专利名称：超氧化物歧化酶－4的制作方法
本申请是申请日为1994年5月31日、申请号为94195125.1、发明名称为“超氧化物歧化酶-4”的中国专利申请的分案申请。
本发明涉及新鉴定的多核苷酸，由此多核苷酸编码的多肽，此多核苷酸和多肽的应用，以及此多核苷酸和多肽的生产。更精确地说，本发明的多肽为超氧化物歧化酶(SOD-4)。
氧和体内诸如蛋白质，碳水化合物，脂类和核酸的生化化合物之间的反应需要很强的热动力学驱动力。如果这种反应完成，水，二氧化碳和大量废物将作为终产物形成，同时释放大量能量。生物化合物的氧化是有机体能量的来源。这些反应自发进行，但由于反应屏障的原因而非常缓慢。中间代谢中的酶可以克服这些屏障，与氧的最终反应发生在线粒体，在线粒体内氧原子被四个电子还原成水而不会释放出任何中间产物。此反应由电子传递链中的细胞色素氧化酶复合物完成，能量以ATP的形成被捕获。
但是，从氧原子到水的直接四步还原是唯一的，当氧原子自发反应或由酶催化进行时，此过程有时将被迫反应一步。一系列被称为超氧化物基团(O2)，过氧化氢(H2O2)，和羟基基团(OH-)的有反应活性和毒性的中间代谢物将形成。
其中的两个，O2-和OH-，具有单个未成对电子，因此被称为自由基。估计体内氧消耗的一小部分将形成有毒的还原中间产物。氧的毒性作用主要归因于这些中间产物的活动。
氧原子自身与生化化合物的反应缓慢，通常毒性反应是由产生升高的氧基团的过程起始的，这些毒性反应可直接破坏生化化合物或启动有氧的链式反应。
有些化合物与氧原子自发发生反应，即，这些化合物自氧化。几乎所有的自氧化都会导致有毒氧还原中间产物的形成。肾上腺素，邻苯三酚和几个其它化合物的自氧化导致超氧化物自由基的形成。当离子化的基团穿过含氧的水样溶液时，发现超氧化物基团是含量最高的基团。如此形成的有毒氧还原产物对细胞的杀灭能力具有十分重要的意义，但这些产物还可能导致周围组织的破坏。
过氧化氢总是在超氧化物通过歧化反应途径形成时形成。大多数体内的氧化酶直接将氧还原成过氧化氢。
生活在有氧环境中的有机体被迫进化出大量的保护性机制以抵抗有毒氧还原代谢物。这些保护性因子包括歧化超氧化物基团的超氧化物歧化酶(SOD)，在哺乳动物细胞和组织中SOD的数量相当稳定。这些酶中最知名的是CuZnSOD，CuZnSOD是一个含两个铜原子和两个锌原子的分子量为33,000的二聚体。CuZnSOD存在于细胞质和线粒体的膜间间隙。MnSOD是一个含四个锰原子的分子量为85,000的四聚体，主要位于线粒体的基质中。直到最近，人们还认为细胞外液体中缺乏SOD活性。但是，最近U.S.专利5,248,603披露胞外液(例如，血浆，淋巴液，滑液和脑脊髓液)中存在一种叫做EC-SOD的超氧化物歧化酶。
重组的人野生型CuZuSOD和其热稳定的双突变体(Cys-6-----Ala，Cys-111---Ser)已经在2.5A的分辨率上测定分析了其晶体结构。在一个锌结合位点上存在一个螺旋偶极相互作用，14个残基形成两个或多个结构保守的侧链以保证氢原子的结合，这些结构对活性位点结构，环的形成和Cys-111----Ser突变造成的稳定性提高看来是至关重要的。Parge，H.E.et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，896109-13(1992)。
CuZnSOD基因的突变发生在致命的神经退化性紊乱-家族性半身肌萎缩硬化的患者身上。CuZnSOD编码区的筛选揭示外显子1内的Ala4-Val突变是最经常发生的，在外显子2，4和5内鉴定出了突变，但在外显子3形成的活性位点区没有发现突变体。因此，缺陷型CuZnSOD与运动神经元死亡有关，也有助于了解或治疗家族性半身肌萎缩硬化。本发明的多肽，SOD-4，在结构和功能上与CuZnSOD有关。
日本专利4327541披露了一种用于器官移植后免疫反应的治疗药物，含有通过基因重组获得的人CuZnSOD的活性物质。
日本专利4312533披露了一种治疗大脑局部出血组合物，它包括重组的人CuZnSOD，抑制与局部出血相伴的延迟性神经坏死。
日本专利4248984披露了一种在血液中比SOD具有更长半寿期的超氧化物歧化酶衍生物，因此有助于治疗各种疾病。
欧洲专利499621披露了一种纯化重组CuZnSOD的方法和一种提高此多肽的B型同工类似物产量的方法。
日本专利2156884披露了一个具有超氧化物歧化酶特性的153个氨基酸的多肽和一个编码此多肽的DNA序列，和通过寄主细胞培养来生产DNA序列和此多肽的方法。
日本专利63313581披露了一个通过SOD与含氨基或羧基基团的化合物反应形成的具有药物活性的修饰超氧化物歧化酶。
日本专利63077822披露了一个使用类似人SOD的多肽作活性物质，改善器官功能的因子。
根据本发明的一个方面，提供了一个新的成熟多肽，即SOD-4，和SOD-4的片段，类似物和衍生物。本发明的多肽是人源性的。
根据本发明的另一个方面，提供了编码此多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。
根据本发明的另一个方面，提供了通过重组技术生产此多肽的方法。
根据本发明的另一个方面，提供了此多肽或编码此多肽的多核苷酸用作药物的方法，例如，治疗炎症，溃疡，心率失常，局部出血，浮肿，paraquat中毒，类风湿性关节炎和骨关节炎，降低再灌注损伤和降低血压。
根据本发明的另一个方面，提供了一个抗此多肽的抗体。从本文的教导中，本领域熟练技术人员应该明白本发明的这些和其它一些方面。
以下附图示出了本发明的实施方案。
图1显示了SOD-4基因的cDNA序列和推测的氨基酸序列。因为至少有两个框内ATG起始密码子，所以氨基酸序列编码此多肽成熟形式之一。成熟多肽可能在任一ATG密码子开始启动。氨基酸使用标准的单字母缩写。
图2显示SOD-4与其它11个来源于其它生物种的胞质CuZnSOD之间的氨基酸相似性。铜锌结合位点(用加粗字体)由6个His残基和1个Asp残基形成。Arg(R)残基对指引超氧化物到活性位点是必要的。相同残基由虚线表示，缺失由点表示。
图3显示人SOD-4的细菌表达和纯化的结果(SDS聚丙烯酰胺凝胶分离)。
图4显示重组SOD-4在COS细胞中的表达结果(SDS聚丙烯酰胺凝胶分离)。
根据本发明的一个方面，提供了编码具有图1推测氨基酸序列或由1994年3月22日保藏的ATCC 75716的克隆的cDNA编码的成熟多肽的分离核酸(多核苷酸)。
