专利名称：一种变性蛋白复性并同时纯化的方法
技术领域：
本发明涉及一种变性蛋白的复性及同时纯化的方法，特别是一种一步完全除去变性剂、使多种变性蛋白同时复性并相互分离和纯化的方法。
C.B.Anfinsen将溶在含有β-巯基乙醇的8.0mol/L脲溶液的已变性的核糖核酸酶转移到水环境后，便会自动折叠(复性)的这一重大发现及所提出的蛋白三维结构是由它的一维结构决定的重要结论，使分子生物学研究产生了突破性进展，因此荣获1972年诺贝尔奖。但是，到目前为止所有变性蛋白的复性完全是自发的和随机的，因此复性速度慢且活性回收率低。对于分子量大于50K Dalton的蛋白分子而言，活性回收率甚至更低。变性蛋白的折叠研究不仅涉及到分子生物学中的重大理论问题，而且涉及到目前基因工程产品中某些疏水性很强的蛋白，如干扰素，白细胞介素等在用变性剂从大肠杆菌中(E.Coli)提取后是否能完全复性的问题。因为这些基因工程产品的疏水性很强，不用变性剂是无法将其从E.Coli中提取出来的。但用变性剂提取出来的蛋白为变性蛋白，只有经复性后，才会有治疗效果。所以复性的完全与否直接影响到治疗蛋白的产量和质量。如某治疗蛋白的比活为1×107IU/mg，那就是说，具有这么多活性单位就算是1mg，而不管它的实际质量是多少。所以它是否复性完全会影响到产量和巨大的经济效益。
目前国内外所用的蛋白复性方法均是依据首先排除使蛋白变性的环境。如果是用变性剂盐酸胍或脲变性的，则用透析方法将变性剂除去，也可用大量水或具有合适组成的水溶液将变性剂的浓溶液大量稀释，有时高达200倍，这两种方法的共同缺点是不能完全除去变性剂，因此复性不完全。例如，硫氰酸酶的复性活性回收率仅为30-50%。此外，透析法需时长、一般要24小时，且要多次更换透析溶液。对稀释法而言，大体积稀释试样不仅给后来工序的纯化工艺带来不便，而且要增大设备的处理容量。有的样品，如胍变性的重组人干扰素-γ样品虽然稀释了70倍得到的仍然是浑浊溶液，在放置几小时后便会形成沉淀，须在18，000g离心力作用下沉淀分离后方可加上清液到色谱柱上。从现代分离科学理论计算知道，色谱和电泳是目前所知的两种最佳分离方法，但用于工业化大规模分离和纯化只能用制备型液相色谱，但通常事先须经几步预分离，以便除去大量的杂蛋白，虽然已有全色谱的分离和纯化基团工程生产的治疗药物的实例，但用的是传统的柱色谱。
本发明的目的是为了提供一种能使变性蛋白复性的简便、快速和高活性回收率的新方法，并且，在蛋白复性的同时，又能达到与其他杂蛋白进行分离和纯化的目的。从而可使在基因工程产品(如用变性剂从大肠杆菌中提取治疗蛋白干扰素等)的后处理工艺大大简化，并且在生产规模、发酵设备、工艺均相同的条件下，使产量增加2～3倍。
实现本发明的方法依据一种对变性蛋白有极强阻留能力，而对变性剂无阻留或阻留能力极弱的填料将变性蛋白阻留在装有该填料的柱床上，再以合适的溶剂和适当的洗脱方式，使变性剂与变性蛋白完全分离。不同蛋白移动速度不同，从而达到相互分离的目的。与此同时，变性蛋白会随组成变化并且连续流过柱床的溶剂缓慢移动，并且在溶剂和填料之间进行无数次的吸附和解吸附的分配，并且，变性蛋白完成了水合表面的脱水过程和折叠过程，直至复性。与此同时，复性蛋白也会以带状形式逐个流出柱外，达到与其他杂蛋白分离的目的。具体实施的方法如下1、选择合适的填料所用填料必需显示出在合适的介质中对在浓变性剂溶液中失活的蛋白质有足够强的阻留能力，包括形成沉淀、络合物、分子间相互作用的力和电荷作用力等选择性作用力以及疏水相互作用力，而对变性剂不显示或显示出极弱的阻留能力。在更换介质时，能迅速从填料上解吸并得到高的蛋白和活性回收率。该填料表面必须具有合适极性的基团，该基团必须能耐变性剂的长期作用而不改变其极性强度和色谱选择性。该填料是一种大孔径(30-50nm)而粒度合适(5-20μm)，在500Kg/cm2条件下有足够高机械强度的粒状颗粒，在500Kg/cm2条件下装柱以使既有足够高的柱效，又不致使在加入变形蛋白的变性剂溶液时产生过压。西北大学现代分离科学研究室研制的XDF-GM和XDF-G及XDF-GG型吸附剂便能满足这一要求。
