专利名称：克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域。
丙酰螺旋霉素是一种新药，目前尚未用于临床，但是据药理实验初步结果看，体内外抗菌活性优于目前临床使用的乙酰螺旋霉素，目前尚无产品。当前获得丙酰螺旋霉素可以采用下列方法1.生物转化法中国医学科学院医药生物技术研究所刘若莹教授在中国专利申请号为87104407中介绍一种生物转化法，该法基本上将具有丙酰化酶活性的生米卡链霉菌变株在28℃条件下培养48小时后，于培养液中加入螺旋霉素，在菌株的丙酰化酶作用下，使螺旋霉素生物转化成为丙酰螺旋霉素。
采用上述生物转化发酵方法获得丙酰螺旋霉素时，可以减少因化学合成所造成的三废污染;可以将具有丙酰化酶活性的生米卡链霉菌制备成固相化细胞，从而提高生物转化率，有利于工业生产。但此法存在着缺点，它必须通过发酵获得螺旋霉素，才能进行生物转化，因此工艺复杂，成本较高。
2.半合成方法采用半合成方法使螺旋霉素4″-0丙酰化，从而获得丙酰螺旋霉素，该法需先通过发酵获得螺旋霉素后再用化学方法，在保护其它位点情况下进行半合成，因此，工艺仍很复杂，成本高，有三废污染，且目前尚无报导。
3.基因工程方法目前有人采用其它基因克隆路线(尚未发表)，将生米卡链霉菌的酰化酶基因克隆至螺旋霉素产生菌株中，但得到的产物成分较多，除螺旋霉素外，还有乙酰螺旋霉素和丙酰螺旋霉素以及其它酰化成份。由于多组份，为化学提取和使用均带来很大困难，从而直接影响经济效益，目前未有报导。
本发明目的在于采用基因工程方法，构建一种可直接产生丙酰螺旋酶素的基因工程菌，只需将其一次发酵即可获得丙酰螺旋霉素产品，从而简化生产步骤，可使丙酰螺旋霉素占产物总组成的20%以上并减少生产过程中的三废污染。
本发明目的是这样达到的将有丙酰化酶基因的重组质粒转化至螺旋霉素生产菌株，选择出所需转化子，再经原位杂交即可获得丙酰螺旋霉素基因工程菌，即克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌。
以下结合附图对本发明进行详细说明。
附
图1是克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建步骤方框图;
附图2是丙酰化酶基因克隆菌株(Streptomyces lividans TK 54 No.9菌株)孢子丝;
附图3是No.9重组质粒转化子的转化产物薄层层析图;
附图4是No.9重组质粒转化子的转化产物生物显迹图;
附图5是丙酰螺旋霉素高压液相色谱;
附图6是NO.9重组质粒转化子的转化产物高压液相色谱;
附图7为Southern分子杂交图;
附图8是NO.9重组质粒的限制性内切酶图谱;
附图9是原位杂交放射自显影图;
附图10是Southern分子杂交图;
附图11图No.61转化子发酵产物薄层层析图;
附图12为NO.61转化子发酵产物生物显迹图;
附图13是丙酰螺旋霉素高压液相色谱;
附图14是NO.61转化子发酵产物高压液相色谱;
附图15是丙酰螺旋霉素质谱分析图;
附图16是NO.61转化子发酵产物质谱分析图;
附图17是丙酰螺旋霉素基因工程菌孢子丝照片;
附图18为丙酰螺旋霉素基因工程菌孢子(1×12000);
附图19为丙酰螺旋霉素结构示意图。
附图1是本发明克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌(也称丙酰螺旋霉素基因工程菌)构建步骤方框图。
从附图1可见，第一步骤是鸟枪克隆，其原理是以研究任何生物体的基因为对象，将酶切后的不同大小、简单或复杂的基因经载体带入特定受体菌中，并进行分离、筛选、纯化和扩增。在鸟枪克隆法中，以质粒PIJ702为载体，它具有硫链丝菌素抗性基因和黑色素基因，因此，一旦插入外源基因后极易选择，且拷贝数高，易于制备，若选用其它质粒作载体则难以选择转化子。在鸟枪克隆法中将限制性内切酶BglⅡ酶切过的生米卡链霉菌(Streptomyces mycarofaciens)总DNA经T4-DNA连接酶进行连接;第二步骤是转化，重组后的质粒被引入受体菌中，引入的步骤称之为转化。本发明将上述连接过的DNA转化至变铅青链霉菌TK54(S·lividans TK 54)原生质体;第三步骤为挑选转化子及提取重组质粒，先选择抗硫链丝菌素的转化子，即以硫链丝菌素为选择标记，挑选耐药转化子，然后提取重组质粒，选出生米卡链霉菌No.9重组质粒;第四步骤为含丙酰化酶基因的生米卡链霉菌No.9重组质粒的转化，该No.9重组质粒转化至螺旋霉素产生菌株(Streptomyces spiramyceticus)，以硫链丝菌素为转化子选择标记;第五步骤为挑选克隆有NO.9重组质粒的转化子，先选择抗硫链丝菌素的菌落，然后进行原位杂交，采用“分子克隆”手册标准方法进行，以P32-标记的NO.9重组质粒为探针，对上述转化子进行原位杂交，从中选择，得到阳性杂交菌落。
