专利名称：一种发酵杀虫剂化合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵产物A83543的新化合物。
靶昆虫正迅速地产生对合成杀虫剂的耐药性，包括产生对较新的拟除虫菊酯杀虫剂的耐药性(见Pickett(1988)，Chem.Britain，137.)。因此需要新杀虫剂。
发酵产物A83543，一个由SaccharopolysporaSpinosa系产物的同类化合物族，现已被发现并表现出优越的杀虫活性。A83543及该类化合物中的每一种对于控制螨类及昆虫，特别是鳞翅目及双翅目虫是有效的。
所谓A83543化合物是指含有一个稠合成12-元大环内酯、天然糖及氨基糖的5，6，5-三核环系统的化合物(见Kirst等(1991)，TetrahedronLettes，32∶4839)。A83543天然化合物族包括EPO申请No.0375316中所说的属，并具有下列通式
其中R1是H或是选自
的基团，而R2，R4，R3，R5及R6是氢或甲基;或当的是除氢之外的上述基团时，它们是其一种酸的加成盐。
A83543发酵产物已显示出含有单独的化合物A83543A、A83543B、A83543C、A83543D、A83543E、A83543F、A83543G、A83543H及A83543J(见欧洲专利公开No.0375316)。
这些单个的化合物的结构展示于下
其中每种化合物的R1、R2、R4、R3，R5及R6如下A83543化合物的结构
本发明导出式1的化合物
其中R7，R8，R9及R10单独地是下列中的每一种
本发明还涉及杀虫及杀螨的组合物和使用式1中R7是除氢之外的化合物1-8来降低昆虫及螨虫的虫数的方法。
本发明的另一方面是提供生产化合物1-7，A83543发酵产物的新的天然化合物的方法，该方法包括在浸没的需氧发酵条件下，在适宜的培养介质中培育能产生化合物1-7的S.spinosa株系或其突变体直至产生可回收量的化合物1-7中的任一种。可按下文所述方法分离和提纯化合物1-7。
本发明还提供新发现的S.spinosa系NRRL18719(A83543.6)，NRRL18720(A83543.7)及NRRL18823(A83543.9)的生物纯的培养物。
本发明的目的还在于提供化合物1-7。这些新化合物的化学结构通过包括核磁共振谱(NMR)、紫外光谱(UV)的光谱测量法及通过与已知的A83543化合物比较而确定(见Kirst.等(1991)，上述引文。)下列段落描述化合物1-7的物理和光谱特性A83543LA83543L有以下特征分子量731经验公式C4H65NO10UV(EtOH)λmax244(ε＝10.362)MS(FAB)(M+H)m/z732表Ⅰ概括了A83543L(在d6-内酯中)的1H和13CNMR数据表Ⅰ 在内酯-d6中的A83543L的1H和13C NMR数据位置13C1H*1172.59-234.323.07/2.42348.392.91442.753.455123.295.536137.19-745.332.18835.612.01/1.45976.624.321038.592.36/1.381146.991.031249.992.7713148.517.0214145.11-15203.09-1648.433.301780.913.551835.041.551922.501.79/1.192030.891.532176.814.452229.111.49
续表I位置13C1H*239.550.812416.291.136-CH320.85 1.741'96.374.862'82.443.333'72.333.734'84.592.955'68.343.506'18.311.202'-OCH359.05 3.444'-OCH360.74 3.511''104.064.462''31.901.93/1.393''18.741.83/1.524''65.972.125''74.043.576''19.391.21N(CH3)240.97 2.21＊取自杂环单键2D相关谱的值。
A83543MA83543M有如下特征分子量703经验式C39H61NO10UV(EtOH)244nm(ε＝10，240)MS(FAB)(M+H)m/z704表Ⅱ概括了A83543M(在d6-内酯中)的1H和13C核磁共振光谱(NMR)数据。
表Ⅱ在内酯-d6中的A83543M的1H和13C NMR数据位置13C1H*1172.65-234.533.08/2.44348.802.94442.363.505129.805.876130.345.91742.052.14837.211.97/1.36977.044.341038.302.36/1.361147.120.941250.442.87
表II(继续)位置13C1H*13148.347.0514144.93-15203.08-1648.363.311781.223.551835.151.521922.381.78/1.172031.091.502176.824.662229.111.48239.570.802416.441.131'96.464.842'82.503.313'72.233.724'84.612.945'68.403.486'18.341.192'-OCH359.08 3.444'-OCH360.72 3.50
表II(继续)位置13C1H*1''104.154.482''31.781.88/1.423''29.112.11/1.234''61.862.025''76.553.276''19.341.22N(CH3)234.16 2.34＊取自杂环单键2D相关谱的值。
A83543NA83543N有如下特征分子量717经验式C40H63NO10UV(EtOH)244nm(ε＝10，446)MS(FAB)(M+H)m/z718表Ⅲ规纳了A83543N(在d6-内酯中)的1H和13C的核磁共振(NMR)光谱数据。
表Ⅲ 内酯-d6中的A83543N的1H和13CNMR数据位置13C1H*1172.65-234.413.06/2.43350.002.90442.853.455123.385.556137.25--745.392.18835.672.01/1.46976.784.321038.652.37/1.401147.071.031250.072.7813148.417.0314145.17-15203.14-1648.443.311781.143.561835.131.511922.441.81/1.202031.051.512176.784.61
表III(继续)位置13C1H*2229.111.48239.560.812416.411.126-CH320.82 1.731'96.514.862'82.513.313'72.243.734'84.622.955'68.413.506'18.341.182'-OCH359.01 3.434'-OCH360.71 3.511''104.134.482''31.781.87/1.403''29.112.11/1.234''61.882.805''76.583.266''19.331.22N(CH3)234.18 2.34＊取自杂环单键2D相关谱的值。
A83543QA83543Q有如下特征分子量731。
经验式C41H65NO10UV(EtOH)λMAX244(ε＝10，492)MS(FAB)(M+H)m/z732表Ⅳ规纳了A83543Q(在d6-内酯中)的1H和13C核磁共振(NMR)光谱数据。
表Ⅳ 在内酯-d6中的A83543Q的1H和13CNMR数据位置13C1H*1172.64-234.303.08/2.44348.942.91442.773.445123.245.556137.65-6-CH320.82 1.74745.322.18835.472.00/1.45976.354.321038.522.36/1.391146.961.05
表IV(继续)位置13C1H*1249.982.7913148.537.0414145.12-15203.12-1648.443.311780.883.531835.051.501922.531.81/1.182030.871.532176.844.652229.121.48239.530.812416.241.121'99.514.752'68.443.943'82.523.334'82.623.065'68.333.556'18.191.203'-OCH356.81 3.394'-OCH360.71 3.46
表IV(继续)位置13C1H*1''104.064.472''31.901.94/1.393''18.721.81/1.494''65.982.125''74.053.566''19.391.21N(CH3)240.95 2.21＊这些值取自杂环单键2D相关谱。
A83543RA83543R有以下特征分子量703经验式C39H51NO10UV(EtOH)λMAX245(ε＝10，991)MS(FAB)(M+H)m/z704表Ⅴ规纳了A83543R(在d6-内酯中)的1H和13C核磁共振(NMR)光谱数据。
表Ⅴ 内酯-d6中的A83543R的1H和13CNMR数据位置13C1H*1172.63-234.4130.8/2.46348.712.95442.233.515129.675.876130.295.91742.042.16837.021.95/1.36976.644.331038.192.37/1.381147.010.931250.332.8713148.437.0614144.84-15203.08-1648.323.311780.993.561835.061.521922.411.79/1.192030.911.59/1.46
