得自非洲扇头蜱的组织粘合蛋白的制作方法

专利名称：得自非洲扇头蜱的组织粘合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及由某些取食血液的外寄生物物种产生的组织粘合蛋白。这些蛋白和包含这些蛋白的组合物可特别用于临时或永久将动物组织相互粘合或将动物组织粘合于其它生物材料。本发明也涉及将组织粘合蛋白用于生产疫苗，以保护动物抵抗吸血外寄生物的叮咬以及抵抗由这类外寄生物传播病毒、细菌和其它病原体。
包括硬蜱某些种在内的许多取食血液的外寄生物产生胶结物。硬蜱是借助“粘合锥”将其自身粘附于脊椎动物宿主的吸血寄生虫，所述粘合锥是一种蜱唾液腺的Ⅱ型和Ⅲ型腺泡的产物(Kemp等，1982；Walker等，1985)。(本文涉及的所有文献均列于说明书结尾处。)形成所述锥的胶结物是注射入这些寄生物取食的动物皮肤中的乳白色分泌物。所述胶结物包含多种相互作用蛋白和糖类组分。所述胶结物传播到叮咬部位和皮肤上，硬化时确保取食期间口部仍坚固地锚定于宿主，取食时期通常持续4-8天。粘合锥另外还用作垫圈，以防止取食期间流体从叮咬部位渗漏。
所述蜱的粘合锥是一多层结构，由两种主要类型的胶结物构建。第一种类型的胶结物仅在建立叮咬部位后数分钟后产生，并迅速硬化形成所述锥的刚性“核心”。第二种类型的胶结物在以后的粘附后约24小时分泌，并且硬化较缓慢，形成更具柔性的“外层”。在蜱成虫中，胶结物的产生通常持续直至粘附后第三天或第四天(Kemp等，1982；Sonenshine等，1991)。
所述蜱的粘合锥看来主要是蛋白性的，但也含有某些糖类和脂质。一项早期研究发现，微小牛蜱(Boophilus microplus)完整胶结物的氨基酸组成富含甘氨酸、亮氨酸、丝氨酸和酪氨酸(Kemp等，1982)。然而，对包含各种蛋白的所述蜱胶结物的特征鉴定非常少。尽管已经表明了SDS-PAGE凝胶上的所述组分蛋白的迁移率，但尚未纯化出任何一种所述组分蛋白。
对胶结物组分硬化的过程也不了解，尽管已经提出了与外皮揉革和血淋巴凝固相似的机制(Kemp等，1982；Moorhouse和Tatchell，1996)。目前尚无直接的科学证据证实这些理论机制。
人们已经注意到，形成胶结物外层的多肽看来与脊椎动物皮肤的某些结构组分相似。包括这些脊椎动物样分子可能使得蜱能够在胶结物硬化过程期间使用宿主来源的酶，例如使胶原蛋白和弹性蛋白交联的赖氨酰氧化酶(Siegel，1979)；或谷胺酰胺转移酶(transglutaminase)，诸如伤口愈合期间被诱导并使纤连蛋白、血纤蛋白和胶原蛋白交联的凝血因子ⅩⅢa(Ichinose等，1990)。这些酶可以使外层多肽交联至皮肤的细胞外基质蛋白。
在非洲扇头蜱的唾液腺中，已经鉴定出其它酶，诸如催化节肢动物细胞外结构硬化的酚氧化酶或过氧化物酶(Sugumaran等，1992)，因此这些其它酶可能在粘合锥硬化中起作用。
蜱胶结物的组成看来在不同硬蜱物种中是相似。例如，已经表明针对褐色耳蜱非洲扇头蜱90kD唾液蛋白产生的抗血清识别来自美洲犬蜱变异革蜱(Dermacenter variabilis)、美洲钝眼蜱(Amablyommaamericanum)和褐色犬蜱血红扇头蜱(R.sanguineus)(Jaworski等，1992)的唾液腺的多肽和胶结物蛋白。
所有这些蜱种均是极其有效的疾病传播者。例如，非洲扇头蜱是数个撒哈拉分(sub-saharan)区家畜发育的主要障碍。它传播引起通常致死的罗得西亚热的原生动物寄生虫小泰累尔梨浆虫(Theileria parva)。这种疾病通常被认为是最重要的牛病(Norval等，1992a；Norval等，1992b)。该蜱也是引起内罗毕绵羊病的病毒的主要载体，这种病使得绵羊和山羊残废，并通常是致死的疾病(Davies，1988)。非洲扇头蜱和其它蜱害虫也引起对皮肤的相当大的损害，因此影响皮革工业。
在抗争寄生物传播的疾病的努力中，已经将未纯化的胶结物组分作为宿主抗性的诱导物进行了测试(Brown等，1986；Shapiro等，1989)，但基于胶结物蛋白的可靠的疫苗尚未成功地开发出。锥蛋白看来可能是疫苗合理的靶，因为所述锥的形成是所述蜱粘附于宿主并取食必不可少的。然而，仅其中某些所述锥蛋白具有抗原性。
因此，非常需要有效的疫苗来抗争由取食血液的外寄生物传播的疾病。由这些生物产生的组织胶结物组分的阐明将使得可以合理地设计这类疫苗。
此外，可能证明这些分子可作为组织胶结物的组分用于医药中。目前可得到的组织胶结物有两种类型，这两种类型均有明显的缺点。基于丙烯酸的胶极强，但毒性也非常强，因此可以仅以非常少量用于机体内。所用的第二种类型的组织胶结物无免疫原性，但形成的结合强度低得多。因此，这种类型的胶结物仅用于少数外科手术中。因此，非常需要能够以强的强度粘合哺乳动物组织的无免疫原性的组织胶结物。
发明概述按照本发明，提供其氨基酸序列示于图3或图7、或含有图2、4-6和8中任何一个所示的任何一种部分氨基酸序列的组织粘合蛋白、得自取食血液的寄生物(最好是蜱)的有关组织粘合蛋白及其功能相当物。
本发明的蛋白具有两种亚型A组和B组。A组蛋白当在唾液中分泌时形成粘合锥核心，并快速硬化形成刚性胶乳样结构。B组蛋白形成粘合锥的外层且硬化较缓慢。得到的结构更具柔性。因此，A组或者B组的蛋白的功能相当物将具有这些相应的活性和特性。
本文用术语“功能相当物”描述功能类似于含图2-8中任一个中鉴定的氨基酸序列的组织粘合蛋白的蛋白。
这些蛋白可以属于与图2-8中鉴定的蛋白和部分蛋白相同的蛋白家族。蛋白家族是指一组共享共同功能并在所述多肽序列中存在的基元之间表现出共同序列同源性的多肽。
序列同源性是指所述多肽序列因从一个共同的祖先趋异而相关。具体地说，如以下更详细讨论的，本文鉴定的的蛋白和部分蛋白具有某些共同的序列，所述序列在整个该蛋白序列中重复数次。在该蛋白的整个氨基酸序列中，多肽序列之间的同源性优选至少为50％。在所述蛋白的整个氨基酸序列中，同源性更优选至少为75％。在整个所述蛋白序列中，同源性最优选高于80％。
