专利名称：强力抗感染型重组合异种骨的制备方法
技术领域：
本发明涉及抗感染型重组合异种骨的制备方法。
自1965年美国Urist发现骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins,BMP)以来(Urist MR.Science,1965,150893)，具有诱导骨形成的生物材料的开发与研究，在全世界得到广泛注目。我国第四军医大学西京骨科医院全军骨科研究所胡蕴玉教授等在此基础上经十余年研究，从牛皮质骨中提取高效诱导成骨活性的bBMP，然后再与去抗原的牛松质骨作为载体，复合制成具有诱导成骨活性，又不引起免疫排斥反应的重组合异种骨(Recombinant Bone Xenograft,RBX)，经动物实验及临床应用(用于骨折延迟愈合，骨不连，骨缺损，矫形骨植等)获得成功，并于1995年授予专利权(ZL942 44566X)。
临床上对于开放性骨折合并骨缺损或感染性骨缺损清创后一期，以及在慢性骨与软组织感染中，以往国内外人们多局部应用抗生素如庆大霉素与骨水泥(聚甲基丙烯酸酯)混合的链珠[Klemmk,E.MOrthop Surg.,1 980,25(4),182-183；Sanderson,P.JJ.AntimicrobChemother.,1989,210,522;Martindale The Extra Pharmacopoeia30ed.,1993；孟丽君等中国药学杂志，1992,27(4),225,1993,28(1),39～40；杨宽宏等陕西医学杂志，1992,21(11),661；苏天福等人民军医，1994,(12),29]，以及庆大霉素EACR链珠(谭富生等四川医学，1991,12(5),283～285)等。最近，栗向东等制备了庆大霉素重组合异种骨复合体，提供了一种较新抗感染骨移植材料(栗向东等，第四军医大学学报，1999,20(1),59～61)。
庆大霉素虽有一定的抗感染作用，但存在以下不足抗菌谱不广，对某些革兰氏阳性球菌及厌氧菌不敏感；对敏感菌的抗菌活性也较低。80年代后由于庆大霉素的广泛应用，临床分离耐药菌株迅速增加，绿脓杆菌、沙雷杆菌和吲哚阳性变形杆菌对其耐药率甚高(陈新谦等新编药物学，第14版，70页，人民卫生出版社)，已在我国成为严重的问题。另据上海医科大学抗生素研究所1989年提供，肠杆菌科细菌中不同菌属对庆大霉素的耐药率约20～40％，绿脓杆菌耐药率40～50％或以上，阴沟杆菌、产气杆菌、硝酸盐阴性杆菌以及其它不动杆菌属的耐药率更高，如此大大限制了庆大霉素的使用(胡文铎等国家基本药物及新特药临床指南，1996年版，27-28页，天津科技翻译出版公司)。此外，庆大霉素临床应用过敏致死的病例已有报导(侯金成，中国药业，2000,9(11),60)。
70年代后期，氟喹诺酮类抗菌剂的出现给化学合成药物在抗感染领域带来了令人振奋的期望，因为它们具备理想抗感染剂所具有的全部特征既可口服也可非肠胃道给药；体内外抗菌活性高，对大多数细菌的MIC90＜2μg/ml；抗菌谱广，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、需氧菌和一些厌氧菌，甚至分枝杆菌；有较高的组织及血浆浓度和高清除率，在体内分布很广，在组织和体液中均有分布且浓度较高；化学及生物学性能稳定，与其它一些药物包括硝基咪唑类药物配伍性好；相对毒性较低，具有独特的抗菌作用机制，与其它抗生素无交叉耐药性，耐药倾向相对较小；以及在常用抗感染药中从成本效果分析，它们是预防手术感染中一类最佳选择等。目前它们已用于各科敏感菌感染的治疗，包括也广泛应用于外科手术感染预防和治疗。在各科感染疾患的治疗中，临床平均有效率90％以上，细菌清除率也平均在80％以上。
