皮肤护理组合物的制作方法

专利名称：皮肤护理组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及涂敷于人体皮肤的局部用组合物及其在改进皮肤的状况和表观中的应用。
消费者正逐渐追求抗衰老化妆产品，其可以处理或延迟慢性老化和光老化皮肤的明显征兆，例如皱纹、纹线、下垂、色素沉着过度和老年斑。
消费者还常常在化妆品中寻求除抗衰老以外的益处。敏感皮肤的概念也使消费者更加需要可以改善敏感、干燥和/或薄片状皮肤的表观和状况并缓解红色和/或刺激皮肤的化妆品。消费者也期待具有油/皮脂控制效果的化妆品。
许多人关心其皮肤色素沉着的程度。譬如，带有老年斑或雀斑的人可能希望此类着色斑点变得不明显。其他人可能希望减小因与日光接触引起的皮肤颜色变深或希望增亮其天然肤色。为了满足这些需要，人们努力尝试开发出减少黑素细胞中颜色生产的产品。然而，目前的物质被认为易于产生不良副作用，如皮肤刺激性。
所以此类物质不适合化妆品使用，或者它们只可以在一定浓度下使用，而在该浓度下其皮肤增亮作用比预期的小。人们认为利用不同皮肤增亮物质的联合形式可以减小副作用，但使用联合形式却存在因竞争作用导致的皮肤增亮作用削弱的巨大危险。因此，特别需要改进化妆用皮肤增亮产品的有效性，使它们不刺激皮肤。
所属领域熟知用于改善皮肤的状况和表观的皮肤护理化妆和皮肤用组合物，其中含有聚不饱和必需脂肪酸的长链甘油三酯、游离酸及其碱或铵盐。譬如，GB 2181349 A特别公开了由亚油酸的甘油三酯组成的用于提高皮肤的光滑度和弹性的组合物。市售产品LinolaFett n，ex.Dr.August Wolff Gmbh购自干燥皮肤疾病和皮肤病的治疗，其特别含有偶联亚油酸的9，11异构体。
视黄醇(维生素A)是一种内源性化合物，其天然存在于人体中并且是上皮细胞分化所必需的。天然和合成维生素A衍生物(视黄醛类)业已被广泛应用于多种皮肤疾病的治疗中，而且已经作为皮肤修复和更新剂使用。譬如，视黄酸可以用来治疗多种皮肤病症，如痤疮、皱纹、老年斑和变色。参见如Vahlquist，A.等J.Invest.Dermatol.，Vol.94，Holland D.B.和Cunliffe；W.J.(1990)，pp.496-498；Ellis，C.N.等.，″Pharmacology of Retinols in Skin″，Vasel，Karger，Vol.3，(1989)，pp.249-252；Lowe，N.J.等，″Pharmacology of Retinols in Skin″，Vol.3，(1989)，pp.240-248，PCT专利申请号WO 93/19743。
WO99/26588公开了美容用抗老化皮肤霜剂，其中含有偶联亚油酸和可有可无的视黄酰基抗坏血酸酯，其是视黄酸酯。
然而，仍然存在对其他局部涂敷在皮肤上用于处理/延迟老化和光损伤皮肤的可见征兆(如皱纹、纹线、下垂、色素沉着过度和老年斑)的有效化妆品组合物的需求。
我们现在发现，通过将化妆品组合物涂敷在皮肤上可以获得对因慢性老化或光老化导致的正常(但化妆上不良的)皮肤状况，如皱纹、纹线、下垂、色素沉着和老年斑的有效治疗和预防，所述的化妆品组合物是由与视黄酸、视黄醇或视黄醇酯(视黄基酯)和/或酶酰基CoA视黄醇转移酶(ARAT)或卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)的抑制剂(此后是指LRAT/ARAT抑制剂)联用的特定脂肪酸偶联亚油酸和/或其衍生物组成。我们还发现，此类化妆品组合物的使用有利于提供除抗老化以外的其他皮肤益处，如平抚敏感和/或刺激皮肤，控制油/皮脂的分泌且增亮皮肤。
上述现有技术不曾公开偶联亚油酸与视黄酸、视黄醇或视黄基酯和/或LRAT/ARAT抑制剂的特殊协同作用，也没有将此类特定联合形式应用于处理皱纹、敏感皮肤、干燥皮肤、控制油/皮脂分泌或增亮皮肤。
发明概述根据本发明的第一方面，提供一种局部用组合物，其含有(a)偶联亚油酸和/或其衍生物；(b)视黄酸、视黄醇或视黄基酯和/或LRAT/ARAT抑制剂；和(c)皮肤可接受赋形剂。
按照本发明的第二方面，提供一种产生至少一种选自下列的皮肤护理益处的美容方法处理/预防起皱纹、下垂、干燥、老化和/或光损伤皮肤；提高皮肤中胶原的沉积作用，促使皮肤中核心蛋白聚糖的生产，增强组织修复；平抚刺激、红色和/或敏感皮肤；改善皮肤纹理、光滑度和/或坚固度；增亮皮肤；控制油/皮脂分泌，该方法包括在皮肤上涂敷上述局部用组合物。