2、阻留及洗脱溶剂的选择pH6.0～8.0范围内的浓盐(如2.0-3.5mol/L，含有Na+、K+、NH+4、Mg2+和Ca2+离子的盐酸盐、硝酸盐、醋酸盐、碳酸盐、硫酸盐和磷酸盐)水溶液是使变性蛋白在上述3种填料上完全阻留的极好溶剂(以下简称流动相Ⅰ)。而pH6.0-8.0的0.05-0.01mol/L的含有Na+、K+、NH+4离子的盐酸盐、硝酸盐、醋酸盐、碳酸盐、硫酸盐和磷酸盐溶液则是使蛋白从这些填料上迅速解吸，并且有能使变性蛋白实现可逆复性的双重作用，从而获得高质量及高活性回收率的溶剂(以下简称流动相Ⅱ)。
3、动态吸附与解吸将填料装填在附
图1所示开口的玻璃或塑料管中，或装在附图2所示的密封的不锈钢或钛钢管中，两者进出口均有孔径适中的筛板以使溶液流过但能阻止管内吸附剂从该管中的任何一端漏出。对附图2而言，既便在500Kg/cm2的压力条件下也是如此。高效液相色谱用的带有柱头的空柱可以代用。
将溶在变性剂溶液中的蛋白质试样加到柱入口端，并使流动相Ⅰ连续流过柱管，直至完全洗脱残留在柱床上的变性剂为止。接着用流动相Ⅱ冲洗并使其以连续流过柱管的方式完全洗脱被阻留在柱床上的蛋白。
4、操作方法可以借用传统的或现代的任何一种液相色谱操作装置或仪器，其流程如附图1和附图2所示。
附图1为压差式动力复性装置流程图。图中各部分表示〔1〕、流动相Ⅰ储存器;〔2〕、流动相Ⅱ储存器;〔3〕、试液;〔4〕、表面键合有亲合水性基团的玻璃毛;〔5〕、填料;〔6〕、孔状筛板;〔7〕、阀门;〔8〕、接收蛋白流出液的收集器。
附图2为泵动力式蛋白复性装置流程图。图中各部分表示〔1〕、流动相Ⅰ储存器;〔2〕、流动相Ⅱ储存器;〔3〕、试样;〔4〕、泵;〔5〕、进样装置;〔6〕、预柱;〔7〕、复性柱;〔8〕、检测器;〔9〕、记录仪〔10〕、收集器。
A、操作程序(以附图2所示装置为例)。
用流动相Ⅰ使系统平衡后(从检测系统指示出的平直基线可以判断)，在流速为0.30-2.0ml/min条件下加样，以合适的流速，并用合适的梯度使流动相组成从100%流动相Ⅰ变化到100%流动相Ⅱ，当检测器指示出有所需复性蛋白流出时，用人工或分步收集器分别接收各复性和纯化的蛋白。在梯度洗脱完毕时，用100%流动相Ⅱ继续洗脱10分钟，然后再用100%流动相Ⅰ流过柱床，直至系统平衡，为下一个样品的复性和纯化作好准备。
B、柱的再生。
用流动相Ⅱ将较目标蛋白阻留能力更强的杂蛋白完全洗出柱外。然后再使流动相Ⅰ流过直达到平衡(从检测系统指示的基线平直为止)。
与已有技术相比，本发明的突出优点在于①复性和色谱纯化同时完成。②将胍变性的蛋白或重组人干扰素-Gamma(rIFN-γ)盐酸胍粗提液直接进样到柱床上，在30-40分钟时间内便能使rIFN-γ的活性回收率高达280%(将通常所用的稀释法活性回收率视为100%)，纯度达85%，成本亦较通常方法低。③如果一个生产rIFN-γ的工厂一年能生产20g rIFN-γ，每克比活为1×107IU/mg的rIFN-γ价值1000万，则该厂年产值为2亿元，但因复性的活性回收率仅为40%，故只能得8000万元产值，如用本发明的复性方法，按90%活性回收率计，则可生产18g，得1.8亿元产值，本法创造的经济效益为1亿元/年。
实施例1、牛血清蛋白(BSA)和溶菌酶(Lys)的复性及纯化将溶在7.0mol/L盐酸胍中的牛血清蛋白和溶菌酶的混合溶液，用进样器注射到已用流动相Ⅰ平衡的XDF-GM填料上(4.0×150mm ID)，在流速为0.50-1.0ml/min和在30-40min时间间隔内，在100%的流动相Ⅰ至100%流动相Ⅱ的线性梯度洗脱条件下洗脱，直至检测信号表明该两种蛋白分别流出时，接收(用手工方式或分步接收器)直至洗脱完全为止。此后，再持续10min以便洗出万一存在的其它杂蛋白。最后用流动相Ⅰ连续流过柱床，直至检测信号基线平直为止。这时可进行下一个样品的复性和纯化操作。
附图3为该两种蛋白的复性及天然蛋白色谱图。色谱条件与“实现本发明的方法”2中所述的条件相同。在检测波长280nm，灵敏度0.64 AUFS条件下操作。a和c分别为天然和复性的牛血清蛋白;b和d分别为天然和复性的溶菌酶。
