专利名称：高效超声波基因导入方法
技术领域：
本发明涉及基因工程中的基因导入方法，属动植物遗传工程。
植物基因工程的关键技术之一，是如何高效地将外源基因导入植物细胞，并再生出转基因植株，用于作物品种改良，以培育高产、优质、抗病的新品种。目前，植物细胞的基因转移有生物方法，化学方法和物理方法。比较常用的物理方法是电激基因转移法。操作过程是将盛有细胞和DNA(脱氧核糖核酸)液的特制小容器置于电脉冲仪的正负电极之间，然后施加电脉冲。在高压电脉冲的作用下，细胞膜因发生临时性破裂而形成微小的孔洞，在其自动修复以前，溶液中的DNA分子会籍助浓度差通过孔洞扩散到细胞中，并最终进入细胞核内部，整合到受体细胞的染色体中。这种方法的优点是操作简便，基因转移效率较高以及无宿主范围限制等，因此，电激法是动植物基因工程中较常用的基因转移方法。缺点是在进行植物基因转移时受体一般是原生质体，而原生质体培养再生出植株比较困难，特别对于有经济意义的禾谷类作物更是如此，因此电激基因转移法在植物基因转移中受到了限制。
本发明的目的是提出一种新的物理方法转移基因，即应用超声波诱导基因转移，此方法同时适用于动植物以及微生物的基因转移。
本发明的内容是将生物材料(植物组织块、植物悬浮细胞、动物细胞、微生物细胞等)与DNA溶液混合放入超声小室中;再将超声波引入超声小室，作用于DNA溶液中的生物材料上。超声波为连续或脉冲型，生物材料感受到的超声波声强为小于10W/cm2，频率为小于5MHZ，作用时间为大于0.01秒。
超声波诱导基因转移的原理是，超声波在液体中传播时，能够产生空化作用。所谓空化作用，就是液体中存在的一些微小气泡，在超声波的作用下发生共振并伴随产生一系列物理现象。如空化作用发生时，在空化中心会产生局部的高温高压，使得细胞壁产生局部的穿孔，也使得细胞膜产生局部的和暂时的结构改变，即也造成一系列的穿孔效应，溶液中的DNA分子可以籍此扩散进入细胞。在高等植物的许多组织中，细胞间的通道里存在一些微小气泡，这些气泡在超声作用下将成为空化中心，从而对周围的细胞发生作用。由于这种气泡是普遍存在的，这就使得大量细胞都能感受到超声波的空化作用。
超声波诱导基因转移方法不受宿主范围限制，而且可将外源基因直接导入带壁的植物细胞，特别是植物体的组织块中，由它们再生植株比从原生质体培养要容易得多。超声波基因转移方法同样适用于动物的基因转移和微生物的基因转移，同时超声波法导入基因还具有装置简单，操作方便等优点，在动植物基因工程中有广泛的应用前景。
本发明的五个实施例为1.用声强为0.5W/cm2及1.0W/cm2，频率为800KHZ的脉冲超声波，作用时间为30分钟，实现将外源基因导入小麦幼穗诱导愈伤组织，获短暂表达。
2.用声强为0.5W/cm2，频率为800KHZ的脉冲超声波，作用时间30分钟，实现将外源基因导入烟草叶块，获稳定表达。
3.用声强为2.0W/cm2，频率为800KHZ的连续超声波，作用时间为30秒，将外源荧光物质钙黄素导入衣藻细胞中。
4.用声强为0.5W/cm2，频率为800KHZ的脉冲超声波，作用时间为15秒，将外源荧光物质钙黄素导入红细胞中。
5.用声强为2.0W/cm2，频率为800KHZ的脉冲超声波，作用时间为10分钟，将外源荧光物质钙黄素导入酵母细胞中。
权利要求
1.一种高效超声波基因导入方法，其特征在于基因导入的步骤为(1)将生物材料(植物组织块、植物悬浮细胞、动物细胞或微生物细胞等与DNA溶液混合；(2)引入超声波，作用于DNA溶液中的生物材料上。
2.如权利要求1所述的基因导入方法，其特征在于引入的超声波为连续或脉冲超声波，作用在生物材料上的超声波声强小于10W/cm2，频率小于5MHZ，作用时间大于0.01秒。
3.如权利要求1所述的基因导入方法，其特征在于所述的生物材料为小麦幼穗诱导愈伤组织，引入的超声波为脉冲超声波，作用在衣藻细胞上的超声波声强为1.0W/cm2，频率为800KHZ，作用时间为30分钟。
4.如权利要求1所述的基因导入方法，其特征在于所述的生物材料为衣藻细胞，引入的超声波为连续超声波，作用在衣藻细胞上的超声波声强为2.0W/cm2，频率为800KHZ，作用时间为30秒。
5.如权利要求1所述的基因导入方法，其特征在于所述的生物材料为红细胞，引入的超声波为脉冲超声波，作用在红细胞上的超声波声强为0.5W/cm2，频率为800KHZ，作用时间为15秒。
6.如权利要求1所述的基因导入方法，其特征在于所述的生物材料为酵母细胞，引入的超声波为脉冲超声波，作用在酵母细胞上的超声波声强为2.0W/cm2，频率为800KHZ，作用时间为10分钟。
全文摘要
本发明涉及一种动植物基因工程中新的基因导入方法，即高效超声波基因导入方法。本方法是将超声波作用于DNA溶液中的生物材料上，由于超声波使细胞膜产生局部和暂时的结构改变，溶液中的DNA分子可以藉此扩散进入细胞。超声波诱导基因转移方法不受宿主范围限制，而且可将外源基因直接导入带壁的植物细胞，特别是植物体的组织块中，由它们再生植株比从原生质体培养要容易得多，超声波法导入基因还具有装置简单，操作方便等优点，在动植物基因工程中有广泛的应用前景。
文档编号C12N15/87GK1056124SQ9110362
公开日1991年11月13日 申请日期1991年6月5日 优先权日1991年6月5日
发明者许宁, 赵南明, 章力建, 贾士荣 申请人:清华大学, 中国农业科学院生物技术研究中心