专利名称：丙烯酸铵的生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及制备丙烯酸铵和其它丙烯酸系单体的水溶液的方法。
有一个主要的工业需要，即生产含水的丙烯酸，或其水溶性盐如丙烯酸铵或丙烯酸钠，例如用作可聚合的单体。该水溶液应该尽可能地不含这类杂质，它们或者从环境的角度考虑是不希望的或者因为它们可能会干扰后续的聚合。
工业上制备丙烯酸的一种常用方法包括将丙烯腈水解而生成丙烯酰胺，然后将丙烯酰胺水解而生成丙烯酸铵或丙烯酸。虽然最为工业化的这类方法依赖于化学水解，但已知每步可用酶解法(即用腈水合酶将腈转化成酰胺，再用酰胺酶将酰胺转化成酸盐)。通过该方法生产丙烯酸不经济，例如因为它需要大量设备进行两步操作。通常还需要彻底的纯化步骤。例如，重要的是将丙烯腈杂质的量消除至很低含量，这就需要彻底的蒸馏。
制备丙烯酸的另一个常用方法是通过氧化丙烯的水合作用。这就避免进行纯化操作以消除任何丙烯腈污染，但该方法的缺点是必须在复杂的、通常是耐压的装置中实施。
文献中有一些提议应用腈水解酶将含水的丙烯腈转化成含水的丙烯酸铵。一般公认直接转化法对芳族腈比对脂族腈更有效，例如Stevenson等，Biotech.and Appl.Biochem.15，283-302(1992)。
在EP-A-444640的一个实施例中，应用腈水解酶催化剂对浓度低于200mM的丙烯腈几乎实现定量转化而成丙烯酸，它伴随一些丙烯酰胺杂质。
在JP-B-632596中，2％丙烯腈溶液被用于一个实施例中，而在另一个实施例中25％丙烯腈溶液被水解成32.9％丙烯酸铵溶液。在又一个实施例中，15％(甲基)丙烯腈溶液被用于生产23％(甲基)丙烯酸铵溶液。
在Biotech and Appl Biochem 11，581～601(1989)中，叙述了该文所述的特定酶对丙烯腈的Km为17mM。未给出操作条件，但该值必定指示产物中会存在相当量的丙烯腈。该文献指示，生成了4-6％的丙烯酰胺。该文献还指示，文中所述的酶对苄腈的活性远高于对丙烯腈。
在J Bacteriol 1990.9，pp 4807-4815中分析了紫红红球菌K22的性能，它还叙述了该酶对丙烯腈的Km为1.14mM。该值也指示，终产物中必然存在大量的丙烯腈。未给出有关可得到的丙烯酸铵浓度的信息，但该文献确实指出在55℃以上酶活性迅速失去。
在Appl Microbiol Biotech 1990，34，pp322-324中描述了将丙烯腈转化成丙烯酸的补料分批法。必须将丙烯腈保持在低于200mM(1.06％)的浓度，据说24小时后产物含38％丙烯酸。先用溶剂萃取产物，接着蒸发和蒸馏。
这些酶促转化法为两步酶促转化(即丙烯腈至丙烯酰胺然后从丙烯酰胺至丙烯酸铵)和化学转化法提供有用的替代方法，但都需要彻底纯化步骤以减小丙烯腈含量。
按本发明，我们通过如下方法制备含至少30wt％(甲基)丙烯酸或其盐和低于0.2％(甲基)丙烯腈的水溶液，该方法包括提供水和(甲基)丙烯腈，其用量足以使水解时生成浓度至少是30wt％的(甲基)丙烯酸或其盐，且在操作期间提供酶与(甲基)丙烯腈接触用以将(甲基)丙烯腈转化成(甲基)丙烯酸铵，该酶对(甲基)丙烯腈的Km低于500μM以及对(甲基)丙烯酸铵的Ki高于100,000μM，使之发生(甲基)丙烯腈的水解而得一反应液，该反应液中含浓度低于0.2％的(甲基)丙烯腈和浓度高于30％的(甲基)丙烯酸铵，再回收含浓度高于30％的(甲基)丙烯酸铵和低于0.2％的丙烯腈的溶液。
因此在本发明中，即使反应液中存在的(甲基)丙烯酸铵或其它(甲基)丙烯酸盐的量会很高，我们也能应用一种酶将(甲基)丙烯腈清除至极低浓度而生产(甲基)丙烯酸铵。结果我们首次获得只含很少量(甲基)丙烯腈的高浓度的(甲基)丙烯酸铵或其它(甲基)丙烯酸单体。尤其是通过应用具有很低Km值的酶我们能实现终产物中很低(甲基)丙烯腈含量并且通过应用也具有高Ki值的酶我们能实现在高浓度(甲基)丙烯酸铵存在下该低浓度的(甲基)丙烯腈。
