专利名称：新的抗癌抗生素c-1027的制造方法
技术领域：
本发明涉及一种新的大分子肽类抗肿瘤抗生素的制造方法。
C-1027抗生素是在筛选抗肿瘤抗生素的过程中，从近2000株放线菌的发酵液中，用精原细胞检测出的，不仅具有较强的抗瘤活性，而且还有抗革兰氏阳性细菌及抗革兰氏阴性细菌的作用，但无抗真菌作用。本发明涉及的C-1027抗生素，经检测和查阅现有的技术资料，均未发现有过报导，故可确定为一新的化合物。
本发明的目的是为提供一个具有较好抗肿瘤作用的新抗生素，以解决目前临床使用的抗肿瘤抗生素品种不足或疗效欠佳的问题。
本发明的要点是由具有产生C-1027能力的菌株(下称C-1027产生菌)在适当条件下进行培养，从培养液中分离、提取得到该物质。
用于制造C-1027的产生菌是链霉菌属菌株C-1027，可用Streptomycesglobisporusvar.qianjiangensisn.var.C-1027来表示。此菌株是从中国湖北省潜江县土壤分离得到的，(原日本专利说明书中误写为“中国云南土壤”)，并以CGMCCNO0135号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。该菌株的微rz物学性质如下形态特征C-1027菌株的孢子丝直至波曲(图1)，成熟的孢子链每链10至30个或更多的孢子，孢子柱形，表面光滑(图2)。
培养特征C-1027菌株在各种合成的或有机的培养基上形成白色至淡黄的气生菌丝，往往带有微褐或淡肉桂色色彩。
基内菌丝一般无色或乳脂淡黄，浅黄灰或浅灰黄，没有特定的颜色。
在所试验的培养基上不产生可溶性色素。C-1027的培养特征详见表1。
C-1027的生理特征见表2。
C-1027的碳原利用谱见表3。
C-1027菌株的全细胞水解产物含有LL-二氨基庚二酸和葡萄糖、核糖。
表1C-1027菌株的培养特征培养基生长气生菌丝体基内菌丝体可溶性色素ISP NO2 丰茂 象牙黄至黄灰或淡橄榄软皮黄浅软皮黄无或浅黄ISPNO3适度浅黄白至淡橄榄软皮黄无色或乳脂无ISPNO3适度浅黄白至淡橄榄软皮黄无色或乳脂无ISPNO5丰茂浅黄灰或淡橄榄软皮黄无色或乳脂无ISPNO6薄白至浅黄色浅黄无ISPNO7丰茂浅黄灰或淡橄榄软皮黄无色或浅灰黄无察氏琼脂(蔗糖)薄浅黄白至淡橄榄软皮黄无色无察氏琼脂(葡萄糖)丰茂 浅黄白至淡橄榄软皮黄无色或乳脂 无高氏1号琼脂丰茂浅黄灰或淡橄榄软皮黄无色或浅黄灰无葡萄糖天门冬素琼脂适度浅黄灰或淡橄榄软皮黄无色无Bennetts琼脂适度白至浅黄灰浅黄浅黄或无马铃薯琼脂丰茂淡橄榄软皮黄无色至橄榄软皮黄无表2C-1027菌株的生理特性观察项目特征黑色素产生ISPNO1培养基阴性ISPNO6培养基阴性ISPNO7培养基阴性H2S的产生阳性明胶液化阳性牛乳凝固阳性胨化阳性硝酸还原阳性生长的温度(ISPNO2培养基)28-32℃丰茂，生长迅速，37℃适度，慢45℃不生长表3C-1027菌株的碳源利用谱碳源生长L-阿拉伯糖++++D-木糖+++D-葡萄糖+++D-果糖++++蔗糖-肌醇-L-鼠李糖++++D-甘露醇++++D-半乳糖++++乳糖-纤维素-卫茅醇-水杨苷+棉籽糖-
基于形态、培养、生理生化、胞壁分析等特征的研究结果表明，C-1027菌株应属于链霉菌属的球孢类群。与球孢链霉菌Streptomycesglobispous和西唐氏链霉菌Streptomycessetonii都很相似。经过在同样培养条件下比较结果表明，C-1027菌株与球孢链霉菌更接近但仍存在三点差异，故将C-1027菌株定名为球孢链霉菌潜江变种Stretomycesglobisporusvarqianjiangensisn.var.(日本专利说明书定为StreptomycessetoniiC-1027西唐化链霉菌C-1027)本发明的C-1027物质可用上述C-1027菌株，在适宜的条件下进行培养、制造，通常宜在需氧环境下进行振荡、通气、搅拌培养。
