一种调控动物脂肪代谢的丁酸梭菌制剂及其制备方法

本发明涉及益生菌，具体涉及一种调控动物脂肪代谢的丁酸梭菌制剂及其制备方法。

背景技术：

1、近些年来，我国经济发展迅速，人民生活水平提高，关于肉类的消费理念发生了很大变化。人们在追求肉“量”的同时，更加注重对肉“质”的要求。随着家禽肉类的需求量日益增加，现代选育的快大型家禽快速生长的同时，也伴随着体内脂肪含量高、体脂沉积严重等问题。

2、脂肪的功能主要是为机体贮存能量，家禽通过对食物摄入脂肪，消耗能量进行生理调节。适量腹部脂肪有利于家禽能量储存，而绝大部分脂肪沉积并非机体生理所必需。现在的养殖方法使得家禽体内过多的脂肪，会导致一系列负面后果，如：影响饲料利用率；降低可食用胴体产量；作为加工废物丢弃而污染环境；增加脂肪肝综合征的发生等等。

3、脂肪形成的过程是前脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化的过程，并受到一系列转录因子的调控。如何调控脂肪合成、转运、分解和脂肪细胞分化相关基因的表达，是维持动物体内脂肪代谢平衡和防止脂肪过度沉积的关键。如何将饲料中的营养成分有效转化为人们所需要的产品，减少过多的脂肪沉积，生产出高品质的畜产品，是家禽生产者和消费者的当务之急。

4、丁酸梭菌是一种革兰氏阳性厌氧细菌袁存在于健康的人和动物肠道中，丁酸梭菌是一种活跃的糖酵菌，可发酵碳水化合物，产生短链脂肪酸，包括丁酸、丙酸和乙酸等，短链脂肪酸在调控动物的生长和免疫力等方面发挥着重要作用。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提出一种调控动物脂肪代谢的丁酸梭菌制剂及其制备方法，具有原料来源广、成本低，制备方法简单，条件温和，制得的产物具有很好的调节脂肪代谢，降低家禽的体脂率，提高肉质质量，降低家禽的患病率，提高免疫力，促进生长，具有广阔的应用前景。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供一种调控动物脂肪代谢的丁酸梭菌制剂的制备方法，将制得小蘖碱/l-肉碱/甜菜碱共晶、由荷叶、决明子、山楂水提取得到的脂肪调节水提取物和发酵得到的脂肪调节发酵提取物、丁酸梭菌经富集铬和多糖并包埋的微球混合均匀，制得调控动物脂肪代谢的丁酸梭菌制剂。

4、作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：

5、s1.小蘖碱/l-肉碱/甜菜碱共晶的制备：将小蘖碱溶于热乙醇，得到溶液a；将l-肉碱和甜菜碱溶于水中，得到溶液b；将溶液a和溶液b加热混合均匀，停止加热，静置，过滤，洗涤，干燥，制得小蘖碱/l-肉碱/甜菜碱共晶；

6、s2.脂肪调节水提取物的制备：将荷叶、决明子、山楂洗涤，干燥，粉碎，制得混合粉，加入水中，加热至沸腾提取，过滤，滤渣干燥留用，滤液加入乙醇沉淀，离心，收集固体，制得混合多糖，上清液回收乙醇，干燥，制得脂肪调节水提取物；

7、s3.丁酸梭菌的活化：将丁酸梭菌接种于高氏培养基中，活化培养，制得菌种种子液；

8、s4.发酵：将步骤s2中的滤渣加入水中，灭菌，接种步骤s3制得的丁酸梭菌菌种种子液，发酵培养，过滤，滤渣洗涤，收集洗脱液浓缩，得到浓缩菌液，滤液冷冻干燥，制得脂肪调节发酵提取物；

9、s5.富铬菌多糖混合物的制备：将步骤s2制得的混合多糖经灭菌后加入步骤s4中的浓缩菌液中，加入三价铬盐，搅拌混合均匀，发酵培养，透析，制得富铬菌多糖混合物；

10、s6.包埋：向步骤s5制得的富铬菌多糖混合物中加入海藻酸钠和卵磷脂，加入鱼油中，乳化，滴加氯化钙溶液，常温固化，离心，洗涤，干燥，制得包埋球；

11、s7.调控动物脂肪代谢的丁酸梭菌制剂的制备：将步骤s1制得的小蘖碱/l-肉碱/甜菜碱共晶、步骤s2制得的脂肪调节水提取物、步骤s4制得的脂肪调节发酵提取物、步骤s6制得的包埋球混合均匀，制得调控动物脂肪代谢的丁酸梭菌制剂。

12、作为本发明的进一步改进，步骤s1中所述热乙醇的温度为70-80℃，所述小蘖碱、l-肉碱和甜菜碱的质量比为5-7:2-4:1-2，所述加热至温度为70-80℃，所述静置的时间为2-4d。