以下对各步骤进行详细说明。
(一)鸟枪克隆1.含有丙酰化酶基因的生米卡链霉菌无活性变株(Streptomyces mycarofaciens)总DNA的分离基本上采用Sambrook方法(Sambrook，J.et alMolecular cloning.A laboratory Manual.Seccond Edition.Cold Spring.Horbour.P1.42，1989)，生米卡链霉菌生长于26～28℃，采用SGYS培养基培养48～50小时(淀粉2～4%;硫酸胺0.3%;蛋白胨0.3-0.5%;葡萄糖2%;酵母膏0.5%;磷酸氢二钾0.05%;硫酸镁0.02%;碳酸钙0.5%自然PH)，于4℃～10℃离心(3000转/分)去上清液得湿菌丝2克左右，加入3-5ml的Saline-EDTA缓冲液(0.15MNaCl，0.01MEDTA，PH8.0)其中含溶菌酶5mg/ml，于35-37℃水浴保温30-60分钟，立即置于-20℃冰箱，令其迅速冻结，加入15-20mlTris-SDS缓冲液(0.1M Tris，1%SDS，0.1M NaClPH9.0)置于60℃化冻，再置于-20℃冻结并再度于60℃化冻，加入20ml酚于室温下振荡抽提，于12000-14000转/分4-10℃离心15-20分钟，取上清液，加入2倍体积预冷过的无水乙醇，-20℃放置2小时以上，12000-15000转/分4-10℃离心10-15分钟，弃去乙醇，沉淀物溶于Saline-Citrate缓冲液中(0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)，加入250微升RNA酶(1微克/微升)，37℃保温1小时，加入等体积酚振荡去蛋白，12000-15000转/分，10分钟左右，取上清，加入2倍体积预冷过的无水乙醇，-20℃放置2小时以上，12000-15000转/分离心10分钟左右溶于2mlTE缓冲液(10mM Tris.HCl，1.0mM EDTA PH8.0)，加入0.5ml醋酸盐-EDTA，(3.0M醋酸钠，0.001M EDTA，PH7.0)，迅速振荡，加入1.5-2.0ml异丙醇，缓慢振荡，出现絮状沉淀，逐滴加入乙醇，置于-20℃2小时以上，12000-15000转/分离心10分钟左右，弃洒精，沉淀溶于2ml Saline-柠檬酸缓冲液中，自加入醋酸盐-EDTA步骤后重复2-3次，样品置于-20℃备用，得到含丙酰化酶基因生米卡链霉菌无活性变株总DNA。
本发明所采用的分离方法的特征在于，采用反复快速冷冻和解冻法，如其中，当将离心后的湿菌丝加入含溶菌酶的Saline-EDTA缓冲液后，35～37℃水浴保温后立即于-20℃冻结，加入Tris-SDS缓冲液后于60℃化冻，再度于-20℃冻结和60℃化冻。其目的在于简化方法，可用便宜试剂并便于配制。
2.质粒PIJ702的提取含有质粒PIJ702的变铅青链霉菌Tk54(Streptomyces lividans TK54)培养于YEME培养基中(酵母粉0.3%，蛋白胨0.5%，麦芽提取物0.3%，葡萄糖1-2%，蔗糖34%，MgCl0.1%，余量为无盐水，PH7.0-7.2)，26-28℃培养40-48小时，2000-2500转/分离心10分钟左右，去上清，用STE缓冲液洗涤(蔗糖10.3%，EDTA25mM，Tris.HCl25mM，PH8.0)离心(2000-2500转/分)弃上清液，加入10-15mlSTE缓冲液(内含5mg/ml溶菌酶，37℃，30-60分钟保温，加入20ml碱性SDS溶液(0.2N NaOH，1%SDS)于冰浴中放置5-10分钟，加入15ml 3M醋酸钠，于冰浴放置30-60分钟，12000-15000转/分离心15-30分钟，取上清，加入2.5倍体积预冷无水乙醇，-20℃放置2小时以上，12000-15000转/分离心15-30分，除上清加入10mlTE缓冲液，1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积预冷无水乙醇，-20℃放置2小时以上，12000-15000转/分离心，15-30分，真空干燥，溶于1毫升TE缓冲液，-20℃保存备用，得到质粒PIJ702。本发明采用PIJ702为载体，因为它具有硫链丝菌素抗性基因和黑色素基因，因此一旦插入外源基因后极易选择，且本质粒拷贝数高，易于制备，本提取方法快速而简便。