很意外地，我们能提供这种方法，它能生产高浓度的(甲基)丙烯酸铵或其它(甲基)丙烯酸盐而(甲基)丙烯腈的浓度很低。尤其意外的是我们能应用如优选的那样稀浓度的丙烯腈达到这个目的。应用本发明甚至有可能在一步法中得到良好的产率和纯度的所需产物，于是不需纯化来除去(甲基)丙烯腈。特别意外的是能在这种方法中实现上述情况，该方法在起始原料浓度终产物浓度为＜0.2∶＞30的比率下实施。
在本发明中我们提供(甲基)丙烯腈和水，通过水解反应生成(甲基)丙烯酸或其盐。可以应用化学法来进行水解的大部分以生产含(甲基)丙烯酸(或其盐)和未反应的(甲基)丙烯腈的水溶液。然后提供规定的酶与(甲基)丙烯腈接触而使未反应的(甲基)丙烯腈进一步发生水解直至反应液中(甲基)丙烯腈的浓度低于0.2％而(甲基)丙烯酸铵的浓度高于30％。
(甲基)丙烯腈的量通常低于0.1％，且可以低到常规分析方法检测不出的程度。
本发明的方法可在一个反应器中分两步进行。也可在一个反应器中进行化学步骤，再将所得含溶解的(甲基)丙烯酸或盐和残余(甲基)丙烯腈的溶液转至生物反应器，在生物反应器中残余的(甲基)丙烯酰胺与规定的酶接触而减少。
然而优选地基本上所有(甲基)丙烯腈的水解都被规定的酶催化。此时生成的溶液含至少30wt％(甲基)丙烯酸铵。因此优选地，我们在反应器中装入丙烯腈、酶和水，然后回收最终的溶液。
我们发现，完全通过本发明的酶促方法生产的丙烯酸铵单体(生物-丙烯酸铵)显示极好的性能，它们相当于或优于由备择的化学法生产的单体如得自氧化丙烯的丙烯酸的性能。应用由本发明的方法制备的单体而生产的聚合物也显示优良的性能。按本发明的方法制备的生物-丙烯酸铵可被转化成其它化学形式，例如丙烯酸或其钠盐或其它碱金属盐或其它相关的丙烯酸系单体，并用作起始单体供生产丙烯酸系聚合物。也可将它作为丙烯酸铵应用而不需转化。它可被用于生成均聚物或者与其它单体结合而生产共聚物。
在本说明书中，本发明将在本文讨论生产(甲基)丙烯酸铵的优选的酶促方法，但应懂得所讨论的原理适于这类方法，其中生产其它的(甲基)丙烯酸盐或(甲基)丙烯酸，以及其中第一步是通过(甲基)丙烯腈的化学水解。
本发明的方法可作为一步法操作。在这种方法中，在反应器中装入水和(甲基)丙烯腈，其用量足以使水解时生成浓度至少为30wt％的(甲基)丙烯酸铵，并在反应器中装入规定的酶。然后使它发生水解直至反应器中的溶液含浓度低于0.2％(且往往低于0.1％)的(甲基)丙烯腈和浓度高于30％的(甲基)丙烯酸铵。然后从反应器中排出该溶液。
这种方法可作为连续法操作。在这种方法中，向连续反应器加入(甲基)丙烯腈，使反应器中(甲基)丙烯腈的浓度低于0.2％，往往低于0.1％，优选低于0.05％(分别为2、1和0.5g/l)。将反应器中(甲基)丙烯酸铵的浓度保持在30％或更大。因此可以连续地从反应器排出物料使得到的产物含至少30％(甲基)丙烯酸铵和低于0.2％(甲基)丙烯腈。通常，排出混合物的速度与反应物进料速度一样，以便维持反应器中固定的工作容积。
水既是一种反应物也是(甲基)丙烯腈和(甲基)丙烯酸铵的溶剂。反应器中可在开始反应时包括所需的全部量的水。不过更常用的方法是在反应期间给反应器加入水。它可与(甲基)丙烯腈呈(甲基)丙烯腈水溶液形式进料。室温时(甲基)丙烯腈在水中的溶解极限是约7％wt/wt，且该(甲基)丙烯腈溶液通常是饱和的。如果以溶液的形式加入(甲基)丙烯腈，则通常希望除了该溶液之外还加入纯净的(甲基)丙烯腈。纯净的(甲基)丙烯腈可呈液体形式或作为(甲基)丙烯腈蒸汽加入。可以完全与纯净的(甲基)丙烯腈分开而给反应器加入水。