13、作为本发明的进一步改进，步骤s2中所述荷叶、决明子、山楂的质量比为7-10:2-4:3-5，所述混合粉和水的固液比为1:5-10g/ml，所述沸腾提取的时间为3-5h，所述加入乙醇至体系乙醇含量为60-80wt％，沉淀2-4h。

14、作为本发明的进一步改进，步骤s3中所述活化培养的条件为无氧条件下，36-38℃，100-120r/min，活化培养18-24h，所述菌种种子液的含菌量为108-109cfu/ml；步骤s4中所述滤渣、水的质量比为10-15:100，所述丁酸梭菌菌种种子液的接种量为2-4v/v％，所述发酵培养的条件为无氧条件下，36-38℃，100-120r/min，发酵培养48-56h，所述浓缩菌液的含菌量为1011-1012cfu/ml。

15、作为本发明的进一步改进，步骤s5中所述混合多糖、三价铬盐、浓缩菌液的质量比为12-15:2-4:120-150，所述三价铬盐选自氯化铬、硝酸铬、硫酸铬中的至少一种，所述发酵培养的条件为无氧条件下，36-38℃，100-120r/min，发酵培养12-16h，所述透析采用的透析袋孔径为3000-5000da，时间为7-10h。

16、作为本发明的进一步改进，步骤s6中所述富铬菌多糖混合物、海藻酸钠和卵磷脂的质量比为100:10-12:0.5-1，所述常温固化的时间为20-30min。

17、作为本发明的进一步改进，步骤s7中所述小蘖碱/l-肉碱/甜菜碱共晶、脂肪调节水提取物、脂肪调节发酵提取物、包埋球的质量比为2-4:4-8:7-10:10-15。

18、作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：

19、s1.小蘖碱/l-肉碱/甜菜碱共晶的制备：将5-7重量份小蘖碱溶于50重量份温度为70-80℃的乙醇，得到溶液a；将2-4重量份l-肉碱和1-2重量份甜菜碱溶于50重量份水中，得到溶液b；将溶液a和溶液b加热至温度为70-80℃，搅拌混合均匀，停止加热，静置2-4d，敞口挥发溶剂，过滤，洗涤，干燥，制得小蘖碱/l-肉碱/甜菜碱共晶；

20、s2.脂肪调节水提取物的制备：将7-10重量份荷叶、2-4重量份决明子、3-5重量份山楂洗涤，干燥，粉碎，制得混合粉，加入水中，所述混合粉和水的固液比为1:5-10g/ml，加热至沸腾提取3-5h，过滤，滤渣干燥留用，滤液加入乙醇至体系乙醇含量为60-80wt％，沉淀2-4h，离心，收集固体，制得混合多糖，上清液回收乙醇，干燥，制得脂肪调节水提取物；

21、s3.丁酸梭菌的活化：将丁酸梭菌接种于高氏培养基中，无氧条件下，36-38℃，100-120r/min，活化培养18-24h，制得含菌量为108-109cfu/ml的菌种种子液；

22、s4.发酵：将步骤s2中的滤渣加入水中，灭菌，接种步骤s3制得的丁酸梭菌菌种种子液，接种量为2-4v/v％，无氧条件下，36-38℃，100-120r/min，发酵培养48-56h，过滤，滤渣洗涤，收集洗脱液浓缩，得到含菌量为1011-1012cfu/ml的浓缩菌液，滤液冷冻干燥，制得脂肪调节发酵提取物；

23、s5.富铬菌多糖混合物的制备：将12-15重量份步骤s2制得的混合多糖经灭菌后加入120-150重量份步骤s4中的浓缩菌液中，加入2-4重量份三价铬盐，搅拌混合均匀，无氧条件下，36-38℃，100-120r/min，发酵培养12-16h，采用孔径为3000-5000da的透析袋透析7-10h，制得富铬菌多糖混合物；

24、s6.包埋：向100重量份步骤s5制得的富铬菌多糖混合物中加入10-12重量份海藻酸钠和0.5-1重量份卵磷脂，加入200重量份鱼油中，乳化，滴加10-15重量份2-4wt％的氯化钙溶液，常温固化20-30min，离心，洗涤，干燥，制得包埋球；

25、s7.调控动物脂肪代谢的丁酸梭菌制剂的制备：将2-4重量份步骤s1制得的小蘖碱/l-肉碱/甜菜碱共晶、4-8重量份步骤s2制得的脂肪调节水提取物、7-10重量份步骤s4制得的脂肪调节发酵提取物、10-15重量份步骤s6制得的包埋球混合均匀，制得调控动物脂肪代谢的丁酸梭菌制剂。