表V(继续)位置13C1H*2176.834.662229.061.48239.550.812416.311.131'99.514.742'68.313.933'82.483.334'82.593.075'68.313.536'18.181.193'-OCH365.80 3.394'-OCH360.70 3.471''104.164.482''31.701.88/1.423''29.062.11/1.234''61.821.985''76.523.266''19.301.22NHCH334.18 2.35＊这些值取自杂环单键2D相关谱。
A83543SA83543S有如下特征分子量703经验式C39H61NO10UV(EtOH)λMAX244(ε＝9，697)MS(FAB)(M+H)m/z704表Ⅵ规纳了A83543S(在d6-内酯)中的1H和13C的核磁共振(NMR)光谱的数据。
表Ⅵ 内酯-d6中的A83543S的1H和13CNMR数据位置13C1H*1172.39-234.863.06/2.40348.792.95442.033.435129.665.866130.325.91741.992.16837.041.97/1.38976.654.331038.202.35/1.381147.080.93
表VI(继续)位置13C1H*1250.312.8613148.377.0514144.74-15203.01-1647.983.341781.163.561834.901.61/1.521922.251.80/1.172033.571.502172.974.682221.621.122416.441.131'99.514.732'68.413.933'82.513.334'82.593.065'68.313.536'18.191.193'-OCH356.81 3.384'-OCH360.71 3.47
表VI(继续)位置13C1H*1''104.054.472''31.921.49/1.413''18.711.83/1.524''65.952.135''74.033.566''19.391.21N(CH3)240.96 2.21＊各值自杂环单键2D相关谱。
A83543TA83543T有如下特征分子量703经验式C39H61NO10UV(EtOH)245nm(ε＝13，082)MS(FAB)(M+H)m/z704表Ⅶ规纳了A83543T(在d6-内酯)中的1H和13C核磁共振(NMR)光谱数据。
表Ⅶ A83543T在内酯-d6中的1H和13CNMR数据位置13C*1H*1172.65-234.253.11/2.49348.502.97441.923.545129.695.916130.315.94742.012.18837.031.98/1.39976.444.361038.182.39/1.391147.320.961250.142.8913148.367.0914144.85-15203.12-1648.223.351780.833.571834.991.57/1.511922.341.82/1.222030.831.58/1.49
表VII(继续)位置13C1H*2176.724.692229.041.52239.290.842416.141.161'99.464.752'72.613.713'72.613.694'84.123.055'68.223.576'18.181.244'-OCH360.55 3.601''104.554.502''31.811.97/1.433''18.591.86/1.554''65.762.155''73.983.606''19.241.24N(CH3)240.95 2.25＊各位取自杂环1D或反相2D单键相关谱。
本发明另外的方面是天然因素A83543P化学脱甲基而产生N-脱甲基A83543D。类似地，通过使A83543J和A83543L反应可产生A83543M和A83543N。
该N-脱甲基衍生物是通过使天然因子A83543D在有1-13当量间的碘及一种适宜的碱，如乙酸钠，存在时反应而制得的。该反应在极性有机溶剂，如甲醇，或极性有机溶剂和水的混合物，如含水甲醇中进行。进行该反应的优选条件是温度30°-90℃、时间2-6小时、PH值8-10。
N-脱甲基A83543DN-脱甲基A83543D有如下特征UV(EtOH)λMAX244nm(ε＝9400)表Ⅷ规纳了N-脱甲基A83543D(在d6-内酯)中的1H和13C核磁共振(NMR)光谱数据。
表Ⅷ.N-去甲A83543在内酯-d6中的1H和13C的NMR数据位置13C1H*1172.62-234.383.09/2.47348.972.91445.382.195123.385.556137.20-742.803.47
表VIII(续)位置13C1H*835.592.02/1.45976.784.661038.642.36/1.371147.031.031250.022.7813148.367.0314145.17-15203.08-1648.433.311781.083.551831.011.521922.451.79/1.192035.111.5221 76.70*4.332229.111.48239.560.812416.391.131'97.104.842'78.353.553'82.563.414'83.133.02
表VIII(续)位置13C1H*5'68.693.506'18.271.192'OCH57.323.413'OCH59.043.444'OCH60.703.471''104.104.472''31.791.86/1.423''29.232.09/1.484''61.943.005'' 76.60*3.256''19.341.226CH20.841.75NHCH34.312.34＊各值取自杂环单键2D相关谱。
化合物1-8可反应而形成各种酸式加成盐。有代表性的适宜的盐包括那些通过与诸如硫酸、盐酸、磷酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸、乳酸、马来酸、胆酸、富马酸、双氢萘酸、粘酸、谷氨酸、樟脑酸、戊二酸、乙醇酸、苯二甲酸、酒石酸、甲酸、月桂酸、硬脂酸、水杨酸、甲磺酸、苯磺酸、山梨酸、苦味酸、苯甲酸、肉桂酸等有机或无机酸进行标准反应而形成的盐。这些盐比如在分离和提纯化合物1-8时是有用的。另外，这些盐类中的一些可能具有增高了的水溶解度。这些盐用标准成盐程序制成。
化合物1-8还可用于制备相应的拟配质，方法是使化合物1-8中任一种与酸反应而去掉氨基糖。适宜的酸包括盐酸和硫酸，而最好是硫酸。该反应最好在一种极性有机溶剂，极性有机溶剂与水的混合物中进行。适宜的有机溶剂包括甲醇、THF、乙腈和二噁烷。用于此转变的较佳溶剂是用甲醇和水的混合物。可在约25℃-约95℃之间，最好是80℃的温度进行此反应。
通过以下流程制备此拟配质流程AA83543J→化合物1→化合物5→化合物9A83543PsaA2→A83543AgAA83543L→化合物2→化合物6→化合物10A83543PsaD2→A83543AgDA83543M→化合物3→化合物7→化合物9A83543PsaB2→A83543AgAA83543N→化合物4→化合物8→化合物10A83543PsaN2→A83543AgD相应地，本发明的另一方面是提供生产A83543AgA、A83543AgD、A83543AgE或A83543AgF的方法，该法包括(a)水解A83543A、A83543B、A83543C、A83543G、A83543H、A83543J、A83543PsaA1、A83543PsaA2、A83543PsaH1、A83543PsaJ1、A83543PsaB2、或A83543PsaC2而产生A83543AgA;或(b)水解A83543PsaP2或A83543PsaN2而产生A83543AgD，或(c)水解A83543E或A83543PsaE1而产生A83543AgE，或(d)水解A83543F或A83543PsaF1而产生A83543AgF。
该拟配质作为制备新A83543化合物的原料是有用的，比如在有氨基糖存在时可在羟基上使该配质糖基化。糖基化可通过化学合成或微生物转换法进行。更具体地说，通过在A83543PsaL1存在时培养任何已知的A83543～制备株系，可将A83543Psa L1转变成A83543L和A83543N。
一般通过在适宜的培育介质中在浸没需氧条件下，培养S.spinosaSP.nov.的A83543-制备株系直至产生可回收量的天然因子来产生化合物1-7。可用本技术领域中已知的各种分离和提纯方法收取化合物1-7。
为在后面的讨论方便，A83543-制备株系给予以下名称A83543.1和83543.4(见EPO.No.0375316)。还有，新的A83543J-制备株系给予名称A83543.6及A83543.7;化合物A83543L、A83543M及A83543N由A83543.6和A83543.7制取。最后，新的A83543Q-制备株系给予名称A83543.9;化合物A83543Q、A83543R、A83543S及A83543T用A83543.9制取。培养物A83543.1、A83543.4、A83543.6、A83543.7及A83543.9已被寄存，并成为中西部地区研究中心，农业研究处，美国农业部(MidwestArtaRegionalResearchCenter.AgricultaralResearchService.UnitedStatesPepartmentofAgriculture)的收藏培养物收集品的一个部分，公众按以下登记号就可得到它们NRRLNO.系NO18395A83543.118538A83543.418719A83543.618720A83543.718823A83543.9通过使培养物A83543(它是在维金岛(Virginlslands)收集的土壤样品中分离出来的化学突变得到培养物A83543.1(见Mertz及Yao(1990)，Int′lJ.ofSystematicBacterioligy，40∶34)。通过用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍进行的化学引发的诱变从培养物A83543.1产生培养物A83543.4和A83543.6。通过用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍进行的化学引发的诱变从A83543.4产生培养物A83543.7和A83543.9。下列数据表明，这些不同的分离物都是S.spinosa菌株系，而且只有很小的培养的、形态学和生物化学上的区别。除A83543组分在生产上的差别外，这些分离物显得与亲体培养物相同。