“类似的功能”首先是指所述蛋白保留了形成胶结物的能力。因此，这类蛋白能够在一段时间内硬化形成固体物质或胶。其次，该术语可以指结构上与A组或B组蛋白相似、并因此含有相似或相同表位的蛋白。这些功能相当物因此可以用作免疫原，以开发针对取食血液的寄生物、导向组织粘合蛋白家族成员的疫苗。
组织粘合蛋白的功能相当物可以包括例如含有野生型序列的氨基酸取代、插入或缺失的突变体。也可以通过所述蛋白序列的系统突变或特定残基的定向突变，设计与野生型序列相比功能改进的功能相当物。可能需要的功能的改进包括粘合强度更强、粘合速度更快或硬化胶结物的柔性更强。
可以使得组织粘合蛋白或蛋白片段的功能相当物的免疫原性高于或低于相应的野生型蛋白或蛋白片段，以适应所需应用。如果所述蛋白将作为组织胶结物用于外科手术，则所述蛋白理想的是应该无免疫原性，以躲避免疫系统的攻击。然而，如果所述组织粘合蛋白将用于疫苗接种制度，以诱导宿主对寄生物蛋白的抗性，则应该修饰所述蛋白，以增强其免疫原性。因此，它们将更可能在接种疫苗的宿主中诱发免疫应答。
功能相当物将包括不会以不利方式影响所述蛋白功能或活性的保守的氨基酸取代。该术语也将包括天然的生物变异体(例如衍生所述组织粘合蛋白的物种内的等位基因变异体或地理变异)。
按照本发明，也设想了组织粘合蛋白的片段作为功能相当物。保留了该蛋白负责所需活性的部分的片段证明可能在某些应用中是理想的。例如，得自组织粘合蛋白的免疫原性部分的数段短肽可用作免疫原。抗体通常识别包含6-12个氨基酸残基的表位。这类数段短多肽序列对于大量合成生产或通过重组方法生产是简单的。
本发明的组织粘合蛋白可以或者作为组织胶结物的结构组分起作用，或者可以具有针对所述组织胶结物结构组分的酶活性。
人们认为，迄今鉴定并示于图2-8中的大多数蛋白或部分蛋白序列是组织胶结物的结构组分。然而，本申请人不希望受该理论的束缚。例如，图2中鉴定的蛋白序列看来含有信号序列而且其序列类似于广泛研究的结构蛋白-角蛋白的序列。同样，其序列于图3中提出的蛋白也含有一个信号序列，并且像许多结物蛋白一样，富含甘氨酸和脯氨酸。部分序列示于图4的cemA蛋白含有许多重复序列，因此也可能是组织胶结物的结构组分。
图5的蛋白由许多重复序列组成，并在序列上类似胶原蛋白。该编码cDNA与已知的自身装配蛋白麦谷蛋白享有共同的序列。因此，该蛋白能够自身装配似乎可能的。然而，本申请人不希望受这种理论的束缚。这种特定序列可能参与自身装配的可能性产生了使用这些基元赋予不相关蛋白以自身装配能力的机会。
与附图中描述的某些其它蛋白的相同，图6的蛋白含有许多对糖类部分的共有识别位点，特别是对糖胺聚糖的共有识别位点。
图7描述的蛋白序列也含有对糖胺聚糖部分的共有粘附位点，并具有推定的信号序列。该蛋白氨基末端的一半类似胶原蛋白，而羧基末端与角蛋白更具相同。该蛋白富含甘氨酸，并含有数个基元(C/S1-4(Y/F)重复序列，该基元也发现于某些昆虫卵壳的结构蛋白。这些共有序列中的酪氨酸可能通过酚氧化酶的作用形成二酪氨酸桥而参与该蛋白的交联。
图8的序列富含甘氨酸和酪氨酸，类似造礁多毛动物Pragmatopoma californica的胶结物蛋白(参见图9)。因此，可能该蛋白也是组织胶结物的结构组分。然而，本申请人不希望受该理论的束缚。
本发明组织粘合蛋白可能具有的酶活性可能包括实现诸如其它蛋白和糖类部分的磷酸化、糖苷化、还原或氧化的共价修饰的能力，并且可以导致所述组织胶结物的结构组分的交联。交联可以或者是可逆的，或者是不可逆的，并且可能在所述组织胶结物的同源组分或异源组分之间发生。所述交联也可以在组织粘合蛋白和诸如脊椎动物组织组分的非寄生物蛋白之间发生。
本发明的组织粘合蛋白可以是A组蛋白。“A组”是指在寄生物唾液中，这些蛋白形成粘合锥核心。所述锥核心在寄生物中的功能是粘附于脊椎动物宿主皮肤，并形成不不易断裂的刚性结合。因此，这些蛋白形成一种于脊椎动物皮肤快速凝固并结合的硬胶乳样胶结物。A组蛋白因此理想地适用于需要快速凝固的坚固结合的应用。
本发明的组织粘合蛋白可以是B组蛋白。“B组”蛋白是指在蜱唾液中，这些蛋白形成粘合锥的外层。外层在寄生物中的一个功能是形成叮咬部位周围垫圈样密封垫，以防止流体渗漏。外层蛋白的再一功能是形成柔性铰链，使得所述寄生物不易从其宿主上刷掉。因此B组蛋白比A组蛋白硬化更缓慢，但设定以形成更具柔性的柔韧的胶结物。这些蛋白因此理想地适用于需要更具柔性的结合的应用。
本发明的许多结构组织粘合蛋白共同享有结合于脊椎动物组织的能力。这种结合可以由于所述蛋白对脊椎动物皮肤的某些组分(诸如胶原蛋白)具有固有的亲和性而引起的。然而，在需要其活性以产生组织粘合蛋白和皮肤组分之间结合的酶存在下，可能仅显现对脊椎动物蛋白的亲和性。这种酶活性可能源于组织粘合蛋白本身，或可以由脊椎动物皮肤的酶组分提供，所述酶组分诸如使胶原蛋白和弹性蛋白交联的赖氨酰氧化酶或在许多脊椎动物愈合过程中使纤连蛋白、血纤蛋白和胶原蛋白交联的谷胺酰胺转移酶，诸如凝血因子ⅪⅡa。
按照本发明的组织粘合蛋白或其功能相当物可以得自任何一种取食血液的寄生物。本发明的组织粘合蛋白最好得自取食血液的外寄生物，更优选为蜱。本发明的组织粘合蛋白最优选得自褐色耳蜱非洲扇头蜱。
本发明的组织粘合蛋白也可以包含糖类组分。许多组织粘合蛋白事实上是糖蛋白，含有共价结合于该蛋白不同位点的糖类连接物。所述糖类一般包含一系列单糖单元，这通常存在于寡糖或相当小的多糖中。如以上简洁讨论的，迄今在蜱中鉴定的许多所述蛋白均具有糖胺聚糖(含有氨基糖残基的聚糖)的共有连接部位。
本发明的组织粘合蛋白可以作为单体、二聚体、四聚体或作为包含许多同源或异源单体作为一个单元的寡聚体存在于组织胶结物中。这对于结构组织粘合蛋白特别是如此，结构组织粘合蛋白可以作为所述胶结物硬化过程的部分进行非共价结合。然而，本申请人不希望受这种理论的束缚。
可以从活寄生物产生的胶结物中纯化本发明的组织粘合蛋白。这可以通过用诸如PBS、TRIS缓冲液或非离子洗涤剂例如吐温-20或Triton处理收集的锥来进行。通过用对该蛋白序列中表位特异性的抗体，通过免疫沉淀制备胶结物蛋白。或者，可以合成制备所述蛋白，或采用基因工程技术制备所述蛋白。本发明的组织粘合蛋白最好包含通过由编码核酸表达产生的重组多肽。
