专利名称：信号序列捕获方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种检测和分离编码具有分泌能力的肽的DNA的方法。
背景技术：
至今，已将编码激素或生长因子的基因分离并用于生产许多商业上作为药的重组蛋白。它们中大多数为分泌蛋白。因此，在开发新药中分离编码新型分泌蛋白的基因是一极其重要的步骤。因此，已开发出分离编码分泌蛋白的基因的方法。例如，Honjo等人开发了一种方法(未经实质审查公开的日本专利申请JP-平6-315380)，该方法利用分泌蛋白具有允许胞内表达蛋白转位到细胞表面的信号序列的特征。在该方法中，人体IL-2受体，一种分泌蛋白的α链的信号序列用相应于来自靶细胞或组织的mRNA的5′-末端序列的短cDNA片段替换以构建文库，然后将它导入细胞中。在克隆中，IL-2受体在带有信号序列的克隆的细胞表面上表达，但是不含信号序列的那些克隆却不能。因此，该信号序列的存在可以通过抗-IL-2受体抗体检测。
Genetics Institute，Inc.，(Cambridge，MA)开发了一种利用酵母代谢酶的更复杂的系统(US5536637)。转化酶，一种酵母代谢酶，是一种在培养基中将蔗糖裂解成葡萄糖和果糖以传递能量的分泌酶。不分泌该酶的突变型菌株在没有葡萄糖但含蔗糖作为唯一碳源的培养基中不能生长。在利用该现象的方法中，将转化酶基因与cDNA连接以构建文库，然后将其导入缺乏转化酶基因的突变型酵母菌株中。将含该信号肽的克隆通过选择能在仅含蔗糖作为碳源的培养基中生长的克隆进行分离。
然而，Honjo等人的方法的缺陷在于，由于使用抗体，因此在选择阳性克隆中需要繁复的步骤。而且，检测灵敏度非常低。Genetics Institute，Inc.的方法的问题还在于，不能将酵母中分泌效率差的克隆分离出来。此外，由于当报道基因与大的蛋白融合时抗原性或酶活性可能丧失，因此这些方法仅能检测短DNA。而且，这些方法不能检测N-末端在细胞内而C-末端在细胞外的Ⅱ型膜蛋白。
本发明的公开内容本发明提供了一种检查所试验的cDNA是否编码具有分泌能力的肽的方法。本发明还提供了一种分离编码具有分泌活性的肽的cDNA的方法，它能够使用编码长肽编码区的cDNA。
如细胞因子受体的蛋白质转位到细胞表面，在结合其配体时，其二聚化并诱导细胞增殖。已知蛋白质转位到细胞表面的能力(分泌能力)依赖于信号序列的存在。本发明人认为，通过从蛋白质中去掉信号序列(或具有附加的胞外区)并用含所需肽的融合蛋白替换它，在细胞中表达融合蛋白，并检测细胞的增殖能力，可以检测所需肽是否具有分泌活性。如果肽具有分泌能力，融合蛋白则转位到细胞表面、二聚化、并诱导细胞增殖。与此相反，如果肽不含分泌活性，融合蛋白则不能转位到细胞表面和诱导细胞增殖。因此，可以通过仅检测细胞增殖作为指标来检测所融合的肽的分泌能力。而且，本发明人认为，可以通过选择增殖的细胞对具有分泌能力的肽进行阳性筛选。因此，本发明人使用mpl(血小板生成素受体)作为通过转位到细胞表面并二聚化以触发细胞增殖的蛋白质，并开发出一种检测和分离具有分泌能力的肽的方法。
特别地，我们通过从mpl的组成活性形式去掉分泌信号和大部分胞外域制备了编码人体mpl但没有分泌能力的DNA，这是本发明人发现的(在没有配体的情况下通过转导信号来改变mpl以给IL-3依赖型细胞系提供自主增殖能力；Blood 881399-1406(1996))。然后将该DNA与待检测的cDNA、编码已知分泌蛋白的DNA、或编码分泌信号区被除去的分泌肽的DNA连接。所得嵌合基因在细胞中被表达，并检测细胞的增殖能力。结果显示，编码用作测试cDNA的已知分泌蛋白的DNA诱导细胞增殖，然而对编码分泌信号区被移去的分泌蛋白的DNA来说没有检测到细胞增殖。以这种方式，本发明人发现可以使用如此开发的系统使用细胞增殖作为指标容易地检测并分离编码具有分泌活性并含长肽编码区的肽的DNA。事实上，他们进行了筛选并成功地检测和分离了编码包括Ⅰ型膜蛋白和Ⅱ型膜蛋白的分泌蛋白的DNA。
因此，本发明涉及(1)一种肽，其能够在细胞表面通过二聚化诱导细胞增殖并且缺乏分泌能力；(2)(1)中所述的肽，其中该肽得自细胞因子受体；