各种反应器都适合于本方法。它们包括连续搅拌釜反应器、抽注(draw-fill)和环型反应器以及活塞流反应器。合适的体系包括系列填充床反应器，各反应器中都加入(甲基)丙烯腈和水。使反应液流过第一个填充床反应器而到第二个然后到第三个等等。从最后一个填充床反应器排出含至少30wt％(甲基)丙烯酸铵和低于0.2wt％(甲基)丙烯腈的反应液。也可应用流化床反应器，特别是代替填充床反应器。
这种一步法也可以是补料分批法。在这种方法中，给反应器加入(甲基)丙烯腈而使它反应以生产(甲基)丙烯酸铵。可这样做，即保持(甲基)丙烯腈的浓度在上浓度限和下浓度限之间。可以在反应器中连续加入(甲基)丙烯腈而将浓度保持在该范围内。也可进料至一定程度使(甲基)丙烯腈的浓度达该范围的上限。然后暂停加料直至(甲基)丙烯腈的浓度降至该范围的下限，此时又开始加料以再次提高(甲基)丙烯腈的浓度。继续操作该方法直至(甲基)丙烯酸铵的浓度达预定值，即至少30wt％。
在整个反应期间，补料分批反应器中(甲基)丙烯腈的浓度可保持在低于0.2％，使选定范围的上限和下限都低于该值。也可在反应期间使浓度升到高于该值或者基本整个反应期间可高于该值。上限一般是1wt％或2wt％或更小，通常是0.5wt％或更小，优选是0.2％或更小。然而，关键是在补料分批反应末使(甲基)丙烯腈的浓度减小至低于0.2％，优选低于0.1％或0.05％。
当(甲基)丙烯腈的浓度低于0.2％而(甲基)丙烯酸铵的浓度高于30％时，从反应器排出该溶液。然后可开始新的补料分批操作。
可在开始反应前或在反应期间加入水，方法与前述连续法一样。
补料分批反应的合适反应器包括与适用作连续反应器相同的类型，以及补料分批搅拌釜反应器。
按本发明，连续法和补料分批法是优选的。然而，本发明还包括应用作为一步法的间歇法。在间歇法中，给反应器装入足够的(甲基)丙烯腈以便反应时生成适当高浓度的(甲基)丙烯酸铵，再放置使它在酶的存在下反应。继续反应直至(甲基)丙烯腈减小到预定的含量，它一般低于0.2％且通常低于0.05％。
间歇反应合适的反应器包括间歇搅拌釜反应器。
另一方面，本发明的方法可作为两步酶解法操作。在这种方法中，在操作初始步骤期间，(甲基)丙烯腈发生的水解至这种程度，即(甲基)丙烯酸铵的重量百分比小于30％或很低，或者残余(甲基)丙烯腈的重量百分比大于0.2％或大于其它所需的最终浓度，或二者兼顾。一般地，(甲基)丙烯酸铵的存在量至少为30wt％，但残余(甲基)丙烯酰胺的量大于0.2wt％。该初始步骤是在第一个反应器中进行的。
然后将第一个反应器的反应液转至一个或多个后续反应器中。在后续的一个或多个反应器中，通过规定的其它酶进一步催化另外的水解以至生成的水溶液含至少30wt％(甲基)丙烯酸铵和不多于0.2wt％的(甲基)丙烯腈。这类后续的步骤通常被称为“精制”步骤。
包括一个初始步骤和一个或多个进一步的步骤的方法可作为连续法、补料分批法或间歇法操作。也就是说，初始步骤可作为连续法、补料分批法或间歇法以上述任意方式操作。然后使所得溶液通过进一步的精制步骤。在精制步骤中通过规定的酶催化另外的水解以至终产物具有所要求含量的(甲基)丙烯酸铵和(甲基)丙烯腈。然后从最后的反应器中排出产物。
在一个优选的两步法中，在连续的或其它反应器中酶促水解反应混合物，生成的产物含至少30wt％(甲基)丙烯酸铵，以及约0.5wt％至饱和量(可以是约4wt％-约7wt％)的(甲基)丙烯腈。使该产物通过进一步的步骤而精制，其中丙烯腈浓度通过酶解而被减小到低于0.2％且通常低于0.1％，而(甲基)丙烯酸铵的浓度被增大了。
进一步的步骤可包括至少两个反应器如槽式反应器。第一个反应器填充得自初始步骤的反应液。当填充第一个反应器时，存在于反应器中的规定的酶使(甲基)丙烯腈水解。当填充该第一个反应器后，从该反应器排出(甲基)丙烯腈含量低于0.2wt％、且通常低于可检测值的终产物。此时开始填充第二个(通常是完全相同的)反应器。以同样的方式填充，当填满时从第二个反应器泵抽出反应混合物，再一次开始填充第一个反应器。这样各个反应器以交替的补料分批方式工作。