设计以模拟所述组织粘合蛋白三级结构或活性位点的合成分子，构成本发明的再一方面。
本发明的再一方面包括融合至其它分子诸如标记、毒素或生物活性分子的组织粘合蛋白。特别适于融合的候选者是报道分子，诸如荧光素酶、绿荧光蛋白或辣根过氧化物酶。也可以使用接头分子，诸如链霉抗生物素蛋白或生物素。另外，可以将生物活性肽或多肽融合至组织粘合蛋白。这类分子可以包含具有防腐剂或抗生素特性的分子、或靶向癌细胞的毒素。
可以采用化学交联的方法，将所述蛋白进行化学融合。这类方法是本领域技术人员众所周知的，可以包括例如半胱氨酸残基巯基的交联。在大多数情况下，化学交联用来将组织粘合蛋白融合于非蛋白分子，诸如标记。所述标记可以是放射标记或是可以通过分光检测到的标记，例如荧光或磷光化学基团。
当需要将组织粘合蛋白融合于另一蛋白分子时，精选的方法通常是将所述分子进行基因融合。为了产生重组融合蛋白，可以将编码目的蛋白或目的蛋白片段的基因或基因部分进行工程改造，以形成一个连续布置的基因，使得两种基因序列的密码子被符合读框地转录。
可以将组织粘合蛋白基因融合于其编码基因序列已知或将了解的任何蛋白。特别适于融合的候选者是报道分子，诸如荧光素酶、绿荧光蛋白、生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或辣根过氧化物酶。另外，可以将毒素肽或多肽融合于组织粘合蛋白。也可以将防腐剂或抗生素蛋白和肽融合于本发明的组织粘合蛋白。
按照本发明的再一方面，提供一种药用组合物，该药用组合物在缺乏其它寄生物唾液蛋白的情况下、可选地在存在一种或多种能够使所述组织粘合蛋白交联的化合物的情况下，包含一种含A组和B组组织粘合蛋白的混合物以及药学上可接受的赋形剂。
这种药用组合物具有许多应用，特别是在皮肤外科和伤口愈合方面具有许多应用，可用于临时或永久地将人或动物组织相互粘合，或将人或动物组织粘合于其它生物材料。
组织胶结物先前已经用于外科手术中，以提供对活组织的粘合和稳定性，以使得能够发生正常的愈合和修复过程，或在正常的愈合延迟或不可能发生的情况下提供长期的粘合。由本发明蛋白形成的组织胶结物有优于常规组织胶结物的几个优点。例如，本发明的蛋白与脊椎动物组织形成强的粘合。这使得它们可理想地用作组织胶结物组分，以使两种组织的表面或边缘粘合在一起。
不同的外科手术需要使用具有不同特性的组织胶结物。由本发明蛋白形成的组织胶结物因此是理想的，因为精确地设计所述胶结物的硬化或弹性特性，以通过改变所述胶结物包含的A组蛋白和B组蛋白的相对量，提供所述外科手术的特定需要。所述组织胶结物以该方式通用性极强。
具有高含量A组蛋白的组织胶结物一般可用于基本上不需要折曲、需要极其坚固粘合的操作中。这种粘合的良好的实例可能是两个骨表面之间的粘合或骨表面和人工关节表面之间的粘合。当必需快速建立粘合时，也需要A组含量高的组织胶结物。
关于诸如粘合皮肤裂伤的操作，当需要高度柔性时，使用含有高含量B组蛋白的组织胶结物。然而，B组蛋白确实粘合更缓慢，因此B组含量高的组织胶结物一般不用于需要快速形成的坚固粘合的操作。然而，这种胶结物可以与B蛋白硬化时可以形成快速粘合以将所述组织保持在一起的其它措施结合使用，诸如外科U形钉或A组组织胶结物。
包含按照本发明的组织粘合蛋白的药用组合物也可以含有另外的防腐剂或负责防止过早固化的组分。例如如果待将所述组织胶结物喷洒到组织表面，则所述组合物也可以包含抛射剂。这类化合物是本领域技术人员熟知的。
本发明的组织粘合蛋白的一个重要优点是在脊椎动物组织原位中，这些蛋白无免疫原性，因此不引起所述组织的炎症。当所述组织胶结物计划用于内部使用，例如用于固定脱垂的器官时，这特别合适。如果所述组织胶结物具有免疫原性，则免疫攻击可能导向该组织胶结物，因此引起局部炎症、使所述胶结物破裂并阻止该组织的永久粘合。
目前在外科中克服免疫排斥的的基本原理包括抗争初始排斥现象，直至最终免除系统变得耐受为止。例如，在器官移植后，最初需要极大的混合剂量的免疫抑制剂，所述剂量在治疗期间逐渐减少，如果移植物成功地经受住一年左右，则需要非常少的维持免疫治疗。
本发明的组织粘合蛋白也可以用来预防免疫排斥。本发明的组织粘合蛋白除天然无免疫原性外，其另一特性是所述蛋白本身结合于外寄生物唾液的生物活性蛋白，诸如蜱组氨酸结合蛋白。通过如此结合，所述组织粘合蛋白使该生物产生的各种免疫抑制分子的作用局部化。这些免疫抑制化合物在取食过程中随时间而改变，以便适应宿主的排斥反应。因此，粘合锥实际上是一种活性局部免疫抑制结构。
结合于生物活性寄生物蛋白的能力是指，包含按照本发明的组织粘合蛋白的组织胶结物可以补充一些由某些寄生物产生的免疫抑制分子。例如，合适的分子可能包括血管活性胺结合分子，这是共同待审的国际专利申请PCT／GB97/01372的主题。这些分子将结合于所述组织胶结物，由此提供假扮任何同种或甚至异种器官并防止其排斥的局部免疫抑制结构。
因此，本发明组织粘合蛋白的这些特性除提供组织胶结物的常规用途外，还提供保持与骨的联接接合或修饰损伤的器官。除作为无免疫原性粘合剂的用途外，按照本发明产生的组织胶结物可以用作器官移植的附件，以向移植物位置供应免疫抑制化合物，并将免疫抑制化合物局限于移植物位置。
本发明的再一方面因此通过向基本胶结物补充一种或多种本发明的组织粘合蛋白、可任选结合寄生物来源的免疫抑制化合物，提供具有免疫抑制特性的组织胶结物。