本发明的多核苷酸是从早期人脑cDNA文库中分离出来。它含有编码255个氨基酸的多肽的一个开放阅读框架。此多肽与从Schistosoma mansoni分离出来的CuZnSOD有最高的同源性，在151个氨基酸重叠中有51％相同，72％相似。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式，或DNA形式，DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，DNA可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。编码成熟多肽的编码序列可以与图1所示的编码序列相同，或与保藏克隆的编码序列相同，或者也可以是不同的编码序列，该编码序列由于遗传密码的丰余性或简并性，与图1的DNA或保藏的cDNA编码相同的成熟多肽。
编码图1的成熟多肽或编码由保藏的cDNA编码的成熟多肽的多核苷酸可以包括成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和另外的编码序列如前导序列或分泌序列或蛋白原序列；成熟多肽的编码序列(和任选的另外的编码序列)和非编码序列如内含子或成熟多肽编码序列的5’和/或3’非编码序列。
因此，术语“编码多肽的多核苷酸”包含如下的多核苷酸，即仅包括多肽编码序列的多核苷酸，以及包括另外的编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码具有图1的推导的氨基酸序列的多肽或编码由保藏的克隆的cDNA编码的多肽的片段、类似物和衍生物。这些多核苷酸的变异体可以是天然发生的该多核苷酸的等位基因变异体，或是该多核苷酸的非天然发生的变异体。
因此，本发明包括编码图1所示的相同成熟多肽或由保藏克隆的cDNA编码的相同成熟多肽的多核苷酸，以及这些多核苷酸的变异体，所述变异体编码图1的多肽或由保藏克隆的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物。这些核苷酸变异体包括缺失变异体、置换变异体和增加或插入变异体。
如上所述，多核苷酸可以具有为图1所示的编码序列的天然发生的等位基因变异体的编码序列，或保藏克隆的编码序列的天然发生变异体的编码序列。如本领域所公知的，等位基因变异体是多核苷酸的另一种形式，其可以置换、缺失或增加一个或多个核苷酸，但基本上不改变编码多肽的功能。
本发明的多核苷酸还可以具有在读框内与标记序列融合的编码序列，其可用于纯化本发明的多肽。标记序列可以是，例如，由pD10载体提供的六组氨酸标记物用于在细菌宿主中纯化与该标记物融合的成熟多肽，或者，例如，当使用哺乳动物宿主如COS-7细胞时，标记序列可以是血凝素标记物(HA)。HA标记物相应于由流感病毒血凝素蛋白衍生的表位(Wilson，I.，et al.，Cell，37767(1984))。
本发明还涉及可与上述序列杂交的多核苷酸，条件是序列间具有至少50％、优选70％的同一性。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。如本文所用的，术语“严格条件”是指杂交仅发生在序列间具有至少95％、优选97％同一性的情况下。在一优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码基本上保持了由图1的cDNA或保藏的cDNA编码的成熟多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。
本文所指的保藏物将根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定期限保藏。这些保藏仅为本领域技术人员提供方便，而不是对根据35 U.S.C 112索取保藏物的许可。保藏物中所含的多核苷酸的序列以及该序列编码的多肽的氨基酸序列引入本文作参考，并且在与本文的序列描述有抵触时，其是参照。制造、使用或销售保藏物需经许可，而本文不授予这种许可。
本发明还涉及具有图1的推导的氨基酸序列或具有由保藏的cDNA编码的氨基酸序列的SOD-4多肽，以及该多肽的片段、类似物和衍生物。
当指图1的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽时，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持这些多肽的相同的生物学功能或活性的多肽。因此，类似物包括蛋白原，其可通过裂解蛋白原部分而激活以生产有活性的成熟多肽。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选重组多肽。
图1的多肽或由保藏的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是(i)其中的-或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基取代(优选由保守的氨基酸残基取代)，并且这种取代的氨基酸残基可以由遗传密码编码，也可不是由遗传密码编码，或者(ii)其中的-或多个氨基酸残基包括-取代基，或者(iii)其中的成熟多肽与另一种化合物融合，所述化合物例如为增加多肽的半寿期的化合物(例如聚乙二醇)，或者(iv)其中有附加的氨基酸与成熟多肽融合，例如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟多肽获得序列或者蛋白原序列。这种片段、衍生物和类似物被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。
本发明的多肽和多核苷酸优选地以分离的形式提供，并优选纯化至均一性。
术语“分离的”是指从其原始环境(例如，若其是天然存在的则是天然环境)中脱离的物质。例如，存在于活体动物中的天然发生的多核苷酸或多肽不是分离的，但从一些或所有共存物质中分离的相同的多核苷酸或DNA或多肽则是分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是某种组合物的一部分，并且如果这种载体或组合物不是其天然环境的一部分，则其还是分离的。