3.酶切采用限制性内切酶BglⅡ分别酶切上述PIJ702质粒DNA和生米卡链霉菌总DNA，酶切缓冲液为10×Y10缓冲液(Tris 10mM，MgCl26mM，巯基乙醇7mM，NaCl10mM)，37℃保温反应1小时以上。
4.连接将以上BglⅡ酶切过的生米卡链霉菌总DNA和BglⅡ酶切过的PIJ702质粒DNA(二者浓度比3～5∶1最好为5∶1)在T4-DNA连接酶作用下，于10-14℃放置3小时以上，连接缓冲液组成为Tris 60mM，MgCl26mM，巯基乙醇10mM，PH7.5，得到重组DNA分子。本方法特点在于由BglⅡ切过的生米卡链霉菌总DNA的浓度和由BglⅡ酶切过的PIJ702质粒DNA浓度比为3～5∶1，最好为5∶1，在14℃下过夜进行连接反应。
(二)转化本发明采用PEG处理除去受体菌细胞壁，在原生质体形成的情况下，直接和DNA接触，进行转化，再在特定再生培养基中生长，使细胞壁重新形成，成为转化子。
1.原生质体的制备将变铅青链霉菌TK 54(Streptomyces lividans TK54)种于25mlYEME培养基中(并中加入适量玻璃珠)，26-28℃培养24-30小时，再以10-15%接种于新鲜YEME培养基中(加入0.5%甘氨酸，适量玻璃珠)26-28℃培养36-40小时，2000-3000转/分离心，10-15分钟，去上清，用10.3%蔗糖溶液洗涤并离心两次，加入4-5mlP缓冲液(Tris 0.31%，MgCl2·6H2O2.04%，葡萄糖0.1%，CaCl2·2H2O，0.386%，蔗糖10%)其中含有溶菌酶1-2mg/ml，于26-28℃放置30分钟以上，于相差显微镜下观察原生质体形成率大于90%，于1500-2000转/分离心5分钟左右，去上清，用1-2mlP缓冲液洗涤一次，1500-2000转/分离心5分钟左右，将所得原生质体悬浮于100微升P缓冲液中。
本方法特点原生质体形成率高。
2.转化操作本发明在转化操作中采用Hopwood(Hopwood，D.A.et al.Genetic Manipulation in streptomyces.The John Innes Foundation，Norwich，p110.1985.)方法。取50微升变铅青链霉菌TK54的原生质体与1微克以下，最好为0.5微克的上述已连接的DNA样品混匀，加入25%PEG1000(P缓冲液中)1ml，缓慢振荡3-5分钟，立即加入5ml P缓冲液，于1500-2000转/分离心5分钟左右，用P缓冲液洗涤并离心一次，将原生质体悬浮于1mlP缓冲液中，取50-100微升涂布R2琼脂平板(蔗糖10.3%，酵母粉0.4%，CaCl2·2H2O0.7%，酪蛋白水解物0.01%，Tris0.3%，K2SO40.025%，蛋白胨0.3-0.5%，MgCl2·6H2O1%，葡萄糖1%，KH2PO40.003%，琼脂1.5，微量元素溶液0.2%，(ZnCl20.004%，Na2B4O7·10H2O0.001%，MnCl2·4H2O0.001% CuCl2·2H2O0.001%，FeCl3·6H2O0.02%)28-30℃培养18-20小时后，于每一琼脂平板上加入一定体积软琼脂上层(与R2相同，但琼脂为0.6%)内含硫链丝菌素终浓度为25μg/ml，28-30℃培养7-14天得到抗硫链丝菌素的转化子。
本方法特点转化率高。
(三)挑选转化子1.选择抗硫链丝菌素的转化子于28-30℃培养7-14天后，陆续从R2琼脂平板挑选含重组质粒的菌落，如前所述本发明是从PIJ702BglⅡ酶切位点插入生米卡链霉菌BglⅡ酶切片段的，因为BglⅡ位于PIJ702黑色素编码区，因此凡是含有重组质粒的转化子则呈白色，而只含有PIJ702质粒的转化子呈黑色，根据上述颜色区别可以很快挑选出含重组质粒的转化子。本方法特点由于所用载体PIJ702带有特殊的编码黑色素基因，因此易于从颜色变化选择转化子，方法简便。