本发明还涉及本发明组合物在产生至少一种选自下列皮肤护理益处中的应用处理/预防起皱纹、下垂、干燥、老化和/或光损伤皮肤；促进胶原沉积在皮肤中，促使皮肤中核心蛋白聚糖的生产，增强组织修复；平抚刺激、红色和/或敏感皮肤；改善皮肤纹理、光滑度和/或坚固度；增亮皮肤；和控制油/皮脂分泌。
根据本发明的另一方面，提供与视黄酸、视黄醇、视黄基酯和/或LRAT/ARAT抑制剂联合的偶联亚油酸及其衍生物在产生至少一种选自下列美容皮肤护理益处的化妆品局部用组合物中的应用处理/预防皱纹、下垂、干燥、老化和/或光损伤皮肤；促进胶原沉积在皮肤中，提高皮肤中核心蛋白聚糖的生产，增强组织修复；平抚刺激、红色和/或敏感皮肤；改善皮肤纹理、光滑度和/或坚固度；增亮皮肤；和控制油/皮脂分泌。
本发明的组合物、方法和应用产生抗老化益处，由此能够促使光滑和柔软皮肤具有改进的弹性并且减少或延迟皱纹和衰老皮肤的出现，同时改进皮肤颜色。因此获得表观、纹理和状况的全面改善，特别是皮肤的光泽、透明度和总体年轻化表观。本发明的组合物、方法和应用也有利于平抚和平缓敏感和/或刺激皮肤，增亮皮肤和控制油/皮脂的分泌。所以，本发明有利于提供广泛的皮肤护理益处。
此处所用的术语“处理”在其范围内包括减轻、延缓和/或预防上述正常皮肤状况(如皱纹、老化和/或光损伤)和/或刺激的皮肤，并且通过预防或减轻刺激、起皱且提高柔软性、坚固度、光滑度、弯曲性和弹性来总体上提高皮肤的品质并改善其表观和纹理。本发明的组合物、方法和应用可以有效处理已经起皱、老化、光损伤、刺激的病症，或者用于处理年轻皮肤以预防或减少上述那些因正常衰老/光老化过程导致的不良变化。发明详述偶联亚油酸(此后称为CLA)是二元不饱和长链(C18)脂肪酸。CLA包括一系列的亚油酸的位置和几何异构体，其中可以是位置(6，8)，(7，9)，(8，10)，(9，11)，(10，12)或(11，13)上顺式和反式双键的多种构型。因此，存在24种不同的CLA异构体。
本发明还包括游离酸的衍生物，因此其含有偶联亚油酸部分。优选的衍生物包括从酸的羧基的取代作用衍生的化合物，例如酯(如甘油三酯、甘油单酯、甘油二酯、磷酯)、酰胺(例如神经酰胺衍生物)、盐(例如碱金属和碱土金属盐、铵盐)；和/或那些从C18碳链的取代作用衍生的化合物，如α羟基和/或β羟基衍生物。
在甘油三酯衍生物的情况中，包括所有取代在甘油主链上的CLA的位置异构体。所述的甘油三酯必须含有至少一个CLA部分。例如，在甘油主链上的三个可酯化位置中，第1和2位置可以被CLA酯化而第3位被另一脂质酯化，或者同样地，CLA可以在甘油主链的1和3位上酯化而在2位上被另一脂质酯化。
适用于本发明的CLA的最优选异构体是顺式9反式11(c9 t11)或反式10顺式12(t10 c12)异构体。优选在所述的组合物中存在至少1％(重量)的总CLA(和/或CLA部分)是c9，t11和/或t10，c12异构体的形式。更优选在所述的组合物中存在至少20％(重量)且首选至少40％(重量)的总CLA和/或CLA部分是c9，t11异构体和/或t11，c12异构体的形式。
在特别优选的实施方式中，所述的偶联亚油酸富集c9 t11或t10，c12异构体。所谓“富集”是指组合物中存在至少50％(重量)的总CLA和/或CLA部分为顺式9，反式11或反式10顺式12异构体。优选在组合物中存在至少70％(重量)、更优选至少80％(重量)和首选至少90％(重量)的总CLA和/或CLA部分为c9，t11异构体或t10，c12异构体。
本发明的含有CLA的CLA和/或其衍生物是商购的油，其富集偶联亚油酸甘油三酯，如桐油或脱水蓖麻油(Unichema)。混合异构体产品购自Sigma，并且富集c9 t11异构体的CLA购自Matreya Inc.。同样地，按照本发明的优选实施方式CLA可以按照WO 97/18320所公开的方法制备，该文献在此引入作为参考。一个优选的制备方法公开在下面的实施例1中。
无论术语“偶联亚油酸”或“CLA”用于说明书中何处，其应被理解为包括含CLA部分的衍生物。CLA部分是指CLA衍生物的CLA脂肪酰基部分。
按照本发明所用的CLA是以有效量存在于所述的局部用组合物中。通常，活性物质的量占该组合物的0.0001％至50％(重量)。更优选该含量为0.01％至10％且首选0.1％至5％，从而以最小的成本得到最大的效益。
本发明的组合物还特别含有视黄酸、视黄醇、视黄基酯和/或LRAT/ARAT抑制剂。
术语″视黄醇″包括下列视黄醇的异构体全反式视黄醇、13-顺-视黄醇、11-顺-视黄醇、9-顺-视黄醇、3，4-二脱氢-视黄醇。优选的异构体是全反式视黄醇、13-顺-视黄醇、3，4-二脱氢-视黄醇、9-顺-视黄醇。首选全反式视黄醇，因为其可以广泛商购。
