专利名称：维生素b6的酶促生产的制作方法
技术领域：
本发明涉及从1-脱氧-D-苏-戊酮糖(此后表示为DTP)和4-羟基-L-苏氨酸(HT)酶促生产维生素B6的方法。本发明中所用的术语“维生素B6”包括吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。
维生素B6是对于动物、植物和微生物营养必需的维生素之一。并且对于人类来说也是非常重要的药物或食品添加剂。本发明的目的是提供从DTP和HT酶促生产维生素B6的高效方法。
已有很多关于维生素B6发酵生产的研究。已知各种属于酵母属[G.H.Scherr和M.E.Rafelson，应用细菌学杂志，25,187-194(1962)]、毕赤酵母属[N.Nishino,K.Fujii和T.Kamikubo，农业生物化学，37,553-559(1973)]、克雷伯氏菌属[R.Suzue和Y.Haruna，维生素学杂志，16,154-159(1970)]、无色杆菌属[M.Ishida和K.Shimura，农业生物化学，34,327-334(1970)]、芽孢杆菌属[W.Pflug和F.Lingens,Hoppe-Scyler’s Z.,Physiol.Chem.,359,559-570(1978)]和黄杆菌属[Y.Tani,T.Nakarmatsu,T.Izumi和K.Ogata，农业生物化学，36,189-197(1972)]的微生物用于生产维生素B6。但至今还没有商业上有吸引力的生产维生素B6的酶促方法。近来在欧洲专利公开0 765 938 A2中描述了一种发酵生产维生素B6的方法，该方法是在有氧条件下培养基中培养属于根瘤菌属能合成该维生素的微生物；其中培养基除了含有可吸收的碳源和可消化的氮源、无机盐及其它养分外，还含有提高维生素B6效价的其它物质如DTP和HT。虽然这种近来才知道的方法以高产率生产维生素B6，但是还有提高其效率的余地。
本发明使得以比目前更高的效率从DTP和HT生产维生素B6成为可能。现已发现，从微生物细胞制备的无细胞提取物能在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的参与下从DTP和HT合成维生素B6，所述微生物是例如根瘤菌属、中华根瘤菌属、黄杆菌属、金黄杆菌属、乳杆菌属、弓形菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、埃希菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微小杆菌属、酵母属、Yamadazma、毕赤酵母属或假丝酵母属。
因此本发明涉及从DTP和HT酶促生产维生素B6的方法，包括使DTP和HT与从能由DTP和HT合成维生素B6的微生物细胞制备的酶反应体系接触，所述接触在NADP+、NAD+和ATP的参与下发生。本发明进一步涉及维生素B6的酶促生产方法，包括在NADP+、NAD+和ATP的参与下，使DTP和HT与含有来自能合成维生素B6的微生物的无细胞提取物的酶反应体系接触，所述能合成维生素B6的微生物是例如属于以下属的微生物根瘤菌属、中华根瘤菌属、黄杆菌属、金黄杆菌属、乳杆菌属、弓形菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、埃希菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微小杆菌属、酵母属、Yamadazma、毕赤酵母属或假丝酵母属。
反应混合物中维生素B6的含量可以按照D.R.Osborne和P.Voogt的方法〔食品中的养分析，Academic Press,London,224-227(1978)〕，用卡尔酵母ATCC 9080通过生物分析得到测定。
