专利名称：一种经分离筛选的屎肠球菌纯培养物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种经分离筛选的屎肠球菌(Enterococcus faecium)的纯培养物及其应用，该纯培养物已于二零零零年一月二十五日由武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC NO:M99016。
屎肠球菌(Enterococcus faecium)广泛存在于自然界，也是畜禽胃肠道中的正常菌群。屎肠球菌能通过抑制动物胃肠道致病性细菌如大肠杆菌、沙门氏杆菌等，促进有益微生物的定植，调节动物的微生态平衡(参考文献《中国微生态学杂志》，1998,10(1):59～60；《Food Science and Technology Today》,1998,12(1):46-50；《动物微生态学》，1994年第一版，北京中国农业出版社；《肠道微生物》，1996年台湾养猪科学研究所出版；《生物技术在饲料工业中的应用》，1995年第一版，北京中国农业出版社；《动物医学进展》，1997,18(1):38-41；《J.Appl.Bacteriol》,1989,66:365-378；《Annual reviews inmicrobiology》,1977,31:107-133；《J.Appl.Bacteriol》,1996,81(5):474～480)。屎肠球菌可用常规菌种分离方法分离，但对屎肠球菌及其在畜禽胃肠道微生态调节的作用研究较少，对屎肠球菌作为畜禽胃肠道微生态调节剂的研究，如其耐酸性、耐胆盐特性、耐热性、安全性等则未发现。
本发明的第一个目的是提供一种能应用于制造畜禽胃肠道微生态调节剂的屎肠球菌纯培养物。
本发明的第二个目的是应用上述菌种制造仔猪胃肠道微生态调节剂。
本发明的第一个目的是这样实现的其包括，培养基选择、粪便样品采集、接种及培养筛选，其特征在于经胆汁耐受性筛选检测证实能耐受30％～40％胆汁；经耐酸性筛选检测证实在pH3.0条件下保温2小时，存活率为1.4％；经安全性筛选检测证实无害。选择KF培养基(参考文献现代细菌学培养基和生化试验手册，1992年第一版，北京中国科学技术出版社)，采集猪的新鲜粪便，适当稀释后接种于KF培养基平板，置烛缸内45℃培养18-24小时，挑菌落，纯化后经全自动细菌分析仪(美国VITEC全自动细菌分析仪)筛选鉴定。由于用作微生态调节剂的微生物菌株需要有较好的耐酸、耐6.5％氯化钠及耐胆汁特性，保证菌株在胃肠道内不失活，经40％胆汁、6.5％氯化钠和耐酸性筛选检测(参考文献动物源乳杆菌筛选及生物特性参数测定《江苏农学院学报》，1997,18(1):1-5；Comparison of the bile salts and sodium dodecyl sulfate stressresponses in Enterococcus faecalis 《Applied and Environmental Microbiology》,1996,62(7):2416-2420)，从鉴定出的屎肠球菌纯培养物中进一步筛选出耐胆汁、耐酸和能在6.5％氯化钠条件下正常生长的屎肠球菌纯培养物。将含有108和109cfu/ml活菌的发酵液分别给1日龄健康雏鸡腹腔注射和口服，在整个试验期内未发现任何毒副作用。
本发明的上述方案可以这样完善其特征在于该纯培养物经药敏检测表明其对氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、青霉素G、利福平、氯林可霉素、环丙氟哌酸、托布霉素、红霉素、氧氟沙星、SMZ、洛克沙生、泰乐菌素、奎乙醇、阿散酸、呋喃唑酮、莫能霉素耐药；对杆菌肽、盐霉素中等耐药。经85℃热处理3min，该纯培养物存活率在82％以上。当该纯培养物用作饲料添加剂时，需要考虑其对饲料中常用抗生素的耐受性以及其对饲料制粒高温的耐受性问题，该纯培养物经药物敏感系统检测(美国VITEC全自动细菌分析仪)及耐高温检测(参考文献《生物技术在饲料工业中的应用》，1995年第一版，北京中国农业出版社；Survival of lactic acid bacteria in the human stomach andadhesion to intestinal cells《Journal of Dairy Science》1987,70:1-12；Survival,physiology,and lysis of lactococcus lactis in the digestive tract<Appl.Envir.Microbiol.>1999,65:4881-4886)，确定了其对不同抗生素及温度的耐受性。