视黄基酯是视黄醇的酯。术语“视黄醇”业已在上文中定义。适用于本发明的视黄基酯是视黄醇的C1-C30酯，优选C2-C20酯，并且最优选C2-C3，和C16酯，因为它们更常用。
适用于本发明的优选的酯选自棕榈酸视黄基酯、乙酸视黄基酯、丙酸视黄基酯和亚油酸视黄基酯，因为这些化合物最易商购且最便宜。优选视黄基酯还归因于其功效。LRAT/ARAT抑制剂视黄醇是一种内源性化合物，其天然存在于人体中，并且是正常上皮细胞分化所必需的。视黄醇的酯在体内水解生成视黄醇。可以确信视黄基酯和视黄醇按照下面的机理在皮肤中代谢转化为视黄酸 然而，大多数内部使用的视黄醇迅速转化为失活脂肪酯储存在表皮细胞中(角化细胞)。
细胞中使视黄醇成为失活视黄基酯的酯化作用是通过源自酰基CoA的脂肪酰基在酶酰基CoA视黄醇转移酶(ARAT)催化下的转移，或者通过源自磷脂酰胆碱的酰基在酶卵磷脂视黄醇酰基转移酶(LRAT)催化下的转移来实现。这些酯化反应在角化细胞中非常有效--大多数(95％)的细胞视黄醛类化合物成为视黄基脂肪酯的形式。
因此，本申请中术语“LPAT/ARAT抑制剂”是指抑制这些酯化反应且通过提高视黄醇转化为视黄酸的可利用量来加强视黄醇的作用的试剂。
本发明范围内的LRAT/ARAT抑制剂通过下文实施例3所述的体外微粒体试验测定可证明是那些在100μM浓度下可以抑制至少20％的LRAT或ARAT催化的视黄醇酯化反应的化合物。在本发明的一个优选实施方式中，LRAT/ARAT抑制剂是在100μM浓度下抑制至少40％且首选至少50％的LRAT或ARAT催化的视黄醇酯化作用的化合物。下文实施例3中描述了用于测定化合物是否是LRAT/ARAT抑制剂的体外微粒体试验。
所以，如果一种化合物通过了这种体外微粒体试验，也就是它通过体外微粒体试验测定可以充分抑制LRAT或ARAT催化的视黄醇酯化作用，则它属于本发明，即使在本文中没有具体提及它。
此类LRAT/ARAT抑制剂的实例包括脂肪酸酰胺类、羟基脂肪酸酰胺类、神经酰胺、亚油甲苄胺(melinamide)、咪唑烷酮和环状脂族不饱和烃、萜烯和脂肪羟乙基咪唑啉表面活性剂。环状脂族不饱和化合物适用的环状脂族不饱和化合物按照上述体外微粒体测定试验来选择。
优选的环状脂族不饱和化合物选自环状脂族不饱和醛、酮、醇和酯，如α二氢大马酮、β二氢大马酮、β二氢大马酮、异二氢大马酮、大马酮、α紫罗酮、β紫罗酮、烯丙基α紫罗酮、异丁基紫罗酮、α甲基紫罗酮、γ甲基紫罗酮、brahmanol、檀香醇(sandanol)、α松油醇、新铃兰醛、乙基藏红花酯(ethyl saffranate)及其混合物。更加可取地，为了在最小成本下使性能最大化，环状脂族不饱和化合物选自二氢大马酮类化合物和紫罗酮类化合物。
最优选地，环状脂族不饱和化合物是α-二氢大马酮和/或α-紫罗酮。双萜类化合物适用的双萜类化合物按照上述体外微粒体测定试验来选择。优选的双萜化合物是香叶基香叶醇，其是视黄醇酯化作用的有效抑制剂。脂肪羟乙基咪唑啉表面活性剂包括在本发明中的脂肪羟乙基咪唑啉表面活性剂通过上述体外微粒体测定试验。优选的脂肪羟乙基咪唑啉类化合物具有下面通式 其中R是脂族饱和或不饱和、直链或支链含有8-20个碳原子的烃链。
更加可取地，所述脂肪羟乙基咪唑啉中的R含有8至18个碳原子，更优选11至18个碳原子。首选该脂肪羟乙基咪唑啉是油基羟乙基咪唑啉，这归因于其商购可用性和功效。脂肪酸酰胺更加可取地，所述的脂肪酸酰胺含有至少6个碳原子。适用的脂肪酸包括饱和或不饱和、直链或支链脂肪酸。适用的脂肪酸适宜含有8至24个碳原子，优选12至20个碳原子，并且首选12至18个碳原子，因为长链脂肪酸酰胺更加适宜皮肤的调理。在本发明的首选实施方式中，使用了必需脂肪酸的酰胺，因为必需脂肪酸为皮肤提供营养。必需脂肪酸的实例包括但不限于亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸、高γ-亚麻酸及其混合物。首选亚油酸，因为它也是神经酰胺的前体。
含在本发明中的优选酰胺是一-和二-烷醇酰胺，特别是必需脂肪酸。烷醇酰胺比烷基酰胺更加常用。
首选的脂肪酸酰胺选自亚油酸棕榈酸的一和二乙醇酰胺和磷脂酰乙醇胺，和椰油、二乙基椰油酰胺、亚油酰氨基二甲胺、二甲基亚油酰胺、二乙基亚油酰胺、二甲基棕榈酰胺(palmitide)、肉豆蔻酰基肌氨酸。羟基脂肪酸酰胺羟基脂肪酸的酰胺的结构如下所示 其中R1、R2和R4分别独立地选自氢和脂族饱和或不饱和、直链或支链烃链，其可以羟基化，含有1至20个碳原子R3是-(CH2)n，其中n是0至18的整数；更加可取地，R1、R2、R4购自独立地含有2至20个碳原子，更优选2至15个碳原子，首选3至13个碳原子。