由本发明组织粘合蛋白形成的组织胶结物的其它具体应用可以包括但不限于下表中给出的其它应用取代常规封闭物如果缝线或U形钉而修复切开的手术伤口；修饰撕裂伤，诸如分娩后的会阴撕裂或创伤后的皮瓣撕裂；将皮肤、培养的皮肤代用品或生物材料代用品移植至慢性伤口、烧伤、皮肤移植供体部位以及在重建性或美容整形外科中移植皮肤、培养的皮肤代用品或生物材料代用品；固定肌成形瓣(myoplastic flap)；组织与组织修复，诸如修复肝脏或其它实质器官的撕裂；组织与组织吻合术诸如胃肠吻合术，或组织对生物材料吻合术诸如血管修复或吻合术；组织与组织重建，诸如在其解剖学部位中固定脱垂器官；如在复发性气胸后胸膜胸膜粘连中的组织与组织近似法；作为诸如痔注射的操作中的组织硬化剂；用于神经外科操作，诸如用天然或人工代用品修复或修补硬膜以及移植或修复中断的(severed)神经组织；用于正牙操作，诸如牙齿的再移植或用碎骨片或诸如胶原蛋白基质或羟磷灰石的材料重建下颌骨弓或上颌骨弓；用于矫形外科操作包括椎骨融合术、关节固定术、碎片(fraction)固定术和切骨术以及假体的移植诸如髋部关节成形术；用于诸如在美容领域使用缝线不合要求的操作中，诸如皱纹切除术；在疝根治术中固定诸如MarlexTM网的人工材料(在开放性手术中进行或用内窥镜进行)；修复易碎的组织，诸如腱或肌肉；作为渗出表面的止血剂或用于难以保证用常规方法止血的情况下(例如在内窥镜手术期间)；用于闭塞窦道和瘘管；以及用于中空内脏诸如胃或十二指肠的封闭性穿孔术(或者单独使用或者结合组织补片或人工补片使用)。
在本发明的又一实施方案中，提供使用组织粘合蛋白作为粘合锥装配研究和阻止粘合锥装配策略的开发中的工具，由此抑制蜱的粘附和取食。例如，可以使用针对组织粘合蛋白的单克隆抗体和工程疫苗来阻止寄生物取食。
节肢动物寄生物是传染病病原体源，所述病原体诸如蜱传脑炎病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、内罗毕绵羊病毒、Borrelia burgdorgeri(莱姆病的病原体)、小泰累尔梨浆虫(罗得西亚热的病原体)和在人类和兽医医学中具有主要影响的其它有害效应。目前对所述节肢动物寄生物的防治主要依赖于应用诸如杀螨剂的化学药品。
已经尝试使用通过疫苗技术的免疫学防治方法。在将节肢动物寄生物的某些保护性抗原鉴定为潜在的疫苗候选物方面已经取得了一些成功，但迄今仅少数达到商业成果，最显著的是对于牛蜱-微小牛蜱商业成果。尽管取得了这些进展，但仍需要节肢动物寄生物疫苗，特别是可以针对蜱使用的疫苗。
至今尚不可能的一个替代的疫苗策略是用纯化的抗原接种动物。该动物的免疫系统因此发展出对这些抗原性多肽的改善的体液应答，并因此发展出对所述节肢动物寄生物本身的抗性。
使用针对特定载体传播疾病的疫苗来控制所述疾病的一个缺点是不同的疫苗通常需要针对每种疾病进行保护。针对疾病载体(诸如蜱和蚊子)的疫苗的额外的优点是只要这些感染仅由一种类型的疾病载体传播，其效力就可以控制几种不同的感染。
因此，本发明也提供组织粘合蛋白作为以上定义为免疫原的应用。因此，本发明的另一方面包括在节肢动物寄生物疫苗中包含一种或多种以上定义的组织粘合蛋白的疫苗，特别是包含在防治由节肢动物寄生物传播的感染引起的疾病防治方面用作保护性免疫原的一种或多种以上定义的组织粘合蛋白的疫苗。
所述疫苗可以单独给予，或与其它免疫原联合给予。所述疫苗可以包含本领域熟知类型的佐剂，例如明矶。适于疫苗接种的候选者包括人类和家畜，诸如牛、山羊、绵羊、狗、猫和其它哺乳动物。所有这些物种均需要针对节肢动物寄生物的保护，特别是针对蜱和它们传播的感染的保护。
按照本发明的再一方面，提供编码以上定义的组织粘合蛋白的核酸分子或任何功能相当物形式。选择的核酸序列包括或含有图2-8中所示的核酸序列。技术人员会认识到，可以通过添加、置换、缺失或插入一个或多个核苷酸，在核苷酸水平上进行改变，其中根据遗传密码的简并性，所述改变可能反映或不反映在氨基酸水平上。
按照本发明该方面的核酸分子可以包括DNA、RNA或cDNA，并且可以还包括其序列中的核苷酸类似物。所述核酸优选包含DNA，更优选包含单链或双链cDNA。
在本发明该方面的核酸方面也可以设计反义序列，在序列方面，反义序列将全部或部分包含编码核酸链的互补链的序列。在检测表达编码组织粘合蛋白的核酸的生物或载体方面，包含组织粘合蛋白基因的反义序列的寡核苷酸可以用作诊断工具。这些单链寡核苷酸将包含长度为10-300个核苷酸、优选10-100个核苷酸、最优选10-30个核苷酸的核酸。可以标记所述寡核苷酸以有助于其检测。合适标记系统是本领域熟知的。
对cDNA文库筛选本文所述组织粘合蛋白的蛋白类似物的方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。本发明该方面的反义序列因此可以与编码组织粘合蛋白的核酸的互补链精确对应。例如，当使用反义寡核苷酸作为对cDNA文库筛选本文所述组织粘合蛋白的蛋白类似物的探针时，由于遗传密码的简并性和种间序列的趋异性，本文所述基因的任何类似基因均可能包含显著不同于该探针序列的序列。
因此，按照本发明该方面使用的反义序列包含在标准条件下与图2-8所示核酸序列杂交的序列。包括在本发明范围内的“杂交序列”是在标准条件下结合的杂交序列。本文所用的“标准条件”是指非严格标准杂交条件(于室温下6×SSC/50％甲酰胺)与低严格性条件下(2×，室温，或2×SSC，42℃)或于较高严格性标准条件下例如2×SSC，65℃(其中SSC=0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠，pH 7.2)洗涤。标准条件最好是指高严格性条件。
本发明的再一方面包括生产组织粘合蛋白的方法，该方法包括由所述编码核酸进行表达。通过在合适的条件下培养含所述核酸的重组宿主细胞，可以方便地达到表达。
用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是众所周知的。合适的宿主细胞包括细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域可得到的用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞、Hela细胞、仓鼠幼仔肾细胞和许多其它细胞系。通常优选的细菌宿主是大肠杆菌。
在本领域中很好地建立了在原核细胞诸如大肠杆菌中异源多肽和多肽片段的表达；参见例如Molecular Cloninga Laboratory Manual第2版，Sambrook等，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。在培养中的真核细胞中的表达也是本领域技术人员可得到的用于生产异源蛋白的一种选择；参见最近的综述，例如O’Reilly等(1994)，Baculovirusexpression vectors-a laboratory manual，Oxford University Press。