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸的载体，用本发明的载体遗传工程化的宿主细胞，以及用重组技术生产本发明的多肽。
宿主细胞用本发明的载体遗传工程化(转导或转化或转染)，所述的载体可以是克隆载体或表达载体。载体可以是质粒、病毒颗粒、噬菌体等。遗传工程化的宿主细胞可以在改良的传统营养培养基中培养，改良培养基是为了激活启动子，选择转化子或扩增SOD-4基因。培养条件如温度、pH等是先前用于选择用来表达的宿主细胞的条件，其对本领域普通技术人员是显而易见的。
本发明的多核苷酸可通过重组技术用于生产多肽，因此，例如，该多核苷酸可以包括在任一种表达载体中特别是载体或质粒中以表达多肽。这些载体包括染色体的、非染色体的和合成的DNA序列，例如SV40衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒酵母质粒；衍生于质粒和噬菌体DNA的结合体的载体；病毒DNA如痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒和拟狂犬病毒。然而，也可使用任何其它载体，只要其在宿主中可复制和生存。
可通过多种程序将合适的DNA序列插入载体，通常，通过本领域公知的程序将DNA序列插入合适的限制性内切酶位点。这些和其它程序属于本领域熟练技术人员的范畴。
表达载体中的DNA序列与合适的表达调控序列(启动子)连接以指导mRNA合成，作为这些启动子的代表性例子，可提及的有LTR或SV40启动子，E.colilac或trp启动子，λ噬菌体PL启动子和其它公知用于控制基因在原核细胞或真核细胞或者病毒中表达的启动子。表达载体还含有核糖体结合位点用于翻译起始和转录终止子。载体还可包括用于扩增表达的合适的序列。
另外，表达载体优选含有一个用于为选择转化的宿主细胞提供表型标记的基因，如对于真核细胞培养为二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，而在E.coli中例如为四环素或氨苄青霉素抗性。
可采用含有如上所述合适DNA序列以及合适启动子或调控序列的载体转化合适的宿主以使宿主表达蛋白质。
作为合适的宿主的例子，可以提及的有细菌细胞，如E.coli、链霉菌、鼠伤寒沙门氏杆菌；真菌细胞，如酵母；昆虫细胞如果蝇和Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤；植物细胞等。选择合适的宿主细胞被视为属于本领域熟练技术人员根据本文的教导而理解的范围。
更具体地，本发明还包括重组构建体，所述构建体包含一或多种上述序列。该构建体包括载体，如质粒或病毒载体，在该载体中以正向或反向插入本发明的序列。在这一实施方案的一个优选方面，该构建体还包括调节序列，包括例如，与所述序列连接的启动子。本领域熟练技术人员已知大量的合适的载体和启动子，它们是可商购的。以下举出载体的例子，细菌的载体pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen，Inc.)，pbs，phagescript，psiX174，pbluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)；ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。真核载体pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，也可使用其它质粒或载体，只要其可在宿主中复制和生存即可。
启动子区可以选自使用CAT(氯霉素转移酶)的载体或其它带有选择性标记的载体的任何所需基因，两个合适的载体是PKK232-8和PCM7。特别提到的细菌启动子包括lacI，lacZ，T3，T7，gpt，lambda PR，PL和trp；真核启动子包括CMV立即早期，HSV胸腺嘧啶激酶，早期和晚期SV40，反转录病毒的LTR，和鼠金属硫蛋白-I。选择合适的载体和启动子属于本领域普通技术人员的水平范畴。
在另一实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞，所述的宿主细胞可以是高等真核细胞，如哺乳细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，或者宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。可通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染，或电穿孔(Davis，L，Dibner，M.，Battey，I.，Basic Methods in Molecular Biology，(1986))将构建体导入宿主细胞。
可以用传统的方式使用宿主细胞中的构建体以生产由重组序列编码的基因产物。或者，也可通过常规的肽合成仪合成生产本发明的多肽。
在合适的启动子的控制下，可以在哺乳细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白质，也可采用无细胞翻译系统使用由本发明的DNA构建体衍生的RNA生产这种蛋白质。原核和真核宿主使用的合适的克隆和表达载体见Sambrook，et al，Molecular ClonningALaboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，该书引入本文作参考。
高等真核生物对编码本发明的多肽的DNA的转录可通过在载体中插入一增强子序列而得以增加，增强子是约10—300bp的顺式作用的DNA因子，其作用于启动子以增加其转录。其例子包括位于复制起点晚期侧(100—270bp处)的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点晚期侧的多瘤病毒增强子，以及腺病毒增强子。
通常，重组表达载体包括复制起点和允许宿主细胞的转化的选择标记，如E.coli的氨苄青霉素抗性基因和酿酒酵母的TRP1基因，以及衍生于高表达基因的启动子以指导下游结构序列的转录。这种启动子可以衍生于编码糖酵解酶如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、α-因子、酸性磷酸酶、或热休克蛋白的操纵子。在合适的阶段，杂合结构序列装配上翻译起始和终止序列，以及优选地，装配一能指导翻译的蛋白质进入周质空间或胞外培养基的前导序列。任选地，杂合序列可以编码一包括N-末端鉴别肽的融合蛋白质，以赋予所需的特征，如表达的重组产物的稳定性和纯化简便性。