C-1027产生菌所使用的培养基，以含有该菌可利用的营养物质的培养基为好，各种合成、半合成或天然培养基均可使用。培养基组成的碳源有葡萄糖、果糖、甘油、湖精、淀粉、糖密、玉米浆、有机酸等，可以单度使用或组合使用。氮源有蛋白胨、肉膏、酵母膏、大豆粉、干酪素、氨基酸、尿素等有机氮源以及硝酸钠、硫酸铵等无机氮源，可以单独使用或组合使用。还可在培养基中视其需要适当添加钠盐、钾盐、镁盐、磷酸盐及其它重金属盐类。
培养过程中产生泡沫，可添加大豆油、亚麻仁油及十八醇、十四醇、十七烷醇等高级醇类或各种硅化物等消沫剂。
培养基的PH以中性为好，培养温度在20-37℃范围，最佳温度27-30℃。培养时间一般在2-5天之间。按上述培养条件进行培养，可不断积蓄出C-1027物质。上述各种培养条件，可视所用微生物的种类、特性及各种外部条件适当改变，也可从上述范围内，调整选择最适条件。
由上述培养产生的C-1027物质，其分离提取可采用一般提取发酵产物的方法进行，如盐析、疏水性层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤层析等，可单独或任意组合的方式进行。
分离提取方法是将存在于培养液中的C-1027物质，首先过滤、离心，使滤液与菌丝体分开。取滤液加硫酸铵盐析，然后将含有C-1027的沉淀物离心分离或加助滤粉过滤。为了利于沉淀，可以加硫酸铁、三氯化铁、硫酸铝等沉淀剂。如因添加沉淀剂使溶液PH发生较大变化，可先加入碳酸钠、碳酸钾、磷酸二氢钠等中和剂，使PH保持在5-8之间，上述盐析过程可反复进行。
以上所述的沉淀物，溶于水或适当的缓冲液如Tris-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液等，再用cellophane膜，限外滤过膜等脱盐后，进一步精制。精制可用Dowex.1AmberliteIRA-400等强碱性离子交换树脂，AmberliteIR-45、DEAE-cellulose等弱碱性离子交换树脂、助滤粉、Hydroxy磷灰石等吸附剂，将C-1027水溶液通过进行吸附，然后再洗脱，可除去杂质。洗脱液经过离子交换树脂Sephadex和Cellulose吸附，用Nacl水溶液、Tris-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液等洗脱。该洗脱液经限外过滤浓缩后，再经SephadexG-50，G-75等凝胶过滤精制，最好得到纯品，所含低分子盐类，可经过SephadexG-25层析，限外过滤、透析等手段除去。用上述各种层析法反复进行，将更有利于除去杂质。
采用上述各种精制法及其组合所得到的C-1027精制液冷冻干燥后，可得到C-1027白色粉末。
本发明所得的C-1027为单一物质，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一带、SephadexG-50柱层析显示对称单一峰、TSK-gelG-2000SW高效液相色谱为单一峰、LKB等电点电泳呈单一带，均可得到证实。
C-1027物质的理化性质如下性状白色粉末溶解性易溶于水，不溶于甲醇、丙酮、醋酸乙酯等有机溶媒。
紫外吸收光谱在水、0.01NHcl、0.01NNaOH中测定的结果分别如图3中的曲线1、2、3所示，从图中可观察到，在中性、酸性水溶液中270-275、350-360nm，在碱性溶液中270-275、340-345nm处有最大吸收值。
红外吸收光谱以KBr片测定结果，如图4所示，主要吸收在3300、1640、1530cm-1处。
熔点无明确熔点R分解点，在发泡中漫漫变褐、变黑，260℃完全炭化。
呈色反应茚三酮、双缩脲、Folin-Lowry反应阳性，蒽酮、苯胺一邻苯二甲酸反应阴性。
等电点PH3.5-3.7酸碱性酸性元素分析C45.22%、H6.65%、N14.03%分子量利用TSKgelG-2000SW高效凝胶过滤色谱法及SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法计算出分子量约为15，000。