为实施本发明的方法，属于例如根瘤菌属、中华根瘤菌属、黄杆菌属、金黄杆菌属、乳杆菌属、弓形菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、埃希菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微小杆菌属、酵母属、Yamadazma、毕赤酵母属或假丝酵母属的微生物细胞可以通过在含有可吸收的碳源、可消化的氮源、无机盐和其它微生物生长必需养分的培养基中培养所述微生物得到。可以用作碳源的是例如葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糊精和甘油。可用作氮源的是例如蛋白胨(peptone)、酵母提取物、豆粉、玉米浆、肉浸汁、硫酸铵、硝酸铵、尿素及以上物质的混合物。另外，可以用作无机盐的是硫酸盐；盐酸或磷酸的钙盐、镁盐、锌盐、锰盐、钴盐和铁盐。并且，如果需要，传统的营养素或消泡剂如动物油、菜油或矿物油也可以包含在培养基内。培养基的pH值可以是约5～9，优选的是约6～8。培养的适当温度范围是约10℃～45℃，优选的是25℃～40℃。培养时间通常是约1～5天，优选的是约1～3天。培养期间通风和搅拌通常带来有利的结果。
能在本发明方法中使用的微生物包括所有属于以下属的菌株根瘤菌属、中华根瘤菌属、黄杆菌属、金黄杆菌属、乳杆菌属、弓形菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、埃希菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微小杆菌属、酵母属、Yamadazma、毕赤酵母属和假丝酵母属。任何需要这些微生物的人可从公共保藏处(培养物保藏中心)如日本发酵研究所(IFO),Osaka得到。这些保藏菌株的例子是苜蓿根瘤菌(也称为苜蓿中华根瘤菌)IFO 14782(DSM号10226)，产吲哚黄杆菌(也称产吲哚金黄杆菌)IFO 14944，短乳杆菌IFO 13110，烟草节杆菌IFO 14234，枯草杆菌IFO 3007，植生克雷伯氏菌IFO 3317，大肠杆菌IFO 13168，恶臭假单胞菌IFO3738，嗜麦芽寡养单胞菌属(也称为嗜麦芽假单胞菌或嗜麦芽黄单胞菌)IFO 12692，阴沟肠杆菌IFO 3320，粘质沙雷氏菌IFO 12648，产氨棒杆菌(也称为产氨短杆菌)IFO 12612，谷氨酸棒杆菌(也称为谷氨酸短杆菌)IFO 12168，乙酰微小杆菌(也称为乙酰短杆菌)IFO 12146，季也蒙毕赤酵母(也称为Yamadazma guillermondii)IFO 1016，酿酒酵母IFO 0304和IFO 0306及热带假丝酵母IFO 0199和IFO 0587。在这些微生物中，本发明优选使用苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM号10226)，产吲哚黄杆菌IFO 14944，枯草杆菌IFO 3007，大肠杆菌IFO13168，粘质沙雷氏菌IFO 12648，产氨棒杆菌IFO 12612，谷氨酸棒杆菌IFO 12168，季也蒙毕赤酵母IFO 10106和酿酒酵母IFO 0306。
从培养所获细胞制备无细胞提取物，可以采用一般的方法如声裂法、玻璃珠细胞破碎或弗氏压榨匀浆器(French press homogenizer)破裂细胞，如果需要，可以在上述方法破裂之前用细胞溶解酶如溶菌酶或消解酶在15℃～45℃，优选地20℃～40℃处理1～3小时。例如，培养液离心后，用盐水冲洗所得细胞并悬浮于缓冲剂如含有蔗糖、作为一般酶稳定剂的二硫苏糖醇(DTT)和苯甲基磺酰氟(PMSF)的Tris-HCl缓冲剂(pH7.5)中。细胞破裂后，将所得溶液离心以分离细胞残渣，其上清液可以用作无细胞提取物。