本发明的第二个目的是这样实现的仔猪胃肠道微生态调节剂其特征在于菌泥5％～8％(W/V)，油相制膏材料8％～16％(W/V)，水相制膏材料70％～80％(W/V)，营养辅料5％～10％(W/V)。本发明的微生态调节剂是一种由油相和水相混合而成的膏状乳化剂，乳化剂有利于保持微生物的活性以及便于粘附于仔猪胃肠道，营养性辅料的作用是为活菌在胃肠道的快速增殖提供营养。菌泥是经发酵并离心的屎肠球菌纯培养物按照一定的活菌数比例用水相制膏材料重悬浮的产物。
上述发明可以这样完善其特征在于油相制膏材料由含不饱和脂肪酸的植物油和司本80(脱水三梨醇酯类)按15～20∶1混匀，121℃高压灭菌制成。水相制膏材料由2％-3％的Na2HPO4溶液与2％-3％的KH2PO4溶液按2～7∶1混匀后，加入0.85％的NaCL,0.5％～1％的吐温80(聚氧乙烯脱水三梨醇酯类)，121℃高压灭菌制成。营养性辅料由葡萄糖2％～8％(W/V)，蔗糖1％～8％(W/V)，脱脂奶粉1％～8％(W/V)，高分子聚合物1％～3％(W/V)混匀，121℃高压灭菌制成。
其具体配方可以如下菌泥5％～8％，植物油8％～16％(W/V)，司本80 0.5％～1％(W/V)，Na2HPO42％-3％(W/V)，KH2PO42％-3％(W/V)，NaCL0.85％(W/V)，吐温80 0.5％～1％(W/V)，葡萄糖2％～8％(W/V)，蔗糖1％～8％(W/V)，脱脂奶粉1％～8％(W/V)，高分子聚合物1％～3％(W/V)，蒸馏水40％～50％(W/V)。脱水三梨醇酯类和聚氧乙烯脱水三梨醇酯类分别是亲油性和亲水性乳化剂，毒性较低，另外，高分子聚合物(羧甲基纤维素)既有乳化作用，又可帮助菌体粘附。
本发明通过对屎肠球菌的分离筛选，特别是经胆盐耐受性检测、耐酸性检测及安全性检测、药敏试验筛选出能应用于畜禽胃肠道微生态调节剂的屎肠球菌特殊菌种，以达到将该菌种用于各种畜禽胃肠道微生态调节剂的实用目的；应用本发明上述菌种制成菌泥，配以油相制膏材料、水相制膏材料及必要的营养辅料可以制成供仔猪用的胃肠道微生态调节剂。
实施例1屎肠球菌的筛选鉴定(1)筛选培养基的制备月示蛋白胨10g，酵母浸膏10g，麦芽糖20g，乳糖1g，氯化钠5g，甘油磷酸钠10g，溴甲酚紫0.015g，叠氮钠0.4g，红四氮唑(TTC)0.1g，琼脂20g，蒸镏水1000ml，除TTC、溴甲酚紫外，其他成分混合加热溶解，调pH值至7.4，再加入溴甲酚紫和1％TTC溶液10mml，混匀，煮沸5分钟；取新鲜粪便1g，无菌水稀释104倍，取0.1ml接种于培养基平板，45℃厌氧培养48小时，挑取单菌落纯化并传代多次、保存。(2)分离菌种在美国VITEK全自动细菌分析仪上鉴定，并进行药敏检测。筛选鉴定的屎肠球菌纯培养物经VITEK全自动细菌分析仪证实能耐受40％的胆汁和6％的氯化钠，因此，纯培养物进一步进行耐酸性、耐热性和安全性检测。将1011cfu/ml浓度的纯培养物分别置pH2.5、pH3.0的营养肉汤中37℃保温30分钟，检测其存活率，选择存活率最高的菌种进行耐热性检测，将1011cfu/ml浓度的候选菌株置85℃保温1～10分钟，检测其存活率，选择存活率最高的菌种进行安全性检测，将108cfu/ml、109cfu/ml浓度的菌液分别给1日龄雏鸡腹腔注射及口服(1ml/只)，15日内经观察及解剖，实验动物均无不良反应。实施例2菌泥作为饲料添加剂的应用(1)菌泥制作发酵过程挑取实施例1所属的，在斜面保存的屎链球菌单菌落4～5个，接种于装有1000ml培养基(配方见实施例1，培养基中不加琼脂、TTC和溴甲酚紫)的三角瓶中，37℃静置培养8小时，作为种子液；取种子液接种于装有25升灭菌的生产用培养基的发酵罐中，37±1℃静置培养14小时；生产用培养基制备蛋白胨，10g；牛肉浸膏，5g；氯化钠，5g；葡萄糖，1g；碳酸钙，1g；蒸馏水，1000ml；pH调至7.6；离心发酵结束后，菌液在室温25-30℃，转速4000转/min条件下，离心30min，离心后除去上清夜，取菌泥，用水相制膏原料调整菌体浓度为100亿/ml，备用。(2)喷料、混料将液相菌泥10ml与饲料1公斤混匀，饲喂。实施例3以菌泥为基础制作颗粒添加剂屎肠球菌(CCTCC NO:M99016)菌泥5％～10％(W/W)，营养性辅料10％～40％(W/W)，稳定剂10％～20(W/W)％，填充料40％～60％(W/W)。将上述成分混匀，制粒。在55℃温度下干燥40～60min，过40目筛，包装即成。实施例4含屎肠球菌纯培养物的仔猪专用膏剂型微生态调节剂的生产工艺菌泥的制作按实施例2方法进行，不同之处在于菌泥用水相制膏原料调整菌体浓度为1000亿/ml，体积为膏体总体积的5％，备用；水相制膏原料的配制甲液Na2HPO421.3g，加蒸馏水至1000ml；乙液KH2PO420.42g，加蒸馏水至1000ml；把甲液80ml，乙液20ml混匀，加入NaCl0.85g溶解后加热至121℃，高压灭菌30分钟备用，水相制膏原料使用量占膏体总体积的75％；