备择的精制步骤可包括含规定酶的一个填充床反应器或一组填充床反应器。
又一个两步法包括作为第一步的一个填充床反应器。将水和(甲基)丙烯腈送入循环系统，它们在系统中的在线混合器内混合后被送至填充床反应器。从该填充床反应器出来的产物含至少30wt％(甲基)丙烯酸铵和通常为0.5wt％～饱和量的(甲基)丙烯腈。将部分该产物送至精制步骤而另一部分则再循环入连续的初始步骤中。
另一个两步法包括通过第一步生产含高达30wt％(甲基)丙烯酸铵和至少1wt％(甲基)丙烯腈的溶液。将该溶液送至蒸馏步骤以浓缩该溶液而得浓度为35～40wt％的(甲基)丙烯酸铵。然后将该产物送至本发明的酶促精制步骤，使(甲基)丙烯腈的量被减小到低于0.2wt％。
上述任何初始步骤都可与精制步骤一起应用，这些初始步骤不能在一步中生产具有规定性能的终产物。
在两步法中，得自第一步的溶液中(甲基)丙烯腈的量通常是0.5～7wt％，例如至少1wt％且可能高达约3wt％或4wt％。
在这些两步法中，本发明的一个特别意外的特点在于，有可能在初始步骤和精制步骤中应用相同种类的酶。所以该酶不同寻常，因为如前所述，它能在很高含量的产物存在下清除很低含量的(甲基)丙烯腈(在精制步骤中)。然而，大多数腈水解酶在较高含量的(甲基)丙烯腈存在下易被灭活，例如含量高于0.5wt％或1wt％时，尤其当含量高达大约饱和时。用于本发明的酶能在初始步骤的较高(甲基)丙烯腈环境中和在精制步骤的很低(甲基)丙烯腈环境中催化转化作用。
在含120～175mM丙烯腈和2,475～2,525mM丙烯酸铵的水溶液中测得用于本发明方法中的特别优选的酶半寿期至少为5天。优选地该半寿期至少为7天，更优选至少为7.5天。试验期间丙烯腈和丙烯酸铵的准确含量可以变化但总是保持在特定的浓度限度内。丙烯腈将被腈水解酶转化成丙烯酸铵，所以丙烯腈的浓度将逐渐减小。当该浓度达125mM的下限时，另加入丙烯腈而将浓度提到175mM的上限。同样允许丙烯酸铵的量在规定值范围内变化，调节丙烯酸铵浓度以防浓度高于规定的最大值200,525mM。
在本发明的所有方法中，(甲基)丙烯腈的最终浓度低于0.2％，通常低于0.15％或0.1％，优选低于0.05％。优选地低于0.03％，更优选低于0.02％或0.01％，还可能低到基本上检测不到。
(甲基)丙烯酸铵的最终浓度至少是30wt％，通常至少为35wt％，优选至少为40wt％或45wt％。(甲基)丙烯酸铵的最大浓度通常是48～50wt％，因为高于这些值时(甲基)丙烯酸铵将会从溶液中沉淀析出。
该酶可呈任何合适的形式包括于本方法中。它可呈纯形式应用，在用作催化剂之前已从培养的微生物提取出来。应用的提取方法应保证该酶的活性和稳定性不会损失。
它也可呈半纯化的形式应用，例如作为液体培养物或细菌细胞部分如完整的细胞或破碎的细胞。它可呈粗制的、不纯的酶溶液应用。它可被支持或固定于载体上，例如交联的聚合物基质如交联的聚乙烯醇或交联的聚丙烯酰胺。它可呈具有表面结合酶的未溶胀粒子形式应用。优选地它呈完整的细菌细胞形式或支持于交联聚合物基质中的形式应用。
我们发现至于补料分批型反应，应用作为游离细胞的呈纯形式或呈半纯形式的酶特别有益。应用该形式无需将细胞固定于载体上，但我们发现这不会导致贮存时或在反应混合物中稳定性降低至过度的程度。
至于连续法，我们优选应用呈固定化形式的酶，因为这样在应用时会使酶在反应器中具有更长期的稳定性。特别是我们发现，在某些情况下呈固定化形式的酶在反应混合物中与它贮存时一样稳定。从终产物分离催化剂也通常更容易。
当酶被固定化时，特别是呈聚合物珠粒的形式时，我们发现生产更大尺寸的聚合物珠粒可改善聚合期间酶的稳定性。尤其是尺寸大于850μm、优选地大于1mm的珠粒是优选的。