酶反应体系含有如上制备的无细胞提取物或那些通过一般的酶纯化方法如硫酸铵沉淀或凝胶过滤层析部分纯化的物质。选择性地，也可以使用微生物的静止细胞或正在生长的细胞。除了可加入无细胞提取物，还可向酶反应体系加入作为酶底物的DTP和HT和作为辅因子的NADP+、NAD+和ATP。加入体系的DTP、HT、NADP+、NAD+和ATP的量可以根据所用的反应体系来改变。但是通常酶反应体系中的DTP、HT、NADP+、NAD+和ATP的量是0.1mM或更多，对于DTP和HT优选1mM～10mM，对于NADP+和NAD+优选0.05mM～5mM，更优选0.2mM～0.4mM，对于ATP优选1mM～20mM，更优选3mM～7mM。酶反应体系中镁离子或锰离子的加入可促进反应，并且同时加入这两种离子可得到更好的结果。可以使用提供这些离子的盐类如镁和锰的盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐或磷酸盐。所加入的镁离子和锰离子的量也可以根据所用的反应体系来改变。但通常锰离子的浓度是0.1mM～100mM，优选5mM～10mM，镁离子的浓度是3mM～300mM，优选20mM～50mM。
为了启动酶反应，可以使用对从DTP和HT生产维生素B6没有影响的缓冲溶液。为此目的优选使用Tris-HCl缓冲液。酶反应适当地在6.0～8.5，更优选地7.0～8.0的pH值范围内进行。合适的温度是15℃～45℃，优选20℃～40℃。保温时间可以根据反应条件来改变，但通常是30分钟～5小时，更优选地2～4小时。
在上述条件下从DTP和HT生产的维生素B6可以容易地按照下述的回收。例如，反应结束后，反应混合物中的蛋白通过加热、酸、碱或有机溶剂变性沉淀并通过离心除去。为此目的，可以使用一般用于从上清液提取某些产物并适合于维生素B6各种特性的方法。因此例如，用离子交换树脂纯化上清液中的维生素B6。进一步从酒精和水的混合物中重结晶所需产品。
本发明通过以下实施例得到更详细的说明；然而应该理解本发明并不限于这些特定实施例。实施例1无细胞提取物的制备苜蓿根瘤菌IFO 14782(DSM号10226)在含有1％葡萄糖、0.5％聚胨(Nippon Seiyaku公司，日本)、0.2％酵母提取物(Difco)、0.05％MgSO4·7H2O、0.001％MnSO4·5H2O和0.001％FeSO4·7H2O的接种培养基中于28℃培养17小时。将接种培养物转移到盛有200ml含有4％葡萄糖、2％聚胨、0.2％酵母提取物、0.05％MgSO4·7H2O、0.05％MnSO4·5H2O、0.001％FeSO4·7H2O和一滴消泡剂CA-115(Nippon Yushi公司，日本)的发酵培养基的500ml培养瓶中。然后培养瓶在摇瓶器上于28℃振荡。培养72小时后，通过以10,400xg离心10分钟从400ml培养液收集细胞，并用0.85％NaCl溶液洗两次，再用含有15％蔗糖、0.1mM PMSF和1mM DTT的10mMTris-HCl(pH7.5)缓冲液洗一次，然后贮存于-30℃直至用于制备无细胞提取物。
以下操作全部在冰水中或在4℃进行。将贮存于-30℃的细胞融化并且悬浮于5ml含有15％蔗糖、0.1mM PMSF和1mM DTT的10mMTris-HCl(pH7.5)缓冲液中。使细胞悬浮液以200kg/cm2流过弗氏压榨匀浆器(Dhtake Works有限公司)。将所得匀浆以34,800xg离心30分钟以除去细胞残渣。使10毫升上清液逆着1升含有15％蔗糖、0.1mM PMSF和1mM DTT的80％硫酸铵溶液透析，并通过34,800xg离心30分钟来收集沉淀。将沉淀溶于10毫升含有15％蔗糖和0.1mM PMSF的Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中并逆着相同缓冲液透析过夜，将透析的溶液保存于-30℃直至用于酶反应。用Lowry方法〔Lowry等，生物化学杂志，193,265(1951)〕测定无细胞提取物中的蛋白含量，为11.4mg/ml。实施例2从DTP和HT酶促生产维生素B6通过于28℃温育含有500μl表1中所列反应混合物的试管来进行酶反应。完全反应体系含有2.5mM DTP、2.5mM HT、0.38mM NADP+、0.38mM NAD+、5mM ATP、193.25μl无细胞提取物和80mM Tris-HCl缓冲液(pH7.50)。温育2小时后，通过在沸水浴中加热3分钟终止反应，以10,000xg离心10分钟，然后通过于37℃温育含有15μl上清液、10μl1mg/ml酸性磷酸酶(Boehringer Mannheim GmbH，德国)和10μl100mM醋酸盐缓冲液(pH5.0)的试管用磷酸酶处理上清液。