优选该羟基酰胺是α-或β-羟基酸的酰胺，即n是0或1。
含在本发明组合物中的首选的羟基脂肪酸酰胺是乳酰胺-一乙醇酰胺、C13-β-羟基酸酰胺(2-羟基-C13-酰胺)、N-羟乙基-2-羟基-C16酰胺、12-羟基-N-(2-羟乙基)十八烷酰胺和蓖麻油的一乙醇酰胺。多环三萜羧酸(PTCA)适当LRAT/ARAT抑制剂的另一种实例是通过体外微粒体测定的PCTA。
优选PTCA是戊环三萜一元羧酸。
首选PTCA选自由乌索酸、齐墩果酸、glycerrhetinics acid和甘草酸。
PTCA可以商购自Aldrich和Sigma。含有PTCA的植物提取物适用于本发明，例如迷迭香属(迷迭香)、柿属(柿子)、连翘属(连翘)、熏衣草属(熏衣草)、夏枯草属(夏枯草)、毛果芍药、光果甘草(甘草)。
应理解，依赖于组合物的pH，PTCA可以以盐形式存在于组合物中，例如碱金属或碱土金属盐。神经酰胺神经酰胺例如可以是天然的神经酰胺、植物神经酰胺、短链神经酰胺、假神经酰胺或新神经酰胺。这些分子的通用结构公开在EP A711558中，该文献在此引入作为参考。首选的神经酰胺衍生物是乙酰神经鞘氨醇，这归因于其功效。
视黄酸、视黄醇、视黄基酯和/或LRAT/ARAT抑制剂在本发明组合物中的含量可以是该组合物的0.0001％至50％(重量)，优选0.01％至10％，首选0.1％至5％。皮肤可接受赋形剂本发明所用的组合物还含有皮肤/化妆上可接受赋形剂以给活性成分起稀释剂、分散剂或载体的作用。所述的赋形剂可以含有皮肤护理产品中常用的物质，如水、液态或固态润肤剂、硅油、乳化剂、溶剂、湿润剂、增稠剂、粉末、抛射剂等。
所述的赋形剂通常是在组合物的5％至99.9％(重量)，优选25％至80％(重量)，并且可以在其他化妆添加剂不存在下，构成该组合物的余量。任选的皮肤有益物质和化妆品添加剂除了活性剂以外，还可以含有其他特殊的皮肤有益活性剂，如防晒剂，其他皮肤增亮剂、皮肤晒黑剂。所述的赋形剂也可以进一步含有添加剂，如香料、遮光剂、着色剂和缓冲剂。产品制备、形式、应用和包装为了制备本发明方法中所用的局部组合物，可以采用制备皮肤护理产品的常规方式。活性成分一般以常规方式掺混在皮肤/化妆上可接受的载体中。活性成分首先可以适当地溶解或分散在一部分水中或另一部分溶剂或液体中以便掺混在所述的组合物内。优选的组合物是水包油或油包水或水包油包水乳液。
所述组合物可以是常规的皮肤护理产品的形式，如膏霜、凝胶和洗液、胶囊等。组合物也可以是所谓的”洗除式“产品，例如盆浴或淋浴用凝胶，可以含有活性剂的传递体系从而在漂洗中增强对皮肤的粘着作用。首选的产品是“免洗”产品，它是一种涂敷在皮肤上但无需在涂敷于皮肤之后进行一步有意的漂洗步骤的产品。
所述的组合物可以以常规方式包装为任何适当的样式，如罐、瓶、管、走珠等。也可以考虑将本发明的组合物包装为两种独立组合物的套盒，其中之一含有偶联亚油酸同时第二组合物含有视黄酸、视黄醇、视黄基酯/LRAT/ARAT抑制剂化合物，这两种独立的组合物可以同时或连续涂敷在皮肤上。
本发明的组合物也可以配制为适合口服消化的形式，如片剂、胶囊等。
对于需要处理的皮肤，每天可以实施一次或多次的本发明的方法。皮肤表观的改善一般是在3至6个月之后变得明显，这取决于皮肤的状况、本发明方法所用的活性成分的浓度、组合物的用量和其涂敷的频率。通常，将少量如0.1至5ml的的组合物涂敷在皮肤上，组合物取自适当的容器或涂敷器，并且用手或手指或适当装置铺展和/或擦抹到皮肤中。随后可以进行漂洗步骤，也可以不漂洗步骤，这取决于该组合物是否配制为免洗或洗除式产品。
为使本发明更加容易理解，给出下列实施例，其仅仅是举例说明。
通过混合将‘Analar试剂’(AR)氢氧化钠(0.6kg)溶于6kg的药用级丙二醇且在80-85℃下加热。令样品冷却，加入2kg的红花油。用标准小规模设备在170℃下回流该混合物3小时同时快速搅拌。令反应混合物冷却至约95℃，使搅拌器减速至中等速率，并且用1.280L溶于软化水(8L)的35.5％盐酸中和该混合物，令温度保持在约90℃。静置该反应混合物且除去水相。油相用2×1L的5％AR盐乳液和2×1L的软化水在90℃下洗涤，弃去任何皂样物质。富集CLA的油在100℃真空下干燥，此后在约50℃下排出且经含有Whatman滤剂和一薄层的硅藻土-hyflo-助滤剂的布氏系统过滤。将混合异构体CLA油储存在-25℃下直至需要。通过这种方法制备的油的组成如下表1所示表1