氨基酸组成6NHCl，110℃水解20小时，测定所含氨基酸结果见表4。检出其所含氨基酸有天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、酪氨酸、亮氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、而半胱氨酸是以S-磺酸半胱氨酸形成，色氨酸是在NaOH水解后被检出的。
N-末端氨基酸根据DNP法检出N-末端氨基酸为丙氨酸。
表4C-1027氨基酸组氨基酸重量%氨基酸重量%氨基酸重量%天冬氨酸6.16苏氨酸6.27丝氨酸8.97谷氨酸4.74脯氨酸4.96甘氨酸6.41丙氨酸9.36胱氨酸1.90缬氨酸6.85蛋氨酸0异亮氨酸0.76亮氨酸3.76色氨酸0酪氨酸2.76苯丙氨酸4.78组氨酸1.19赖氨酸1.10精氨酸1.14本发明的生物活性表明C-1027物质对革兰氏阳性细菌生长有较强的抑制作用，其抗菌谱如表5所示。C-1027物质还具有明显的抗瘤活性，体外试验作用很强。用克隆生成测定法检查，对人肝癌BEL-7402细胞的半数杀伤浓度(IC50)为0.000013μm，其活性比阿霉素和丝裂霉素C强。(阿霉素和丝裂霉素C的IC50分别为0.00084μM和0.0059μM)。C-1027物质对小鼠L1210和P388白血病有明显抑制作用。DBA小鼠腹腔内接种白血病细胞，24小时后腹腔内注射C-1027一次，60天观察结果。该物质对小鼠腹水癌包括艾氏腹水癌、H22腹水肝癌均有明显的抑制作用。昆明种小鼠腹腔内接种癌细胞，24小时后腹腔内注射C-1027物质，60天观察结果。以上疗效均见表6。
C-1027物质对小鼠移植性实体瘤包括S180内瘤、U14宫颈癌和Harding-passey黑色素瘤均有明显的抑制作用。皮下接种肿瘤，24小时后静脉内一次注射C-1027物质，对Harding-passy黑色素瘤的抑制率见表7。
表5C-1027物质的抗菌活性试验菌最低抑菌浓度微克/毫升金黄色葡萄球菌209P0.78枯草杆菌66330.78八联球菌0.78变形杆菌0×19＞100大肠杆菌B3.13大肠杆菌011150肺炎克氏杆菌25痢疾杆菌302＞100绿脓肝菌11＞100分枝杆菌607(3.13)草分枝杆菌1.56白色念珠菌＞100青霉素5404＞100精原细胞0.0039注()表示抑制圈边缘不清晰。
表6C-1027物质抗瘤活性肿瘤名称剂量(mg/kg)给药次数生存期(天)生命延长率(%)白血病0.0251＞60＞275L12100.012 1 ＞60 ＞2750.0061＞60＞275对照16白血病0.0251＞60＞275P388， 0.012 1 ＞60 ＞2750.00612237.5对照16腹水肝癌0.025138.5156H220.012 1 48 2200.00612247对照15表7 C-1027物质抗瘤活性
此外，C-1027物质对KB细胞体外杀伤效果ED50(50%有效剂量)很好，半数有效剂量只有0.001-0.0001μg/ml。
C-1027物质制造方法实施例如下甘油2%，糊精2%，Soytone1%、酵母膏0.3%(NH4)2SO40.2%，CaCO30.2%、培养基PH6.6，500ml三角瓶中加100ml培养基灭菌，接种入C-1027菌，27℃，旋转震荡培养48小时(180转/分，振幅10cm)。然后再用甘油2%，糊精2.0%、鱼粉1%、(NH4)2SO40.2%、CaCO20.2%、PH6.8培养基500ml三角瓶中装100ml，灭菌。上述种子以5%量种入，27℃培养96小时。
培养完后，取PH8.0的培养液10l离心、过滤，得到7l滤液，用HCl调PH4，加3.5Kg(NH4)2SO4，5℃搅拌3小时，析出的C-1027沉淀离心分离(5℃、3000转、30分钟)得到。此沉淀溶于400ml去离子水、透析、冷冻干燥得粗粉5.3g。