培养特征培养物A83543.1，A83543.4，A83543.6，A83543.7和A83543.9在12个琼脂平板介质上生长，然后对比生长、反转颜色、产生气生菌丝、孢子团生色及产生可溶色素。在所用任何介质上未见明显的区别。这些培养物在复合的和规定的介质上都生长得很好。在大多数所用的介质上都产生气生菌丝。气生孢子团的颜色主要是白色的，而反侧则是黄到黄-褐色。不存在任何特殊的色素形成，然而可溶的棕色素却被释放在某些介质中。这些培养特征与A83543.1的原始分类学图中的特征一样(见Mertz及Yao(1990)的上述引文)。
形态学特征在对比的菌株间未见明显区别。良好形成的气生菌丝存在于大多数介质，其形态为断成长链孢子以产囊丝钩和开口环排布。还可见螺旋体，但它是短而不完整的。一般形态是直肌-柔软性的。每种菌株的气生菌丝都有一种特殊的串珠状的外形，因为在该孢子链中有很多空的空间。这种特性证实了孢子鞘把孢子链包了起来，而这正是Saccharopolyspora属的独特性质。
重量特征将每个菌株的脂肪酸分析作了比较。细胞在胰蛋白酶大豆流体培养基中于28℃生长96小时(DifcoLaboratories、Detroit，MI)。通过用5898A型计算机控制的气-液色谱系统(Hewlett-PackarolCo.，PaloAlto，CA)进行的气液色谱法对脂肪酸甲基酯作分析(见Miller及Berger，“BacterialIdentificationbyGasChromatographyofWhole”CellFattyAcids，"Hewlett-PackardApplicationNote228-41。这些结果已列于表Ⅸ)。
表Ⅸ.A83543菌系的脂肪酸百分数组成
1F，B和C标志了双键位置，或未知的形状。
主要组分分析是涉及一组变量间内在关系的多元统计学的一个分枝。在此分析中，原始数据或测试结果中的最大改变量用主要组分表达(见Alderson，TheApplicationandRelevanceofNonheirarchieMethodsinBacterialTaxonomy，"inComputer-AssistedBacterialSystematics227(1985)。可构成一个显示散点和变化性的区。可通过检查这种变化及特征化的微生物群体估价各种关系。得自菌株A83543.1，A83543.4，A83543.6，A83543.7和A83543.9的脂肪酸分析的两维主要组分区示于
图1。这些值关系到这些菌株间的分离程度。在这些菌株间的分类学区别是不明显的。
当涉及其它生物时，A83543J-制备菌株及A83543Q-制备菌株的这些特征要被改变。因此，可通过本技术领域中已知的物理和化学方法获得这些菌株的突变体。比如通过用如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍之类的化学物质处理就可获得其它的菌株。
本发明的一个方面是制备化合物1-3，方法是在适宜的培养介质中培养S.spinosa的一种A83543-制备株，该株选自NRRL18719和NRRL18720，或A83543J-制备株的突变体。“A83543J-制备株突变体”是天然物，或由S.spinosa的NRRL18719或NRRL18720衍生的诱变突变体，该体能制取值得回收量的A83543J(以及A83543L，A83543M或A83543N)。类似地，通过在适宜的培养介质中培育S.spinosa菌系NRRL18823，或A83543Q-制备株的突变体而产生化合物4-7。A83543Q-制备株突变体是一种能产生值得回收量的A83543Q(以及A83543R，A83543S或A83543T)，它衍生于S.spinosaNRRL18823的菌系。菌系NRRL18823产生含α-3、4-二-O-甲基鼠李糖的A83543组分。因鼠李糖的2-羟基甲基化的生物合成机理是这一新菌系的缺点。
在产生化合物1-7之后，可用本领域中已知的各种分离及提供方法将其从培养介质中分离出来。出于生产的经济性，最佳产率、产物的易于分离方面考虑，要优选一定的培养介质。比如，尽管也可用核糖、木糖、果糖、半乳糖、甘露糖、甘露糖醇、水溶性淀粉、马铃薯糊精，油类，如豆油等也可用，但在大规模发酵中的碳源则是葡萄糖和油酸甲酯。虽然鱼粉、水解大豆粉、酵母提取物、酶水解的酪蛋白、牛肉提取物等也可用。但优选的氮源是棉籽粉、胨化的奶、及玉米浸液。能掺进该培养介质中的营养无机盐是些能产生锌、钠、镁、钙、铵、氯根、碳酸根、硫酸根、硝酸根等离子的常规可溶盐。为此种生物生长和发育所必需的基本痕量元素也应包含在该培养介质内。这类痕量元素通常作为杂质出现在介质的其他替代物中，其数量要充分满足该生物生长的要求。
通常，若起泡是个问题，可在大规模发酵介质中加少量(如0.2ml/L)消泡剂，如聚丙二醇。然而在产生A83543的培养物的情况下，常规的去泡剂阻碍A83543的产生。通过在介质中加入量为(1-3%)的豆油或PLURONICL-101(BASF，Parsipanny，NJ)可控制发泡。如发泡继续发展可再加些油。
为产生基本数量的天然因子，在搅动的生物反应器中浸没需氧发酵是优选的，而用振动烧瓶培养可获得少量的天然因子。由于在生产时用生物的孢子形态在大型反应器内培育常伴有时间的延宕，所以最好用植物性种菌。用该生物的孢子形态或菌丝体断片孕育少量培养介质而获得该生物的新鲜的生长活跃的培养物，以此方法制取该植物性菌种。然后将此植物性菌种转移到大型生物反应器中。该植物性菌种介质可与大型发酵时所用的菌种相同，但其它介质也是适宜的。
用A83543J-制备菌株生产化合物1-3，用A83543Q-制备菌株生产化合物4-7，条件是生长温度为约24°-约33℃之间。产生的最佳温度是约28-30℃。
如在浸没需氧培育法常用的那样，将无菌空气从底部鼓入容器，同时用常规的透平机叶轮搅动该介质。一般，通气速率及搅拌速率应足以保持氧溶解为气体饱和度的60%以上，最好是70%以上，而容器内压为约0.34大压。
在发酵期间，随着化合物1-7的生产要检测该液体培养介质的提取物。进行此生产的优选方法是用高性能液体色谱仪(HPLC)分析该液态培养介质提取物。适宜的分析系统在实施例1和7中讲述。
在振动烧瓶或搅动反应器中进行生产，可用本技术领域中所用的方法从该发酵介质中收取化合物1-7。在A83543J或A83543Q-制备菌株发酵期间产生的这类化合物在网状菌丝体和液体培养介质中都可出现。将大量油用于发酵时，化合物1-7是亲油性的，而全部液体介质培养物的提取则更有效。如果只用少量的油，则化合物1-7的主要部份存在于网状菌丝体。在此情况下，通过对该介质进行起始过滤而将液体培养介质与菌丝体群(生物群)分离实现化合物1-7的更有效的回收。
可用各种技术从该生物群中收取化合物1-7。适宜的技术包括用水洗分离出生物群以去除残留的液体培养介质;将该生物群与可在其中溶解化合物1-7的极性溶剂，如甲醇、丙酮混合分离及浓缩该溶剂;用非极性溶剂萃取此浓缩物和/或将其吸附在反相硅胶吸附剂上，如C8或C18树脂，或高孔聚合物，如HP-20或HP20-SS(Mitsubishi Chemical Indnstries Co.，Let.，Japan)。用适宜的溶剂，如乙腈甲醇的混合物(最好含少量THF)将此活性物从吸附剂上洗脱。
将化合物1-7与此生物群分离的优选技术包括将等体积的丙酮加到整个液体培养介质中，在陶瓷滤器中过滤此混合物以去除生物群，用乙酸乙酯萃取滤液。在真空中浓缩此乙酸乙酯萃取物以去除丙酮，然后将含水层与有机层分离。将乙酸乙酯溶液在真空中进一步浓缩，然后用水稀释的酸(pH3)萃取此浓缩物。用下所述的色谱法可进一步提纯化合物1-7。
将化合物1-7与该生物群分离的更好的技术包括将等量体积丙酮加到整个液体培养介质中，在陶瓷滤器中过滤此混合物以去除该生物群，然后调节滤液的pH值至约pH9-约pH13。将此溶液施加到HP-20SS(MitsubishIndnstriesCo.，Ltd.，Japan)然后用甲醇、乙腈和水的混合物(1∶1∶2)淋洗此柱。可用甲醇/乙腈(1∶1)和0.1%乙酸铵(pH8.1)的95∶5的混合物将化合物1-7中的任一种洗脱。将含化合物1-7的洗脱部分掺合并冷冻干燥。用后文所述的色谱法可将化合物1-7进一步提纯。
作为选择，可使用包含介质构成物及丝菌体的培养物固体而无需萃取或分离，但最好是在去除水之后作为化合物1-7的来源使用。比如，在产生化合物1-7后，全部发酵液体培养介质可被冷冻干燥、转鼓干燥、或共沸蒸馏后干燥法进行干燥。然后该干燥的介质可直接使用，比如将其直接混入原料予混物或用于喷剂或粉末的配料中而直接使用。
化合物1-8能抑制昆虫或螨虫。术语“抑制昆虫或螨虫”指的是减少活的昆虫或螨虫的数量或减少活的昆虫卵或螨虫卵的数量。一般化合物1-8的用量范围为约1-约1000ppm(或0.01-1Kg/a)。
更具体地说，化合物1-8显示出抗甜菜粘虫及烟草芽虫的活性，此二种昆虫属鳞翅目。该目其它的典型成员是南方行军虫、平蠢蛾、切根虫、袋衣蛾、印度谷螟、豆荚卷叶螟、玉米果穗蛾、棉铃虫、欧洲玉米钻蛀虫、菜粉蝶、粉纹夜蛾、锦葵麦蛾、崖柏雪松袋蛾，东方苹天幕毛虫、单网虫，及秋粘虫。
