本发明属于食品添加剂，具体涉及一种基于酶促反应制备香椿特征风味增强剂的方法。
背景技术：
：：1、香椿作为我国一种传统的蔬菜、药用植物和木材来源，有着悠久的消费历史。每年春天香椿生长出嫩芽，由于其独特的风味和营养价值，这种季节性美味的短暂供应，一直以来深受我国大部分地区消费者的喜爱，其芽苗菜近年来也成为一种越来越受欢迎的食物。但香椿嫩芽具有典型的季节性，供应期极短，而大量研究表明，香椿属于热敏性香辛植物，其特征香气活性成分在传统热加工过程中随着加热温度的升高，其香气成分稳定性差容易逸散或分解或聚合，从而丧失植物特征风味，甚至产生劣变，商品价值大打折扣，这对香椿特征香气鉴定、产品开发及其食品加工适用性都带来一定的困难。2、对香椿挥发性成分的研究开始于大约20年前，截止到目前为止，香椿中已鉴定出100多种挥发性成分，主要包括硫化物、萜烯、醛类、烃类、酸、醇和酯类。刘常金等人通过gc-ms及gc-o检测分析表明z/e-2-琉基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩两个异构体是香椿特征香气的主要贡献者(analysis of volatile compounds and identification ofcharacteristic aroma components of toona sinensis(a.juss.)roem.using gc-msand gc-o.[j].food and nutrition sciences,2013,04(03).)。孙宝国等人通过静态顶空稀释分析(shda-aeda)和溶剂辅助蒸发稀释分析(safe-aeda)并结合gc-ms、gc-o测定鲜香椿和烫漂香椿中的主要香气成分，发现含硫化合物特别是(e,e)-丙烯基-二硫醚、(e,z)-丙烯基-二硫醚为关键香气成分，在香椿整体香气中占主导地位，提供了刺激性、含硫磺和大蒜类辛辣气味，从而赋予了香椿独特的香气特征(characterization of typical potentodorants in raw and cooked toona sinensis(a.juss.)m.roem.by instrumental-sensory analysis techniques.[j].food chemistry,2019,282.)。zhai xiaoting等人针对红/绿香椿香气差异，通过香气提取物稀释分析(aeda)结合gc-ms和gc-o检测，结果表明(e,e)-丙烯基-二硫醚、(e,z)-丙烯基-二硫醚、(z,z)-丙烯基-二硫醚、(e,e)-丙烯基-三硫醚、(e,z)-丙烯基-三硫醚、(z,z)-丙烯基-三硫醚以及cis-和trans-2-琉基-3,4-二甲基-2,3-二氢噻吩、二甲基硫醚等含硫类关键香气物质构成、风味稀释因子、含量及气味活性值的明显差异，导致了不同香椿品种总体香气轮廓差异以及每个品种其独特的硫磺类气味。(key odor-active compounds in raw green and red toona sinensis(a.juss.)roem.and their changes during blanching.[j].journal of agricultural and foodchemistry,2020,68(27).)。以上研究均表明，挥发性硫化物对香椿特征香气贡献最大，是其主要特征嗅感成分。3、关于香椿中以上含硫化合物的非挥发性前体物质的研究较少，仅有li jiaxiao等人通过稳定性同位素追踪法，证实了香椿含硫风味前体物质为(s,s)-γ-谷氨酰-(z/e-s-1-丙烯基)硫代甘氨酸(结构如下所示)、γ-谷氨酰-(z/e-s-1-丙烯基)半胱氨酸、z/e-s-1-丙烯酰基-l-半胱氨酸(identification of(s,s)-γ-glutamyl-(cis-s-1-propenyl)thioglycine,a naturally occurring norcysteine derivative,from the chinesevegetable toona sinensis.[j].journal of agricultural and food chemistry,2013,61(31).)。4、5、香椿在组织被切割或咀嚼破坏时，会释放出其典型的含硫类刺激性气味，结合葱、蒜及洋葱等葱属植物中含硫类挥发性风味物质相似的合成路径，li jiaxiao等人研究推测香椿中的风味前体物质(γ-谷氨酰-丙烯基硫代甘氨酸)在肽酶的作用下形成丙烯基硫醇，不稳定的丙烯基硫醇容易发生聚合或热解反应进而生成一系列的挥发性含硫化合物(二丙烯基二硫醚、2-琉基-2,3-二氢-3,4-二甲基噻吩、3,4-二甲基噻吩等)，从而产生香椿特征风味(合成路线如下所示)。本课题组前期的研究发现：完整未破坏的新鲜香椿经冷冻干燥得到的冻干粉，与极少量水接触后，在数秒内即可产生强烈的新鲜香椿固有的含硫类风味，推测典型风味是由于冻干粉与水接触导致酶重新激活产生的结果，类似的现象在大蒜、洋葱冻干粉的复水中也被证实，从而进一步验证了香椿含硫风味形成的酶促合成路径。