基于上述许多特点，国内外竞相开发与应用这类药物，其发展速度十分惊人。曾有人预言，这类抗菌剂将成为今后抗感染药物的一类主导产品。
自从第一个氟喹诺酮类抗菌药物诺氟沙星(氟哌酸，Norfloxacin)问世以来，至目前国内外上市及临床应用的这类药物，按上市年代先后计有培氟沙星(甲氟哌酸，Pefloxacin)、环丙沙星(环丙氟哌酸，Ciprofloxacin)、依诺沙星(恩诺沙星、Enoxacin)、氧氟沙星(氟嗪酸，Ofloxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)、妥氟沙星(妥舒沙星，Tosulfloxacin)、替马沙星(Temafloxacin)、氟罗沙星(Floroxacin)、卢氟沙星(Rufloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、纳的沙星(Nadifloxacin)及左氧氟沙星(左氟沙星，Levofloxacin)等。
硝基咪唑类化合物是新一类抗厌氧微生物药物(温玉麟等，医药工业，1985，16(7)，324-330)。它们对厌氧微生物的最典型代表菌——脆弱类杆菌作用非常显著，抑菌和抗菌性极好，临床疗效确实，各种厌氧微生物对它们的耐药性非常小；具有卓越的吸收、穿透进入人体组织的能力；可各种途径给药，正常剂量和短期治疗毒性低，副作用轻微，耐受性好等特点。迄今，临床上已广泛应用的代表药物有甲硝唑(Metronidazole,MTZ)及替硝唑(Tinidazole,TNZ)，奥硝唑(Ornidazole,ONZ)正在研制开发中。这三种药物对厌氧微生物的抑菌浓度范围(MIC50～MIC100)通常在0.03-16μg/ml之间。在前两种临床应用的药物中，TNZ的抗菌活性及抗厌氧菌感染的疗效，明显优于MTZ，且安全性也比MTZ高。此外，其生物利用度也比MTZ高，半衰期也较MTZ长(约12-14小时)；临床上TNZ具有起效快、疗效高、维持时间长等特点。
以上这两类抗菌剂之间伍用时无相互反应，其水溶液状态也无配伍禁忌，各自的稳定性也不受影响。
本发明的目的是提供一种强力抗感染型重组合异种骨制备方法，采用目前国内外习用的抗菌谱广，抗菌活性强，毒副反应少，耐药倾向相对较小的氟喹诺酮类抗菌剂与专性抗厌氧菌的硝基咪唑类抗菌剂伍用，共同组成复方，在适宜的药学上人体可接受的溶剂中与及酸类(无机的与有机的)存在下，按一定重量比与RBX组合，制成强力抗感染RBX，使产品取代庆大霉素RBX，有望成为既有骨诱导成骨修复骨缺损促进骨愈合等作用，同时也具有局部乃至全身的强力抗感染能力。
本发明具体的实施方法包括下述步骤(1)重组合异种骨(RBX)制备依据中国专利ZL94244566.X公开的制备方法，精称一定量BMP(BMP制备方法将动物皮质骨经盐酸脱钙、盐酸胍抽提等生化分离技术，包括低温高速离心，即可制得骨形态发生蛋白)，剪碎，浸入一定量纯化液(4M盐酸胍液/0.05M氯化钙液)中，置冰箱过夜，用匀浆器匀浆使BMP完全溶解。精称一定量的载体骨粒(发明者所在单位自制)，与BMP溶液混合，置真空器中于700mmHg抽真空10min，进气，搅拌，如此反复5次进行复合。复合用料比为载体(0.5g、1.0g、2.0g、4.0g)BMP 30mg。将复合好的RBX放入透析袋内，于4℃用纯化水透析72小时，每2小时换水一次。将透析完了的RBX置冻干机中冻干，称重，即得RBX。