用于细菌的表达载体的构建是通过将编码所需蛋白质的结构DNA序列与合适的翻译起始和终止信号一起插入带有功能启动子的可操纵阅读相而完成。载体包括一或多种表型选择标记及一个复制起点以确证载体保持在宿主中，并且，如果需要，可以在宿主中扩增。合适的用于转化的原核宿主包括E.coli、枯草芽孢杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属的各菌种，当然，也可采用其它菌。
作为代表性而非限制性的例子，有用的细菌表达载体可以包括衍生于包含熟知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)的遗传因子的商购质粒的选择标记和细菌复制起点，这些商购质粒包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分与合适的启动子及待表达的结构序列结合。
转化合适的宿主菌株并将宿主菌株培养至合适的细胞密度后，用合适的方法(如温度改变或化学诱导)诱导选定的启动子，并继续培养细胞一段时间。
典型地，细胞由离心收集，用物理或化学方法破碎，保留得到的粗提物以进一步纯化。
用于表达蛋白质的微生物细胞可用任何常规方法破碎，如冻-融循环、超声处理、机械破碎，或使用细胞裂解试剂，这些方法是本领域技术人员公知的。
也可使用各种哺乳细胞培养系统表达重组蛋白，哺乳细胞表达系统包括由Gluzman，Cell，23175(1981)描述的猴肾成纤维细胞COS-7细胞系，以及其它能表达相容载体的细胞系，如C127，3T3，CHO，Hela和BHK细胞系。哺乳类表达载体包括复制起点，合适的启动子和增强子，以及任何必需的核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，转录终止序列，和5’旁侧非转录序列。可使用源自SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接体和多腺苷酸化位点以提供所需的非转录遗传因子。
可通过硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阳离子或阴离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析等方法从重组细胞培养物中回收并纯化多肽。优选的是在纯化过程中存在低浓度(约0.15—5mM)的钙离子(Price，et al.，J.Biol.Chem.，244917(1969))。如果需要，可使用蛋白质重折叠步骤以完成成熟蛋白的构型，最后，可采用高效液相色谱(HPLC)进行最后的纯化步骤。
本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成过程的产物，或者通过重组技术从原核或真核宿主(例如，通过培养细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳类细胞)而生产。根据在重组生产过程中采用的宿主，本发明的多肽可以用哺乳类或其它真核类的碳水化合物糖基化或是非糖基化的。
SOD-4还可以用作抗炎剂。在一系列炎症动物模型和患炎症的动物中已经显示出其它的SOD蛋白具有抗炎作用(Huber et al，eds.Michelson et al，AcademicPress，517-549，(1977))。SOD-4还可用于治疗类风湿性关节炎和离子辐射引起的副作用，因为在人类中已经显示出使用SOD蛋白治疗类风湿性关节炎和关节病以及离子辐射处理引起的副作用的有效作用。SOD-4起作用的机制是清除引起组织退化的氧化产物。
SOD-4可用于治疗Crohn氏病，Bechet氏病，皮炎，溃疡，溃疡性结肠炎，和抵抗辐射治疗的副作用。已经发现其它的SOD蛋白对这些疾病是有效的(Niwa，Y et al，Free Rad.Res.Conns.1137-153(1985))。
如果某组织的血液供应被切断，此组织将逐渐坏死。因在先前的局部出血的组织中氧的重新出现而形成的氧基团可能是组织破坏的原因。因此SOD-4对这些自由基的清除作用有助于保护组织免受损伤。SOD-4可能以相似的机制减少局部出血和再灌注引起的心率失常的发生，因为已有报道SOD蛋白对这些病情有作用(Woodward，B.et al，J.Mol.Cell.Cardiol.17485-493(1985)。SOD-4可以以同样的方式用于治疗大脑局部出血和肾局部出血，在肾脏的局部出血和缺氧再灌注模型中，SOD蛋白已经显示出保护组织的作用(Baker，G.L.，et al.，Am.Surg.，202628-41(1985))。
SOD-4还可以在肾脏移植和诸如皮肤，肺，肝和胰脏移植时使用。
SOD-4可以用于治疗烧伤。通过注射SOD蛋白，实验性大鼠轻度烧伤引起的局部浮肿可有所降低(Bjork and Artursson，Bums，9249-256(1983))。
已有报道肠胃外服用的CuZnSOD可防止患呼吸困难的产前新生儿的支气管肺发育不良。最近CuZnSOD已经了解了这类治疗的孤儿药剂量。相应地，SOD-4也可以用于治疗这类疾病。(Rosenfeld W.et al，J.Pediatr.105781-785(1984))。
在诸如系统红斑狼疮和类风湿性关节炎的各种各样的自身免疫疾病中，发现在淋巴细胞中有高频的染色体断裂。这些患者的血浆中含有染色体断裂因子，称为断裂因子。血浆中的超氧化物基团引起这种因子的形成。SOD-4可以通过清除超氧化物基团抑制这种断裂活性。
超氧化物基团可以以氧化胁迫破坏细胞，DNA和蛋白质，氧化胁迫可打断正常细胞周期，导致细胞的无控制分裂，而这正是癌症的基础。相应地，SOD-4可以通过清除患者体内的超氧化物基团而用于防止或控制癌症。
诸如paraquat和四氧嘧啶等的大量有毒物质的破坏作用归因于氧基团。SOD-4可通过直接注射抵抗这些有毒物质。
已经报道四氧嘧啶具有致糖尿活性。SOD-4可以在体内抑制四氧嘧啶的致糖尿活性。胰脏的Beta细胞对四氧嘧啶极度敏感，而这种敏感性可导致胰岛素依赖型糖尿病。因此可以考虑在糖尿病的最初阶段通过注射SOD-4来保护Beta细胞。