(3)(1)中所述的肽，其中该肽得自mpl；(4)(2)或(3)中所述的肽，其中该肽为配体非依赖型；(5)(1)中所述的肽，其中该肽包括SEQ ID NO4的氨基酸序列；(6)编码(1)-(5)中任意一项所述肽的DNA；(7)含(6)中所述DNA和cDNA在该DNA的5′-上游区的克隆位点的载体；(8)(7)中所述的载体，其中该载体得自逆转录病毒；(9)(7)或(8)中所述的载体，其中将cDNA插入(6)的DNA的5′-上游；(10)携带(9)中所述载体的细胞；(11)(10)中所述的细胞，其中细胞为哺乳动物的细胞；(12)一种检测被待测试的cDNA编码的肽是否含有分泌能力的方法，该方法包括(a)将测试cDNA与(7)的载体连接，(b)将(a)中制得的载体导入细胞中，和(c)培养(b)中制得的转化体，并检测细胞增殖能力；(13)一种分离编码具有分泌能力的肽的cDNA的方法，该方法包括(a)将cDNA文库与(7)的载体连接，(b)将(a)中制得的载体导入细胞中，(c)培养(b)中制得的转化体，并检测细胞增殖能力，和(d)选择(c)中经鉴定具有细胞增殖能力的阳性细胞，并从所述细胞中分离该cDNA；(14)一种(12)或(13)中所述的方法，其中所述载体来自逆转录病毒，并且待导入载体的细胞是哺乳动物的细胞；(15)用(13)的方法分离编码具有分泌能力的肽的cDNA；和(16)由(15)中所述的cDNA编码的肽。
本发明涉及一种检测编码具有分泌能力的肽的DNA的方法。该检测方法的特征是使用一种编码能够在细胞表面通过二聚化诱导细胞增殖并缺乏分泌能力的肽的DNA，来检测具有分泌能力的肽。这里，“能够在细胞表面通过二聚化诱导细胞增殖的肽”包括mpl(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895640-5644(1992))，GM-CSF的α链或β链(Blood 832802(1994))，红细胞生成素受体(Nature 348647(1990))，c-kit受体(Blood 85790(1995))和neu(Nature 339230(1989))，但不限于此。在本发明的方法中，构建一cDNA以编码上面去除了分泌能力的肽。通常通过删除含信号序列的区域除去分泌能力。例如，人体mpl的信号序列是相应于蛋白质氨基酸序列中1-25位置的区域(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895640-5644(1992))，人体GM-CSF的β链的信号序列是相应于1-48位置的区域(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，879655-9659(1990))。优选地，也将胞外域从肽中删除。
经构建的cDNA编码的肽优选为配体非依赖型(如果肽为配体依赖型，它可能丧失配体结合能力并在创建融合蛋白之后失活)。例如，创建配体非依赖型肽的方法应在肽中引入突变。在mpl的情况下，将Ser 498取代为Asn可以去除对配体和血小板生成素的依赖性(Blood 881399-1406(1996))。本发明方法中所用的mpl优选包括SEQ ID NO4中所述的氨基酸序列。
将如上所述制备的DNA插入适宜的表达载体中。对该表达载体没有限制，优选是逆转录病毒载体，能通过病毒感染高效地将其引入各种细胞中，并在细胞中稳定地表达插入载体中的DNA。逆转录病毒载体的例子包括加工为用于cDNA文库构建体的载体，如pBabeX(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，929146-9150(1995))或pMX(Exp.Hematol.24324-329(1996))。同样，可以使用例如腺病毒、EB病毒和乳头瘤病毒的病毒载体，或例如pEF-BOS(Nucleic Acid Res.18(17))和pcD SRα296(Mol.Cell.Biol.Jan.466-472(1988))的质粒载体。该表达载体应在上面DNA插入体的5′-上游具有待测试其分泌能力的cDNA的克隆位点以表达融合蛋白。创建cDNA克隆位点的方法是本领域技术人员已知的。
接下来，将所制备的载体与待测试的cDNA连接。将该测试的cDNA连接到“编码能够在细胞表面通过二聚化诱导细胞增殖的肽的DNA”的5′-上游中，将其插入载体中。该测试cDNA可以是任意编码具有待试验分泌能力的肽的cDNA。该测试cDNA可以按照标准方法与载体连接。例如，使用T4 DNA连接酶经过衔接子或连接子的连接方法(Maniatis T.，MolecularCloning)。
然后将所制备的载体引入细胞中。对引入载体中的细胞没有限制，包括细胞因子依赖型增殖细胞如Ba/F3、OTT-1、FDCP-1和TF-1细胞。使用标准方法可以将载体引入细胞中，这些标准方法包括脂质体转染法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法和电穿孔法。在逆转录病毒感染-介导的引入法中，将载体引入包装细胞并整合成病毒颗粒。可以使用例如磷酸钙法和脂质体转染法的标准方法引入载体。例如，可以使用如BOSC23、Bing(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908392-8396(1993))、NX-E和NX-A细胞(Nolan G.P.Immunity 8461-471(1998))作为包装细胞。