温育后，向试管中加入1800μl水，并用微生物学方法按照下述使用卡尔酵母ATCC9080进行测定。标准吡哆醇溶液(0～2μg/ml)用蒸馏水稀释1.21×10-2。将100μl稀释的标准溶液或样品和3ml含有卡尔酵母ATCC 9080的维生素B6分析培养基(Nissui公司，日本)按此顺序加入试管，并在28℃以30°角培养。培养17小时后，通过加入5ml 0.1N盐酸终止细胞生长，然后测定样品于660nm的吸光度。通过将样品的混浊度与卡尔酵母ATCC 9080的标准生长曲线比较确定样品中维生素B6的量。结果完全反应体系中产生97ng/ml/mg蛋白/小时的维生素B6。另一方面，从完全反应体系缺失一种成分时，反应体系中没有维生素B6产生。而且向完全反应体系统添加8.4mM MnCl2、32mM MgCl2或两者都加时，反应体系中分别产生119、123或587ng/ml/mg蛋白/小时的维生素B6。结果表明，无细胞提取物、NADP+、NAD+和ATP对于从DTP和HT生产维生素B6是必需的，而MnCl2和MgCl2可促进维生素B6生产。表1从DTP和HT酶促生产维生素B6
完全反应体系2.5mM DTP、2.5mM HT、0.38mM NADP+、0.38mM NAD+、5mM ATP、193.25μl无细胞提取物和80mMTris-HCl缓冲液，pH7.50。实施例3用如实施例1和实施例2所述的相似方法测试各种微生物的无细胞提取物的维生素B6产量。将一环表2中所列的每个菌株在各自的接种培养基琼脂平板上于28℃培养17小时。将2ml接种培养物转移到盛有100ml生产培养基和1滴消泡剂的500ml培养瓶中，然后于28℃在摇瓶器上振荡。表2中列出的用于培养每个菌株的接种培养基和生长培养基的成分总结于表3中。表2微生物及其培养基
表3培养基成分
培养24小时后，通过离心从400ml培养液中收集每个菌株的细胞，用0.85％NaCl溶液洗2次，并用含15％蔗糖、0.1mM PMSF和1mMDTT的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)洗一次。所得细胞悬浮于5ml相同缓冲液中。如表4中所示，产吲哚黄杆菌IFO 14944、短乳杆菌IFO13110、烟草节杆菌IFO 14234、枯草杆菌IFO 3007、植生克雷伯氏菌IFO 3317、大肠杆菌IFO 13168、恶臭假单胞菌IFO 3738、嗜麦芽寡养单胞菌IFO 12692、阴沟肠杆菌IFO 3320或粘质沙雷氏菌IFO 12648的细胞通过流经弗氏压榨匀浆器或通过超声破裂(Cosmo Bio有限公司)进行破碎。有些微生物细胞在破碎之前用2mg溶菌酶(Sigma)或200单位消解酶(Sigma)/ml细胞悬浮液在30℃处理1小时。将所得匀浆离心以除去细胞残渣，将上清液逆着含有15％蔗糖和0.1mM PMSF的10mMTris-HCl(pH7.5)缓冲液透析并用作无细胞提取物。
通过在28℃培养含有500μl反应混合物A或反应混合物B的试管来进行酶反应，反应混合物A包含2.5mM DTP、2.5mM HT、0.38mMNADP+、0.38mM NAD+、5mM ATP、193.25μl无细胞提取物和80mM Tris-HCl缓冲液，pH7.50，反应混和物B补加了8.4mM MnCl2和32mM MgCl2。温育2小时后，通过在沸水浴中加热3分钟来终止反应，将混合物以10,000xg离心10分钟，用磷酸酶在37℃处理上清液。温育30分钟后，使用卡尔酵母ATCC 9080，通过生物分析法测定反应混和物中产生的维生素B6。结果，如表4所总结的，反应混合物A和B中分别产生7～23和33～139ng/ml/mg蛋白/小时的维生素B6。表4用无细胞提取物生产维生素B6