2.富集c9 t11异构体的CLA的制备(I)月桂基酯的制备将从红花制备的CLA(2.0kg)加入到2×摩尔当量的月桂醇(1-十二烷醇；98％Aldrich chemicals出产)和5.96kg的软化水。温度调至25℃且加入用少量水预混的1％(w/w)的念珠地丝菌(AmanoPharmaceuticals出品，日本)，同时剧烈搅拌。在44小时时中止该反应。将容器加热至80-90℃，排出水层，该油用软化水洗涤且在100℃真空下干燥30分钟。使油冷却至50℃，其经含有Whatman滤剂和一薄层的硅藻土-hyflo-助滤剂的布氏系统过滤。(II)富集c9，t11的CLA酯的分离通过分子蒸馏异25-35ml/分钟在130℃下除去残留的月桂醇。通过在158℃下以25-35ml/分钟的流量蒸发可以将残余物粗分为月桂基酯(富集c9，t11 CLA)和游离酸(富集t10，c12CLA)。通过在171℃下以30-40ml/分钟的流量进一步蒸馏可以除去任何残留在月桂基酯中的游离酸。90℃下用330ml的4M AR氢氧化钠中和2790g的月桂基酯残余物，随后从水相分离出油，油在热的软化水中洗涤3次，进一步用0.1M碱洗涤且用热水洗涤2次。富集月桂基酯的油样品按照上述方法干燥。(III)富集c9，t11CLA月桂基酯的皂化富集c9，t11CLA的月桂基酯用AR氢氧化钠/96％食用级乙醇皂化且用AR浓盐酸再酸化。将含有富集CLA游离脂肪酸的反应混合物在100℃下干燥且按照上述方法在约50℃下过滤。在132℃下以25-30ml/分钟蒸除月桂醇。为了除去任何残留的月桂醇，用SP392米赫毛霉脂肪酶(5％，批次lux 0110，Novo Nordisk出产)将反应混合物中存在的游离醇酯化为脂肪酸。在真空155℃下以15-20ml/分钟利用分子蒸馏从月桂基酯分离出含有富集C9 t11 CLA的脂肪酸。按照上述方法制备的富集C9 t11 CLA的组成如下表2所示
表2
(II)富集t10，c12CLA的制备在130℃下以25-35ml/分钟通过分子蒸馏除去残留的月桂醇。以25-35ml/分钟的流量通过在158℃下蒸发可以将残余物粗分为月桂基酯(富集c9，t1 CLA)和游离酸(富集t10，c12 CLA)。富集t10，c12 CLA的分离由上述步骤(II)得到的CLA游离酸重新在160℃-165℃下以20-30ml/分钟蒸馏从而降低酯的含量。通过在131℃和25-30ml/分钟的流量下蒸馏来进一步减少残留的月桂醇。为了除去任何残留的月桂醇，用SP392米赫毛霉脂肪酶(5％，批次lux 0110，Novo Nordisk出产)将反应混合物中存在的游离醇酯化为脂肪酸。在真空155℃下以15-20ml/分钟利用分子蒸馏从月桂基酯分离出含有富集C10 t12CLA的脂肪酸。按照上述方法制备的富集C10 t12 CLA的组成如下表3所示
表3
实施例2-t10，c12 CLA甘油三酯的制备按照实施例1制备的富集t10，c12 CLA(10g)与1.01g(10.1％)甘油(Pricerine 9083甘油CP，得自Ellis & Everards)混合，并且加入0.5g(约5％)的SP392米赫毛酶非特异性脂酶(米赫毛酶，NovoNordisk产，批次Lux 0110)。该混合物在真空60℃下旋转蒸发并且排出微量氮。
96小时后，该混合物经布氏滤器上的一个薄层的硅藻土高级(super-cel)助滤剂过滤中止该反应，收集CLA甘油三酯油相，其组成如下表4所示
表4
实施例3本实施例证明乳液利用视黄醇的酯化的体外微粒体试验来鉴定本发明范围内的LRAT/ARAT抑制剂。视黄醇的体外微粒体酯化的方法微粒体可以按照J.C.Saari和D.L.Bredberg，“视紫红素上皮中CoA和非CoA依赖的视黄醇酯化作用(CoA and Non-CoADependent Retinol Esterification in Retinal PigmentEpithelium)”J.Biol.Chem.23，8084-90(1988)所述的方法获得。
将含有0.1M磷酸钠pH7缓冲液、5mM二硫苏糖醇、2mg/ml牛血清白蛋白、40微摩尔棕榈酰基CoA、40微摩尔二月桂酰基磷脂酰胆碱、10微摩尔视黄醛和试验化合物或溶剂空白品的溶液在37℃下与微粒体部分一起培养1小时，该微粒体部分分离自牛视紫红素上皮细胞。培养之后，通过加入等体积的乙醇使该反应中止，并且用己烷提取生成的视黄基酯(视黄基棕榈酸酯得自ARAT催化的反应，并且视黄基月桂酸酯得自LRAT催化的反应)。除去己烷层，氮气下蒸发，残余物通过HPLC、在3.9×300mm C18反相柱上、利用80％甲醇、在四氢呋喃流动相中和荧光检测(325nm激发，480nm发射)下分析测定视黄基酯。用溶剂空白品存在下所生成的酯的量作为100％，用它来计算试验化合物对酯形成的抑制百分率。作为对照，通过沸腾5分钟使一等份的微粒体失活，这种处理抑制至少95％的酯形成。