可以选择或构建合适的含有所述合适调节序列的载体用于表达组织粘合蛋白，所述合适调节序列包括启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因和其它合适的序列。合适时，载体可以是质粒、病毒例如噬菌体或噬菌粒。关于进一步的细节参见Molecular Cloninga Laboratory Manual(在上述引文中)。在ShortProtocols in Molecular Biology，第2版，Ausubel等，John Wiley & Sons，1992中详细描述了许多已知的用于核酸操作的技术和方案，所述核酸操作例如制备核酸构成物、诱变、测序、将DNA引入细胞和基因表达以及蛋白分析。例如，在真核细胞中，选择的载体基于病毒，诸如基于杆状病毒。
本发明的再一方面提供含有编码组织粘合蛋白或其功能相当物的核酸的宿主细胞。又一方面提供包括将这种核酸引入宿主细胞或生物的方法。核酸的引入可以采用任何可利用的技术。在真核细胞中，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、脂质体介导的转染或采用反转录病毒或其它病毒(诸如痘苗病毒)或对于昆虫细胞为杆状病毒的转导。在细菌细胞中，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔或采用噬菌体的转染。
核酸引入后可以例如通过在表达所述基因的条件下培养宿主细胞，使得或允许由所述核酸进行表达。
在一个实施方案中，本发明的核酸整合入宿主细胞的基因组(例如染色体)中。可以通过按照标准技术包括促进与基因组重组的序列，可以促进整合。
被转化以在生殖系中表达或过量表达一种或多种本文所述组织粘合蛋白或功能相当物的转基因动物及其产生方法，形成本发明的又一方面。现在有许多技术将转基因引入生物的胚胎或生殖系中，诸如在Waston等，(1994)Recombinant DNA(第2版)，Scientific AmericanBooks中描述的技术。
现在通过实施例，具体参考从蜱中分离的组织粘合蛋白、尤其是非洲扇头蜱中分离的组织粘合蛋白，更详细地描述本发明的各个方面和实施方案。人们会认识到，在不偏离本发明范围的情况下可以对细节进行修改。
附图简述

图1A为SDS凝胶，含有雄性和雌性唾液腺提取物(SGE)和通过在PBS中冲洗粘合锥获得的雄性和雌性胶结物多肽。
图1B是图1A相应的蛋白质印迹，用针对从蜱唾液腺提取物中纯化的17 Kd蛋白产生的多克隆抗血清探测。
图2是克隆21的部分cDNA序列和翻译产物。cDNA推导出的蛋白是一种胶结物蛋白；它含有可能构成分泌蛋白通常的信号序列的疏水N末端区。该蛋白非常类似其它结构蛋白，尤其是角蛋白。糖胺聚糖基团的翻译后粘附的识别序列以下划线表示。
图3是克隆33的cDNA序列和cDNA推导出的多肽序列。推定的信号序列以粗体给出。同许多结构蛋白一样，该蛋白富含甘氨酸和富含脯氨酸。该蛋白也显示出与角蛋白有某些相似。
图4是cemA cDNA的部分序列和cDNA推导出的多肽序列。该蛋白具有非常多的重复，序列KGALLQQQQASQVKGALKAI或其略微变异的变异体重复数次。
图5是克隆24的部分cDNA序列和cDNA推导出的多肽序列。该蛋白与结构蛋白(在其它胶原蛋白中)类似并含有重复序列。所述cDNA也与一种自我装配蛋白麦谷蛋白具有一个共同的区。
图6是克隆68的部分cDNA序列和cDNA推导出的序列。所编码的蛋白类似结构蛋白，诸如角蛋白。一系列推导的糖胺聚糖粘附位点以下划线标记。
图7是克隆64的完整cDNA序列和cDNA推导出的多肽序列。推定的信号序列以粗体给出。可能的糖胺聚糖粘附位点以下划线标记。成熟蛋白的前40个氨基酸部分为胶原蛋白样，而该序列的其余部分类似角蛋白。该蛋白富含甘氨酸并含有数个基元(C/S1-4(Y/F)重复序列，这也在昆虫卵壳的结构蛋白中发现。所述酪氨酸可能通过由酚氧化酶形成二酪氨酸桥而参与交联。克隆Ⅰ编码相似的蛋白(参见图8)。
图8是克隆Ⅰ的部分cDNA序列和cDNA推导出的多肽序列。推定的蛋白富含甘氨酸和酪氨酸，类似造礁多毛动物Pragmatopomacalifornica的胶结物蛋白(一种由海洋蠕虫建立的所述管中醌褐变的胶结物的一种组分)。
图9是图8所示蛋白序列和多毛动物Pragmatopoma californica的胶结物蛋白之间的DNA序列对比。
图10A显示一PAGE凝胶，显示从以克隆64截短的编码序列转化的大肠杆菌细胞表达的蛋白。
图10B显示对应于图10A的蛋白质印迹。
图11a和图11b显示截短的克隆64蛋白与各种天然蛋白的序列对比。
图12a和12b显示用各种常规染料染色的仓鼠皮肤的组织学切片。
图13a、13b和13c显示仓鼠皮肤的免疫过氧化物酶染色的切片。
实施例蜱按照Jones等(1988)所述方法饲养蜱。所有三个发育阶段的非洲扇头蜱均在Dunkin Hartley豚鼠上取食。当不取食时，所有蜱均于21-26℃和85％的相对湿度下维持。实施例1蛋白的鉴定在粘附时期的不同时间点从在豚鼠上取食的蜱(若虫和成虫)收集粘合锥。粘合锥在磷酸缓冲盐水(PBS)中匀浆，以提取可溶性蛋白，并在热碱和酸中提取可溶性较差的组分(Kemp等，1982；Jaworski等，1992)。
用SDS-PAGE分析蛋白带型；所得的凝胶以图1A显示。从凝胶上切下与早期表达(A组)蛋白和较晚表达(B组)蛋白相应的条带和斑点，用于产生多克隆抗血清。甚至可以获得针对抗原性较低的蛋白的良好的抗血清，条件是不让这些蛋白完全复性。
所得的抗血清用来筛选cDNA文库，也用于免疫印迹(参见图1B)和免疫组织化学。