根据本发明，这些多肽可以用于体内表达，即通常所指的“基因治疗”。
因此，例如，患者的细胞可以用编码某多肽的多核苷酸(DNA或RNA)在体外进行工程化，然后用工程化的细胞提供给需要此多肽治疗的患者。这些方法是本领域所熟知的。例如，细胞可以通过本领域所熟知的方法使用含编码本发明多肽的RNA的逆病毒颗粒进行工程化。
类似地，例如也可通过本领域公知的程序在体内对细胞进行工程化以在体内表达多肽。如本领域所公知的，可将生产含编码本发明的多肽的RNA的反转录病毒颗粒的生产者细胞给予患者以在体内进行细胞的工程化并在体内表达多肽。通过这种方法给予本发明的多肽的这些和其它方法对于本领域熟练技术人员根据本发明的教导是显而易见的。例如，用于工程化细胞的表达载体可以不是反转录病毒，而是例如腺病毒，其在与合适的输送载体结合后可用于在体内工程化细胞。
本发明的多肽可以与合适的药物载体结合应用，这种组合物包括药物有效量的蛋白质以及药物学可接受的载体或赋形剂。这种载体包括但不限于盐水、缓冲的盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其结合物。配制品应适合给药方式。
本发明还提供了一种药物包装盒或试剂盒，其包括一或多个填充有一或多种本发明的药物组合物成分的容器。与这种容器在一起的还有由控制药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机构出具的通知，该通知反应了该机构许可其为人体用而生产、使用或销售。另外，本发明的多肽可以与其它药物化合物结合应用。
所述的药物组合物可以以传统的方式给药，如口服、局部、静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下、鼻内或皮内给药。给予个体的SOD-4的量和剂量模式取决于数种因素，如给药方式、需治疗的病情的性质和开药医生的判断。通常，例如，其是以药物有效剂量至少约10μg/kg体重而给予，在大多数情况下，给药量不超过8mg/kg体重/天，考虑到给药途径、症状等，优选的剂量是约每天为10μg/kg体重-1mg/kg体重。
本发明的序列还可用于染色体鉴定，该序列特异地定向于个别的人染色体的特定位置并可与之杂交。另外，目前需要鉴定染色体上的特定位点，而现在只有很少几种基于实际序列资料(重复多态性)的染色体标记试剂可以商购用于标记染色体位置。本发明的将DNA定位于染色体是将这些序列与相关疾病的基因联系起来的非常重要的第一步。
简而言之，可通过从cDNA制备PCR引物(优选15—25bp)而将序列定位在染色体上。使用cDNA的计算机分析快速选择长度不超过基因组DNA的一个外显子并因而不会使扩增复杂化的引物，随后使用这些引物对含有个别的人染色体的体细胞杂合子进行PCR筛选。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合子能得到扩增产物。
体细胞杂合子的PCR作图是将特定DNA定位于特定染色体的一个快速程序。采用本发明相同的寡核苷酸引物，可以类似的方式将来自特定染色体的一组片段或大基因组克隆的集合体进行亚定位。其它的可类似用于染色体作图的作图策略包括原位杂交、用标记的流选的染色体进行的预筛选，以及通过杂交预选以构建染色体-特异cDNA文库。
cDNA克隆与中期染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可以用来提供精确的一步法染色体定位。这一技术可使用短至500或600个碱基cDNA；然而，大于2000bp的克隆更易于与独特的染色体位置结合以具有足够的信号强度便于检测。FISH需要使用衍生EST的克隆，越长越好。例如，2000bp是好的，更好为4000bp，而超过4000则可能不是获得好结果所必须的，因其时间不合理。此技术的综述见Verma et al.，Human ChromosomesaManual of Basic Techniques，Pergamon Press，New York(1988)。
一旦某一序列已被精确定位于染色体某一位置，则可比较该序列在染色体上的物理位置与遗传图谱资料的关系，这种资料例如可在V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man中发现(可在线从Johns Hopkins University Welch Medical Library获得)。随后可通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传性)鉴别基因与已定位于相同染色体区的疾病之间的关系。
接着，必须确定感染个体和未感染个体之间的cDNA或基因组序列的差异，如果在一些或所有感染个体中观察到某一突变而未在任何正常个体中观察到这种突变，则该突变可能是该疾病的致病原。
应用目前的物理作图和遗传作图技术的分辨率，一种精确定位于与疾病有关的染色体区的cDNA可以是50—500个潜在的致病基因中的一个(这假定作图分辨率为1兆碱基，并且每20kb为一个基因)。
感染个体和未感染个体的比较通常是首先寻找染色体的结构改变，如可从染色体涂片上观察到的或者用基于该cDNA序列的PCR检测到的缺失或易位。最后，需要对来自一些个体的基因进行全测序以证实存在突变并从多态性中区分突变。
多肽、其片段或其它衍生物、或其类似物、或表达其的细胞可用作免疫原生产抗体，这些抗体可以是例如多克隆抗体或单克隆抗体。本发明还包括嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体，以及Fab片段，或者Fab表达文库的产物。可使用现有技术中公知的各种程序生产这些抗体和片段。
抗对应于本发明的序列的多肽的抗体可以通过将多肽直接注射给动物或将多肽给予动物、优选非人而获得，如此获得的抗体随后与多肽本身结合。以这种方式，仅编码多肽的一个片段的序列也可用于生产与完整天然多肽结合的抗体，这种抗体随后可用于从表达该多肽的组织中分离该多肽。