所得结果概括在表5中。
表5
可以看出，乙酰基鞘氨醇、LODEA、LOMEA和羟乙基咪唑啉表面活性剂是有效的视黄醇酯化抑制剂，而其它表面活性剂和杂环化合物基本上没有活性。辛基羟乙基咪唑啉(R＝CH3(CH2)6)无法充分抑制LRAT。
该体外微粒体测定试验采用表6A和6B中所列的化合物进行。
表6A中的化合物是在100μM的浓度下测试。表6B中的化合物是在10μM的浓度下测试。
表6A
表6B
由表6A和6B的结果可以看出，某些环状脂族不饱和化合物，特别是紫罗酮类化合物和二氢大马酮类化合物是有效的LRAT和ARAT催化的视黄醇酯化作用的抑制剂。这些化合物中在视黄醇中所存在的三甲基环己烯环系。
体外微粒体测定试验是用另外的环状脂族不饱和化合物进行的。所得结果概括在表7中。
表7中的化合物是在100μM的浓度下进行测试。
表7
从表7中的结果可以看出，不是所有的环状脂族不饱和化合物皆可以抑制或充分抑制LRAT和ARAT催化的视黄醇酯化作用。
该体外微粒体测定试验是二萜类化合物，香叶基香叶醇或法尼醇进行的。
所得结果概括在表8中。
表8
1购自TCI America(Portland，Oregon)。也可以购自Sigma和CTCOrganics(Atlanta，Georgia)。2购自Givaudan Co.，Bedoukian Co.或Dragoco Co.
从表8中的结果可以看出，两种香叶基香叶醇和法尼醇均可抑制视黄醇酯化。香叶基香叶醇实质上是比法尼醇更加有效的酯化抑制剂。
现有技术了解，视黄酸是有效的抗衰老活性剂并可以诱使光损伤皮肤的皮肤修复。业已显示，在用视黄酸局部处理后、通过新胶原在皮肤中的沉积及合成可以使皱纹消失和皮肤修复(例如Griffiths等N.Eng.J.med.(1993)329，530-535)。人们普遍接受，通过用视黄酸提高皮肤内的胶原水平所致的皮肤基质的强化可以产生抗老化/皮肤修复的益处。前胶原-I是胶原的一种前体。涂敷试验化合物导致的前胶原-I的生产增强是胶原水平增高的一个标志。
征募两组妇女，她们在各自的外前臂上具有相同或几乎相同程度的轻度至中度光损伤。给她们提供存在于保湿基质中的0.05％视黄酸(Retinova)，并另外提供具有相似感觉特性但不含有活性成分的有色参比保湿霜(Dermacare洗液)作为安慰剂对照。在两组中的各个参加者的一条外前臂上涂敷Retinova，并且将安慰剂(Dermacare)涂敷在另一外前臂上。第1组每天在其外前臂上涂敷产品共14周，第2组在其外前臂上涂敷产品共28周。在研究结束时，从各前臂的被处理区域取两个总厚度为4mm的穿取的活组织检查。对由参加者采集的活组织进行免疫组织化学分析，从而鉴定视黄酸处理对皮肤胞外基质组成，核心蛋白聚糖和前胶原-I的表达的影响，将其与安慰剂处理的前臂进行对比。进行下列方法材料用于蜡切片的抗体稀释缓冲液是由Tris缓冲盐水(TBS)、3％牛血清白蛋白(BSA)、0.05％Triton X-100和0.05％叠氮化钠组成。前胶原-I的初级抗体(氨基末端)得自Chemicon International Inc.(cat#；MAB 1912，大鼠IgGl)并以1∶800的稀释度用于蜡切片上，切片用胰蛋白酶预处理(0.5mg/ml，25分钟，37℃)后，4℃下过夜。核心蛋白聚糖的初级抗体得自Biogenesis(兔多克隆)并以1∶800的稀释度用于蜡切片上，4℃下过夜。抗兔生物素化次级抗体得自DAKO(cat#；EO468，兔多克隆)，其以1∶400的稀释度用于蜡切片。抗兔生物素化次级抗体得自Amersham(cat#；RPN 1004，驴多克隆)，以1∶400的稀释度用于蜡切片。链霉抗生物素偶联的碱性磷酸酶得自Zymed(cat#；43-4322)，其以1∶2500的浓度使用。固红色原得自DAKO(cat#；K597)。Gills#血毒素(Haemotoxylin)核复染色得自Sigma(cat#；GHS-3)，将其过滤且无需稀释就可使用。胰蛋白酶得自Sigma(cat#；T-7186)且封固在载玻片上的得自DAKO的甘油凝胶(cat#；C563)中。方法将活组织切片的蜡切片封固在甲硅烷涂层的载玻片上并在55℃下烘烤18小时。用二甲苯和醇将载玻片脱蜡并置于水中，随后转移到TBS。