将不能产生良好抗血清的蛋白印迹至聚偏二氟乙烯膜上，用于氨基末端序列的测定。关于氨基酸测序，将样品在Applied Biosystems494A“Procise测序仪”(Perkin-Elmer，Applied Biosystems Division，英国Warringon)上测序。电印迹的样品用Applied Biosystems“Mini-Blot”柱取代标准柱进行分离。从膜上切下目的条带，并切成1×3mm小片，用于插入所述柱中。用生产商建议的用于膜结合样品的程序(Schagger和von Jagow，1987；Matsudaira，1987)对这些样品进行测序。
然后将该信息用来设计寡核苷酸，以对蜱cDNA文库筛选目的克隆。实施例2cDNA文库的构建从已经在豚鼠上取食2天的20只雄性和20只雌性非洲扇头蜱成虫标本中切下唾液腺。将唾液腺收集在干冰上的Eppendorf管中。用FastTrack mRNA分离试剂盒(Invitrogen)分离信使RNA。
为了合成cDNA并将所述cDNA插入λZap Ⅱ载体中，使用ZAPcDNA合成试剂盒(Stratagene)。在将所述cDNA单向插入所述λ载体中之前，所述核酸在Sephacryl S-400柱(Pharmacia)上进行分级分离。
由低分子量cDNA(范围为约100-2，000碱基对)构建文库(称为d2-Ⅰ)。用较高分子量部分构建第二个文库(d2-Ⅱ)。用Packagene(Pormega)包装提取物进行包装。在XL-1-Blue细胞(Stratagene)中每个文库扩增约1.5×106噬斑形成单位(PFU)用于随后的应用。实施例3筛选d2-Ⅱ cDNA文库由该文库随机选择的部分体内切下噬菌粒，用来如Short等(1988)所述在XLl-Blue细胞(Stratagene)中产生双链pBluescript SK(-)质粒。
将XLl-Blue集落平板接种到补充5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal，Melford Laboratories，UK)和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG，Novabiochem)的含氨苄青霉素的LB(Luria-Bertani)琼脂平板上，用于蓝/白集落选择。
选择约具有250-1000个碱基对的插入片段(通过用PvuⅡ消化并在1％琼脂糖凝胶上电泳测定)的75个质粒进行测序。用于测序的寡核苷酸对应于pBluescript质粒DNA中的T3和T7引物部位。实施例4测序按照Goode和Feinstein所述(1992)，从过夜培养物中纯化质粒，将其碱变性(Mierendorg和Pfeffer，1987)并用Sanger二脱氧介导的链终止反应(Sanger和Coulson，1975)进行测序。用GCG序列分析软件(Wisconsin软件包的程序手册，1994)分析序列数据。
在国家生物技术信息中心(NCBI)，用BLAST网络服务进行蛋白质数据库检索。
对许多克隆进行测序或部分测序。那些克隆的序列或部分序列示于所附的图2-8中。克隆序列的结构和特征的解释在以上的附图简述和说明书的其它部分中给出。实施例5CemA抗血清的生产针对大小为18kDa左右的显著的唾液腺蛋白产生抗血清。
关于多克隆抗血清的生产，将成虫取食阶段第6天取出的唾液腺在磷酸缓冲盐水(PBS)中匀浆，并离心(3min；12，000×g)。按照Laemmli(1970)所述，在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离上清液中的所述蛋白[即唾液腺提取物(SGE)]。
凝胶在冰冷的100mM KCl溶液中染色并切下18kDa蛋白。真空干燥含所述蛋白的聚丙烯酰胺部分，在PBS中匀浆，与等体积的Montanide ISA 50佐剂(法国Seppic)混合，并皮下注射入Dunkin Hartley豚鼠中。每10天重复该步骤。在第4次注射后10天收集血清。
按照Kyhse-Anderson(1984)进行的蛋白质印迹显示出所述抗血清与粘合锥表面的17kDa蛋白的强反应(参见图1A)。称为CemA的该蛋白在所述蜱的所有取食阶段均存在，并可以通过在PBS中洗涤粘合锥而容易地获得。实施例6免疫组织化学/蛋白质印迹/RNA印迹/原位杂交在取自取食时期不同阶段的粘合锥和唾液腺的蛋白质印迹和染色部分中使用多克隆抗血清。当光学显微镜不能提供足够的分辨率以显现染色时，使用电子显微镜。
关于可以针对其不产生抗血清的蛋白，采用洋地黄毒苷标记的DNA探针进行RNA印迹(Sambrook等，1989)，所述探针采用从原始克隆纯化的插入片段经随机引物标记构建。与碱性磷酸酶缀合的抗洋地黄毒苷抗血清提供探针检测。事实上，原位杂交可能更适于使基因表达在唾液腺中局部化并进行跟踪，因为当在唾液腺上进行时，免疫组织化学通常产生高背景。
这些技术结合SDS-PAGE数据，使得可以确定在取食时期内特定蛋白表达的时间，确定它们在唾液腺中产生的位置以及确定它们构成粘合锥的哪层(因此更好地定义A组和B组蛋白)。实施例7基因组文库的构建和差异表达的检查为了评价组织粘合蛋白基因的差异表达，目前按照以下步骤。将用合适的内切核酸酶消化的基因组蜱DNA插入λFixⅡ载体(Stratagene)中，这使得易于进行限制性图谱分析。使用洋地黄毒苷标记的cDNA探针进行文库筛选。
对邻接所述编码序列和内含子的区域进行测序，检查在所述蛋白有序表达中起作用的位点(例如蜕皮甾类或热激效应元件)的存在。人们认为，同时表达的蛋白的基因的比较可能揭示出负责基因表达调节的共同的上游或下游序列。例如，所有A组蛋白的基因对于调节因子可能具有相同的识别位点。
将预期的调节区偶联至报道基因例如荧光素酶基因，转染入合适的细胞(例如果蝇属(Drosophila)细胞)中，并进行功能分析。也进行凝胶阻滞分析、DNA保护分析或条带迁移分析，以证实功能调节域的存在。
单个启动子区控制整个系列基因的同时表达是可能的。然后，这些基因最可能相互紧密相邻定位于基因组上。为了研究这种可能性，正使用洋地黄毒苷标记的探针，借助原位杂交、DNA印迹和基因组文库筛选，在基因组上将所述基因定位。