接下来，将这样制得的转化体培养并检查其增殖能力。当由插入载体中的cDNA所编码的蛋白质被表达成具有配体非依赖型活性细胞因子受体的融合蛋白时，在缺乏细胞所依赖的细胞因子(配体)的培养基中培养该转化体。如果检测到显著细胞增殖，那么判断该测试cDNA为编码含有分泌能力的肽的“阳性克隆”。或者，如果没有检测到显著细胞增殖，判断该cDNA为编码缺乏分泌能力的肽的“阴性克隆”。当由插入的cDNA所编码的蛋白质被表达为具有配体依赖型细胞因子受体的融合蛋白时，在存在配体的情况下培养该转化体。如果必要的话，在与没有配体情况下的阴性对照比较之后，如果检测到显著的细胞增殖，则判断该测试cDNA为“阳性克隆”。本领域技术人员可以根据载体所插入的细胞类型以及待表达的融合蛋白的性质适当选择培养转化体的其它条件。
本发明还涉及一种分离编码含有分泌能力的肽的cDNA的方法。在该方法中，将cDNA文库连接到载体中，而不是上面用于检测编码含分泌能力的肽的cDNA的测试cDNA。在本发明的一个具体实施方案中，将使用随机引物制备的cDNA与BstXI衔接子连接并插在两个BstXI位点之间；一个是载体的，另一个插在活性mpl的胞外切割位点中。cDNA文库的来源不被限制在任意具体的一个上，但可以是能从其中分离出含分泌能力的所需肽的细胞或组织。可以使用许多标准方法来构建cDNA文库。在本方法中，判断能够增殖的细胞选自引入cDNA文库的细胞。在所选细胞中含有的cDNA被假定为编码具有分泌能力的肽。例如，通过提取基因组DNA或RNA、通过PCR使用被设计成包含克隆位点的引物将感兴趣的cDNA扩增(在为RNA的情况下，使用逆转录酶将其转变成DNA之后进行)、以及回收该产物可以从其增殖已被检测的细胞中分离出cDNA。
所回收的cDNA是否为全长还是片段，或者它是否为编码新型分泌肽的cDNA，可以将该cDNA序列与数据库中已知的那些蛋白质进行比较来进行分析。如果该cDNA不是全长，常常筛选二级cDNA文库以分离全长cDNA。可以通过本领域技术人员已知的方法构建该二级cDNA文库，例如文献(Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2nd edition.Sambrook J.等人，(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)中所述的那些。
可以利用通过本发明的方法分离的编码具有分泌能力的肽的cDNA生产用于医药或相关疾病的基因治疗中的重组蛋白。可以通过本领域已知的方法生产来自该分离cDNA的重组蛋白。例如，将该cDNA插入到适宜载体中，这些载体例如有pED(Kaufman等人，Nucleic Acids Res.194484-4490(1991))、pEF-BOS(Mizushima等人，Nucleic Acids Res.185322(1990))、pXM、pJ13和pJL4(Gough等人，EMBO J.4645-653(1985))，将该载体引入宿主细胞，培养所得转化体以使其表达重组蛋白，并纯化该重组蛋白。
附图简述
图1图示了用于检测分泌能力的肽和通过表达该肽检测BAF/03细胞的细胞因子非依赖型增殖能力的结果。
下面参照实施例详细描述本发明，但并不应解释为将本发明限制其中。
实施例1.载体构建在小鼠骨髓增殖白血病病毒中，将env连接到包括由从跨膜结构域到N-末端的56个氨基酸组成的胞外域、跨膜结构域和胞内域的小鼠mpl上。进行PCR以获得编码人体mpl的相应区域的cDNA，该区域从Leu(449)到终止密码子(636)，紧靠在该Leu(499)前面是NotI位点(单个核苷酸插入)以及紧靠在终止密码子之后是SalI位点，以便为如下所示的GM-CSF cDNA框架中。将该″pBabeX MPLM″(Blood 881399-1406.(1996))，活性人体mplcDNA在其中克隆，用作模板。所用引物列于表1中。