2.重组质粒的提取在重组粒提取中，本发明采用Katz的快速碱变性方法(Katz.E et al1983，J.Gen.Microbiol.1292703)，其中，每次选取10-50株不等转化子，种于2ml YEME培养基中(加入少量玻璃珠)，26-28℃培养24-30小时，10%-15%转种于新鲜YEME培养基2ml(加入少量玻璃珠)中，26-28℃培养40-48小时，2000-2500转/分，离心5-10分钟，去上清，用STE缓冲液洗涤，离心，去上清液，加入0.2-0.5mlSTE缓冲液(内含5-3mg/ml溶菌酶)37℃，30-60分，加入0.3-0.5ml碱性SDS溶液，冰浴5-10分，加入0.2-0.4ml 3M醋酸钠冰浴30分-1小时，12000-15000转/分离心15-30分钟，取上清，加入2.5倍体积预冷过的无水乙醇，-20℃放置2小时以上，12000-15000转/分离心15-30分，去上清液，加入200μl TE缓冲液，1/10体积3M醋酸钠和2.5倍体积预冷无水乙醇，-20℃2小时以上，于12000-15000转/分离心15-30分钟，去上清，真空干燥，溶于50μl TE缓冲液中，取适量进行琼脂糖凝胶水平平板电泳(1%琼脂糖)，电压为3.5V/cm，缓冲液为Loening缓冲液(Tris.HCl0.036M，Na2HPO40.036M，EDTA0.001M，PH7.8)。
将琼脂糖凝胶电泳后确定为重组质粒的样品，再进行限制性内功酶BglⅡ的酶切，酶切后的DNA片段与在同一琼脂糖凝胶电泳平板上泳动的入噬菌体DNA限制性内切酶HindⅢ酶切片段泳动距离进行比较(λ-HindⅢ为分子量标准)，可确定各片段分子量大小。本发明挑选了分子量为10.0Kb，插入片段为4.16Kb的No.9重组质粒。含No.9重组DNA的No.9转化子的形态见附图2。附图2是变铅青链霉菌TK 54 No.9菌株(丙酰化酶克隆菌株)孢子丝照片，所用斜面培养基(%)麦芽糖1、酵母粉0.4、葡萄糖0.4、琼脂1.5、自然PH，温度28～30℃，培养6-7天;其生长形态为有较多气生菌丝、孢子较多、顶部有卷曲、气生菌丝呈灰白色、产生紫红色色素、菌落表面平滑、基内菌丝呈紫红色。
为了确认含NO.9重组质粒的NO.9转化子是否已经克隆有来自生米卡链霉菌的丙酰化酶基因，通过NO.9转化子的生物转化来观察克隆菌株是否具有将螺旋霉素转化为丙酰螺旋霉素的能力。
将NO.9转化子培养于YEME培养基中，28-30℃培养40-48小时后，加入500mg-200g/升螺旋霉素，再于28-30℃培养40-48小时，上述培养液经2000-3000转/分离心10-20分钟，弃菌丝，上清液在PH8.0左右用乙酸丁酯进行抽提，然后转至PH2.0-3.0的磷酸缓冲液中，重复一次，最后用二氯甲烷抽提，减压干燥，将上述样品用硅胶柱层析进行进一步纯化，以氯仿-甲醇(75∶25)洗脱，收集高活性部分，浓缩、干燥，得出NO.9转化子生物转化产物。
下述步骤是对NO.9转化子的生物转化产物的确定步骤(1)薄层层析采用0.1N NaOH配制的硅胶GF254板进行层析，以乙酸乙酯∶甲醇＝9∶1展层，以碘显迹(附图3)。附图4是含NO.9重组质粒转化子转化产物的薄层层析图，图中横坐标1代表乙酰螺旋霉素样品;2代表丙酰螺旋霉素样品;3代表NO.9转化子转化产物样品;4代表变铅青链霉菌TK54生物转化产物样品;5代表螺旋霉素样品。
由图可见NO.9转化子转化产物(样品3)和标准丙酰螺旋霉素(样品2)Rf值相同。因此说明转化产物是丙酰螺旋霉素。样品1为乙酰螺旋霉素，其Rf值与NO.9转化产物不同，样品5为螺旋霉素，是在生物转化过程中加入的样品和变铅青链霉菌生物转化产物(4)同，说明该菌本身不具有转化螺旋霉素为丙酰螺旋霉素的能力，NO.9转化子之所以具有转化螺旋霉素成为丙酰螺旋霉素能力，是由于含有NO.9重组质粒的缘故。
同时可以进行生物显迹(附图4)。生物检定菌为八叠球菌(Sarcinalutea)。八叠球菌保存斜面培养基组分为麦芽糖1%、酵母粉0.4%、葡萄糖0.4%、琼脂1.5%、自然PH。其检定培养基为蛋白胨1-2%、酵母粉0.2-0.4%、牛肉膏0.1-0.3%、葡萄糖0.1-0.3%、琼脂1.2-1.5%，PH8.0。附图5是含NO.9重组质粒转化子转化产物生物显迹图。横坐标上1代表变铅青链霉菌TK54生物转化产物样品，2代表NO.9转化子生物转化产物样品;3代表螺旋霉素样品;4代表标准丙酰螺旋霉素样品。从图可见NO.9转化子生物转化产物样品1和标准丙酰螺旋霉素样品4有相同的Rf值，而且均有抗八叠球菌的生物活性;变铅青链霉菌TK54生物转化产物1与螺旋素样品相同，说明该菌本身无转化螺旋霉素为丙酰螺旋霉素的能力。
(2)高压液相色谱分析采用国产C-18柱，流动相为乙腈0.2M醋酸胺∶水＝53∶10∶37，柱温为30℃，在232nm紫外光下检测(见附图5和图6)。
附图5是丙酰螺旋霉素高压液相色谱，附图6是含NO.9重组质粒转化子转化产物高压液相色谱，从此二图可知，含NO.9重组质粒的NO.9转化子生物转化产物高压液相色谱的保留时间与丙酰螺旋霉素基本相同，因此确证转化子生物转化产物为丙酰螺旋霉素。