表Ⅰ为溶菌酶用本法及透析法复性后活性回收率的比较。以天然Lys为100，透析法回收率5次平均为83.1±15%，本法平均为115±20%，说明天然Lys有一部分失活，经本法复性后活性提高了约15%。此外，透析法为在4℃条件下，更换6次水，经24小时透析后所得到的结果。而本法仅须30分钟。Lys是一个分子量仅为14.6K Dalton的蛋白，容易复性。对于分子量稍大的蛋白，复性难度会更大，活性回收率会更低。
表Ⅰ Lys的透析及本法复性活性回收率的比较1 2 3 4 5 平均透析法% 92.9 59.1 79.3 90 94.2 83.1±15%本法% 105 140.7 90 130 111 115.3±20%2、核糖核酸酶-A(RNase-A)的复性以在流动相流速为0.30-1.0mol/min的条件下将溶在7.0mol/L盐酸胍溶液中的RNase-A注入到柱床中，用流动相Ⅰ持续冲洗20min，然后再换用流动相Ⅱ，在相同的流速条件下洗脱，接收复性的RNase-A直至洗脱完全为止。再用流动相Ⅱ，在流速1.0-1.5mol/min条件下冲洗10分钟。然后用流动相Ⅰ，在流速0.30-1.0mol/min条件下，冲洗直至柱床达到了新的平衡。便可继续下一个试样的操作。
附图4为天然(实线)与复性(虚线)的核糖核酸酶-A的园二色性谱图。
附图5为天然(a)、复性(b)和变性(c)的RNase-A紫外吸收光谱图。(a)和(b)，0.083mg/ml对应于左侧纵座标，(c)0.50mg/ml，对应于右侧纵座标3、大量溶菌酶的复性附图6为大量变性溶菌酶的复性色谱图。进样量为150mg，柱尺寸为Φ22mm×15cm(填料平均直径为15μm，平均孔径50nm)。复性条件为线性梯度100%流动相Ⅰ到100%流动相Ⅱ。在流速1.0-3.0ml/min 30分钟并连续10分钟100%流动相Ⅱ。接收复性Lys，测定活性回收率平均为93.6%。
4、rIFN-γ的复性与纯化附图7为重组人干扰素-gamma的复性与纯化色谱图。柱尺寸100mm×4mmID。流动相与“实现本发明的方法”2，样品为用7mol/L盐酸胍从大肠杆菌中提取的rIFN-γ溶液。rIFN-γ的活性测试方法细胞病变拟制法为。操作条件洗脱梯度，100%流动相Ⅰ到100%流动相Ⅱ，30分钟;流速，1.0ml/min。操作步骤进10-1000μl rIFN-γ粗样至已用流动相Ⅰ平衡过的柱床上，并开始梯度洗脱直至rIFN-γ洗脱完全为止，接收留出液。图中实线表示紫外吸收，阴影部分为活性回收率。经测定在附图7中所示的30-35min时间间隔内的收集液的活性回收率平均280%。
权利要求
1.一种变性蛋白的复性及同时纯化的方法，其特征在于选用对变性蛋白有极强阻留能力，而对变性剂无阻留能力或阻留能力极弱的填料，将变性蛋白阻留在装有该填料的柱床上，选用适当比例的流动相Ⅰ和适当比例的流动相Ⅱ分别作阻留、复性和洗脱溶剂，以改变流动相组成和连续流过柱床的方式操作，直至变性剂、杂蛋白和复性蛋白分离。
2.按照权利要求1所述的变性蛋白的复性及同时纯化的方法，其特征在于填料选用XDF-GM、XDF-G或XDF-GG型填料。
3.按照权利要求1所述的变性蛋白的复性及同时纯化的方法，其特征在于流动相Ⅰ为pH6.0～8.0范围内的浓盐(如2.0～3.5mol/L的含有Na+、K+、NH+4、Mg2+和Ca2+离子的盐酸盐、硝酸盐、醋酸盐、碳酸盐、硫酸盐和磷酸盐)水溶液，流动相Ⅱ为pH6.0～8.0范围内的稀盐溶液(如0.05～0.01mol/L的含有Na+、K+和NH+4离子的碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐、硝酸盐或醋酸盐)或者水。
全文摘要
本发明涉及一种使变性蛋白复性及同时纯化的方法，特别是一种一步完全除去变性剂、使多种变性蛋白同时复性并相互分离和纯化的方法。其特征是选用对变性蛋白具有极强的阻留能力，而对变性剂无阻留能力或阻留能力极弱的填料，将变性蛋白阻留在装有该填料的柱床上，并选用适当比例的流动相作阻留、复性和洗脱溶剂，以使变性剂、杂蛋白和复性蛋白分离。
文档编号C12N9/00GK1077715SQ9210272
公开日1993年10月27日 申请日期1992年4月13日 优先权日1992年4月13日
发明者耿信笃, 冯文科, 边六交, 马风, 常建华 申请人:西北大学