聚合物基质可以任何方法生产，例如通过珠状聚合或悬浮聚合。在单体混合物中加入增粘剂也很有用。
我们发现在生产期间于低细胞载荷(即基于聚合物基质的干细胞重量百分数)、特别是低于5％、优选地低于1％、例如约0.5wt％时酶的稳定性最大。不过还可通过应用低聚合温度实现酶的稳定性，例如低于30或20℃，通常低于15℃。这可与更高的细胞载荷结合应用，例如至少4wt％，优选至少5wt％，如约6.5wt％或6.8wt％。
在优选的方法中，酶被包括于反应混合物中以便在反应器中提供需要的活性。通常，加入反应器的催化剂形式具有的活性为每克50～100,000个腈水解酶单位，一般是每克500～5000个腈水解酶单位，此处一个腈水解酶单位定义为在30℃、pH7和50mM丙烯腈于50mM磷酸盐缓冲液中时以1μmol/min的速率将丙烯腈转化为丙烯酸铵。催化剂可呈细菌细胞的形式，或者更通常地呈固定于聚合物凝胶基质中。具有规定活性的催化剂包括于反应器中的量为反应混合物的1～50wt％。
具体说来，优选的是加入反应混合物的酶活性为每升反应混合物3000～50,000个腈水解酶单位。
在本发明的两步法中，我们发现希望在精制步骤中比在初始步骤中包括更大量的酶催化剂。
在优选的方法中，通常在反应开始时将所需酶的全部量装入相关的反应器，即在添加(甲基)丙烯腈反应物或反应溶液之前装入。不过，也可以通过在反应期间连续地或定期地将附加的酶加入相关的反应器而操作该优选的方法。
该反应在水溶液中进行。通常地，水溶液中的组分只有水、酶(包括细菌细胞、聚合物基质等)、(甲基)丙烯腈和(甲基)丙烯酸铵。
该反应可进行任意合适的时间。连续反应可进行长达10小时，一般至少20或30小时，经常50或60小时或更长。连续反应的持续时间一般倾向于至少部分依赖于反应液中酶的稳定性。高度稳定的酶使连续反应进行相当长的一段时间而不必在反应混合物中另加新鲜的酶。
补料分批法和间歇法一般历时1～24小时，例如约5小时。这类反应持续的时间依赖于酶的活性，以及它将(甲基)丙烯腈转化成(甲基)丙烯酸铵的速度。对丙烯酸铵的Ki值高的酶即使在产物浓度达35％甚或40％时也能使丙烯腈迅速转化，这不同于在Appl.Microbiol.Biotech.1990，34，pp.322-324中描述的腈水解酶，该文献报道了显著的产物抑制作用见于低到25～30％丙烯酸铵时更低的转化速度。
本发明的方法一般在5～70℃温度下操作，优选为20～60℃。我们发现，通过应用低反应温度能减少酶活性的损失而不会显著减小(甲基)丙烯酸铵的产率。例如低于30℃、尤其低于20℃的温度是优选的。反应温度可低于15℃，甚至低到10℃。
pH条件通常是3～9.5，优选为5～9，更优选为6～8。
反应器中存在的很低浓度的(甲基)丙烯腈需要小心控制反应物浓度，尤其是对补料分批法，特别是对连续法。
(甲基)丙烯腈浓度的测定和控制可用任意常规的方法(例如光谱法或色谱法)在液相进行，但特别方便而快速的方法是检测与反应混合物平衡的液上气体中的(甲基)丙烯腈。这可应用UV分析法进行检测。
如果反应器液面上没有空间，则可对与反应混合物保持平衡的任意气体进行分析，例出通过排放。
另一种合适的监控技术是导电率的应用。例如通过取样或通过排放取出反应混合物的部分。我们已发现导电率和(甲基)丙烯酸铵的浓度之间的关系很灵敏且在低浓度的(甲基)丙烯酸铵时基本上呈线性，例如在低于约20wt％时。因为本发明的方法倾向于在高于该浓度的浓度下进行，所以将反应液样品稀释使(甲基)丙烯酸铵的浓度处于该灵敏线性区内。
然后应用导电率很精确地测定(甲基)丙烯酸铵的含量。再应用物料衡算确定(甲基)丙烯腈的百分含量。
我们还发现在高浓度如30wt％的(甲基)丙烯酸铵时，存在的(甲基)丙烯腈对导电率有可观测到的效果。还可应用该效果估测反应混合物中(甲基)丙烯腈的含量。