表1Not v-mpl (SEQ ID NO1)(TGCGGCCGCCCTGGAGCTGCGCCCGCGATCCTGCTACCGTTTA)NotI mpl序列MPL Sal(SEQ ID NO2)(GTATGTCGACTCAAGGCTGCTGCCAATAG)SalI使用GeneAmpPCR系统(Perkin Elmer)在含10μg/ml模板DNA、1μM各种引物、50U/ml KOD DNA聚合酶(TOYOBO)、1mM MgCl2、0.2mMdNTPs、120mM Tris-HCl(pH8)、10mM KCl、6mM(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100和10μg/ml BSA的反应混合物中在以下条件下进行PCR在98℃下变性60秒，接着在98℃下15秒、60℃下10秒和74℃下30秒循环25次。在琼脂糖胶上电泳分析该PCR产物，切除含0.6kb感兴趣的片段凝胶片提取DNA。然后在该DNA的5′-末端用T4多核苷酸激酶(TOYOBO)使其磷酸化，并使用T4 DNA连接酶(TOYOBO)将其与用SmaI(TaKaRaShuzo)和细菌碱性磷酸酶(BAP；TaKaRa Shuzo)预处理过的pBluescript SK(-)载体(Stratagene)连接。用ABI PRISM 310遗传分析仪(Perkin Elmer)证实插在所得质粒中的活性mpl cDNA的核苷酸序列。该质粒用NotI(TaKaRa Shuzo)和SalI(TaKaRa Shuzo)消化并在琼脂糖凝胶上电泳分离，分离出一条0.6kb片段。使用T4 DNA连接酶将该片段与pMX(Proc.Natl.Acad.Sci.USA929146-9150.(1995))连接以获得pMX v-mplM，其中pMX也用NotI和SalI消化，用BAP处理，并通过琼脂糖凝胶电泳纯化过。该质粒pMX v-mplM含编码缺乏分泌能力的活性mpl的cDNA。该cDNA插入体的核苷酸序列和由该cDNA编码的肽的氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO3和NO4中。
接下来，为了获得其中终止密码子用NotI位点替换的人体GM-CSFcDNA，使用含人体GM-CSF cDNA的pcDSRα298 hGM-CSF(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824360-4394(1985))作为模板进行PCR。所用引物示于表2中。
表2EcoGMss(SEQ ID NO5)(CGAATTCAAAGTTCTCTGGAGGATG)EcoRIEcoGM(SEQ ID NO6)(CGAATTCGCCGCCACCATGGCACCCGCCCGCTCGCCC)EcoRIGM Not(SEQ ID NO7)(AGCGGCCGCCTCCTGGACTGGCTCCCA)NotI将EcoGM设计成具有翻译起始密码子ATG代替Ser(17)，而且与在EcoGMss和EcoGM中一样，EcoRI位点和Kozak共有序列(J.Cell Biol.10829.(1989))紧靠在ATG密码子前面。将EcoGMss和GM Not的引物对用于PCR以扩增含信号序列的GM-CSF，将EcoGM和GM Not用于扩增缺乏信号序列的GM-CSF。除了使用55℃作为退火温度外，如上所述进行PCR，将该产物克隆成pBluescript SK(-)。使用ABI PRISM 310遗传分析仪(Perkin Elmer)证实DNA插入体的核苷酸序列。然后用EcoRI(TaKaRa)和NotI消化该质粒并将其插入如上所述的pMX v-mplM的EcoRI-NotI位点，获得″pMX GM(+)v-mplM″和″pMX GM(-)v-mplM″。该″pMX GM(+)v-mplM″和″pMX GM(-)v-mplM″分别在从Leu(449)开始的活性mpl的C-末端部分和有信号序列或没有信号序列的整个GM-CSF之间编码融合蛋白。其cDNA插入体的核苷酸序列示作SEQ ID NO8和NO10，由该cDNAs编码的蛋白质的氨基酸序列示作SEQ ID NO9和NO11。
实施例2.病毒感染使用LipofectAMINE(Life Technologies)将上面各种质粒引入包装细胞系BOSC23(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 908392-8396.(1993))。将BOSC23细胞涂布在含10％胎牛血清(FCS；JRH Biosciences)的Dulbecco′s改良的Eagle培养基(DMEM；Nissui Pharmaceutical)的6-cm培养皿(CORNING)中。培养6小时之后，用减少了血清的OPTI-MEM I培养基(Life Technologies)洗涤细胞。分别地，将稀释在200μl OPTI-MEM I中的LipofectAMINE(18μl)与3μg稀释在200μl OPTI-MEM I中的每种质粒样品混合。使所得混合物在室温下静置15分钟，与1.6ml OPTI-MEM I混合，然后添加到细胞中。5小时之后，将含20％FCS的2ml DMEM添加到细胞中，将细胞再培养19小时。然后用含10％FCS的3ml DMEM替换培养基，24小时后回收培养基上清液。将小鼠白细胞介素-3(IL-3)和10μg/ml polybrene(1，5-二甲基-1，5二氮十一亚甲基聚甲溴化物，Sigma)加入含重组病毒的培养基上清液中，并且Ba/F3细胞也悬浮在其中以感染。感染24小时之后，在含10％FCS但没有小鼠IL-3的RPMI1640(Nissui Pharmaceutical)中将该细胞洗涤两次，在相同培养基中继续培养。