鉴于上述结果已确证NO.9转化子可以转化螺旋霉素成为丙酰螺旋霉素，说明丙酰化酶基因位于NO.9重组质粒的4.16Kb DNA片段部分。
为了确证4.16Kb DNA片段确实来源于生米卡链霉菌变株DNA，进行了Southern分子杂交。Southern分子杂交方法见Sambrook.J的文章(Sambrook.J，1989，Molecular cloning.A.laboratory.Manual.Second Edition.Cold Spring Harbour，P.1.42.)本方法原理DNA分子为双螺旋结构，彼此以G-C，A-T互补方式形成双链结构，基于具有同源性的DNA单链可以重新配对互补的原理，因此建立了本方法。其中，用NO.9重组质粒作为探针和BglⅡ酶切过的生米卡链霉菌总DNA进行杂交。
采用同前述方法提取了生米卡链霉菌变株总DNA和NO.9重组质粒DNA，依前述同条件用限制性内切酶BglⅡ分别酶切生米卡链霉菌总DNA和NO.9重组质粒，并按同前方法进行琼脂糖凝胶水平平板电泳。电泳毕，以溴化乙锭染色(0.5μg/ml)在紫外灯下摄影随后操作按下列步骤进行a.DNA的变性和固定将上述电泳毕凝胶浸于200-300ml0.25N HCl中缓慢振荡10-20分，弃去盐酸，重复用0.25N HCl再振荡10-20分，以无盐水洗涤除去盐酸，再用0.5M NaOH/1M NaCl 200-300ml洗涤两次，每次10-20分，弃去上述溶液后，用无盐水冲洗，再加入200-300ml 0.5M Tris.HCl/1M NaCl洗涤，弃去用无盐水冲洗再换成0.5M Tris，HCl/3M NaCl200-300ml振荡洗涤，在凝胶上放置与其大小相同的硝酸纤维素滤膜(预先用20×SSC浸泡过，20×SSC组分为3M NaCl、0.3M柠檬酸钠)进行DNA膜转移，过夜放置，次日取下滤膜，于紫外灯下检查DNA转移是否完全，室温下晾干膜后置于真空干燥烤箱内，80℃烤2-3小时。
b.探针的制备采用NO.9重组质粒作为探针，用同位素P32进行缺刻翻译标记，反应在14℃反应3.5小时，反应毕加下终止液(10mM Na EDTA，1%SDS)，用葡聚糖凝胶(Sephadex.G-50)柱将标记的NO.9质粒和残存未标记的同位素分开，经液体闪烁计数器记录CPm值后，探针(P32标记的NO.9质粒)在沸水中煮10-5分即刻置于冰浴中。
c.杂交将已烤干的硝酸纤维素滤膜浸泡于5×SSC溶液中至湿，再用6×SSC浸泡2-5分钟，将膜置于杂交袋中，进行预杂交，预杂交液中含有6×SSC，0.5%SDS，5×Denhardts溶液(0.01%Ficoll，0.01%牛血清清蛋白，0.01%PVP)，100μg/ml鲑鱼精DNA(在沸水中煮过5-10分钟，置于冰浴中)，封袋后于68℃水浴放置4小时以上，然后将袋剪开一口，取出预杂交液，加入杂交液，其中含有6×SSC0.01M EDTA 5×Denhardts 0.5%SDS100μg/ml已变性处理过的鲑鱼精DNA，另外加入已用P32标记的探针，NO.9质粒DNA，封袋后，于68℃杂交20小时以上，杂交毕，将膜从袋中取出于65℃3×SSC中洗涤10-30分，再于2×SSC中洗涤20-30分，最后于1×SSC中洗涤30分，室温下晾干膜，用塑料薄膜将膜包好后置于X光片暗盒中，上置X光片，进行放射自显影，于-80℃放置适当时间，取出冲洗后即可获杂交结果(附图7)。
在附图7中，左图是Southern分子杂交前琼脂糖凝胶电泳，右图是Southern分子杂交后放射自显影图，在图中1代表BglⅡ酶切的NO.9重组质粒;2代表BglⅡ酶切生米卡链霉菌变株DNA;3代表NO.9重组质粒。从右图看，样品1(BglⅡ酶切NO.9重组质粒)和BglⅡ酶切的生米卡链霉菌变株DNA的样品2在同一位置有相同杂交带，说明NO.9重组质粒中4.16Kb片段(图中小片段)与生米卡链霉菌总DNA有同源性，它确系来源于生米卡链霉菌总DNA，而不是污染的结果。尽管从左图看样品2呈连续降解的核苷酸状态，无明显带状，但是在杂交后从右图可见样品1和BglⅡ酶切的生米卡链霉菌变株DNA(样品2)在同一位置，有相同杂交带出现。
限制性内切酶图谱是表明不同限制性内切酶在某种质粒DNA上相互位置的图谱，是质粒DNA重要特征。按前述方法对NO.9重组质粒DNA进行酶切和双酶切。(BamHⅠ，KpnⅠ，PVuⅡ，KPnⅠ-PVuⅡ，PVuⅡ-BamHⅠ，KPnⅠ-BamHⅠ)从而绘制出NO.9重组质粒的特征限制性内切酶图谱(见附图8)。