化合物1-8还显示出抗叶蝉的活性，该昆虫属同翅目。属于该目的其它昆虫有棉蚜、光蝉、梨黄木虱、苹果木虱、蚧、椰粉虱及沫蝉和其它的寄主专一的蚜属昆虫。
另外，化合物1-8还显示出抗厩螫蝇、丽蝇及蚊虫的活性，这些虫都属双翅目。属该目的其它典型昆虫是普通家蝇。
化合物1-8还显示出抗二点红蜘蛛的活性，此昆虫属蜱螨目。属该目的其它典型的昆虫有猫痂螨，马瘙螨、绵羊癣疥螨、鸡皮刺螨、拔羽螨、狗腺囊螨。
化合物1-8可用在抑制昆虫和螨虫虫口的方法中，该法包括使昆虫或螨虫失活有效量的选自化合物1-8中至少一种化合物施于昆虫或螨虫的位点。在一较佳实施方案中，本发明旨在提供一种抑制鳞翅目的易感受昆虫的方法，该法包括使昆虫失活有效量的选自本发明化合物1-8中的至少一种化合物施于植物上。本发明另一较佳实施方案旨在提供一种抑制动物中的双翅目刺螫蝇的方法，该法包括以有效抑制害虫量的选自化合物1-8中至少一种化合物通过口服、肠外或局部投药于动物。在另一较佳实施方案中本发明旨在提供一种抑制同翅目的易感受昆虫的方法，该法包括使昆虫失活有效量的选自化合物1-8中的至少一种化合物施于植物。本发明再一较佳实施方案旨在提供抑制蜱螨目螨虫的方法，该法包括将使螨虫失活量的选自化合物1-8中的至少一种化合物施于螨虫位点。
螨虫/昆虫筛选在下面的螨虫/昆虫筛选中对化合物1-8作杀螨及杀昆虫活性的测试。通过将化合物溶于每升含23gTOXIMVLR(磺酸盐/非离子乳化剂混合物)及13gTOXIMVLS(磺酸盐/非离子乳化剂混合物)的丙酮-乙醇(1∶1)的混合物中配制测试化合物。然后将这些混合物用水稀释到指定浓度。
将二点红蜘蛛及棉蚜引在南瓜藤子叶上。并使之在叶子的两个表面上确立。用Devilbiss雾化喷雾器向这些叶子各喷上5ml试验溶液。叶子的两面都被喷到直到溶液流下，然后使之干燥1小时。经标准的暴露时间后计算百分死亡率。用类似的公式及评估程度估算其余的昆虫。结果报导于表X中。使用以下缩略词缩写害虫害虫学名ALH六点叶蝉Macrosteles fascifronsBAW甜菜粘虫Spodoptera exiquaCA棉蚜Aphis gossypii GloverCBW棉铃虫Heliothis zeaGECR德国小蠊Blattella germanicaNEM根瘤线虫Meliiodyne sppSAW南方行军虫Spodoppera eridiniaSCRW南方玉米根虫Diabrotica undecimpunctatahowardiTBW烟草蚜虫Heliothis virescensTSSM二点红蜘蛛Tetranychus urticae
化合物9(N-去甲基-A83543D)是抗SAW、SCRW及TSSM的活性物。
用以下试验评估化合物1-8以确定抗新生的烟草芽虫(Helieothis virescens)的LD50。将陪替式培养皿(100mm×20mm)翻倒过来并用1＃定性滤纸衬罩。每个培养皿放十个新生的幼虫，然后用滴管吸1ml试验溶液滴在各虫上。将陪替式培养皿的底放在该罩上以便盛放幼虫。在处理后1小时的时刻往每个培养皿加一小片Heliothis食料(改性悬浮液，Southland Prodnets.Lake Village，AR)。在24小时和48小时的时刻计算死亡率。该试验重复进行三次。结果示于表Ⅺ。
表Ⅺ.抗新生烟草芽虫的活性化合物 LD50(ppm)a1(A83543L)26.02(A83543M)22.63(A83543N)40.04(A83543Q)0.395(A83543R)14.56(A83543S)53.07(A83543T)>64.08(N-去甲A83543D)5.8a是二次试验的平均值杀虫组合物。
本发明的化合物1-8以组合物的形式应用，这些组合物含存在于植物学上可接受的惰性载体中的，昆虫-或螨虫失活量的化合物1-8中的任一种。化合物1-8中的任一种存在形式可为单一化合物、两种或多种化合物的混合物、至少一种选自化合物1-8中的化合物的混合物或至少一种选自化合物1-8与发酵介质的干燥部分的混合物，该化合物是在所述发酵介质中产生的。
按照农业化学工艺中的常规程序和准则制备各组合物，但由于有本发明的一种或多种化合物的参与，该程序和准则又是新而重要的。该组合物或是分散在水中以便施用的浓缩的配制品，或是无需再处理而施用的粉状或小球状的配制品。
作为该化合物或粗的干料使用形式的分散体经常是由各化合物或干粗料的配制品制成的水溶液，水悬浮液或乳液。这类可溶水的，可在水中悬浮或乳化的配制品或是固体(通常以可湿润的粉末为人所知)或是液体(常以可乳化的浓缩物或水悬浮液为人所知)。
可经压制而形成水可分散的小球的可湿润粉末含有一种活性化合物、惰性载体及表面活性剂的紧密混合物。活性化合物的浓度通常为约1%-约90%(重量)。惰性载体在attapuliteclays(一种美国白土)，蒙脱土、硅藻土或精制硅酸盐中选择。
包含约0.5%-约10%可润湿粉末的有效表面活性剂发现选自磺化木质素、稠合的萘磺酸盐、萘磺酸盐、烷基苯磺酸盐，烷基硫酸盐、及非离子的表面活性剂，如烷基酚的环氧乙烷加合物。
该类化合物的可乳化浓缩物含常规浓度的一种化合物，如每升液体约50-约500g，分散于惰性载体中相当于约10%-约50%，该载体或是可水混溶的溶剂或水不混溶的有机溶剂与乳化剂的混合物。有用的有机溶剂包括芳族化合物，特别是二甲苯及石油馏份，特别是石油的高沸点的环烷的或烯属部份，如重的或芳族的石油脑。其它的有机溶剂，如萜烯属的溶剂，包括松脂衍生物，脂族酮，如环已酮及复合醇，2-乙氧基醇也可用。适宜的用于使浓缩物乳化的乳化剂选自如上述的常规非离子表面活性剂。
水悬浮液包括以约5%-约50%(重量)的浓度范围分散在水载体中的本发明的水不溶组分的分散体。通过将该组分研磨，再强烈地将之混入由水和选自上述类型的表面活性剂所组成的载体中而制成该悬浮体。也可添加惰性成分，如无机盐和合成的或天然的树胶来提高该水载体的密度及粘度。在制备该水混合物的同时，研磨及混合该化合物并在一诸如砂磨机、球磨机或活塞式均化器的设备中使其均化，这种方法通常是最有效的。
化合物1-8还可以小球状的组合物形式使用，将它们用于土壤时特别有效。小球状组合物通常含约0.5%-约10%(重量)的化合物1-8中的至少一种化合物，它们分散在全部或大部由粘土或类似的廉价物质构成的惰性载体中。通常是将该化合物溶于适当的溶剂中然后涂于球状载体上而制成这类组合物，所述的载体是予先形成的，大致颗粒尺寸范围为约0.5-3mm。也可通过制造该载体的捏塑体或糊体，将掺好了该活性组分的捏塑体或糊料干燥，将干燥后的组合物压碎至所要求的球料尺寸来配制这类组合物。
含该化合物的粉末是通过将该化合物的粉末与适宜的粉状农用载体，如高岭土，磨碎的火山岩等紧密混合而制成的。粉末适宜含约1%-约10%的选自化合物1-8中的至少一种化合物。
当出于任何原因的需要，将该化合物溶在适当的有机溶液中使用同样可行，所述溶剂一般是调合的石油润滑油，如广泛用于农业化学中的喷淋油。
杀虫剂及杀螨剂的常规应用形式是在液体载体中的活性组分分散体。应用最广的载体是水。
化合物1-8也可以气态组合物的形式施用。在这类组合物中，活性化合物溶在一种惰性载体中，该载体是一种产生压力的发射剂。该气态组合物被包装在一容器中，从中该混合物经一雾化阀被分散。发射剂混合物既可含能与有机溶剂混合的低沸点卤化碳，也可含用惰性气体或气态卤化碳加压的水悬浮液。
欲施用于昆虫和螨虫位点的该化合物的量是不严格的，而且可由本技术领域中普通技术人员根据所提供的情况迅速确定。一般，为提供良好的控制，希望选自化合物1-8中的至少一种化合物的浓度为约10ppm-约5000ppm。至于大多数此化合物，浓度为约100-约1000ppm将足够了。对于大田作物，如大豆和棉花而言，该类化合物的适宜施用率为约0.01-约1Kg/公顷，一般按5-50加仑/英亩喷雾制品施用。
施用选自化合物1-8中的至少一种化合物的位点可以是居存昆虫或螨虫的任何位点，如蔬菜、作物、水果、坚果树、葡萄藤及装饰用的植物。
由于螨卵独特的耐毒作用的能力，为控制新孵出的幼虫，就象用其它已知杀螨剂一样，需要反复用药。
杀外寄生虫的活性化合物还有抗双翅目昆虫的活性。表Ⅻ和ⅩⅢ归纳了某些化合物体外作用的研究。
表Ⅻ抗丽蝇幼虫的活性化合物活性施用率(ppm)死亡率%A83543L590A83543Q10100590A83543R101005100表VIII抗厩螫蝇成虫的活性化合物活性施用率(ppm)死亡率%24时48时A83543L570100A83543M560100A83543N52090A83543Q109010055090A83543R1090100570100
杀外寄生虫的方法本发明的杀外寄生虫的方法是通过施用化合物1-8中的至少一种化合物于寄生动物来控制昆虫及Aearina寄生物而进行的。对动物用药可经皮、口服及肠外途径实施。
寄生昆虫和蜱螨(Acarina)包括吸血及食肉的物种和在它们的全部生命周期或仅一部分生命周期内(如仅是幼虫或仅是成虫阶段)是寄生的物种。
代表性物种包括如下马蝇Tabanusspp厩螫蝇Stomoxyscalcitrans黑蝇Simuliumspp驴盲虱Haematopinusasini猫痂螨Sarcoptesscabiei马痒螨Psoroptesequi角蝇Haematobiairritans牛羽虱Bovicolabovis牛盲虱Haematopinuseurysternus犊长颚虱Linoqnathusvituli采采蝇Glossinaspp牛腺囊螨Demodexbovis具环方头蜱BoophilusmicroplusandB.decoloratus海湾蜱Amblyommamaculatum美洲花蜱Amblyommaamericanum耳蜱Otobiusmeqnini