为制备单克隆抗体，可使用任何提供由连续细胞系培养物生产的抗体的技术，例如杂交瘤技术(Kohler and Milstein，1975，Nature，256495-497)，三瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(kozbor et al.，1983，Immunology Today 472)，以及生产人单克隆多肽的EBV一杂交瘤技术(Cole，et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，AlanR.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用于生产单链抗体的技术(USP4.946，778)可以用来生产本发明的免疫原性多肽产物的单链抗体。
根据本发明的另一个方面，提供了测定对直接与SOD-4基因产物突变有关的紊乱的易感性的方法。这些紊乱包括但不限于，半身肌萎缩硬化“ALS”，和帕金森氏病。因此，SOD-4蛋白中的突变指示对这些紊乱的易感性，编码SOD-4多肽的核酸序列可用于确定这种易感性的分析。因此，例如，此分析方法可用于测定上述人SOD-4蛋白的突变，如缺失，截短，插入，框架移动等，用这些突变指示对上述疾病的易感性。
例如，突变可以通过DNA序列测定来确定。组织样品，包括但不限于血液样品，是从患者获得。样品经本领域所熟知的方法处理以获取RNA。通过加入可与mRNA上存在的多聚腺苷杂交的由多聚胸苷组成的寡聚核苷酸引物，从RNA样品中合成cDNA的第一链。加入逆转录酶和脱氧核苷酸以使cDNA的第一链合成。引物序列以本发明的SOD-4多肽的DNA序列为基础合成。引物序列通常包括SOD-4基因的15到30个连续的碱基，最好为18到25个碱基。用PCR方法使用一对引物(一个“有义”和一个“反义”)已从患者中扩增此cDNA，这样产生三段重叠的患者cDNA片段。然后使用一套与整个基因的约每200个碱基对为一个引物的cDNA碱基对相对应的引物序列测定重叠片段的脱氧核苷酸序列。引物序列用来测定患者的SOD-4蛋白中的突变在何处。然后从患者中测定的序列信息与非突变序列比较以确定突变的存在。
在另一个实施方案中，引物序列用来以PCR的方法扩增突变的区域。此突变区的序列可以被测定，以用作诊断工具预测此突变基因的预定位。
或者，鉴定SOD-4基因中突变的方法还可以通过从RNA中产生cDNA和用体外转录翻译的方法表达由此cDNA编码的蛋白的方法进行。然后可以通过在SDS聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶上电泳的方法分析所表达的蛋白。一个“正常的”SOD-4基因产物也在凝胶上电泳，然后将凝胶干燥，用自动X光摄影术处理，分析可疑的突变基因产物和“正常的”基因产物，这些基因产物的带型上的任何差异都可指示cDNA中突变的存在。基因产物的突变还可以在Western杂交分析中用SOD-4抗体进行鉴定。相应地，本发明中的基因的突变可以直接用序列分析的方法或间接地用检测表达的蛋白的方法来测定。
以下述实施例为参考将进一步描述本发明；但是众所周知，本发明不仅限于这些实施例。除非另有特别描述，所有的部分和数量都根据重量。
为促进对下述实施例的理解，以下将描述常用的方法和/或术语。
“质粒”的命名是将小写字母p置于前面和/或后跟大写字母和/或数字。本文的起始质粒或者是商购得到的，或者是公众可以不受限制地得到的，或者可以根据公布的程序由可得到的质粒构建的。另外，与所述的这些等效的质粒是本领域公知的，并对本领域普通技术人员是显而易见的。
DNA的“消化”是指用仅作用于DNA的特定序列的限制性酶对DNA的催化裂解。本文所用的各种限制性酶是可商购的，其反应条件、辅因子和其它要求对于本领域普通技术人员是公知的。为分析目的，典型地，1μg质粒或DNA片段使用约2单位的酶，反应体积为20μl缓冲液；为分离DNA片段用于构建质粒的目的，典型地，在较大体积中用20-250单位酶消化5-50μg DNA。对特定限制性酶的合适的缓冲液和底物由厂商提供。通常使用37℃1小时的温育时间，但可根据供应商的指示而变化。消化后，将反应物直接在聚丙烯酰胺凝胶上电泳以分离所需片段。
裂解片段的大小分离是根据Goeddel，D.et al.，Nucleic Acids Res.，84057(1980)所述在8％聚丙烯酰胺凝胶上进行。
“寡核苷酸”是指可化学合成的单链聚脱氧核苷酸或两个互补的聚脱氧核苷酸链。这种合成的寡核苷酸没有5’磷酸，并因此如果不在激酶的存在下用ATP加上磷酸则不能与另一寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸将与没有经过脱磷酸化的片段连接。
“连接”是指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，et al.，Id.，p.146)。除非另有说明，连接可以采用公知的缓冲液，在每0.5μg约等摩尔的待连接DNA片段使用10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)的条件下进行。
除非另有说明，使用Graham，F.and Van der Eb.A.，Virology，52456-457(1973)的方法进行转化。
实施例1SOD-4的细菌表达和纯化编码SOD-4的DNA序列，ATCC#75716首先用与加工后的SOD-4蛋白的5’和3’序列(减去信号肽序列)和SOD-4基因3’端的载体序列相对应的PCR寡聚核苷酸序列扩增。与SOD-4相对应的附加核苷酸相应地加到5’和3’序列上。5’寡聚核苷酸引物为5’-CGGGATCCATGGGCAGCGGCCAGTTG-3’，其中包含一个BamHI限制酶位点，后接在此加工蛋白的假定末端氨基酸之一处起始的SOD-4密码序列的18个核苷酸。3’序列5’-CGTCTAGAGGTCCTGCTCAAAGGTGGG-3’含有互补于一个XbaI限制酶位点和SOD-4的最后21个核苷酸的互补序列和位于SOD-4 DNA插入片段3’端的pD10载体序列的互补序列。限制酶位点与细菌表达载体pD10上的限制酶位点相对应(Qiagen，Inc.9259 EtonAvenue，Chatsworth，CA，91311)。pD10编码抗生素抗性(Ampr)，一个细菌复制起始点(ori)，一个IPTG-可调节启动子操作子(P/O)，一个核糖体结合位点(RBS)，一个6-His标记物和限制酶位点。然后pD10用BamHI和XbaI消化，扩增的序列连入pD10并插入到有编码组氨酸标记物和RBS的序列的框架中。