用DAKO笔圈划切片。必要时用胰蛋白酶处理切片以便于抗原提取，如各自的抗体指示。当抗原提取是必要的时，将载玻片与0.5mg/ml的胰蛋白酶(Sigma Cat#；T-7186)在35℃下培养25分钟。随后用TBS(2×2分钟)漂洗掉蛋白酶。如果必要在抗原提取后或者在漂洗切片后直接地在加湿室中用存在于TBS中的5％次级抗体宿主血清的溶液/0.5％BSA/0.1％叠氮化钠作为封阻溶液在室温下将非特异性抗体结合封阻至少20分钟。倾去过量的封阻溶液，但不使切片干燥。随后切片与初级抗体(按照上文适当稀释)在加湿室中4℃下培养过夜。此后除去切片中的抗体，但不使切片干燥。载玻片随后用TBS漂洗除去未结合的初级抗体-漂洗1分钟，随后5分钟的洗涤共3次-此后与适当的次级抗体(按照上文适当稀释)在加湿室内室温下培养1小时。此后除去抗体溶液但不使切片干燥。载玻片在TBS中洗涤，漂洗1分钟后，4×5分钟洗涤，以便除去未结合次级抗体。对于生物素化次级抗体，切片与链霉抗生物素偶联物在37℃下培养45分钟，此后在TBS中漂洗除去未结合的链霉抗生物素偶联物。加入色原且在观察下显色以避免过度染色。此后将切片复染色且封固。
用光显微镜、通过免疫组织化学染色切片的目测评估来测定被视黄酸(Retinova#；D)和安慰剂(Dermacare)处理的位置之间在前胶原-I和核心蛋白聚糖的表达中的差异。
该试验鉴定出在局部涂敷视黄酸(Retinova)后光损伤皮肤中前胶原-I和核心蛋白聚糖两者皆明显增量调节，如下表9所示。
表9视黄酸处理在体内对皮肤中的前胶原-I和核心蛋白聚糖的作用
所以，胞外基质组分前胶原1和核心蛋白聚糖是视黄酸诱导的皮肤修复的可识别标志。
此后，用得自Bio-Rad的96孔生物斑装置按照制造商说明书中所述的方法将试验样本一式三份涂在一片预湿的Immobilon-P转移膜上。每孔中使用约200μl的培养基。令培养基经膜在重力作用下过滤(30分钟)，其后膜用PBS(200μl)洗涤2次。这些PBS洗涤液经膜在重力作用下过滤(2×15分钟)。此后将该生物印迹装置与真空复式接头连接且在抽滤下进行第三次和末次PBS洗涤。拆开该装置，取出膜并按照要求迅速切割，随后置于封阻缓冲液中4℃下过夜。由核心蛋白聚糖试验制备的膜用存在于PBS中的3％(w/v)BSA/0.1％(v/v)吐温20封阻，而那些前胶原-I分析的膜用存在于PBS中的5％(w/v)脱脂干燥奶粉/0.05％吐温封阻。
次日，室温下用1∶10000稀释的初级抗体探测2小时膜的人前胶原-I(MAB1912；大鼠单克隆；Chemicon Int.Inc.，Temecula，CA)或人核心蛋白聚糖(兔多克隆；Biogenesis)。此后，膜用TBS/0.05％吐温20(3×5分钟)洗涤，并且在室温下用1∶1000稀释的125I-偶联的抗大鼠或抗兔F(ab’)2片段(Amersham)按照要求培养1小时。此后，Immobilon抽提物用TBS/吐温20(3×5分钟)洗涤，随后令其在室温下空气中干燥。干燥的膜卷在玻璃纸中并在分子动力学磷光体筛下暴露16-18小时。
结束时，通过磷成像(phosphorimager)(Molecular DynamicsPhosphorimager SF)利用ImageQuantTM软件扫描暴露的筛。通过计算机辅助成像分析、利用ImageQuantTM中的定量工具评估印迹强度，标准化为细胞数目，并且相对于100个随意单位的载体处理对照值测定不同试验试剂对核心蛋白聚糖和前胶原-I合成的作用。
表10与LRAT/ARAT抑制剂联合的偶联亚油酸对于核心蛋白聚糖合成的协同作用
表10的结果表明，和对照品比较，偶联亚油酸与LRAT/ARAT抑制剂的联合形式协同增量调节人体皮肤成纤维细胞中前胶原-I和/或核心蛋白聚糖的合成。
核心蛋白聚糖在皮肤中的水平于皮肤状况和表观的改善有关。提高皮肤中核心蛋白聚糖的水平对于控制和矫正皮肤中胶原的沉积作用十分重要，其于许多皮肤益处有关，如皱纹消失和光损伤皮肤的皮肤修复。CLA与视黄酸的协同作用下表11表明，与视黄酸联合的偶联亚油酸对于人体皮肤成纤维下表中的前胶原-I的协同作用，并且给出了所涂敷活性剂的量。为了使结果标准化，相对于100随意单位的载体处理对照值测定试验物质的作用。试验中所用试剂的浓度对细胞的生存力没有影响。
表11未处理对照＝100％。所有结果用该值标准化。
表11的结果表明，和对照品比较，偶联亚油酸与视黄酸的联合形式协同增量调节人体皮肤成纤维细胞中前胶原-I的合成。