安氏矩头蜱Dermacentorandersoni螺杆蝇Cochliomyiahominivorax猎蝽Reduviusspp蚊虫Culisetainornata棕耳蜱Rhipicephalusappendiculatus非洲红虱Rhipicephalusevertsi斑点蜱Amblyommasp腿斑点蜱Hyalommasp猪虱Haematopinussuis穿皮潜蚤Tunqapenetrans体虱Haematopinusovillus羊虱Linoqnathuspedalis羊蜱蝇Melophaqusovinus羊痒螨Psoroptesovis丝光绿蝇Phaeniciasericata黑丽蝇Phormiaerqina副螺旋锥蝇Cochliomyiamacellaria羊丽蝇Phaeniciacuprina臭虫Cimexlectularius南方鸡蚤Echidnophaqaqallinacea波斯绿喙蜱Arqaspersicus鸡皮刺螨Dermanyssusqallinae膝疥螨Knemidokoptesmutans拔羽螨Knemidokoptesqallinae
狗蠕形螨Demodexcanis狗栉头虱Ctenocephaliscanis美洲犬蜱Dermacentorvariabilis血红扇头蜱Rhipicephalussanguineus本发明的方法用于防护经济动物和伴生动物遭受寄生虫的侵害。例如，该化合物可有效地给药于马、牛、绵羊、猪、山羊、狗、猫等，以及外来动物如骆驼、驼羊、鹿及其它通常所指的野生动物物种。该化合物也可有效地给药于家禽和其它鸟类，如火鸡、鸡、鸭等。优选地，该方法应用于经济动物，最好是牛和羊。
杀外寄生虫剂组合物本发明也涉及用于控制吸寄生动物血的外寄生虫昆虫数量的组合物。这些化合物用于防护经济动物、伴生动物以及野生动物遭受外寄生虫之侵害。这些化合物也可有效地给药于家禽和其它鸟类。
优选地，该方法用于或该组合物用于防护经济动物，最好是防护牛和羊。有效施用的量、时机和方式依据寄生虫的数量、寄生虫侵害的程度以及其它因素而在很大范围内变化。可以在寄主动物整个生命期间内周期地施用，或仅在寄生虫侵害高峰季节内施用。通常，外寄生虫的控制可通过局部施用含有约0.0005至约95%的至少一种选自化合物1-8的化合物的液体配制品而实现，优选含有高至5%，最好高至1%的至少一种选自化合物1-8的化合物。以从约5至约100mg/Kg的给药量可获得有效的寄生虫控制。
可通过常用的兽医学方法将化合物1-8施用于寄生动物。通常该化合物被配制成杀外寄生虫剂组合物，该组合物含有至少一种选自化合物1-8的化合物和生理学可容许的载体。例如，可将液体组合物简便地喷洒在所需外寄生虫控制的动物体上。这些动物也可用含有至少一种选自化合物1-8的化合物和一种织物的例如磨擦施药器这类装置而自行进行治疗，例如，在这种方式中，当动物走动时则与之相接触，从而达到治疗之目的。也可用浸药水池来将活性试剂给药于寄主动物。
口服给药可通过将化合物掺于动物饲料或饮用水中而实现，或者通过以给药剂量形式如片剂、胶囊、大丸剂或植入物。经皮给药可方便地通过皮下、腹膜内、以及静脉注射可注射的配制品而实现。
化合物1-8可以配制成口服给药的常用形式，如兽用顿服剂、片剂或胶囊。当然，这类组合物需要口服可接受的载体。这些化合物也可配成注射溶液或悬浮液，以用于皮下、膜、管腔内(intrauminal)、腹膜内、肌内或静脉注射。在某些应用中，这些化合物可方便地配成标准动物饲料的一种组合。在这种实施方案中，通常是首先将本发明化合物配成预混物，在其中该化合物分配在液体或粒状固体载体中。该预混物可含有每磅预混物约2至约250g的至少一种选自化合物1-8的化合物。该预混物然后再按常规混合方法而配成最终饲料。
因为在寄主生命期间的具体一段时间内通常会发生外寄生病，所以优选以能在所述时间期间内提供持续释放的方式将本发明化合物给药。常用方法包括使用能物理地抑制溶解的基体，该基体是一种蜡状半固体，例如植物蜡，或者是高分子聚乙二醇。该化合物的优选给药途径是用持续有效的大丸剂，例如Laby的美国专利NO.4，251，506和Simpson的英国专利NO.2，059，767中所公开的那些。对于这种大丸剂，该化合物被包胶在聚合物基体中，这种基体举例如Nevin的美国专利NO.4，273，920中的那些。本发明化合物的持续释放也可通过用植入物如含硅橡胶而获得。
为了更全面说明本发明，提供下列实施例。
实施例1化合物1(A83543L)、化合物2(A83543M)和化合物3(A83543N)的鉴定方法。
下面的高效液相色谱(HPLC)分析方法用于监测化合物1(A83543L)、化合物2(A83543M)和化合物3(A83543N)以及其它A83543组分的产物的发酵。
将全液体培养基样品用三倍体积的乙腈稀释以便从菌丝体上萃取因子。然后将所得溶液在注射到HPLC鉴定体系之前用0.45微米的PTFE过滤器过滤以去除颗粒状物质。将于甲醇中浓度为100mg/ml的纯化A83543A溶液用作鉴定的外标样，并将所用A83543组分的峰区再与该标定标样相比较以确定各个因子的浓度。HPLC体系柱载体4.6×100-mm柱，ODS-AQ，5m球形颗粒，120
孔(YMC，Inc.，Morris Plins，NJ)流动相含有0.05%乙酸铵的CH3CN/MeOH/H2O(40/40/20)流速3ml/分钟检测UV于250nm保留时间A83543A9.1分钟A83543J5.7分钟
A83543L7.3分钟A83543M2.6分钟A83543N3.3分钟实施例2A83543J、化合物1(A83543L)、化合物2(A83543M)和化合物3(A83543N)用培养基A83543.6来制备A.振荡烧瓶发酵将或者以冷冻干燥片状沉淀物或者以悬浮物而保存于液氮中的培养基SaccharopolysporaspinosaNRRL18719用于接种具有下述组成的营养介质营养介质组分含量(g)胰蛋白酶液体培养基＊30酵母膏3MgSO4·7H2O 2葡萄糖5麦芽糖4去离子水足量至1l于120℃高压灭菌30分钟。
＊Baltimore Biological Laboratories，Cockeysville，MD。
可将2.5%琼脂加到该营养介质中而制得斜面培养基或平板培养基。将该接种的斜面培养基于30℃培养10～14天。用消毒的工具将该成熟的斜面培养基刮削以疏松该芽孢并以去除和浸软该菌丝体垫。四分之一的如此获得的疏松的芽孢和培养基生长物用于接种50ml的第一级营养介质。另一方面，该第一级营养介质也可由液氮安瓿剂而被接种。
当该培养基保存在液氮时，安瓿剂可通过均化营养培养基(培养48-72小时，30℃)、用无菌悬浮剂稀释1∶1(体积∶体积)，并分散于无菌试管中(1.5ml/每管)而制得。该悬浮剂含有乳糖(100g)、甘油(200ml)、及去离子水(足量至11)。
在500ml锥瓶中可用液氮安瓿剂接种100ml营养介质(或于250ml烧瓶中50ml的介质)。该培养基于30℃在振荡器上培育48小时，该振荡器以260rpm的速度以2英吋(5.08cm)圆周旋转。
该培育的培养基(10%V/V接种物)用于接种50ml或100ml(这取决于锥瓶的容积)的具有下列组成的生产介质生产介质组分含量(g)葡萄糖80胨化牛奶＊20棉籽粉＊＊30玉米浆10CaCO3(技术等级) 5油酸甲酯 30＊＊＊自来水足量至11用1NNaOH将PH调至PH7.0，于120℃灭菌40分钟。
＊Peptonized Milk Nutrient，Sheffield Products，Norwich，NY＊＊Proflo，Traders Protein，Memphis，TN＊＊＊油酸甲酯的量是30ml。
该接种的生产介质于30℃在250ml或500ml锥瓶中在振荡器上培育7-10天，该振荡器以260rpm速度以2英吋的圆周旋转。
B.搅拌反应器发酵为提供大量的接种物，将10ml培育的第一级介质(如A部分所述而制得)用于接种具有与第一级介质相同组成的400ml第二级营养介质。将该第二级营养介质于21阔口锥瓶中在30℃于振荡器上培育48小时，该振荡器以260rpm速度以2英吋圆周旋转。
将由此制得的培育的第二级营养介质(2ml)用于接种80到115升的无菌生产介质(如A部分所述而制得)。
该接种的生产介质可在1651搅拌的生物反应器中于30℃温度发酵7至10天。在该搅拌容器中的空气流量及搅拌速度由计算机控制以保持空气饱和度中溶解氧含量为至少约60%到约80%。
实施例3A83543J、A83543L、A83543M、A83543M和A83543N用培养基A83543.7来制备。
如在实施例2中所述用培养基SaccharopolysporaspinosaNRRL18720来制备A83543J、A83543L、A83543M和A83543N。
实施例4A83543J、A83543L、A83543M和A83543N的分离。
加入5NNaOH将发酵的液体培养基(1051，如实施例2所述而制得)调至pH10(初始pH6.8)。用陶瓷过滤器将所得混合物过滤，丢弃滤液，将丙酮和水的混合物(1∶1，501)加入到该菌丝体固体中，再过滤所得混合物。将第二个丙酮和水的混合物(1∶1，501)加入到该菌丝体固体中，然后用25%硫酸将所得混合物的pH值调至pH3.0。所得混合物过滤，并将第三个丙酮和水的混合物(1∶1，501)加入到该菌丝体固体中。所得混合物过滤并将酸性滤液合并。
用庚烷(101)萃取该合并的滤液。这些相发生分离并将水液相加入到第二份的庚烷(101)中。用5NNaOH将所得混合物的pH调至pH10。用501水稀释所得的乳液。发生相分离并用第三份的庚烷(101)萃取该水溶液相。发生相分离并将第二次和第三次庚烷萃取物合并且浓缩至体积约为4升。竖直方向，该浓缩物分成三相水相、乳化相和有机相。将有机相冷冻干燥则得到15.29g的粗产物。
将该粗产物溶于甲醇(500ml)中、过滤、并于真空浓缩至干燥。将残留物溶于第二份甲醇(20ml)中，并加到LH-20SEPHADEX柱上(PharmaciaLKBBiotechnology，Inc.，PiscatawayNJ，7.5cm×46cm)，用甲醇洗脱并收集25ml的馏分。使用实施例1中所述的HPLC体系，分析该馏分以确定哪一馏分含有式2化合物。将馏分18-50合并且浓缩至干燥。