胶结物蛋白的表达可能受一种或多种血淋巴媒(haemolymph-borne)因子调节。通过在含已取食24-48小时的蜱的血淋巴的组织培养基中从仅粘附于其宿主的动物中取出的唾液腺温育，研究这种可能性。然后用印迹(RNA印迹和蛋白质印迹)或反转录酶-PCR确定基因已经打开还是关闭。
当有血淋巴媒因子控制胶结物基因表达的证据时，在体外温育试验不能提供相当清楚的结果时，将取食阶段早期的蜱唾液腺移植到取食阶段较晚期的动物。通过HPLC和其它标准技术鉴定该因子。实施例8聚集/交联研究-蛋白质表达用从唾液腺和粘合锥提取的蛋白，也使用表达的重组蛋白，测定聚集(聚合)和交联。直接通过蛋白水解，然后检测所述氨基酸中的二酪氨酸或三酪氨酸测定从而检查粘合锥蛋白。也使用其它分析检测交联酶以及在存在和不存在还原剂时的SDS-PAGE以显示分子间或分子内二硫键。
另外，通过免疫沉淀，从胶结物和唾液腺提取物中分离天然A组和B组蛋白。这仅可能用于溶解性较强的蛋白。通过凝胶过滤检测沉淀蛋白的分子量。经SDS-PAGE和蛋白质印迹测定，或从cDNA衍生的蛋白序列计算，比较单体的分子量。
通过用采用N末端氨基酸序列设计的寡核苷酸探针筛选cDNA文库，鉴定与给定(A或B)蛋白共同沉淀的其它组分。
也测定最终分子间键的性质。可以用尿素破坏氢键，用去污剂破坏疏水性相互作用。可以按先前所述(Creighton，1989；Malencik等，1996)进行二硫键和交联氨基酸的检测。
研究天然蛋白并不总是容易进行的。例如，可能难以提取足够的蛋白使得可以进行详尽的研究。而且，非特异性的蛋白相互作用可能发生。利用重组蛋白取代天然蛋白可以解决许多这些问题。
因此在细菌中，或当糖基化和其它翻译后修饰很重要的情况下，在真核(杆状病毒)系统中，表达重组A组和B组蛋白。溶解性非常差的那些蛋白可以与硫氧还蛋白融合，用例如ThioFusion系统(Invitrogen)进行表达。在该系统中，为所述蛋白提供寡聚组氨酸标记，使得易于通过镍-琼脂糖层析纯化(Janknecht等，1991)。在必需的情况下加入肠激酶和/或凝血酶位点，以在纯化后从胶结物蛋白去除标记和融合蛋白。在蛋白发生聚集的情况下，或如果在例如两种不同的A组蛋白之间发生相互作用，则必需确定键的性质，关于天然蛋白-参见上文。在存在和不存在特异性和非特异性酶-抑制剂的情况下，将可以在所有时间因其组氨酸标记而被识别、或由抗血清识别的表达的蛋白与唾液腺提取物一起温育，以鉴定交联。
然后，可以将组氨酸标记的表达蛋白偶联至镍-琼脂糖上，并用于亲和层析(Bugge等，1992；Lu等，1993)以从唾液腺提取物或粘合锥分离相互作用蛋白。然后可以通过筛选cDNA文库鉴别出这些蛋白。因此，通过缺失和突变实验，鉴别出参与重组蛋白聚集或交联的结构域或残基。实施例9在细菌中表达截短的胶结物蛋白(64TRP)设计具有合适限制性酶位点的寡核苷酸，以允许进行图7所示的克隆64 N末端片段的PCR克隆。来自所述cDNA的称为64P的该片段(氨基酸34-85)符合读框地克隆入pET23载体(Novagen)中。用标准PCR克隆法(Sambrook等，1989)获得在pET23载体的6×His-Tag上标记的构成物64TRP(编码氨基酸34-85)。将该质粒转化入大肠杆菌AD494细胞中(Sambrook等，1989)。
借助镍-琼脂糖亲和层析，纯化已表达的组氨酸标记的表达64TRP(截短的胶结物蛋白)(Jarknecht等，1991)。经SDS-PAGE分析所述蛋白(Leammli，1970)，所得的凝胶示于图10A。获得表达的大小约7.8kDa的蛋白条带加上约10kDa的额外的上部条带。上部条带的表观大小表明它不是二聚体。目前正在进行这两个条带的氨基末端序列分析(Schagger和von Jagow，1987；Matsudaira，1987)，以确定这两个条带之间的关系。相应的蛋白质印迹示于图10B。实施例10用重组杆状病毒在昆虫细胞中表达全长的胶结物蛋白(64P)用含合适的限制性酶位点的寡核苷酸，从cDNA扩增胶结物蛋白64P的全长克隆(即长度为114个氨基酸)，将其插入C129.1His杆状病毒载体中，并转染入Sodoptera fugiperda昆虫细胞中，用于真核表达(O’Reilly等，1994)。实施例11非洲扇头蜱胶结物蛋白的氨基酸序列与其它结构蛋白序列的相似性在国家生物技术信息中心(NCBI)，用BLAST对所述胶结物蛋白的截短克隆和全长克隆的氨基酸序列进行蛋白质数据库检索。图11a和11b显示64P、截短的64TRP和其它结构蛋白之间的关系。
所述胶结物蛋白的前40个氨基酸非常象胶原蛋白(图11b)，该序列的其余部分类似角蛋白(图11a)。该蛋白富含甘氨酸，并含有数个基元(C/S)l-4(Y／F)的重复序列，类似黄猩猩果蝇(Drosophila melanogaster)和其它昆虫卵壳的结构蛋白(外皮蛋白)以及脊椎动物细胞角蛋白，包括哺乳动物角蛋白复合物2碱性蛋白、小鼠角蛋白、人角蛋白、胶原蛋白Ⅳα型和IPIB2前体。似乎所述胶结物蛋白已经设计为类似宿主的皮肤蛋白，最可能的目的是避免宿主天然免疫防御机制对皮肤-蜱粘附物的排斥。64P与其周围组织在组成上类似，也促进粘合锥和周围皮肤组织之间的最终结合(参见实施例12和13)。实施例12组织学研究在正常仓鼠皮肤切片和非洲扇头蜱已经在其上取食的仓鼠皮肤切片上进行用或者苏木精和曙红或van Gieson染料的组织学研究。图12.a.A显示具有完整表皮、真皮和皮下层的正常皮肤切片。苏木精和曙红以及van Gieson染色显示预期的组织类型(即基膜、胶原纤维和网状纤维)。在非洲扇头蜱已经在其上取食的皮肤切片中，蜱粘合锥清楚地粘附于皮肤(图12.b.A)，并可见包埋在具有口部的真皮部位中(图12.a.B和图12.b.b)。相比之下，在组织染料摄取方面，粘合锥似乎类似正常的皮肤基膜、胶原/网状纤维。而且，没有证据显示与粘合锥相关的炎症细胞的浸润。明显缺乏炎症增加了下述假说的凭证粘合锥的结构和组成类似皮肤组织，并设计以避免引起宿主对所述蜱的应答。在图12.a.B中粘合锥的多层结构清晰可辨。明显的分层堆积可能是由于当蜱在唾液分泌(即分泌)和吸取宿主流体之间轮换时，胶结物蛋白进行不连续地沉积。实施例13免疫组织化学研究/蛋白质印迹按照生产商的建议(Pharmacia)，通过阳离子交换层析进一步纯化变性的重组64TRP。用纯化的蛋白通过将等体积蛋白和Montanide ISA50佐剂皮下注射入Dunkin Harley豚鼠中来产生多克隆抗血清。