附图8表明，生米卡链霉菌来源4.16Kb DNA片段(图中粗黑实线部分)是由BglⅡ酶切位点插入质粒PIJ702的(黑细线部分)。在4.16kb DNA片段部分有一个KPnⅠ两个BamHⅠ和一个SalⅠ酶切位点。本图表明了这三种酶在该片段中的相关位置。该质粒分子量为10.0kb。
(四)含丙酰化酶基因的NO.9重组质粒的转化目的通过NO.9重组质粒转化进入螺旋霉素生产菌株Streptomyces spiramyceticus.使丙酰化酶基因在其中克隆表达，以形成能直接产生丙酰螺旋霉素的基因工程菌。
1.S.spiramyceticus原生质体的制备将该菌种于一种可溶性培养基中(牛肉膏0.3-0.4%，蛋白胨0.5-0.8%，酵母粉0.3-0.5%，PH7.1)培养并中加入适量玻璃珠，28-30℃一级培养40-48小时后，以10-15%接种于新鲜同种培养基中，(加入适量玻璃珠，0.5%甘氨酸)28-30℃二级培养24-30小时，基本按前述方法制备原生质体，但溶菌酶加量为5-15mg/ml，成球达90%以上需1.5-3小时。在现有技术中，一级时间培养时间短，而二级培养时间长，在本发明中，将一级培养时间改为40～48小时，而二级培养时间改变24～30小时。这是由于在这个时间中，菌丝生长状况最佳。因此形成原生质体效率高，可达90%以上。如按现有技术，将两个时间间隔调换过来，则菌丝生长的生理状况衰老，所形成的原生质体效率极低(大约为20～30%)，无法进行转化。此外，本发明所加溶菌酶量显著高于制备其它链霉菌所用量，本发明加入溶菌酶为5～15毫克/毫升，最佳条件为10毫克/毫升，如低于5毫克/毫升，则原生质体几乎不形成;形成原生质体的时间为1.5～3小时，若少于1.5小时，则原生质体形成率仅20%，若高于3小时，则原生质体有破裂，也无法进行转化。
2.转化操作与前述Hopwood转化方法基本相同。
(五)挑选克隆有NO.9重组质粒的转化子1.选择抗硫链丝菌素的菌落凡是在R2再生琼脂平板(含硫链丝菌素终浓度为25μg/ml)均全部挑选。
2.原位杂交原理与Southern分子杂交大体相同，探针可以与转化子菌落直接杂交以确定其DNA同源性。本方法适用于快速、准确、大量筛选阳性克隆菌株，尤其当克隆片段不能表现一种能方便检测的表型时，这种方法则更为适宜。
随机挑选上述转化子菌落，点种于已铺在SASM琼脂平板上的硝酸纤维素薄膜(已消过毒)上(SASM成份淀粉2-5%，黄豆饼粉1-3%，NaCl 0.3-0.5%，CaCO30.4-0.6%，琼脂1.5% PH7.5)。28℃-30℃，培养40-48小时，取出膜，置于3张3MM厚滤纸上(纸已用10-15mg/ml溶菌酶P缓冲液浸泡过)，静置30-60分钟，以形成原生质体，再将滤纸(菌落朝上)移至用1%SDS，1M NaOH浸泡过的3张3MM厚滤纸上，放置20-30分钟，再放置于干厚滤纸上，以除去多余液体，然后置于用中和溶液(70%PH7.5 1MTris-HCl和30%5M NaCl)浸泡过的三张厚滤纸，5-10分钟，重复三次，再置于用90%乙醇处理过的厚滤纸上5-10分，室温下晾干，将膜置于80℃真空干燥烤箱烘烤1.5-3小时。随后的操作步骤和试剂全部同前述Southern分子杂交。以P32标记的No9重组质粒为探针，原位杂交结果见图9，从中挑选了阳性杂交结果包括NO.61在内的克隆菌株进行工作。
采用了原位杂交方法来筛选转化子，也是本构建方法的特征，本发明用原位杂交方法从200株转化子中挑选出阳性转化子130余株，仅用了4天时间，效率高，工作准确性强。而若用常规快速质粒抽提法，则需10天以上，且误差较大。
附图9是原位杂交放射自显影图。图中1为NO.9质粒DNA作为杂交阳性对照。
2为S.spiramyceticus受体菌，图中未出现黑色杂交点，说明该菌与NO.9重组质粒无DNA同源性，是负对照。
3是NO.61转化子，具有与阳性对照相同强度的阳性杂交点，因此说明它和NO.9重组质粒有DNA同源性，是阳性杂交菌落。
为了进一步选择NO.61克隆菌株，还可进行Southern分子杂交。以NO.9重组质粒为探针，与BglⅡ酶切过的螺旋霉素链霉菌受体菌总DNA和NO.61转化子总DNA杂交。
按前述方法制备了NO.61转化子菌株和受体菌S.spiramyceticus总DNA。将NO.9重组质粒和分别用BglⅡ酶切过的上述两种总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，条件与前相同，以NO.9重组质粒作为探针，其它操作装步骤同于前述部分。结果见附图10。