上述粗粉2g溶于400ml去离子水，离心(5℃、3000转、30分钟)，除去不溶物。活化物经DEAE-Cellulose柱吸附，400ml去离子水洗后，0.1MNacl洗脱，活性部份112ml，透析，膜内液体冷冻干燥。
这样得到的粗制品245mg，溶于水，经SephadexG-50柱去离子水层析，活性部份80ml，冷冻干燥得120mg白色粉末，此物再溶于水，经SephadexG-75柱层析，收集活性部份冷冻干燥，得到62mgC-1027白色粉末精制品，其理化性质及生物学特性如前所述。
图1C-1027菌株的孢子丝(300×)图2C-1027菌株的孢子(15000×)图3C-1027的紫外光谱图4C-1027的红外光谱
权利要求
1.一种能从微生物培养物中提取大分子肽类抗肿瘤抗生素C-1027的制造方法，其特征在于它是从链霉菌属C-1027菌株中，用提取发酵产物的一般方法进行制备。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其特征是C-1027菌株的孢子丝直至波曲，孢子柱形，表面光滑，气生菌丝体为浅黄白至淡橄榄软皮色往往带有浅褐或浅肉桂色彩，基丝无色或乳脂色，全细胞水解产物含有LL-二氨基庚二酸。
3.根据权利要求2所述的制造方法，其特征是C-1027菌株，可在各种全合成、半合成或天然培养基中培养，这些培养基通常含有适于培养放线菌的碳源、氮源和适量的无机盐类，发酵培养一般在振荡或通气搅拌需氧条件下进行，培养温度27-30℃，PH值中性，培养时间2-5天。
4.根据权利要求1所述的制造方法，其特征是为从培养滤液中提取C-1027抗生物质，可用盐析、疏水性层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤层析等单独地或组合地进行处理，将沉淀物离心、分离、过滤、脱盐、精制、洗脱、浓缩，冷冻干燥，最终得到C-1027白色粉末纯品，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示单一带，Sephadex G-50柱层析显示单一峰，TSK-gel G.2000SW高压液相色谱为单一峰，LKB等电点电泳呈单一带，证明所得C-1027为一单体。
5.根据权利要求4所述的制造方法，其特征是用此方法提取制备的C-1027抗生素的分子量约为15000，氨基酸组成中的N-末端氨基酸为丙氨酸。
6.根据权利要求4所述的制造方法，其特征是用此方法制备的化合物，不仅对革兰氏阳性细菌生长有较强的抑制作用，还具有明显的抗肿瘤活性，用克隆生成测定法检查，对人肝癌BEL-7402细胞的半数杀伤浓度比阿霉素和丝裂霉素分别强64倍和454倍，对小鼠移植性实体瘤包括S180肉瘤、U14宫颈癌和Harding-passey黑色素瘤均有明显抑制作用，因此，本发明所得到的C-1027抗生素，作为抗肿瘤药物是有用的。
全文摘要
一种新的大分子肽类抗肿瘤物质C-1027，是用能产生该物质的菌株或其变株，在适宜的培养条件下进行培养(培养基的pH以中性为好，培养温度在20—37℃范围，培养时间一般2—5天)，其产物C-1027可采用一般分离提取发酵产物的方法进行，如盐析、疏水性层析、离子交换层析、吸附层析、凝胶过滤层析等，可单独或任意组合方式进行，然后离心、分离、过滤、反复精制、冷冻干燥、制得纯品，该物质具有明显的抗肿瘤活性，疗效优于临床使用的阿霉素和丝裂霉素C。
文档编号C12P21/02GK1037539SQ88102759
公开日1989年11月29日 申请日期1988年5月13日 优先权日1988年5月13日
发明者胡继兰, 甄永苏, 大古敏夫, 张瑞, 解美玉, 松本宏, 南庆典, 丸中照义, 齐藤等, 山田雄次 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所