油相制膏原料的配制市售食品级大豆油与司本-80按20∶1的比例混匀后加热至121℃，30分钟高压灭菌备用，油相制膏原料使用量占膏体总体积的10％；辅料的配制5％(W/V)葡萄糖，5％(W/V)蔗糖，2％(W/V)寡糖，0.5％(W/V)吐温-80,2％(W/V)羧甲基纤维素混匀后加热至121℃，高压灭菌30分钟备用，使用量占总体积的10％；制膏将菌泥5％、水相制膏原料75％、油相制膏原料10％及辅料10％按比例加入无菌的高速匀浆器中，充分匀浆即制得益生膏产品。
仔猪专用膏剂型微生态调节剂的应用效果选择同一栏舍母猪生产的健康乳猪9窝共78头，每窝乳猪随机均分成试验组与对照组选择本发明的益生膏进行试验；试验方法为了剔除母体效应，每窝取一半乳猪(试验组)分别于第2、7日龄各饲喂本发明制得的益生膏，每头每日0.5～0.8ml，记录所有参试乳猪1～28日龄的腹泻日期，于28日龄称个体重；试验结果分析由表2可见，试验组的腹泻次数对照组有减少，0～7日龄减少43.75％；8～28日龄减少32.56％；全期减少35.59％；结果如下项目 试验组对照组样本数(头) 3939初生重(kg) 1.77±0.251.56±0.3328日龄重(kg) 6.40±1.465.79±1.531～28日龄日增重(kg) 0.165±0.050.15±0.151～7日龄腹泻次数9168～28日龄腹泻次数 2943试验结果证明在乳猪第2、7日龄分别饲喂0.5～0.8ml益生膏可减少乳猪的腹泻、对促进乳猪的生长有良好效果。
权利要求
1.一种经分离筛选的屎肠球菌(CCTCC NO:M99016)纯培养物，其包括，培养基选择、粪便样品采集、接种及培养筛选，其特征在于分别经胆汁耐受性、耐酸性、安全性筛选检测合格。
2.根据权利要求1所述的纯培养物，其特征在于经药敏筛选检测表明该纯培养物对氨苄青霉素、氯霉素、庆大霉素、青霉素G、利福平、氯林可霉素、环丙氟哌酸、托布霉素、红霉素、氧氟沙星、SMZ、洛克沙生、泰乐菌素、奎乙醇、阿散酸、呋喃唑酮、莫能霉素耐药；对杆菌肽、盐霉素中等耐药。
3.根据权利要求1或2所述的纯培养物，其特征在于经耐热筛选检测，该纯培养物存活率在82％以上。
4.一种使用权利要求1纯培养物的仔猪胃肠道微生态调节剂，其特征在于菌泥5％～8％(W/V)，油相制膏材料8％～16％(W/V)，水相制膏材料70％～80％(W/V)，营养辅料5％～10％(W/V)。
5.根据权利要求4所述的调节剂，其特征在于油相制膏材料由含不饱和脂肪酸的植物油和司本80按15～20∶1混匀，121℃高压灭菌制成。
6.根据权利要求4所述的调节剂，其特征在于水相制膏材料由2％-3％的Na2HPO4溶液与2％-3％的KH2PO4溶液按2～7∶1混匀后，加入0.85％的NaCL和0.5％～1％的吐温80，121℃高压灭菌制成。
7.根据权利要求4所述的调节剂，其特征在于营养性辅料由葡萄糖2％～8％(W/V)，蔗糖1％～8％(W/V)，脱脂奶粉1％～8％(W/V)，高分子聚合物1％～3％(W/V)，121℃高压灭菌制成。
8.根据权利要求4、5、6、或7所述的调节剂，其特征在于菌泥5％～8％(W/V)，植物油8％～16％(W/V)，司本80 0.5％～1％(W/V),Na2HPO41％-2％(W/V),KH2PO40.5％-1％(W/V),NaCL0.85％(W/V)，吐温80 0.5％～1％(W/V)，葡萄糖2％～8％(W/V)，蔗糖1％～8％(W/V)，脱脂奶粉1％～8％(W/V)，高分子聚合物1％～3％(W/V)，蒸馏水40％～50％(W/V)。
全文摘要
本发明涉及一种经分离筛选的屎肠球菌(CCTCCNO:M99016)及其应用。经培养基选择、粪便(猪)样品采集、接种及培养筛选,其特征是:分别经胆汁耐受性、耐酸性、安全性筛选、检测获得能应用于制造畜禽胃肠道微生态调节剂的特殊屎肠球菌纯培养物。并在此基础上,制成仔猪生态调节膏剂、畜禽饲料添加剂等。
文档编号A61K35/74GK1314466SQ00114138
公开日2001年9月26日 申请日期2000年3月21日 优先权日2000年3月21日
发明者谢明权, 陈庄, 陈平洁, 廖玲, 禹慧敏 申请人:广东省农业科学院畜牧研究所