在含信号序列的整个GM-CSF和活性mpl(得自pMX GM(+)v-mplM)之间含有融合蛋白的细胞以及那些含具有分泌能力的活性mpl的细胞在没有IL-3的情况下生长。相反地，在没有信号序列的GM-CSF和活性mpl(pMXGM(-)v-mplM)之间含有融合蛋白的细胞以及其中没有引入融合蛋白表达载体的对照Ba/F3细胞没有生长(图1)。
实施例3.筛选合成以下的寡核苷酸(表3)，使用T4多核苷酸激酶使其5′-末端磷酸化。混合该寡核苷酸并在95℃下变性，然后通过渐渐将其冷却到40℃退火以制备DNA序列盒。
表35′-GGCCCCAGCACAGTGGC-3′(SEQ ID NO12)5′-GGTCGTGTCACCGCCGG-3′(SEQ ID NO13)
用NotI(TaKaRa)消化并用BAP处理的pMX GM(-)v-mplM与该序列盒混合并使用T4 DNA连接酶连接。通过DNA测序证实所得质粒中该序列盒的方向为按BstXI和NotI(pMX GM(-)v-mplM2)的次序。使用TRIZOL试剂(GIBCO BRL)由大鼠成神经细胞系MNS70制备总RNA并通过寡脱氧胸苷酸柱(Pharmacia)以制备polyA(+)RNA。用SuperScript选择系统(GIBCO BRL)中所含的随机六聚体合成双链cDNA。该cDNA为平端，与BstXI衔接子(Invitrogen)相连，使用SizeSep 400旋转柱(Pharmacia)分级分离。然后混合该cDNA并使用T4 DNA连接酶将其与用BstXI(TaKaRa)消化并用BAP处理过的pMX GM(-)v-mplM2连接。使用基因脉冲发生器(BioRad)通过电穿孔将DNA引入DH10B大肠杆菌(GIBCO BRL)中以构建cDNA文库。
从含cDNA文库的重组大肠杆菌中提取质粒并使用JETstar柱(GENOMED)纯化。使用如上所述的LipofectAMINE将文库质粒引入BOSC23包装细胞中。将小鼠IL-3(10 ng / ml)和10μg/ml polybrene(1，5-二甲基-1，5二氮十一亚甲基聚甲溴化物，Sigma)加入含重组病毒的培养物上清液中，并且将Ba/F3细胞悬浮在其中以进行感染。感染24小时之后，用磷酸盐缓冲液将该细胞洗涤两次，再在含10％FCS的RPMI1640中培养。由在没有IL-3情况下生长的克隆制备基因组DNA，使用设计为包含cDNA插入位点的引物进行PCR以回收该cDNA片段。
表45′-GGGGGTGGACCATCCTCTA-3′(SEQ ID NO14)5′-CGCGCAGCTGTAAACGGTAG-3′(SEQ ID NO15)使用GeneAmpPCR系统2400在50μl含500ng基因组DNA、500pM各种引物、2.5U TaKaRa LA Taq(TaKaRa)、2.5mM MgCl2、0.3mM dNTPs和所附缓冲液的反应混合物中在以下条件下进行PCR在98℃下变性60秒，接着在98℃下20秒和68℃下120秒循环30次。在琼脂糖凝胶上电泳分离该PCR产物，切下含扩增片段的凝胶片，并纯化DNA。确定从所得190个克隆中纯化的DNA片段的核苷酸序列，发现150个克隆是编码已知分泌蛋白或膜蛋白的cDNA，或其部分。发现其它40个克隆编码未知分泌蛋白。将如此获得的已知分泌蛋白的一部分示于表5中，其中“长度”是指以氨基酸残基数计所得cDNA片段ORF的长度。编码已知分泌蛋白的克隆的平均长度为273个氨基酸残基。“登录号”是指在GenBank蛋白质数据库中的登录号。应注明的是，本方法的背景值，如检测编码除分泌蛋白外的蛋白质的cDNA或以反方向插入的cDNA为1％或更少。