附图10是Southern分子杂交图，其中，a为杂交前琼脂糖凝胶电泳;b是杂交后放射自显影。附图中1代表BglⅡ酶切NO.61转化子DNA;2代表BglⅡ酶切S.spiriamyceticus DNA;3代表NO.9重组质粒。
由b.可见NO.9重组质粒(3)与S.spiramyceticus受体菌(2)未出现杂交带，而与NO.61克隆菌株(1)有明显杂交带，说明NO.9重组质粒与克隆受体菌S.spiramyceticus没有DNA同源性，而与NO.61克隆菌株有DNA同源性。表明NO.9重组质粒确已转化至S.spiramyceticus受体菌中而获得NO.61克隆菌株。
本步骤确证了NO.9重组质粒和NO.61克隆菌株总DNA有同源杂交带，而与受体菌S.spiramycetions DNA无同源性，说明NO.9重组质粒确已克隆至NO.61菌株。
七.S.streptomyceticus NO.61克隆菌株的发酵目的为了确证NO.61克隆菌株的发酵产物。
将NO.61克隆菌株种于下列培养基淀粉3-5%，黄豆并粉2-4%，NaCl0.3-0.5%，蛋白胨0.5-2%，CaCO30.5%，于28-30℃振荡培养40-48小时，以10-15%接种于发酵培养基淀粉4-7%，玉米浆0.5-2.5%，葡萄糖1.5-3.0%，NH4NO30.4-0.7%，Mg2SO40.5-2.5%，KH2PO40.03-0.06%，NaCl0.5-1.5%，CaCO30.3-0.6%，余为自来水，PH6.5-7.0。28℃-30℃振荡培养，96-120小时，于3000转/分离心发酵液，取上清弃去菌丝，提取步骤同前。得到丙酰螺旋霉素。
丙酰螺旋霉素的确证为了证实包括NO.61在内的克隆菌株发酵产物为丙酰螺旋霉素，因此选择No61克隆菌株进行若干检测1.薄层层析方法同前，碘显迹和生物显迹均表明发酵产物中具有与丙酰螺旋霉素Rf值相同的组分(图11、图12)。
附图11是NO.61转化子发酵产物薄层层析图。其中1代表丙酰螺旋霉素;2代表NO.61转化子发酵产物;3代表螺旋霉素。附图11表明NO.61转化子产物(2)具有Rf值与丙酰螺旋霉素(1)相同的成份。从而证明NO.61克隆菌株的发酵产物中有丙酰螺旋霉素。此外NO.61转化子也产生与螺旋霉素(3)Rf值相同产物，说明它也产生螺旋霉素。
附图12是NO.61转化子发酵产物生物显迹图，其中1代表丙酰螺旋霉素;2代表NO.61转化子发酵产物。附图12表明，NO.61转化子发酵产物(2)具有与丙酰螺旋霉素(1)相同的Rf值，且均有抗八叠球菌的生物活性，因此证明NO.61转化子发酵产物中有丙酰螺旋霉素。
2.高压液相色谱分析采用μ Bondapack TM C18柱，流动相为甲醇水(用磷酸调至PH2.8-2.9)＝67∶33，室温操作，于232nm进行紫外检测(图13、14)。
附图13是丙酰螺旋霉素高压液相色谱图。附图14是NO.61转化子发酵产物高压液相色谱图。可见NO.61克隆菌株产物中具有与标准丙酰螺旋素保留时间相似的组分(见箭头所示)，说明NO.61克隆菌株能产生丙酰螺旋霉素。
3.质谱分析采用FAB法，结果见附图15和图16。附图15是丙酰螺旋霉素质谱分析图;附图16是NO.61转化子发酵产物质谱分析图。
从结果可见标准丙酰螺旋霉素Ⅱ在942处有一分子离子峰，NO.61克隆菌株在943处有一分子离子峰，数值相同，说明该克隆菌株产物中有丙酰螺旋霉素Ⅱ组分。
综上所述，我们通过前述七步主要技术关键步骤获得了可以直接产生丙酰螺旋素的基因工程菌株。该菌株形态见附图17和18。附图17为克隆有丙酰化基因的螺旋霉素链霉菌NO.61菌株(丙酰螺旋霉素基因工程菌)孢子丝照片。所用SASM培养基为淀粉4.0%、黄豆饼粉2.0%、NaCl0.4%、CaCO30.5%、琼脂1.5%，PH7.5，15磅、20分灭菌，于28℃培养8-10天。
生长形态气生菌丝孢子较少，气生菌丝为灰白色，菌落表面呈皱褶，不产生色素，基内菌丝为椰壳色。
附图18是克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌NO.61菌株(丙酰螺旋霉素基因工程菌)孢子(1×12000)照片，该照片说明该孢子具有棘状突起。附图19是丙酰螺旋霉素结构示意图。
本发明构建方法提供可用于工业生产的丙酰螺旋霉素基因工程菌，效价500μg/ml以上，丙酰螺旋霉素在总产物中含量为20%以上，菌种遗传性状稳定，在一般条件下除螺旋霉素外，只产生丙酰螺旋霉素。
权利要求