然后连接混合物用于转化大肠杆菌M15/rep4，商标为M15/rep4的菌可从Qiagen公司得到，操作方法按Sambrook，J et al，.MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Laboratory Press，1989进行。M15/rep4含有表达lacI抑制子和携带卡那霉素抗性(Kanr)的pREP4质粒的多个拷贝。转化子按其在LB平板上的生长能力来鉴定，选择对青霉素/卡那霉素有抗性的菌落，分离质粒DNA，进行限制分析鉴定。含所需构建体的克隆在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中生长过夜(O/N)。过夜培养物以1∶100到1∶250的比率进行扩大培养。细胞生长至光密度值在0.4到0.6之间，然后加入IPTG(“异丙基-β-D-硫代半乳糖苷”)至终浓度为1mM。IPTG通过使lacI抑制子失活，清除P/O来增强基因表达。细胞继续生长3到4个小时，然后离心回收细胞，细胞沉淀物溶于6摩尔盐酸胍中。清澈后，在允许含6-His标记物的蛋白紧密结合的情况下用镍螯合柱层析从此溶液中纯化溶解的SOD-4。Hochuli，E.et al.，J.Chromatography411177-184(1984)。纯化过程不同阶段的蛋白在12.5％的SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，用考马斯亮兰染色。M代表分子量大小标记。第1和2道是在无IPTG(1道)和有IPTG(2道)的情况时含载体pD10的细菌的全部抽提物。第3和4道是在无IPTG(3道)和有IPTG(4道)的情况时含表达质粒pD10-SOD-4的细菌的全部抽提物。第5到9道为从镍螯合柱洗脱的部分；5道为洗脱前样品6和7道是用6M盐酸胍，50mM NaPO4，pH8和pH6洗脱的部分；8和9道是用6M盐酸胍，50mMNaPO4，pH5和pH2洗脱的部分。见图3。
实施例2重组SOD-4在COS细胞中的表达表达质粒pSOD-4-HA是由载体pcDNAI/Amp(Invitrogen)衍生而来的，此载体包含1)SV40复制起始位点，2)青霉素抗性基因，3)大肠杆菌复制起始位点，4)CMV启动子，紧接着多聚接头区，一个SV40内含子和多聚腺苷化位点。将编码整个SOD-4前体和融合到其3’端的HA标记物的片段克隆到载体的多聚接头区，因此，重组蛋白的表达在CMV启动子的指导下进行。HA标记物与来源于以前所描述的流感病毒血细胞凝集素蛋白的一个表位相对应(I.Wilson，H.Niman，R.Heighten，A.Cherenson，M.Connolly，and R.Lermer，1984，Cell 37，767)。HA标记物与我们目标蛋白的融合可以让我们用识别HA表位的抗体轻而易举地鉴定重组蛋白。
质粒的构建策略描述如下编码SOD-4的DNA序列，ATCC#75716用PCR的方法构建，使用两个引物pBluescript载体的5’引物序列5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’；3’序列5’-CGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTAAAGGTGGGCAGGGGGCTG-3’包含互补于XbaI限制酶位点、翻译终止密码子、HA标记物和SOD-4密码序列的最后18个核苷酸(不包括终止密码子)的序列。因此，PCR产物包含一个pBluescript载体来源的Ban HI位点，后接融合进框架的HA标记物的SOD-4密码序列，与HA标记物相邻的一个翻译终止密码子，和一个XbaI位点。PCR扩增的DNA片段和载体pBluescript用限制酶Bam HI和XbaI消化并连接，连接混合物用于转化大肠杆菌菌系SURE(StratageneCloning Systems，11099 North Torrey Pines Road，La Jolla，CA 92037有售)。转化培养物涂于含青霉素的培养基平板上，挑选抗性菌落。从转化体中分离质粒DNA，用限制分析检测正确片段的存在。为了重组SOD-4的表达，用DEAE-DEXTRAN方法使表达载体转染COS细胞(J.Sambrook，E.Fritsch，T.Maniatis，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Laboratory Press，(1989))。SOD-4-HA蛋白的表达用放射标记和免疫沉淀的方法检测(E.Harlow，D.Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1988))。转染后两天，蛋白质用35S-半胱氨酸标记8小时。然后收集培养基，用去污剂(150mM NaCl，1％NP-40，0.1％SDS，1％NP-40，0.5％DOC，50mM Tris，pH7.5)裂解细胞(Wilson，I.et al.，Id.37767(1984))。COS细胞的裂解物和上清中的35S-半胱氨酸标记的蛋白用一个HA多克隆抗体进行免疫沉淀，用15％的SDS-PAGE分离。M代表分子量标记。第1到4道为细胞裂解物。第5至8道为上清液。第1和第5道为没有DNA的空白对照。第2和第6道为分泌蛋白的MIP-1γ对照。第3和第7道为细胞裂解物的对照，第4和第8道为SOD-4。见图4。
从上述的教导中可知，本发明的各种修改和变化是可能的，因此，在所附的的范围内，除非有特别描述，本发明是可行的。
序列表(1)一般信息(i)申请者YU，ETAL.
(ii)发明名称超氧化物歧化酶-4(iii)序列数2(iv)通讯地址(A)收信人CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFIILLAN，CECCHI，STEWART&OLSTEIN(B)街道6BECKERFARMROAD(C)城市ROSELAND(D)州NEWJERSEY(E)国家USA(F)邮政编码07068(v)计算机可读形式(A)媒体类型3.5英寸软盘(B)计算机IBM PS/2(C)操作系统MS-DOS(D)软件WORD PERFECT 5.1(vi)本申请数据(A)申请号08/225,757(B)申请日1994年4月11日(C)分类(vii)律师/代理人信息(A)姓名FERRARO，GREGORY D.