长度登录号名称221 1805299 淀粉样前体288 416630淀粉样蛋白1350 468563淀粉样前体样蛋白2561 112929淀粉样A4蛋白同源物前体161 2494287 O-乙酰GD3神经节苷脂合酶176 2507439 多配体蛋白聚糖3(硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白)218 118115Cyr61蛋白(生长因子结合蛋白)382 3219172 胶原蛋白α1(Ⅴ)286 461671Ⅰ型胶原蛋白α1159 1082724 前列环素刺激因子259 1777354 SHPS-1.BIT254 205167120kDa唾液酸糖蛋白(肝溶酶体膜蛋白)482 1708023 K-磷脂酰肌醇蛋白聚糖224 1139548 与抽搐有关的基因产物6Ⅱ型前体105 135818G-蛋白偶合凝血酶受体482 129731蛋白质二硫键异构酶322 1172451 基底膜蛋白聚糖(基底膜硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)165 1709256 神经蛋白聚糖(蛋白聚糖核心蛋白前体)264 2367641 神经纤维网-2(semaphorin Ⅲ受体)211 126638赖氨酰氧化酶308 2627143 神经钙粘着蛋白459 3123675 Notch140 1718156 血管内皮细胞生长因子534 627989内皮缩血管肽转化酶89 114393输送钠/钾的腺苷三磷酸酶β-1链工业实用性本发明提供了一种检测和分离编码分泌肽的cDNA的方法，该方法使用了一种能够在细胞表面通过其二聚化引发细胞增殖但缺乏分泌能力的肽。由于该方法利用细胞增殖作为检测指标，因此它特别容易且灵敏。而且，与能够检测短DNA片段的传统方法相比，该方法能够检测和分离含较长肽编码区的cDNA，因此它从一级分离克隆中提供了更多的信息。此外，该方法能够检测和分离包括Ⅰ型和Ⅱ型膜蛋白的分泌蛋白。
序列表&#60110&#62中外制药株式会社北村俊雄&#60120&#62信号序列捕获方法&#60130&#62C1-902PCT&#60150&#62JP 1997-324912&#60151&#621997-11-26&#60160&#6215&#60210&#621&#60211&#6243&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的引物序列&#60400&#621tgcggccgcc ctggagctgc gcccgcgatc ctgctaccgt tta 43&#60210&#622&#60211&#6229&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工合成的引物序列&#60400&#622gtatgtcgac tcaaggctgc tgccaatag 29&#60210&#623&#60211&#62579&#60212&#62DNA&#60213&#62人工序列&#60220&#62&#60223&#62人工序列的描述人工改造的人体mpl序列&#60220&#62&#60221&#62CDS&#60222&#62(1)..(573)&#60400&#62 3gcg gcc gcc ctg gag ctg cgc ccg cga tct cgc tac cgt tta cag ctg 48Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu1 5 10 15cgc gcc agg ctc aac ggc ccc acc tac caa ggt ccc tgg agc tcg tgg 96Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly Pro Trp Ser Ser Trp20 25 30tcg gac cca act agg gtg gag acc gcc acc gag acc gcc tgg atc tcc 144Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser35 40 45ttg gtg acc gct 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1 5 10Thr Val Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser15 20 25Thr Gln Pro Trp Glu His Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu30 35 40Leu Asn Leu Ser Arg Asp Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu45 50 55Val