6、7、基于此研究背景，本发明根据香椿含硫特征香气的酶促形成机制，分别分离纯化香椿含硫风味前体底物、γ-谷氨酰转肽酶(γ-gtp)，并通过构建酶促反应体系，成功制备出香椿特征风味，首次在体外验证了香椿含硫类特征香气形成的酶促反应机制，为生物酶法制备香椿典型风味增强剂提供了可行路径。目前为止，通过分离纯化香椿风味前体底物和γ-谷氨酰转肽酶(γ-gtp)，利用酶促反应制备香椿特征风味的方法尚未见报道。技术实现思路1、本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种基于酶促反应制备香椿特征风味增强剂的方法。本发明提取纯化的香椿γ-gtp酶，与商品化的异源γ-gtp酶相比，成本较低，且通过与提取的香椿风味前体底物反应，制备的香椿特征风味增强剂具有浓度高、风味浓郁、与鲜香椿风味更加接近的特点，具有较好的应用前景。2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：3、一种基于酶促反应制备香椿特征风味增强剂的方法，其包括如下步骤：4、1)香椿含硫风味前体底物或提取物的制备：5、向新鲜或冷冻香椿嫩芽中加入3-8％的三氟乙酸水溶液，在破壁机中粉碎灭酶处理10-30min，加入去离子水30-50℃超声提取30-60min，再经离心、浓缩得到风味前体底物粗提物水溶液，依次加入sevage试剂、石油醚、乙醇进行萃取除杂，经浓缩、冷冻干燥得到风味前体底物提取物，为黄褐色粉末，4℃储存备用；6、或，将得到的风味前体底物提取物复溶于水，依次采用阳离子交换树脂、固相萃取柱分离纯化，得到纯化的风味前体底物；7、2)制备γ-谷氨酰转肽酶(γ-gtp)或γ-谷氨酰转肽酶粗酶液：8、3)基于酶促反应制备香椿特征风味增强剂：9、将风味前体底物提取物或风味前体底物配制成浓度0.1-0.5g/ml的水溶液，用tris-hcl缓冲液将γ-谷氨酰转肽酶配制成1-5mg/ml的溶液，然后等体积混合并在30-50℃、ph 7-8的密封条件下反应30-60min，即得；10、或者，将风味前体底物提取物或风味前体底物配制成浓度0.1-0.5g/ml的水溶液，与γ-谷氨酰转肽酶粗酶液等体积混合并在30-50℃、ph 7-8的密封条件下反应30-60min，即得；所述γ-谷氨酰转肽酶粗酶液的比酶活为0.1-0.3units/mg。11、本发明中，γ-谷氨酰转肽酶可以是商品化来源的γ-gtp酶、提取的香椿γ-gtp粗酶液或纯化的γ-gtp酶。12、具体的，步骤1)中，所述新鲜或冷冻香椿嫩芽与三氟乙酸水溶液的质量比为1：1-2。13、进一步的，步骤1)中，所述去离子水的添加量为新鲜或冷冻香椿嫩芽质量的10-20倍。14、具体的，步骤2)中所述γ-谷氨酰转肽酶粗酶液经下述步骤制备获得：15、将新鲜、完整的香椿嫩芽优选在-30～-40℃、0.01kpa真空条件下冷冻干燥35-40h，打碎过40-80目筛得到冻干香椿粉，取适量冻干香椿粉加入缓冲液中快速研磨10-20min，然后冰浴超声处理30-60min，2-8℃冷冻离心10-20min，即得到γ-谷氨酰转肽酶粗酶液。16、进一步的，上述γ-谷氨酰转肽酶粗酶液制备过程中，所述缓冲液为浓度40-60mm、ph7-9且含8-12％甘油、18-22μm磷酸吡哆醛、1-2mm乙二胺四乙酸edta及4-6mmβ-巯基乙醇的tris-hcl缓冲液。优选的，所述冻干香椿粉与缓冲液按照料液比1g：15-20ml进行添加。17、进一步的，所述γ-谷氨酰转肽酶粗酶液依次采用硫酸铵分级沉淀、透析及冷冻干燥得到纯化的γ-gtp酶样品，具体经下述步骤纯化获得γ-谷氨酰转肽酶：18、在2-8℃条件下，向γ-谷氨酰转肽酶粗酶液中加入硫酸铵至饱和度为40-45％，静置过夜，2-8℃离心，取上清液并添加硫酸铵至饱和度达到65-70％，静置过夜，2-8℃离心，收集沉淀物目标蛋白，用tris-hcl缓冲液溶解，再以截留分子量为8 -14kda的透析袋进行透析，透析液经冷冻干燥，得到纯化的γ-谷氨酰转肽酶。19、本发明首次通过酶促反应在体外成功制备出香椿特征风味，为生物酶法制备典型香椿风味香料香精或风味增强剂提供了可行路径，有利于解决新鲜香椿不易贮存及香椿加工制品风味丧失等问题。与现有技术相比，本发明方法具有以下有益效果：20、1)本发明构建了香椿含硫类特征香气的体外酶促反应体系，成功制备出香椿典型特征风味的增强剂，首次在体外验证了香椿含硫类特征香气形成的酶促反应机制，为生物酶法制备香椿典型特征风味增强剂提供了可行路径(结果见实施案例)，可以在香椿风味制品的加工中应用，起到风味强化的作用。21、2)本发明提取纯化的香椿γ-gtp酶，与商品化的异源γ-gtp酶相比，成本较低，且通过与提取的香椿风味前体底物反应，制备的香椿特征风味的增强剂具有浓度高、风味浓郁、与鲜香椿风味更加接近的特点，具有较好的应用前景。当前第1页12当前第1页12