将残留物溶于甲醇、乙腈和水的混合物(5∶5∶1)中并以1ml1份在制备反相HPLC柱(Rainin DYNAMAX-60A)，C18，41.4mm×300mm，8mm颗粒，60
孔，Woburn，MA)上色谱分析。使用甲醇、乙腈和水的混合物(87.5∶87.5∶25)洗脱该色谱柱，该混和物加入最终浓度为0.1%的乙酸铵(pH7.6)。类似于实施例1中所述，用HPLC体系来分析馏分，合并类似的馏分并浓缩得到三种半纯浓缩物A、B和C。
在上段所述体系上再次色谱分析半纯浓缩物C，进行10次流程每次用200ml。将每次流程的馏分合并且浓缩则得到制品C1和C2。将制品C2作第三次色谱分析，但用水来代替0.1%乙酸铵(脱盐步骤)。含有至少99.5%HPLC纯度的A83543L的馏分合并且浓缩。将残留物由乙醇/水(1∶1)中结晶则得到2.4g的A83543L。
制品C1和半纯浓缩物B合并且如上段所述进行脱盐(12×200ml次)，但用甲醇、乙腈和水(11∶11∶3)的混合物洗脱所需化合物。将含有至少99.5%HPLC纯度的A83543J的馏分合并且浓缩。将残留物溶于热的叔丁醇中并冷冻干燥则产出4.3g的A83543J。
半纯浓缩物A如上所述进行色谱分析，所不同的是用甲醇、乙腈和水的混合物(37.5∶37.5∶25)洗脱所需化合物，加入乙酸铵至最终浓度为0.1%。将每次的(共4次)馏分合并且浓缩则产出制品A1、A2和A3。
用上述柱将制品A1色谱分析，但用甲醇、乙腈和水的混合物(2∶2∶1)洗脱该柱。将含有至少99.5%HPLC纯度的A83543M馏分合并且浓缩，残留物溶于叔丁醇中并冷冻干燥则产出136mg的A83543M。
如上段所述将制品A2进行色谱分析并处理得到71mg的A83543N。
实施例5合成A83543M(化合物2)将A83543J(105.4mg，0.15mmol)和三水乙酸钠(144.6mg，1.06mmol)加入到甲醇和pH9缓冲溶液的混合物中(Fisher scientific，Lexington，MA)。将所得悬浮液加热至约47℃，然后加入一份碘(46.6mg，0.18mmol)。约10分钟后，该溶液均化。于47℃4小时后，将该反应物加到50%硫代硫酸钠溶液中。用二氯甲烷萃取所得的无色水液混合物。将二氯甲烷萃取物合并，用盐水洗涤，通过K2CO3干燥。在真空下将二氯甲烷干燥液溶蒸发至干得57.3mg的A83543M，呈浅黄色玻璃状(54%产率)。
实施例6合成A83543N(化合物3)用类似于实施例5所述的方法，A83543L(102.5mg)可化学转变成A83543N(66.5mg)。
实施例7A83543Q(化合物4)、A83543R(化合物5)、A83543S(化合物6)和A83543T(化合物7)的鉴定方法。
下面的高效液相色谱(HPLC)分析方法用于监测A83543Q、A83543R、A83543S、A83543T和其它A83543组分的产物的发酵。
将全液体培养基样品用三倍体积的乙腈稀释以从菌丝体上萃取因子，然后将所得溶液在注入到HPLC鉴定体系之前用0.45微米聚四氟乙烯(PTEE)过滤器过滤以去除颗粒状物质。将于甲醇中浓度为100μg/ml的纯化A83543A溶液用作鉴定的外标样，并将所有A83543组分的峰区图再与该标定标样相比较以确定各个因子的浓度。
HPLC体系柱载体4.6×100-mm柱，PDS-AQ5μ球形颗粒，120
孔(YMC，Inc.，Morris Plains，NJ)流动相含有0.05%乙酸铵的CH3CN/MeOH/H2O(37.5∶37.5∶25)流速2ml/分钟检测UV于250nm保留时间A83543A14.97分钟A83543Q11.82分钟A83543R4.52分钟A83543S6.50分钟A83543T5.97分钟A83543H8.50分钟实施例8A83543Q、A83543R、A83543S和A83543T用A83543.9培养基来制备
A.振荡烧瓶发酵将或者以冷冻干燥片状沉淀物或者以悬浮物而保存于液氮中的培养基S.spinosaNRRL18823用于接种具有下述组成的营养介质营养介质组分含量(g)胰蛋白酶液体培养基＊30酵母膏3MgSO4·7H2O 2葡萄糖5去离子水足量至1l于120℃高压灭菌30分钟。
＊Baltimore Biological Laboratories，Cockeysville，MD。
将2.5%琼脂加到该营养介质中而制得斜面培养基或平板培养基。将该接种的斜面培养基于30℃培养约10至约14天。用消毒的工具将该成熟的斜面培养基刮削以疏松该芽孢子并去除和浸软该菌丝体垫。约四分之一的如此获得的疏松的芽孢和培养基生长物用于接种50ml的第一级营养介质。另一方面，该第一级营养介质也可由液氮安瓿剂而被接种。
当该培养基保存在液氮时，安瓿剂可通过均化营养培养基(培育48-72小时，30℃)、用无菌悬浮剂稀释1∶1(体积∶体积)，并分散于无菌试管中(1.5ml/每管)而制得。该悬浮剂含有乳糖(100g)、甘油(200ml)、及去离子水(足量至1l)。
液氨安瓿剂用于500ml锥瓶中接种100ml营养基(或于250ml烧瓶中50ml的介质)。该培养基在30℃至32℃于振荡器上培育48小时，该振荡器以250rpm速度以2英吋(5.08cm)圆周旋转。
该培育的培养基(5%V/V接种物)用于接种50ml或100ml(这取决于锥瓶的容积)的具有下列组成的生产介质生产介质组分含量(g)葡萄糖80胨化牛奶＊20棉籽粉＊＊30玉米浆10CaCO3(技术等级) 5油酸甲酯 30＊＊＊自来水足量至1l用1NNaOH将PH调至PH7.0，于120℃灭菌40分钟。
＊Peptonized Milk Nutrient，Sheffield Products，Norwich，NY＊＊Proflo，Traders Protein，Memphis，TN＊＊＊油酸甲酯的含量为30ml。
该接种的生产介质于30℃在250ml或500ml锥瓶中在振荡器上培育7-10天，该振荡器以250rpm速度以2英吋的圆周旋转。
B.搅拌反应器发酵为提供大量的接种物，将10ml培育的第一级介质(如实施例8A部所述而制得)用于接种具有与第一级介质相同组成的400ml第二级营养介质。将第二级营养介质于21阔口锥瓶中在30℃于振荡器上培育约48小时，该振荡器以260rpm速度以2英吋圆周旋转。将由此制得的培育的第二级营养介质(2ml)用于接种80至115升的无菌生产介质(如实施例8A部分所述而制得)。
该接种的生产介质可在165l搅拌的生物反应器中于30℃温度发酵7至10天。在该搅拌容器中的空气流量及搅拌速度由计算机控制以保持空气饱和度中溶解氧含量为或高于60%至约80%。
实施例9将A83543Q、A83543R、A83543S和A83543T从A83543.9中分离将如实施例8中所述而制得的发酵液体培养基(100l，所得物浓度(titer)为A83543H，303μg/ml，A83543Q，50μg/ml)在处理之前冷冻2天。用5N HCl将PH调至3.0后将丙酮(100l)加入到该全部液体培养基中。用陶瓷过滤器过滤所得混合物则得到滤液(170l)，将该滤液在冷冻下保持过一个周末。将该液体培养基/丙酮滤液调至PH13并再次用陶瓷过滤器过滤，然后以11/分钟的流速加到含有HP-20SS树脂的钢柱(10l)上(Mitsubishi chemical Industries，Ltd.，Japon)。用梯度混合的溶剂“A”(0.1%NH4OAc、用NH4OH调至pH8.1)和溶剂“B”(CH3CN-CH3OH 1∶1)以11/分钟的流速洗脱该柱，收集41馏分。使用泵送体系以在1分钟内产生0-50%B的梯度，随后在90分钟内产生50-100%B的梯度，随后在另外附加的15分钟内再(连续)isocratic输送100%B。HPLC分析(如实施例7中所述)表明馏分17(41)主要含有因子R与附加的较大极性物及少量的因子T和H;馏分18-22主要含有因子H与较少量的因子R和Q及少量的因子S和较大极性物;馏分23-24含有因子H和Q。对沉淀物的HPLC分析表明下列总的量因子H，23.0g;因子Q，3.4g;因子R，2.0g;因子S，0.2g;因子T，0.2g。
实施例10由Q-制备菌株中回收A83543Q、A83543R、A83543S和A83543T。
以Q-制备菌株而生产的发酵液体培养基(851，所得滴定度为A83543H，302μg/ml，A83543Q，44μg/ml)在处理之前冷冻过夜。在用5N HCl将pH调至3.0之后将丙酮(901)加入到该全部液体培养基中。用陶瓷过滤器过滤所得混合物则得到滤液(176l)，将该滤液在冷冻下保持过一周末。用50%NaOH将该液体培养基/丙酮滤液调至pH13并再次用陶瓷过滤器过滤(140l滤液)，然后以11/分钟的流速加到含有HP-20SS树脂的钢柱(10l)上(Mitsubishi chemical Industries，Ltd.，Japon)。用梯度混合的溶剂“A”(0.1%NH4OAc、用NH4OH调至pH8.1)和溶剂“B”(CH3CN-CH3OH1∶1)以11/分钟的流速洗脱该柱，收集41(大约)馏分。使用泵送体系以产生在1分钟内0～50%B的梯度，随后在90分钟内产生50～100%B的梯度，随后在另外附加的15分钟内再isocratic输送100%B。HPLC分析(见实施例7)表明色谱层物1(馏分16-21;24.51)含有因子H(12.32g)、Q(0.34g);色谱层物2(馏分22-25;161)含有因子H(4.66g)、Q(2.06g)、R、S和T。