在本发明的方法中，尤其在连续法和通常在补料分批法中，很希望维持低的(甲基)丙烯腈浓度。一般地，重要的是将很高浓度的(甲基)丙烯腈局部区减至最小，例如将(甲基)丙烯腈进料入反应器处的局部区。通常在低(甲基)丙烯腈浓度时催化剂寿命最长。如果平均浓度很低，则可耐受与高于0.2％甚或1％或2％浓度的(甲基)丙烯腈短暂接触。同样，如果平均浓度低且浓度变化只持续很短的时间，则可耐受浓度随时间的暂时变化。
通过适当选择添加装置和通过保证维持反应器中适度的搅拌可以减少局部高浓度的(甲基)丙烯腈的发生率。
应用程序控制装置如计算机控制的装置可进行补料分批反应的控制。给这种控制装置编程序以便在预定速度下进料呈液体或气体形式的(甲基)丙烯腈。
补料分批反应和连续反应，尤其是在连续搅拌釜反应器中进行的反应，可应用反馈系统控制。反应混合物的分析例如可在液面上空间进行或以上述任何其它方法进行，并应用所得测定结果来控制呈液体或气体的(甲基)丙烯腈进料入反应器。
可应用通过反应器的循环气体或不溶混的液体进行控制。该气体例如可以是(甲基)丙烯腈蒸汽或与其它气体混合的(甲基)丙烯腈蒸汽。不溶混的液体可以是不与反应混合物溶混的任意液体。另外，(甲基)丙烯腈可溶于该不溶混的液体或与它混合。该气体或不溶混的液体鼓泡通过反应混合物，将(甲基)丙烯腈传入该混合物。气体或不溶混的液体的泡通常向上流经反应混合物，因为通常选择的气体或不溶混的液体比反应混合物的密度小。于是可将它抽出并进行分析。可应用该分析的结果来控制气体或不溶混的液体向反应混合物中的进料。该气体或不溶混的液体还可将水带入反应混合物。这种系统尤其可用于连续反应，特别是连续搅拌釜反应器中，以及补料分批反应。
反应混合物本身可被循环，通过环路抽出再回到反应混合物。该环路可与(甲基)丙烯腈源、且通常是水源连接。可在环路内进行在线分析或对液面上空间分析以便控制加入环路的反应物。如果是连续反应，则可配备一个排放孔，通过它可从环路排出反应混合物。
在所有情况下可给反应器提供一个搅拌器，不过并不是总需要搅拌器。
至于连续反应，可应用抽取反应混合物的任意合适的方法。合适的方法包括上述排放孔和溢出口，反应混合物能经它而溢出反应器。
该酶对(甲基)丙烯腈的Km必须小于500μM，不管被转化的是丙烯腈还是(甲基)丙烯腈，而且对丙烯酸铵或(甲基)丙烯酸铵的Ki大于100,000μM，不管生产的是哪一种。在本说明书中，是在该酶服从Michaelis-Menten动力学的条件下、特别是在pH7时测定Km和Ki的。一个优选的测定方法应用于pH7和30℃的50mM磷酸钠缓冲液中呈完整细胞形式的酶并应用浓度为0.01～0.5mM的丙烯腈(对Km)以及应用1.2M丙烯酸铵和0.079～0.554mM丙烯腈(对Ki)。
优选地Km低于300μM，更优选地低于100μM，最优选地低于60μM。我们进行初始试验的优选酶呈完整细胞形式时的Km为30.6μM，而且我们预测，应用标准方法和选择程序时，例如Silman等(1989)在J.Gen.Microbiol.，1353153-3164中所述对酰胺酶的那些方法和Wagner(1990)在Tibtech.，8263-270中所述对乳酸脱氢酶的那些方法，将产生Km值低到9.4且甚至3.8μM的酶。
Ki优选至少为150,000或200,000μM，更优选至少为250,000μM。我们进行初始试验的优选的酶具有的Ki据我们估测为309,000μM。预计应用标准方法和选择程序例如上述对Km的那些方法，将产生Ki高达300,000μM甚或800,000μM或更高的酶。
Ki/Km的比值一般至少为200，优选至少为300，更优选至少为500，尤其至少为1,000。用于本发明方法中的酶的Ki/Km比值至少为5,000，甚至9,000或更大，而我们进行初始试验的酶所具有的该比值大于10,000。