Ile Ser Glu Met Phe Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr60 65 70Arg Leu Glu Leu Tyr Lys Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu75 80 85 90Lys Gly Pro Leu Thr Met Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro95 100 105Pro Thr Pro Glu Thr Ser Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser110 115 120Phe Lys Glu Asn Leu Lys Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys125 130 135Trp Glu Pro Val Gln Glu Ala Ala Ala Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser140 145 150Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln155 160 165 170Gly Pro Trp Ser Ser Trp Ser Asp Pro Thr Arg Val Glu Thr Ala Thr175 180 185Glu Thr Ala Trp Ile Ser Leu Val Thr Ala Leu His Leu Val Leu Gly190 195 200Leu Asn Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala205 210 215His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu Trp 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权利要求
1．一种肽，它能够在细胞表面通过二聚化诱导细胞增殖并且该肽缺乏分泌能力。
2．权利要求1的肽，其中该肽得自细胞因子受体。
3．权利要求1的肽，其中该肽得自mpl。
4．权利要求2或3的肽，其中该肽为配体非依赖型。
5．权利要求1的肽，其中该肽包括SEQ ID NO4的氨基酸序列。
6．编码权利要求1-5中任意一项的肽的DNA。
7．一种载体，其含有权利要求6的DNA和cDNA在该DNA的5′-上游区的克隆位点。
8．权利要求7的载体，其中该载体得自逆转录病毒。
9．权利要求7或8的载体，其中将cDNA插入权利要求6的DNA的5′-上游。
10．一种细胞，其携带权利要求9中所述载体。
11．权利要求10的细胞，其中该细胞为哺乳动物的细胞。
12．一种检测被待测试的cDNA编码的肽是否含有分泌能力的方法，该方法包括(a)将测试cDNA与权利要求7的载体连接，(b)将(a)中制得的载体导入细胞中，和(c)培养(b)中制得的转化体，并检测细胞增殖能力。
13．一种分离编码具有分泌能力的肽的cDNA的方法，该方法包括(a)将cDNA文库与权利要求7的载体连接，(b)将(a)中制得的载体导入细胞中，(c)培养(b)中制得的转化体，并检测细胞增殖能力，和(d)选择(c)中经鉴定具有细胞增殖能力的阳性细胞，并从所述细胞中分离该cDNA。
14．权利要求12或13的方法，其中载体得自逆转录病毒，并且将被导入载体的细胞是哺乳动物的细胞。
15．一种编码具有分泌能力的肽的cDNA，其是用权利要求13的方法分离的。
16．一种肽，其是由权利要求15的cDNA编码的。
全文摘要
一种编码缺乏分泌能力的人体mp1的DNA,它是通过去除稳态活性mp1的分泌信号和其胞外域主要部分制得的。该DNA与测试cDNA、编码已知分泌蛋白的cDNA和另一编码除去了分泌信号区域的相同蛋白的cDNA连接,所得每一种嵌合基因在细胞中表达以检查细胞增殖能力。在含作为测试cDNA的编码已知分泌蛋白的cDNA的细胞中检测到细胞增殖,然而对除去了分泌信号区域的编码相同蛋白的cDNA没有检测到细胞增殖。因此,通过构建cDNA文库并通过上面的方法筛选它,可以检测和分离编码包括Ⅰ型膜蛋白和Ⅱ型膜蛋白的分泌蛋白的cDNAs。
文档编号C12N15/12GK1285847SQ98812969
公开日2001年2月28日 申请日期1998年11月26日 优先权日1997年11月26日
发明者北村俊雄, 小嶋哲郎 申请人:中外制药株式会社, 北村俊雄