A.纯因子Q的分离将色谱层物2浓缩至干燥，重溶于二氯甲烷(50ml)中，并加到含有用二氯甲烷饱和硅胶(EM等级62，60-200目)的玻璃柱(5.5cm×30cm)上。用二氯甲烷(31)洗涤该柱，然后用二氯甲烷-甲醇(95∶5)展开，收集250ml馏分。馏分3至15合并且浓缩成残余物，然后溶于乙醇/水(400ml)中并于室温保持过一周末。用冷乙醇/水(1∶1)洗涤所得晶体并干燥，得到6.1g含有68.7%因子H和31.2%因子Q的干燥晶体(用HPLC分析)。
将该干燥的晶体材料溶于四氢呋喃/甲醇(1∶1)中并加到制备反相HPLC柱(Rainin Dynamax-60A，8μm C18，41.4mm直径×25cm带有41.4mm×5cm保护模)进行12次流程。用梯度混合的溶剂“A”(0.33%的NH4OAc-CH3OH-CH3CN水溶液，30∶35∶35)和溶剂“B”(1%的NH4OAc-CH3CN-CH3OH水溶液，10∶45∶45)以50ml/分钟的流速来洗脱该柱。使用泵送体系以在60分钟内产生50-100%B的梯度。用调谐到250nm的可变波长UV探测器来监测该分离过程的进行。峰1对应物含有第一次洗脱的因子H(99%;61)，随后是因子Q。将由全部(12)流程的峰2对应物合并后(含有因子H，20%，因子Q，80%，81)浓缩至50ml，再次加到相同的柱上，并在相同的流动相条件下洗脱，进行5次流程。色谱层物2(21)(含有99%纯因子Q)通过将其加到相同的用H2O-CH3OH-CH3CN(20∶40∶40)饱和的柱上脱盐。该柱用H2O-CH3OH-CH3CN(10∶45∶45)洗脱，收集10次3分钟的馏分。合并馏分2-7，浓缩成残留物，并溶于热乙醇(80ml)中。加入等体积的水并将溶液冷却过夜。将所得晶体收集在过滤器上，用冷EtOHH-H2O(1∶1)洗涤，并干燥则产出1.5g纯A83543Q。
B.纯因子R的分离将由HP-20SS色谱分析得到的色谱层物1浓缩成残留物并溶于甲醇(200ml)中。将含于溶液中的因子H和Q在乙腈(31)中沉淀，然后过滤。将滤液浓缩至干，然后溶于二氯甲烷(100ml)中并加到含有用二氯甲烷中饱和硅胶(EM等级62，60-200目)的玻璃柱上(5.5cm×30cm)。用二氯甲烷(21)洗涤该柱，然后用二氯甲烷-甲醇(95∶5)展开，收集250ml馏分。含有因子S和T的馏分3至7在下面分离纯因子S和T时讨论。)将馏分9-14合并且浓缩成残留物，然后溶于CH3OH(10ml)中并加到用溶剂“A”(0.33%的NH4OAc-CH3OH-CH3CH水溶液，30∶35∶35)和溶剂“B”(0.8%的NH4OAc-CH3CN-CH3OH水溶液，25∶87.5∶87.5)饱和的制备反相HPLC柱上(Rainin Dynamax-60A，8μm C18，具有41.4mm×5cm保护膜的41.4mm直径×25cm)。使用泵送体系以在60分钟内产生0-100%B的梯度。用调谐到25nm的可变波长UV探测器来监测该分离过程的进行。含有主峰所对应的馏分通过将其加到相同的柱上并用60分钟内由H2O-CH3OH-CH3CN(30∶35∶35)至H2O-CH3OH-CH3CN(10∶45∶45)的梯度溶液洗脱而被脱盐，收集12次5分钟馏分。将馏分2至12浓缩成残留物，溶于叔丁醇中，并冷冻干燥则产出1.77g纯A83543R。
C.纯因子S和T的分离将用二氯甲烷-甲醇(95∶5)洗脱硅胶柱(见上面的“因子R的分离”一节)而得到的馏分3至7合并，浓缩成残留物，并溶于EtOH-H2O(1∶1)中且于室温保持过一周末。通过过滤而收集所得晶体，用冷EtOH-H2O(1∶1)洗涤，并干燥则产出5.4g晶体物质。将该合并的滤液和洗涤物加到用(0.5%的NH4OAc-CH3OH-CH3CN的水溶液，20∶40∶40)饱和的制备反相HPLC柱(Rainin Dynamax-60A，8μm C18，41.4mm直径×25cm带有41.4mm×5cm保护膜)上。用梯度混合的溶剂“A”(0.33%的NH4OAc-CH3OH-CH3CN水溶液，30∶35∶35)和溶剂“B”(1.0%的NH4OAc-CH3CN-CH3OH水溶液，10∶45∶45)以40ml/分钟的流速洗脱该柱。使用泵送体系以在60分钟内产生50-100%B的梯度。用调谐到250nm的可变波长UV探测器来监测该分离过程的进行;将主UV峰对应物收集为4个色谱层物。色谱层物1(5l)含有因子S;在主UV峰前面洗脱得到的色谱层物5(5l)含有因子T。将晶体(5.4g，见本段上面)溶解，加到相同柱上，用相同的规程来洗脱则产出含有因子T的色谱层物1(5l)和含有因子S的色谱层物2(2l)，随后是因子H和Q。
由两次RPHPLC预备流程中得到的含有因子S的色谱层物合并，浓缩成残留物，重溶于5ml CH3OH中，并在具有相同流动相梯度的相同柱上作色谱分离。收集两个UV吸收(250nm)峰对应物。峰2对应物含有因子H。将含有因子S的峰1对应物浓缩至50ml并加到用H2O-CH3OH-CH3CN(40∶30∶30)饱和的柱(Rainin Dynamax-60A，8μm C18，具有21.4mm×5cm保护膜的21.4mmD×25cm)上。用梯度混合的溶剂“A”(H2O-CH3OH-CH3CN，40∶30∶30)和溶剂“B”(H2O-CH3OH-CH3CN;10∶45∶45，并加入0.1%NH4OAc和1%HOAc)以10ml/分钟的流速洗脱该柱。使用泵送体系以在60分钟内产生10至30%B的梯度。收集主UV吸收峰对应物，浓缩至1/2体积，并在用H2O-CH3OH-CH3CN(40∶30∶30)饱和的相同HPLC柱上用60分钟内从H2O-CH3OH-CH3CN(40∶30∶30)至H2O-CH3OH-CH3CN(10∶45∶45)的梯度溶液洗脱而脱盐，收集2分钟馏分。合并馏分2-8并浓缩至干燥。将残留物溶于叔丁醇(5ml)中冷冻干燥则产出纯因子S(182g)。
将含有因子T的由两次RPHPLC预备流程中得到的色谱层物合并，浓缩至100ml，并加到用0.33%的NH4OAc-CH3OH-CH3CN(30∶50∶30)水溶液饱和的制备反相HPLC柱(Rainin Dynamax-60A，8μm C18，21.4mm直径×25cm，具有21.4mm直径×5cm保护膜)上。用梯度混合的溶剂“A”(0.33%的NH4OAc-CH3OH-CH3CN水溶液，30∶35∶35)和溶剂“B”(1.0%的NH4OAc-CH3OH-CH3CN水溶液，10∶45∶45)洗脱该柱。使用泵送体系以在60分钟内产生从25-75%B的梯度。一个峰对应物含有纯因子R。在相同条件下，将含有因子R和T的混合物其它峰的对应物再次色谱分析。由后一次HPLC制备流程中得到的含有纯因子T的峰对应物在用H2O-CH3OH-CH3CN(30∶35∶35)饱和的相同柱上并用H2O-CH3OH-CH3CN洗脱而被脱盐。将UV吸收峰对应物浓缩至干燥。将残留物溶于叔丁醇中并冷冻干燥则产出纯因子T(166mg)。
实施例11化合物8(N-脱甲基A83543D)的制备A.A83543A和A83543D的分离基本上依照EP00375316A1中实施例2-4所述的方法而将因子A83543A和D分离。
B.合成A83543B和N-脱甲基A83543D制备75%纯度的因子A和D的悬浮液(85∶15混合，分别独立)。毫摩尔的量是基于A83543A的分子量的。
在氮气下将于80%甲醇/水(125ml)中的A83543(5.0克，5.13mmol)和三水乙酸钠(4.68克，34.4mmol)的悬浮液加热至47℃。当加入一份固态碘(1.75g，68.0mmol)时，其pH从10降至8，并变成棕色。通过定期地加入1N NaOH而将pH值保持在8-9。将该反应加热2.75小时(在这期间颜色变浅成浅黄色)，然后将其冷至室温。将该溶液倒入水(250ml)和NH4OH(50ml)的溶液中，用乙醚萃取。用盐水洗涤该醚萃取物，用碳酸钾(K2CO3)干燥，在真空下于室温进行蒸发。
该粗产物通过在C18柱上反相HPLC提纯，用甲醇∶乙腈∶0.05%乙酸铵(45∶45∶10)洗脱则得到两种产物。较大极性的产物(2.52g)被鉴定为A83543B的真实样品(MS，1H NMR，13C NMR，IR和OR)。较小极性的产物(202149;206mg)被证明是单-N-脱甲基-83543D∶H NMR(270MHz，丙酮-d);13C NMR(270Hz，丙酮-d6);IR(CHCl3)3200-2800(br)，1720，1600，1620cm-1;MS(FD)m/z1485(二聚物+Na，60)，1464(二聚物，30)，1463(10)，733(M+，100)，731(90);UV(乙醇)λmax244nm(ε＝9400)。
实施例12制备A83543AgA(化合物17)将7.2N H2SO4(396ml)加入到A83543PsaAl(6.03g，10.7mmol)于甲醇(267ml)的溶液中，然后将该溶液加热回流3小时。然后在冰浴中将混合物冷却。小心地加入大量的NaHCO3(固态)和饱和的NaHCO3水溶液，但是，要使pH值永不超过10。该水溶液与乙醚混合并分离。然后用新鲜乙醚萃取该水液部份。合并该醚萃取物，用盐水洗涤，用K2CO3干燥，并在减压下蒸发。所得黄色半固体(4.89g)通过正相色谱法用100%二氯甲烷和梯度高至于二氯甲烷中7.5%甲醇来纯化，则产出呈无色玻璃质的A83543AgA(2.83g，66%产率)。
实施例13制备化合物9在氮气下将N-氯代琥珀酰亚胺(104.7mg，0.78mmol)的二氯甲烷(2.6ml)悬浮液冷却至-78℃。将二异丙基硫化物(0.125ml，0.86mmol)加到该悬浮液中，并在-78℃下搅拌该混合物1.5小时。然后缓慢加入A83543J(184.6mg，0.26mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液。当添加完毕后，在-78℃搅拌该溶液6.25小时。然后加入三乙胺(0.109ml，0.78mmol)，并将溶液加热至室温。该混合物呈红色。加热之后，加入乙醚(6ml)，并形成沉淀。将该沉淀物溶于二氯甲烷，将其与乙醚液合并。用0.1N HCl洗涤所得溶液，然后用盐水洗涤，用MgSO4干燥，并于室温蒸发。所得的无色玻璃质(215mg)用5%甲醇的二氯甲烷溶液以快速色谱分离进行半纯化，产出呈半固态的无色化合物9(151.2mg)。该重量回收率及NMR谱均表明产物含有二异丙基硫化物杂质，但该产物不需要进一步纯化。