用于本发明方法中特别优选的酶是我们分离的一种新微生物。它是紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)的一个菌株，并于1995.8.8保藏在NCIMB，登记号为NCIMB 40757。另一种优选的酶是我们于1996.12.11保藏在NCIMB的紫红红球菌的一个菌株，登记号为NCIMB40833。因此，本发明优选的一个方面是这种方法其中的酶得自一种微生物，该微生物具有紫红红球菌NCIMB 40757或NCIMB 40833或者这二者任一的突变体或变种的特征。
这些微生物以及它们生产的腈水解酶，描述于我们今天提出的共同未决国际申请号…(参考60/3574/03)，要求英国专利申请No.9525372.0的优先权。
实施例1以培养物收集号NCIMB 40757保藏在the National Collection ofIndustrial and Marine Bacteria的紫红红球菌菌株的原始分离物(含腈水解酶或可从其中诱导出腈水解酶)被转入含下表所示液体培养基的锥形瓶。
搅拌下将该锥形瓶保温24小时。然后从母液分离细胞，重悬浮于50mM pH7磷酸钠缓冲液，再从该缓冲液分离。将一部分细胞在-20℃下冷冻贮存，余下的则重悬浮于含50mM丙烯腈的50mM pH7磷酸钠缓冲液。测得这些细胞的腈水解酶比活性为1060μmol/min/g细胞干重。
再将细胞悬浮于30℃的纯水中。定期往该细胞悬浮液中加入丙烯腈而将丙烯腈浓度提高到190mM。在每次加入前取样以测定细胞悬浮液中的丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸铵浓度。下表示出腈水解酶比活性的初始值、最大值和最终值，最终丙烯酸铵浓度和达到那个浓度的时间。
通过离心和过滤从丙烯酸铵溶液除去细胞物质，测得丙烯腈、丙烯酰胺和丙烯酸铵的浓度示于下表。
用同样方法进行的另一个反应给出丙烯酰胺浓度为0.15wt％，丙烯酸铵浓度为46wt％，丙烯腈浓度低于可检测极限。实施例2应用如实施例1中所述的酶进行本发明的连续法。将该酶包封于聚合物珠粒中以提供固定化细胞。将这些固定化细胞的珠粒转至反应器并悬浮于20℃时33wt％丙烯酸铵和3.6wt％丙烯腈的溶液。通过固定化催化剂的作用使反应器中丙烯酸铵的浓度提高至35wt％。然后自动分别将丙烯腈和水进料入反应器以保持丙烯酸铵的浓度在33～35wt％之间以及丙烯腈的浓度在2.4-3.6wt％之间操作期间，连续从反应器抽出丙烯腈/丙烯酸铵溶液和珠状物质的排出物以维持恒定的反应器工作容积。然后将反应器内含物转入旋风分离器而分离珠状物并返入反应器。再将产物流进料入一对精制釜之一。这些釜也含固定化酶原料的珠粒，且在任一阶段给一个釜装填被丙烯腈污染的丙烯酸铵溶液，而另一个则保持酶解条件。当酶解进行到一定程度而将丙烯腈减少到基本上不可检测的量时，将该釜通过一个过滤机排空，使含酶的珠粒和其它固体组分从基本上不含丙烯腈的39％丙烯酸铵的溶液分离。实施例3应用实施例1中所述的酶进行本发明的重复的补料分批法。将该酶包封于聚合物珠粒中以提供固定化细胞。将这些固定化细胞的珠粒转至反应器并悬浮于20℃时的水中，添加丙烯腈至浓度为1.2wt％。固定化细胞催化丙烯腈水解而生成丙烯酸铵。当反应器中丙烯腈的浓度减小到0.9wt％时，自动往反应器另加丙烯腈而将丙烯腈的浓度再次提高到1.2wt％。继续这种自动进料操作直至反应器中丙烯酸铵浓度升高至43.5wt％。完成一批料后停止丙烯腈进料，使反应器中残余的丙烯腈转化成丙烯酸铵直至丙烯酸铵的浓度为45wt％而丙烯腈的浓度基本上为零。
从反应器中抽出生产的丙烯酸铵溶液并过滤以除去细胞原料和固定化的生物催化剂。然后将该物料返入反应器，再在反应器中重装入20℃的水并重复该操作。
权利要求