26、本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的调控动物脂肪代谢的丁酸梭菌制剂。

27、本发明具有如下有益效果：

28、l-肉碱作是肉碱脂酰转移酶的辅酶，可将长链脂肪酸从线粒体外运输到线粒体内，从而促进脂肪酸的β-氧化，降低体内脂肪含量。甜菜碱可显著降低腹脂脂蛋白脂酶lpl和肝脏苹果酸脱氢酶mdh的活性，显著提高腹脂激素性敏感脂肪酶hsl活性和下丘脑、腺垂体中camp的含量。小蘖碱可以通过改善肠道菌群的结构，减少内毒素入血，减轻慢性炎症，通过调控生物体内能量平衡，从而达到调控脂肪代谢的目的。但是，小蘖碱的水溶性较差，易产生营养不良的缺点，因此，制备小蘖碱/l-肉碱/甜菜碱共晶，大大提高了小蘖碱的水溶性，同时，也改善了其营养摄入的均衡度，避免造成家禽营养不良的缺陷。

29、荷叶、决明子、山楂中含有丰富的多糖、皂苷、黄酮、蛋白等活性组分，具有很好的减脂、促进脂肪代谢的效果。经过水提取将其大部分水溶性物质包括多糖、蛋白、维生素、单宁等水溶性活性组分提取出来，醇沉得到混合多糖，剩余部分干燥得到脂肪调节水提取物。

30、丁酸梭菌的代谢产物包括消化酶、短链脂肪酸、氨基酸等可保护肠道微生态稳定，提高饲料利用率，能够调节消化酶包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的活性和短链脂肪酸含量来促进生长性能。代谢产物短链脂肪酸可以提高消化酶的活性，促进饲料中营养物质的消化和吸收，降低肠道ph抑制病原菌的生长，可以穿透病原菌的细胞壁，释放其质子h+并扰乱细菌细胞的新陈代谢，导致细胞生长缓慢和死亡。其中，丁酸和丙酸可以通过促进肠道糖异生(ign)来改善肥胖以及糖代谢，其中丁酸通过camp途径来促进ign，而丙酸作为糖异生底物来促进该生理过程。另一种代谢产物如色氨酸及其代谢产物吲哚可以抑制白色脂肪组织(wat)表达mir-181，并促进产热以及降低wat炎症水平。吲哚乙酸和色胺还可以通过激活肝脏中的芳香烃受体(ahr)来抑制脂质引起的炎症以及肝脏中的脂肪合成。因此，经过丁酸梭菌发酵后的脂肪调节发酵提取物具有很好的调节脂肪代谢的功效，同时，发酵原料为水提取后的固渣，进一步提高了原料的利用率，还能促进丁酸梭菌的增殖，降低了原料的成本。

31、由于丁酸梭菌具有富集金属离子的功效，抗逆性好、耐胃酸、耐高温、抑菌，并为肠道提供能量。菌体依托表面的活性基团吸附三价铬离子，吸收速率随菌体数量增长而增加。丁酸梭菌以制备的混合多糖为原料，富集三价铬离子，同时，三价铬离子也能够通过络合作用固定于多糖之间，从而制得了富铬菌多糖混合物，三价铬离子可以调节动物脂质代谢，降低脂质沉积，通过形成葡萄糖耐量因子(gtf)增强胰岛素的功能而调节机体脂类代谢，又以gtf形式通过优化胰岛素的功能既能促进血糖转化为脂肪，又能促进能量转化以供给组织更多的atp，从而抑制环腺苷酸二酯酶活性，阻止camp的降解，起到了很好的降低脂肪吸收的效果。

32、另外，将制得的富铬菌多糖混合物中加入海藻酸钠，海藻酸钠和其中的多糖混合，在钙离子的交联作用下形成壳层，包埋益生菌，同时，制得的壳层具有很好的耐酸耐胆碱效果，从而能够保证将丁酸梭菌输送至肠道，发挥出更好的调节脂肪代谢的效果。

33、到达肠道的丁酸梭菌经多重代谢作用，可以促进动物体内对维生素e和维生素d的吸收，其中，维生素e作为细胞信号转导因子，可以直接或间接影响脂肪代谢相关基因的表达，进而实现对动物脂肪代谢的调控，同时通过调控动物的血脂代谢，降低血浆中胆固醇水平，减缓动脉粥样硬化的发生。维生素d可以提高动物体对钙离子的吸收，在β-肾上腺素能受体和ca2+的参与下，加快脂肪进入β-氧化和三羧酸循环的速度，最终使脂肪分解代谢增强。

34、本发明制得的调控动物脂肪代谢的丁酸梭菌制剂具有原料来源广、成本低，制备方法简单，条件温和，制得的产物具有很好的调节脂肪代谢，降低家禽的体脂率，提高肉质质量，降低家禽的患病率，提高免疫力，促进生长，具有广阔的应用前景。