实施例14制备化合物10起始原料用A83543L(99.74mg，1.36mmol)而重复实施例13的步骤则制得呈无色半固态的化合物10(850mg)。
实施例15制备A83543PsaA2(化合物13)将K2CO3(无水，1.82g，13.2mmol)加到化合物9(1.89g，2.46mmol)的甲醇(100ml)溶液中，并于室温搅拌该混合物1小时。然后加入乙醚(100ml)并过滤该混合物。于室温蒸发该滤液，产出黄色固体。将该黄色固体溶于二氯甲烷中，用水、然后用盐水洗涤，并用MgSO4干燥。在减压下将二氯甲烷蒸发，产出无色的半固体(1.53g)。该半固体用5%甲醇的二氯甲烷溶液至10%甲醇的二氯甲烷溶液(一步梯度)以快速色谱分离来纯化，则产出呈纯白色玻璃质的A83543PsaA2(1.09g，76%产率)。
实施例16制备A83543PsaD2(化合物14)用实施例13的产物(770mg，1.06mmol)作为起始原料来重复实施例15的步骤则制得呈无色玻璃质的A83543PsaD2(246mg，42%产率)。
实施例17制备A83543AgD(化合物18)将1N H2SO4滴加到A83543PsaD2(132mg，0.24mmol)的水(5ml)悬浮液中直至该混合物的pH为1.7并均化。将该混合物加热到80℃保温3.75小时，在这段时间内一种油状物从该溶液中分离出来。将该混合物冷却到室温并加入二氯甲烷以溶解油状物。将水液层分离并用新鲜二氯甲烷萃取。合并该二氯甲烷溶液，并用1N H2SO4快速洗涤，用K2CO3干燥，并于室温蒸发则产出淡黄色玻璃质(82.9mg)。该产物用5%甲醇的二氯甲烷溶液以快速色谱分离来纯化，产出呈无色玻璃质的A83543AgD(63.6mg，63%产率)。
化合物21和22可通过化合物13和14分别用甲醇钠/碘来化学脱甲基化而制得。该反应优选在极性有机溶剂如甲醇中进行。另外，该反应在约-10℃至约15℃下进行，优选在0℃至5℃之间。该反应时间可在约4小时至约6小时之间变化。
实施例18制备A83543PsaL1(化合物23)将A83543L(1.0g)的样品加到去离子水(90ml)中并加入足够量的1N H2SO4(约0.5ml)以使其溶解。于约80℃加热该溶液2小时，并将所得混合物冷却到室温。通过过滤收集沉淀，用冷去离子水洗涤，并干燥则产出420mg不纯的A83543PsaL1。合并洗涤水溶液，用NaCl饱和，并用二氯甲烷萃取。用盐水洗涤该合并的二氯甲烷萃取物，干燥(K2CO3)，并蒸发至干则产出白色玻璃质(368mg)。该残余的玻璃质与沉淀物合并且通过快速色谱(硅胶60，230-400目)纯化，用乙酸乙酯和己烷(7∶3)的混合物洗脱。将含有所述化合物的馏分合并且蒸发至干则产出呈无色玻璃质的382.8mgA83543PsaL1。
MS(FD)m/z590，591(M+)，592(M+H)IR(CHCl3)2937，1715，1659cm-1UV(乙醇)Imax242nm(e＝10，048)实施例19本发明的化合物用作制备杀虫剂的中间物。例如，当在存有所要求保护的化合物培养合适的微生物时，所要求保护的化合物则可生物学转变成杀虫活性的A83543因子，正如下述实施例19所表明的。
本实施例表明了通过在存有A83543AgA下培养NRRL18538而制备A83543A的过程。将或者以冷冻干燥片状沉淀物或者以悬浮物而保存于液氮中的培养基SaccharopolysporaspinosaNRRL18538用于接种具有下述组成的营养介质组分含量(g)酶水解的酪蛋白30酵母膏3MgSO4·7H2O 2
葡萄糖10去离子水足量至1l用NaOH将pH调至6.5。
将2.5%琼脂加到该营养介质中而制得斜面培养基或平板培养基。将该接种的斜面培养基于30℃培养10-14天。用消毒的工具将该成熟的斜面培养基刮削以疏松该芽孢并以去除和浸软该菌丝体垫。约四分之一的如此获得的疏松的芽孢和培养基生长物用于接种50ml的第一级营养介质。另一方面，该第一级营养介质也可由液氮安瓿剂而被接种。
当该培养基保存在液氮中时，安瓿剂可用等体积的营养介质(48-72小时培育，30℃)和悬浮介质而制得。该悬浮介质含有乳糖(100g)、甘油(200ml)及去离子水(足量至1l)。
液氨安瓿剂于500ml锥瓶中接种100ml营养介质(或50ml于250ml烧瓶中的介质)。该培养基于30℃在振荡器上培育48小时，该振荡器以250rpm速度以2英吋(5.08cm)圆周旋转。该培育的培养基(5%V/V接种物)用于接种100ml的具有下列组成的生产介质组分含量(g)葡萄糖80胨化牛奶20棉籽粉30玉米浆10CaCO35油酸甲酯30
自来水足量至1l用NaOH将pH调至7.2。
A83543AgA转变成A83543A可通过将A83543AgA(4.88mg，0.195mg/ml)加入到在上述生产介质(于250ml烧瓶中的25ml)中培育65小时的NRRL18538的培养基，并再培育该培养基额外的31小时而实现。将乙腈(3.0ml)加到等分(1.0ml)的培养基中。将该样品混合并离心分离，以及将等分样品注射到HPLC分析柱上以分离A83543培养基的各种因子。对发酵的液体培养基分析表明含有2.44mg(0.098mg/ml)的A83543A。
权利要求
1.一种通式Ⅰ的化合物
式中R7、R8、R9和R10分别独立地如下所述
2.一种制备A83543J、A83543L、A83543M和A83543N的方法，该方法包括在浸没需氧发酵条件下于合适的培养介质中培养S.spinosa菌株NRRL18395的A83543J-制备菌株突变体，直至产生可回收量的该化合物。
3.权利要求2的方法，它还包括分离A83543J的步骤。
4.权利要求9的方法，它还包括分离A83543L的步骤。
5.权利要求9的方法，它还包括分离A83543M的步骤。
6.权利要求9的方法，它还包括分离A83543N的步骤。
7.权利要求8的方法，其中S.spinosa的A83543J-制备菌株是NRRL18719，或其A83543J-制备菌株突变体。
8.权利要求8的方法，其中Saccharopolyspora spinosa的A83543J-制备菌株是NRRL19720，或其A83543J-制备菌株突变体。
9.一种制备A83543Q、A83543R、A83543S的A83543T的方法，该方法包括在浸没需氧发酵条件下于合适的培养介质中培养S.spinosa菌株NRRL18395的A83543Q-制备菌株突变体，直至产生可回收量的该化合物。
10.权利要求9的方法，它还包括分离A83543Q的步骤。
11.权利要求9的方法，它还包括分离A83543R的步骤。
12.权利要求9的方法，它还包括分离A83543S的步骤。
13.权利要求9的方法，它还包括分离A83543T的步骤。
14.权利要求9的方法，其中Saccharopolyspora spinosa的A83543Q-制备菌株是NRRL18723，或其A83543Q-制备株突变体。
15.一种制备N-脱甲基A83543D的方法，该方法包括A83543D在存有惰性溶剂和弱碱下与碘反应的步骤，所述弱碱选自乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠。
16.一种杀虫剂或杀螨剂组合物，它包括植物可容许的载体与使昆虫失活有效量的至少一种选自A83543L、A83543M、A83543N、A83543Q、A83543S、A83543T和N-脱甲基A83543D的化合物。
17.一种杀虫或杀螨的方法，该方法包括将使混合或螨失活有效量的至少一种选自A83543L、A83543M、A83543N、A83543Q、A83543R、A83543S、A83543T和N-脱甲基A83543D的化合物施用于昆虫和螨所活动的场所。
18.一种杀外寄生虫剂的组合物，它包括生理上可容许的惰性载体与至少一种选自A83543L、、A83543M、A83543N、A83543Q、A83543R、A83543S、A83543T和N-脱甲基A83543D的化合物。
19.一种控制吸取寄主动物血的外寄生昆虫数量的方法，该方法包括给药于寄主动物至少一种选自A83543L、A83543M、A83543N、A83543Q、A83543R、A83543S、A83543T和N-脱甲基A83543D的化合物。
20.一种Saccharopolyspora spinosa NRRL18719的，或其A83543J-制备菌株突变体的生物纯培养基。
21.一种Saccharopolyspora spinosa NRRL18720的，或其A83543J-制备菌株突变体的生物纯培养基。
22.一种Saccharopolyspora spinosa NRRL18823的，或其A83543Q-制备菌株突变体的生物纯培养基。
全文摘要
用于控制昆虫和螨的新的A83543组分及其盐、和其N-脱甲基衍生物。提供了通过Saccharopoly- spora spinosaNRRL18720、NRRL18723的培养基而制备新A83543组分的方法。也提供了含有新A83543组分的杀虫剂和杀外寄生虫剂组合物。Aarc的假糖苷配基用于A83435组分的制备。
文档编号C12N1/20GK1073483SQ92114318
公开日1993年6月23日 申请日期1992年11月7日 优先权日1991年11月8日
发明者L·克雷默, H·A·克斯特, J·S·迈恩德斯, M·C·布鲁顿, M·L·B·胡伯, J·W·马丁, J·R·特纳 申请人:道伊兰科公司