1.制备含至少30wt％(甲基)丙烯酸或其盐和低于0.2％(甲基)丙烯腈的水溶液的方法，该方法包括提供水和(甲基)丙烯腈，其用量足以在水解时生成浓度至少为30wt％的(甲基)丙烯酸或其盐，并在该过程期间提供能将(甲基)丙烯腈转化成(甲基)丙烯酸铵的酶与(甲基)丙烯腈接触，该酶对(甲基)丙烯腈的Km低于500μM而对(甲基)丙烯酸铵的Ki大于100,000μM，使之发生(甲基)丙烯腈的水解直至反应液中(甲基)丙烯腈的浓度低于0.2％而(甲基)丙烯酸铵的浓度高于30％，再回收含浓度高于30％的(甲基)丙烯酸铵和浓度低于0.2％的丙烯腈的溶液。
2.权利要求1的方法，其中(甲基)丙烯腈经历化学水解而得含(甲基)丙烯酸铵和丙烯腈的溶液，再将所得溶液与所述酶接触使之发生(甲基)丙烯腈的水解直至反应液中(甲基)丙烯腈的浓度低于0.2％。
3.权利要求1的方法，其中基本上(甲基)丙烯腈的全部水解是通过应用所述酶的酶解而进行的。
4.权利要求3的方法，其中给反应器装入所述酶以及水和(甲基)丙烯腈，其用量足以在水解时生成浓度至少为30wt％的(甲基)丙烯酸铵，使之发生酶解直至溶液中(甲基)丙烯腈的浓度低于0.2％且(甲基)丙烯酸铵的浓度高于30％。
5.权利要求4的方法，其中(甲基)丙烯腈的最终浓度低于0.1％，优选低于0.02％。
6.权利要求4或5的方法，其中(甲基)丙烯酸铵的最终浓度至少为40％。
7.权利要求4～6中任一项的方法，其中Km低于100μM。
8.权利要求4～7中任一项的方法，其中Ki至少为200,000μM。
9.权利要求4～8中任一项的方法，其中比值Ki/Km至少为5,000。
10.权利要求4～9中任一项的方法，其中的酶可通过培养具有紫红红球菌NCIMB 40757或NCIMB 40833的特征的微生物得到。
11.权利要求4～10中任一项的方法，该方法是这样进行的在操作期间往反应器中装入酶、水和(甲基)丙烯腈并使反应器中发生水解，然后从反应器中排出溶液。
12.权利要求4～10中任一项的方法，它是作为两步酶解法进行的，其中，在第一步期间，发生(甲基)丙烯腈的水解至如此程度即(甲基)丙烯酸铵的重量百分浓度小于期望的最终浓度或者残余(甲基)丙烯腈的百分浓度大于期望的最终浓度，然后将该溶液转入一个或多个后续的反应器使之进一步酶解而得所需的最终溶液，最后回收该溶液。
13.权利要求12的方法，其中包括水和(甲基)丙烯腈的反应混合物在连续反应器中被酶解而生产含至少30wt％(甲基)丙烯腈铵和0.5％至饱和量的(甲基)丙烯腈的产物，然后将该产物转入后续的反应器，在此通过酶解将(甲基)丙烯腈的浓度减小到低于0.1％而(甲基)丙烯酸铵的浓度被提高了。
14.权利要求12或13的方法，其中后续的反应是利用至少两个后续的反应器进行的，这些反应器以交替补料分批方式进行操作。
15.权利要求12～14中任一项的方法，其中的第一步在填充床反应器中进行以产生含0.5％至饱和量的(甲基)丙烯腈的溶液，将部分该溶液进一步酶解，而余下的被再循环。
16.权利要求12～15中任一项的方法，其中在第一步中通过酶解而得的溶液在经历第二步酶解之前被蒸馏。
17.权利要求12～16中任一项的方法，其中在整个该方法中应用同样的酶。
18.前述权利要求中任一项的方法，其中该过程的控制包括在进行酶解的一个或多个反应器的液面上空间中检测(甲基)丙烯腈。
19.前述权利要求中任一项的方法，其中反应器的控制包括稀释该溶液的浓度至低于20％丙烯酸铵，并测定该稀溶液的导电率。
全文摘要
具有高浓度的(甲基)丙烯酸铵且基本上不含(甲基)丙烯腈的溶液,是通过应用酶在水的存在下进行(甲基)丙烯腈的酶解而制备的,该酶对(甲基)丙烯腈的K
文档编号C12R1/01GK1207776SQ9619963
公开日1999年2月10日 申请日期1996年12月12日 优先权日1995年12月12日
发明者K·C·塞默斯, J·胡格斯 申请人:联合胶体有限公司