(2)、抗感染型重组合异种骨制备依据本发明方法进行。
配制抗菌液精密称取氟喹诺酮类药物(以下简称为A)和硝基咪唑类药物(以下简称为B)各一定量(预先按投料量及投料比计算好各自用量)，溶解于灭菌注射用水或灭菌生理盐水或灭菌5％葡萄糖溶液中(溶解用量视两药投量量和浓度及投料比而定)，加入适宜的酸液(无机的或有机的)，调节pH合格后搅拌使溶解澄清，补加水至所需总量，过滤澄明，即得复方抗菌溶液。
RBX药物吸附添加在无菌条件下按RBX骨粒吸付添加药物A之重量比为0.1～5.0，吸付添加药物B之重量比为0.2～10.0计算，称取并计数RBX骨粒，置适宜容器中用预先计算好的复方抗菌溶液浸泡24小时，冷冻干燥，称重，按规格要求在无菌条件下装入复合纸袋中，封口，再封于PVC平板内，环氧乙烷灭菌，最终外封铝箔袋即得。
下面通过实施方法对本发明作进一步说明。
实施例1精密称取诺氟沙星3.0g和甲硝唑4.5g，加到5％葡萄糖溶液约950ml中，加适量酸，调节pH为4.5～6.5，搅拌使溶液澄清，补加水至1000ml，除菌过滤至澄明。称取全项化验合格的RBX骨粒3g(约450个骨粒)，置于已灭菌的适宜容器中，在无菌操作条件下将上述抗菌药物溶液加入浸泡24小时，冷冻干燥至干，称量，分包装于特制的包装袋内，环氧乙烷灭菌即得。
实施例2——实施例30，制法同实施例1，其它见表1。
表1实施例2——实施例30举例
*括号内数字为用量范围。
权利要求
1.一种强力抗感染型重组合异种骨，其特征在于它的制备方法包括下述步骤(1)重组合异种骨(RBX)制备将骨形态发生蛋白(BMP)浸入4M盐酸胍液/0.05M氯化钙液的纯化液中，置冰箱过夜，用匀浆器匀浆使BMP完全溶解，加入载体骨粒与BMP溶液混合，置真空器中于700mmHg抽真空10min，进气，搅拌，如此反复5次进行复合，然后将复合好的RBX放入透析袋内，于4℃用纯化水透析72小时，每2小时换水一次，将透析完了的RBX置冻干机中冻干，即得RBX；载体骨粒与BMP重量比为0.5-4.0∶0.03。(2)、将抗菌剂氟喹诺酮类药物或硝基咪唑类药物溶解于人体可接受的溶剂中，pH为4.5～6.5，按计量加入RBX骨粒浸泡24小时，RBX骨粒吸付氟喹诺酮类药物之重量比为0.1～5.0，吸付硝基咪唑类药物之重量比为0.2～10.0；冷冻干燥，无菌条件下装入复合纸袋中，封口，再封于PVC平板内，环氧乙烷灭菌，最终外封铝箔袋即得强力抗感染型重组合异种骨。
2.根据权利要求1所述的强力抗感染型重组合异种骨，其特征在于所述的氟喹诺酮类药物选用诺氟沙星、培氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、氧氟沙星、洛美沙星、妥氟沙星、替马沙星、氟罗沙星、卢氟沙星、司帕沙星、纳的沙星或左氧氟沙星。
3.根据权利要求1所述的强力抗感染型重组合异种骨，其特征在于所述的硝基咪唑类药物选用甲硝唑、替硝唑或奥硝唑。
全文摘要
本发明涉及抗感染型重组合异种骨的制备方法。它是采用高抗菌活性的氟喹诺酮类药物和硝基咪唑类药物为抗感染剂,按比例与重组合异种骨(RBX)进行吸附添加,RBX骨粒与氟喹诺酮类药物的重量比为0.1～5.0。RBX骨粒与硝基咪唑类药物的重量比为0.2～10.0。制品在骨科临床上用于植骨时具有骨诱导活性的同时,尚具有创位强力抗感染之功效。
文档编号A61P19/00GK1296804SQ0013216
公开日2001年5月30日 申请日期2000年12月19日 优先权日2000年12月19日
发明者温玉麟, 倪文琴 申请人:天津中津药业股份有限公司