核心蛋白聚糖在皮肤中的水平于皮肤状况和表观的改善有关。提高皮肤中核心蛋白聚糖的水平对于控制和矫正皮肤中胶原的沉积作用十分重要，其于许多皮肤益处有关，如皱纹消失和光损伤皮肤的皮肤修复。
权利要求
1.一种局部用组合物，含有(a)偶联亚油酸和/或其衍生物，其中该亚油酸衍生物是甘油酯、酰胺、盐或取代偶联的亚油酸；(b)一种视黄酸、视黄醇、视黄基酯和/或LRAT/ARAT抑制剂；和(c)皮肤可接受赋形剂。
2.按照权利要求1的局部用组合物，其中所述的偶联亚油酸或其衍生物是顺式9反式11或反式10顺式12异构体。
3.按照权利要求1或2的局部用组合物，其中该组合物的组分(b)是视黄酸、视黄醇或视黄基酯。
4.按照权利要求3的局部用组合物，其中该组分(b)是视黄醇和亚油酰胺一乙醇酰胺(MEA)。
5.按照上述权利要求任一项的局部用组合物，其中所述的视黄基酯是视黄基亚油酸酯。
6.按照上述权利要求任一项的局部用组合物，其中该组合物是免洗组合物。
7.按照上述权利要求任一项的局部用组合物，其中至少1％(重量)的酸和/或其衍生物的偶联亚油酰部分是作为顺式9，反式11异构体和/或反式10，顺式12异构体存在。
8.按照上述权利要求任一项的局部用组合物，其中所述的LRAT/ARAT抑制剂是脂肪酰胺、羟基脂肪酸酰胺、神经酰胺、亚油甲苄胺、咪唑烷酮、环状脂族不饱和烃、萜烯或脂肪羟乙基咪唑啉表面活性剂，或它们的混合物。
9.按照权利要求8的局部用组合物，其中该环状脂族不饱和混合物选自环状脂族不饱和醛、酮、醇和酯，例如α二氢大马酮、β二氢大马酮、δ二氢大马酮、异二氢大马酮、大马酮、α紫罗酮、β紫罗酮、烯丙基α紫罗酮、异丁基紫罗酮、α甲基紫罗酮、γ甲基紫罗酮、brahmanol、檀香醇、α松油醇、新铃兰醛、乙基藏红花酯，和它们的混合物。
10.按照权利要求9的局部用组合物，其中该环状脂族不饱和混合物是α二氢大马酮或α紫罗酮
11.按照权利要求8的局部用组合物，其中所述的脂肪酸酰胺中的脂肪酸选自亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、γ亚麻酸、高γ亚麻酸，和它们的混合物。
12.按照权利要求11的局部用组合物，其中脂肪酸酰胺中的脂肪酸是亚油酸。
13.按照权利要求8的局部用组合物，其中所述的羟基脂肪酸酰胺是乳酰胺-一乙醇酰胺、C13-β-羟基酸酰胺(2-羟基-C13-酰胺)、N-羟乙基-2-羟基-C16-酰胺、12-羟基-N-(2-羟乙基)十八烷酰胺，和蓖麻油的一乙醇酰胺，以及它们的混合物。
14.按照权利要求8的局部用组合物，其中所述的萜烯是戊环三帖一羧酸。
15.按照权利要求8的局部用组合物，其中所述的神经酰胺是神经酰胺衍生物，其是乙酰基鞘氨醇。
16.一种提供至少一种选自下列的皮肤护理益处的美容方法处理/预防起皱纹、下垂、干燥、老化和/或光损伤皮肤；提高皮肤中的胶原水平，提高/维持皮肤中的核心蛋白聚糖水平，增强组织的修复；平抚刺激、红色和/或敏感皮肤；改善皮肤的纹理、光滑度和/或坚固度；增亮皮肤；控制油/皮脂的分泌；该方法包括将上述任一权利要求所述的局部用组合物涂敷在皮肤上。
17.权利要求1-15任一项所述的组合物在产生至少一种选自下列的皮肤护理益处中的应用处理/预防起皱纹、下垂、干燥、老化和/或光损伤皮肤；提高/维持皮肤中的胶原水平，提高/维持皮肤中的核心蛋白聚糖水平，增强组织的修复；平抚刺激、红色和/或敏感皮肤；改善皮肤的纹理、光滑度和/或坚固度；增亮皮肤；控制油/皮脂的分泌。
18.与视黄酸、视黄醇、视黄基酯和/或LRAT/ARAT抑制剂联合的偶联亚油酸和/或其衍生物在提供至少一种选自下列的化妆皮肤护理益处的化妆品局部用组合物中的应用，处理/预防起皱纹、下垂、干燥、老化和/或光损伤皮肤；提高/维持皮肤中的胶原水平，提高/维持皮肤中的核心蛋白聚糖水平，增强组织的修复；平抚刺激、红色和/或敏感皮肤；改善皮肤的纹理、光滑度和/或坚固度；增亮皮肤；控制油/皮脂的分泌。
全文摘要
本发明涉及一种局部用组合物,含有(a)偶联亚油酸和/或其衍生物,其中该亚油酸衍生物是甘油酯、酰胺、盐或取代偶联的亚油酸;(b)一种视黄酸、视黄醇、视黄基酯和/或LRAT/ARAT抑制剂;和(c)皮肤可接受赋形剂。该皮肤护理组合物适用于处理/预防正常但不良的皮肤状况,所述的皮肤状况选自起皱纹、下垂、光损伤皮肤、干燥皮肤和老年斑,并且可以平抚敏感皮肤。
文档编号A61K8/35GK1376051SQ00813274
公开日2002年10月23日 申请日期2000年7月11日 优先权日1999年7月30日
发明者K·E·巴雷特, M·R·格林, A·V·劳林斯 申请人:荷兰联合利华有限公司