1.克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建方法，其特征在于a、鸟枪克隆以质粒PIJ702为载体将经限制性内切酶Bg1Ⅱ分别酶切过的米生卡链霉菌(Streptomyces mykarofaciens)总DNA和PIJ702质粒DNA，以3～5∶1浓度比，在T4-DNA连接酶作用下，于10～14℃放置3小时以上进行连接反应，得到重组DNA分子。b、转化采用a步骤中连接后的重组DNA，以变铅青链霉菌TK54的原生质体为受体，按Hopwood等人的方法将连接后的DNA转化进入所说的受体菌中；c、挑选转化子及提取重组质粒以含硫链丝菌素终浓度为25微克/毫升的R2琼脂平板挑选含重组质粒的转化子，在所说的含硫链丝菌素R2平板上所选的白色菌落即为含重组质粒的转化子，然后采用快速碱变性方法提取含重组质粒转化子，将琼脂糖凝胶电泳后确定为重组质粒的样品再进行限制性内切酶Bg1Ⅱ的酶切，酶切后的DNA片段与在同一琼脂糖凝胶电泳平板上泳动的入噬菌体DNA限制性内切酶HindⅢ酶切片段泳动距离进行比较，从而确定各片段分子量大小，挑选出其中质粒分子量为10.0kb，插入片段为4.16kb的NO.9重组质粒；从而得到NO.9重组质粒DNA；d、NO.9重组质粒的转化以螺旋霉素链霉菌为受体菌，按照Hopwood等人的方法，将该NO.9重组质粒转化进入受体菌内，使丙酰化酶基因在其中克隆和表达；e、挑选克隆有NO.9重组质粒的转化子。在含硫链丝菌素终浓度为25微克/毫升的R2再生琼脂平板上进行挑选转化子，采用Hopwood等人的方法进行原位杂交，以NO.9重组质粒为探针，与固定于硝酸纤维素薄膜上经过变性处理的转化子DNA进行原位杂交，从中挑选出阳性杂交结果的克隆菌株，因此，获得克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌。
2.按照权利要求1所说的构建方法，其特征在于对在e步骤中挑选出阳性杂交结果的克隆菌株后再进行Southern分子杂交，其中，以NO.9重组质粒为探针，将BglⅡ酶切过的螺旋霉素链霉菌受体菌总DNA和NO.61克隆转化子总DNA杂交，获得NO.61克隆菌株。
3.按照权利要求1所说的构建方法，其特征在于在a步骤的鸟枪克隆方法中，BglⅡ酶切过的生米卡链霉菌DNA与BglⅡ酶切过的PIJ702连接时，其浓度比为5∶1。
4.按照权利要求1所说的构建方法，其特征在于在a步骤的鸟枪克隆操作中，在生米卡链霉菌无活性变株总DNA的分离方法中采用反复快速冷冻和解冻法，其中，当将离心后的湿菌丝加入含溶霉菌的Saline-EDTA缓冲液后，35～37℃保温后立即于-20℃冻结，加入Tris-SDS缓冲液后于60℃化冻，再置于-20℃冻结并再度于60℃化冻，随后进行振荡抽提。
5.按照权利要求1所说的构建方法，其特征在于在b步骤转化操作中，50微升变铅青链霉菌TK54原生质体与已连接的DNA混合进行转化时，该已连接的DNA浓度在1微克以下。
6.按照权利要求4所说的构建方法，其特征在于在b步骤转化操作中，50微升变铅青链霉菌TK54原生质体与已连接的DNA混合进行转化时，该已连接的DNA浓度为0.5微克。
7.按照权利要求1所说的构建方法，其特征在于在d步骤NO.9重组质粒转化过程中，在加入适量玻璃珠的可溶性培养基中，在28～30℃下，一级培养40～48小时，再以10～15%接种于新鲜相同的可溶性培养基中在28～30℃下二级培养24～30小时，用以制备螺旋霉素链霉菌原生质体。
8.按照权利要求1所说的构建方法，其特征在于在d步骤NO.9重组质粒转化过程中，所用溶菌酶量为5～15毫克/毫升，在26～28℃下放置1.5～3小时，形成螺旋霉素链霉菌原生质体成球率达90%。
9.克隆有丙酰化酶基因的包括NO.61在内的螺旋霉素链霉菌用于制造丙酰螺旋霉素。
全文摘要
本发明涉及微生物领域，特别是克隆有丙酰化酶基因的螺旋霉素链霉菌的构建方法。本发明采用基因工程方法，其中包括采用质粒PIJ702为载体对生米卡链霉菌总DNA进行鸟枪克隆，转化至变铅青链霉菌TK54，挑选转化子和提取重组质粒，得到№9转化子，将自№9转化子提取得到的№9重组质粒转化至螺旋霉素链霉菌，挑选克隆有№9重组质粒的转化子，得到克隆有丙酰化酶基因的包括№61在内的螺旋霉素链霉菌，将该螺旋霉素链霉菌进行发酵即可工业生产丙酰螺旋霉素，丙酰螺旋霉素在总产物中含量在20％以上，菌种遗传性稳定。
文档编号C12N1/21GK1052507SQ9110002
公开日1991年6月26日 申请日期1991年1月9日 优先权日1991年1月9日
发明者李元, 李焕娄, 石莲英, 刘伯英, 李晓平 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所