蛋白质印迹(Kyhse-Anderson(1984))显示出抗血清对变性重组64TRP胶结物蛋白带的强反应(图11B)。用雄性和雌性蜱的非洲扇头蜱唾液腺和粘合锥提取物(按先前在实施例5中所述方法制备)进行的蛋白质印迹表明不与抗血清反应。对于所述阴性结果的最可能的解释是由于蛋白的构象，在所述提取的蛋白上不容易得到抗64TRP抗血清结合表位。
采用抗64TRP抗血清，在正常仓鼠皮肤切片和非洲扇头蜱唾液腺、粘合锥和粘附于其上已经粘附非洲扇头蜱的仓鼠皮肤的粘合锥，进行免疫组织化学研究(Coligan等，1991)。
用正常皮肤，抗64TRP抗血清与基膜、表皮组织和真皮组织以及毛囊结构强烈反应(比较图13.a.A与对照血清，图13.a.B)。蜱已经在其上取食的仓鼠皮肤中，各个粘合锥区与所述抗血清反应(图13.b.和图13.c.)。主要与最外层和粘附于皮肤基膜的内层进行反应。与粘合锥的反应模式表明，64P是衬于粘合锥内的胶结物蛋白，可能用作将粘合锥与周围表皮和真皮组织粘合的胶。
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权利要求
1．一种组织粘合蛋白、得自取食血液的寄生物最好是蜱的相关组织粘合蛋白及其功能相当物，其中所述组织粘合蛋白的氨基酸序列示于图3或图7，或所述组织粘合蛋白含有示于图2、4-6和8中任何一个中的任何一种部分氨基酸序列。
2．权利要求1的组织粘合蛋白，它属于上文定义的A组亚型。
3．权利要求1的组织粘合蛋白，它属于上文定义的B组亚型。
4．任一前述权利要求的组织粘合蛋白，它结合于脊椎动物组织。
5．任一前述权利要求的组织粘合蛋白，它得自取食血液的外寄生物。
6．权利要求5的组织粘合蛋白，它得自蜱。
7．权利要求6的组织粘合蛋白，它得自硬蜱。
8．权利要求7的组织粘合蛋白，它得自非洲扇头蜱。
9．任一前述权利要求的组织粘合蛋白，它与一个或多个糖类部分连接。
10．权利要求9的组织粘合蛋白，它与一个或多个糖胺聚糖部分连接。
11．任一前述权利要求的组织粘合蛋白，它以重组形式表达。
12．任一前述权利要求的组织粘合蛋白，它与一种或多种肽或多肽连接。
13．按照权利要求12的组织粘合蛋白，它与形成同二聚体、同三聚体或同四聚体单位的一种或多种自身分子连接。
14．按照权利要求12的组织粘合蛋白，它与形成异二聚体、异三聚体或异四聚体单位的一种或多种非自身分子连接。
15．任一前述权利要求的组织粘合蛋白，它已经在基因上或化学上融合于一种或多种肽或多肽。
16．任一前述权利要求的组织粘合蛋白，它已经与一种或多种肽或多肽交联。
17．任一前述权利要求的组织粘合蛋白，它连接于一种标记。
18．任一前述权利要求的组织粘合蛋白，它连接于一种毒素。
19．任一前述权利要求的组织粘合蛋白，它结合于一种支持体诸如树脂。
20．药用组合物，在缺乏其它寄生物唾液蛋白的情况下包含按照任一前述权利要求的A组和B组组织粘合蛋白的混合物，但在存在一种或多种能够交联所述组织粘合蛋白的化合物的情况下还结合药学上可接受的赋形剂。
21．药用组合物，在缺乏其它寄生物唾液蛋白的情况下包含按照权利要求1-19中任一项的A组和B组组织粘合蛋白的混合物以及药学上可接受的赋形剂。
22．药用组合物，包含按照权利要求1-19中任一项的A组和B组组织粘合蛋白的混合物以及所述胶结物硬化过程必需的那些唾液蛋白，但在缺乏其它寄生物唾液蛋白的情况下还结合药学上可接受的赋形剂。
23．用于治疗的按照权利要求1-19中任一项的组织粘合蛋白或权利要求20-22中任一项的药用组合物。
24．权利要求1-19中任一项的组织粘合蛋白作为药物的用途。
25．用作疫苗或用作疫苗组分的权利要求1-19中任一项的组织粘合蛋白。
26．权利要求1-19中任一项的组织粘合蛋白作为疫苗或疫苗组分的用途。
27．疫苗，包含权利要求1-19中任一项的组织粘合蛋白。
28．生产权利要求27的疫苗的方法，包括用权利要求1-19中任一项的组织粘合蛋白免疫动物。
29．粘合动物组织的方法，包括使动物组织与一种或多种权利要求1-19中任一项的能够形成硬化胶结物的组织粘合蛋白结合。
30．用于临时或永久性粘合组织的权利要求1-19中任一项的组织粘合蛋白或权利要求20-22中任一项的药用组合物。
31．用作防治由节肢动物寄生物传播的感染引起的疾病的保护性免疫原的权利要求1-19中任一项的组织粘合蛋白。
32．核酸分子，它编码权利要求1-19中任一项的组织粘合蛋白或在标准杂交条件下与所述核酸分子杂交。
33．权利要求32的核酸分子，包括DNA、cDNA或RNA。
34．权利要求32或权利要求33的核酸分子，它包括DNA。
35．克隆载体或表达载体，包含权利要求32-34中任一项的核酸分子。
36．基于病毒的权利要求35的载体。
37．基于杆状病毒的权利要求36的载体。
38．用权利要求35-37中任一项的载体转化或转染的宿主细胞。
39．转基因动物，它已经用权利要求31-34中任一项的核酸分子或权利要求35-38之一的载体转化。
40．制备权利要求1-19中任一项的组织粘合蛋白的方法，包括在宿主细胞中表达按照权利要求35-37中任一项的载体，在表达所述蛋白的条件下培养所述宿主细胞，并回收由此表达的所述蛋白。
全文摘要
本发明涉及由某些取食血液的外寄生物物种产生的组织粘合蛋白。这些蛋白和包含这些蛋白的组合物可特别用来临时性和永久性将动物组织相互粘合或将动物组织粘合于其它生物材料。本发明也涉及将组织粘合蛋白应用于生产保护动物抵抗吸血外寄生物的叮咬以及抵抗由这类外寄生物传播的病毒、细菌和其它病原体的疫苗。
文档编号C12N5/10GK1284995SQ98812939
公开日2001年2月21日 申请日期1998年11月12日 优先权日1997年11月12日
发明者G·C·佩森, P·A·努塔尔 申请人:自然环境研究会