F弗氏压榨，U超声破碎*在破碎前，用2mg溶菌酶(Sigma)/ml细胞悬浮液在30℃处理1小时。**在破碎前，用200单位消解酶(Sigma)/ml细胞悬浮液在30℃处理1小时。反应混合物A:2.5mM DTP、2.5mM HT、0.38mM NADP+、0.38mM NAD+、5mM ATP、无细胞提取物和80mM Tris-HCl缓冲液，pH7.50，总体积500μl。反应混合物B:2.5mM DTP、2.5mM HT、0.38mM NADP+、0.38mM NAD+、5mM ATP、8.4mM MnCl2、32mM MgCl2、无细胞提取物和80mM Tris-HCl缓冲液，pH值7.50，总体积500μl。
权利要求
1．从1-脱氧-D-苏-戊酮糖(DTP)和4-羟基-L-苏氨酸(HT)生产维生素B6的方法，此方法包括使DTP和HT与从能由DTP和HT合成维生素B6的微生物细胞制备的酶反应体系接触，于是在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)存在的情况下发生所述的接触。
2．根据权利要求1所述的方法，其中酶反应体系中DTP、HT、NADP+、NAD+和ATP的浓度是0.1mM或更多，对于DTP和HT优选1～10mM，对于NADP+和NAD+优选0.05mM～5mM，更优选0.2～0.4mM，对于ATP优选1mM～20mM，更优选3mM～7mM。
3．根据权利要求1或2所述的方法，其中酶反应体系另外含有锰离子、镁离子或锰离子和镁离子的混合物。
4．根据权利要求3所述的方法，其中锰离子和镁离子的浓度是对于锰离子，0.1mM～100mM，优选5mM～10mM；对于镁离子，3mM～300mM，优选20mM～50mM。
5．根据权利要求1～4中任意一项所述的方法，其中制备酶反应体系的酶反应是在pH值6.0～8.5优选7.0～8.0和温度15℃～45℃优选20℃～40℃的条件下进行30分钟到5小时，优选地2小时到4小时。
6．根据权利要求1～5中的任意一项所述的方法，其中酶反应体系含有来自属于以下属的微生物的无细胞提取物，所述微生物属是根瘤菌属、中华根瘤菌属、黄杆菌属、金黄杆菌属、乳杆菌属、弓形菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏菌属、埃希菌属、假单胞菌属、寡养单胞菌属、肠杆菌属、沙雷氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、微小杆菌属、酵母属、Yamdazma、毕赤酵母属或假丝酵母属。
7．根据权利要求6所述的方法，其中酶反应体系含有来自以下一种或多种微生物的无细胞提取物，所述微生物是苜蓿根瘤菌(也称为苜蓿中华根瘤菌)IFO 14782(DSM号10226)，产吲哚黄杆菌(也称为产吲哚金黄杆菌)IFO 14944，短乳杆菌IFO 13110，烟草节杆菌IFO14234，枯草杆菌IFO 3007，植生克雷伯氏菌IFO 3317，大肠杆菌IFO 13168，恶臭假单胞菌IFO 3738，嗜麦芽寡养单胞菌属(也称为嗜麦芽假单胞菌或嗜麦芽黄单胞菌)IFO 12692，阴沟肠杆菌IFO3320，粘质沙雷氏菌IFO 12648，产氨棒杆菌(也称为产氨短杆菌)IFO 12612，谷氨酸棒杆菌(也称为谷氨酸短杆菌)IFO 12168，乙酰微小杆菌(也称为乙酰短杆菌)IFO 12146，季也蒙毕赤酵母(也称为Ymadazyma guilliermondii)IFO 10106，酿酒酵母IFO 0304和IFO0306及热带假丝酵母IFO 0199和IFO 0587。
8．根据权利要求7所述的方法，其中酶反应体系含有来自以下一种或多种微生物的无细胞提取物，所述微生物是苜蓿根瘤IFO 14782(DSM号10226)，产吲哚黄杆菌IFO 14944，枯草杆菌IFO 3007，大肠杆菌IFO 13168，粘质沙雷氏菌IFO 12648，产氨棒杆菌IFO12612，谷氨酸棒杆菌IFO 12168，季也蒙毕赤酵母IFO 10106和酿酒酵母IFO 0306。
全文摘要
一种维生素B
文档编号C12P17/12GK1232875SQ9910508
公开日1999年10月27日 申请日期1999年4月15日 优先权日1998年4月15日
发明者T·星野, M·田添 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司