为一种天然的水溶性色素，具有如抗氧化，抗炎，抗癌，抗肥胖和抗糖尿病等广泛的生物活性。然而，其自身对温度、光照、ph、活性氧等条件变化非常敏感，特别是随人体摄入后，复杂的身体内环境容易令其丧失原有的功能活性及营养价值，造成其实际的胃肠吸收率及生物利用度较低，极大限制了其在食品工业中的应用。

2、纳米材料是保护环境敏感生物活性分子的重要发现，也是一种药物递送的有效方法，它可以以包裹生物活性化合物的方式为其在不利环境条件下提供保护屏障，从而更好地助力生物学应用。其中，以磷酸和胆固醇为骨架的脂质体因具有良好的生物相容性、生物降解性、低毒性和免疫原性，已被广泛而成熟地应用于食品分子装载和制药等行业。然而，脂质体在胃肠道中也面临半衰期短，易降解、发生聚集及材料氧化等问题，而壳聚糖（chitosan，cs）作为一种阳离子多糖生物聚合物，恰恰具有良好的黏膜粘附性和穿肠稳定性，可有效增加生物分子在吸收位点的停留时间，助力脂质体提高生物利用率。

3、在脂质体的诸多制备方法中，微流控技术因具备对材料流速、配比的实时控制，可实现多相的均一混合等突出优势，解决了传统方法如薄膜分散法，反向蒸发法，有机溶剂注入法等制备时间长、均一性差、粒径大小无法控制等问题，令脂质体制备具备了工业化生产的潜力。

技术实现思路

1、基于具有良好生物学活性及功能的花色苷在体内吸收利用困难这一问题，结合壳聚糖在生物体内的稳定性以及微流控技术制备脂质体的显著优势，本发明要解决的技术问题为：应用微流控技术优化控制可包裹花色苷的脂质体的合成，并在此基础上引入壳聚糖修饰，构建一种具备低粒径、高载量且稳定性好的花色苷纳米脂质体递送系统，为新型功能食品的研究与应用提供科学依据。

2、一方面，本发明提供一种基于微流控技术制备的经壳聚糖修饰的花色苷纳米脂质体递送系统的方法，包含如下步骤：

3、（1）将卵磷脂和胆固醇按1：1~5：1的质量比溶解于无水乙醇溶液中，超声至完全溶解，得到脂质乙醇溶液，作为微流控设备的脂相；将花色苷用ph值为6.5~7.2 pbs缓冲溶液稀释0.1~0.3 mg/ml的浓度，作为微流控设备的水相。优选地，将卵磷脂和胆固醇的质量比控制为5：1，设为脂相，将浓度为0.2 mg/ml的黑果腺肋花楸（aronia melanocarpa，am）溶解于pbs（ph=6.7），设为水相；

4、（2）水相和脂相通过微量泵以1：1~5：1的速率及总流速1.5~4 ml/min进行混合，得到花色苷纳米脂质体。脂质体样品容器保持打开状态，并在4°c下至少保持4~8 h，以稳定并去除无水乙醇，4°c下保存备用。优选地，将流速比控制在3：1，总流速4 ml/min，并在4℃下保存6 h后，以稳定并去除无水乙醇，4℃下保存备用；

5、（3）制备壳聚糖溶液，将1.00 g壳聚糖溶解在1 %的冰醋酸溶液中，搅拌至澄清，并稀释成0.1%~1%的壳聚糖溶液。优选地，将壳聚糖溶液稀释为0.7%；

6、（4）将步骤2的脂质体溶液加入到步骤3的壳聚糖溶液中，并按体积比1：1的比例混合，45℃~55℃条件下搅拌0.5~2 h后静置0.5~2 h，再以2000~5000 rpm，4℃的条件下离心20~60 min，去除多余的壳聚糖，弃掉上清，加入pbs重悬，得到壳聚糖修饰的花色苷纳米脂质体，4℃储存备用。优选地，在50℃条件下搅拌1 h后静置0.5 h，再以3000 rpm，4℃的条件下离心30 min，去除多余的壳聚糖，弃掉上清，加入pbs重悬，得到壳聚糖修饰的花色苷纳米脂质体，4℃储存备用。

7、另一方面，涉及该制备方法得到的花色苷纳米脂质体及其在药物递送、靶向治疗或通路验证研究中的应用。

8、本发明具有的技术效果为：

9、（1）本申请首次使用微流控技术制备了花色苷纳米脂质体，改善了传统方法制备纳米脂质体制备时间长，均一性差，粒径偏大等问题，令纳米脂质体更好地具备了大批量工业化生产潜力。

10、（2）首次以自然界植物中含量最丰富的黑果腺肋花楸花色苷为例，作为功能分子进行包埋递送，不仅克服了花色苷环境敏感性的难题，提高了花色苷的生物利用率，还从原料引入方面最大限度降低了生产成本。

11、（3）本申请通过壳聚糖对黑果腺肋花楸花色苷纳米脂质体的修饰改性，提高了果腺肋花楸花色苷纳米脂质体整体的稳定性和功能性，延长了花色苷在体内的停留时间，使花色苷更好地在体内发挥其生理活性，提高生物利用度。

技术特征：

1.一种基于微流控技术的壳聚糖修饰花色苷纳米脂质体的制备方法，其特征在于，包含纳米脂质体制备和花色苷修饰两个步骤。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，纳米脂质体制备的步骤包括：

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，花色苷修饰的步骤包括：

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将卵磷脂和胆固醇的质量比控制为5：1，设为脂相，将浓度为0.2 mg/ml的花色苷溶解于pbs（ph=6.7），设为水相。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，将流速比控制在3：1，总流速4 ml/min，并在4℃下保存6 h后，以稳定并去除无水乙醇，4℃下保存备用。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，壳聚糖溶液稀释浓度为0.7%。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，壳聚糖修饰实验参数为：在50℃条件下搅拌1 h后静置0.5 h，再以3000 rpm，4℃的条件下离心30 min，去除多余的壳聚糖，弃掉上清，加入pbs重悬，得到壳聚糖修饰的花色苷纳米脂质体，4℃储存备用。

8.如权利要求1-7任一所述的制备方法制备的花色苷纳米脂质体。

9.根据权利要求1~7任一项所述的制备方法在制备包裹不同类型花色苷或花色苷类似物的脂质体中的应用。

10.根据权利要求1~7任一项所述的制备方法制备得到的花色苷纳米脂质体在药物递送、靶向治疗、通路验证领域的应用。

技术总结
本发明提出了一种基于微流控技术的壳聚糖修饰花色苷纳米脂质体及其应用。通过对微流控多相通道内容物的配比、缓冲液条件、流速等系数的优化控制，以粒径大小、包封率为响应值进行系统评估，成功制备了高包封率（超70%）的包裹花色苷的纳米脂质体；同时，壳聚糖修饰的引入最大限度的提高了纳米脂质体的储存时长、温度抗性、以及在胃肠体系下的稳定性和功能性，克服了花色苷因环境敏感性而难以功能性食品摄入的方式被人体利用难题，在提高花色苷的生物利用度的基础上，降低生产成本，有助于花色苷在膳食补充剂、医药工业和化妆品等领域的发展。

技术研发人员：许文涛,朱龙佼,刘海燕,茹苹,兰欣悦,陈可仁
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12