(B)注册号36，134(C)案号/文档号325800-106(viii)电讯信息(A)电话201-994-1700(B)电传201-994-1744(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度1080碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1CTCCTTGGTG CTCCTGCCCC GGAGGAGTTC TGCGTCTCGG GGTGGTGACT GGGTCCAGAA60TGGCTTCGGA TTGGGGAACA GGGGACCCTC TGCACGTTGG AGTTCGCGGT GCAGATGACC 120TGTCAGAGCT GTGTGGACGC GGTGCGCAAA TCCCTGCAAG GGGTGGCAGG TGTCCAGGAT 180GTGGAGGTGC ACTTGGAGGA CCAGATGGTC TTGGTACACA CCACTCTACC CAGCCAGGAG 240GTGCAGGCTC TCCTGGAAGG CACGGGGCGG CAGGCGGTAC TCAAGGGCAT GGGCAGCGGC 300CAGTTGCAGA ATCTGGGGGC AGCAGTGGCC ATCCTGGGGG GGGCTGGCAC CGTGCAGGGG 360GTGGTGCGCT TCCTACAGCT GACCCCTGAG CGCTGCCTCA TCGAGGGAAC TATTGACGGC 400CTGGAGCCTG GGCTGCATGG ACTCCACGTC CATCAGTACG GGGACCTTAC AAACAACTGC 480AACAGCTGTG GCAATCACTT TAACCCTGAT GGAGCATCTC ATGGGGGCCC CCAGGACTCT 540GACCGGCACC GCGGAGACCT GGGCAATGTC CGTGCTGATG CTGACGGCCG CGCCATCTTC 600AGAATGGAGG ATGAGCAGCT GAAGGTGTGG GATGTGATTG CCCGCAGCCT GATTATTGAT 640GAGGGAGAAG ATGACCTGGG CCGGGGAGGC CATCCCTTAT CCAAGATCAC AGGGAACTCC 720GGGGAGAGGT TGGCCTGTGG CATCATTGCA CGCTCCGCTG GCCTTTTCCA GAACCCCAAG 780CAGATCTGCT CTTGCGATGG CCTCACACTC TGGGAGGAGC GAGGCCGGCC CATCGCTGGC 840AAGGGCCGAA AGGAGTCGGC GCAGCCCCCT GCCCACCTTT GAGCAGGACC TCACCTTGGC 900TCTGTTGCTG TCCTCCAGGG CGAGCACTTT CCACTTCCAG AGGGGGCCAG AGGGACTTTG 960CCTCCCCAGT CTTTGGAGAG CTCAGTACAG GGCAGGAGCT GCTGTGGTGT TCCCTTGGCA 100AATGAAAGTT TTATTTTCGT TTGGGAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 100(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度255个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型(D)拓扑学线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Thr Cys Gln Ser Cys Val Asp Ala Val Arg Lys Ser Leu Gln5 10 15Gly Val Ala Gly Val Gln Asp Val Glu Val His Leu Glu Asp Gln20 25 30Met Val Leu Val His Thr Thr Leu Pro Ser Gln Glu Val Gln Ala35 40 45Leu Leu Glu Gly Thr Gly Arg Gln Ala Val Leu Lys Gly Met Gly50 55 60Ser Gly Gln Leu Gln Asn Leu Gly Ala Ala Val Ala Ile Leu Gly65 70 75Gly Ala Gly Thr Val Gln Gly Val Val Arg Phe Leu Gln Leu Thr80 85 90Pro Glu Arg Cys Leu Ile Glu Gly Thr Ile Asp Gly Leu Glu Pro95 100 105Gly Leu His Gly Leu His Val His Gln Tyr Gly Asp Leu Thr Asn110 115 120Asn Cys Asn Ser Cys Gly Asn His Phe Asn Pro Asp Gly Ala Ser125 130 135His Gly Gly Pro Gln Asp Ser Asp Arg His Arg Gly Asp Leu Gly140 145 150Asn Val Arg Ala Asp Ala Asp Gly Arg Ala Ile Phe Arg Met Glu155 160 165Asp Glu Gln Leu Lys Val Trp Asp Val Ile Ala Arg Ser Leu Ile170 175 180Ile Asp Glu Gly Glu Asp Asp Leu Gly Arg Gly Gly His Pro Leu185 190 195Ser Lys Ile Thr Gly Asn Ser Gly Glu Arg Leu Ala Cys Gly Ile200 205 210Ile Ala Arg Ser Ala Gly Leu Phe Gln Asn Pro Lys Gln Ile Cys215 220 225Ser Cys Asp Gly Leu Thr Ile Trp Glu Glu Arg Gly Arg Pro Ile230 235 240Ala Gly Lys Gly Arg Lys Glu Ser Ala Gln Pro Pro Ala His Leu245 250 25权利要求
1.一种多肽，选自如下一组(i)具有图1推导氨基酸序列的SOD-4多肽及其片段，类似物和衍生物，和(ii)由ATCC 75716的cDNA编码的SOD-4多肽和所说多肽的片段，类似物和衍生物。
2.权利要求1的多肽，其中多肽为具有图1推导氨基酸序列的SOD-4。
3.抗权利要求11的多肽的抗体。
4.生产多肽的方法，包括由用包含编码权利要求1的多肽的DNA的载体遗传工程化的宿主细胞表达由所说DNA编码的多肽。
5.生产能够表达多肽的细胞的方法，包括用包含编码权利要求1的多肽的DNA的载体遗传工程化细胞。
6.制备载体的方法，包括将编码权利要求1的多肽的多核苷酸插入一种载体。
7.权利要求1的多肽在制备治疗需要SOD-4治疗的疾病的药物中的应用。
8.包括权利要求1的多肽和药物可接受载体的药物组合物。
全文摘要
本发明公开了编码SOD－4多肽的多核苷酸及多肽,和抗此多肽的抗体及此多肽在用作治疗大脑局部出血,溃疡,炎症,心率失常,浮肿和paraquat中毒以及类风湿性关节炎,骨关节炎和放射损伤的药物中的应用。
文档编号A61P17/02GK1332240SQ0110408
公开日2002年1月23日 申请日期2001年2月20日 优先权日1994年4月11日
发明者余国良, 克雷格·A·罗森, 克莱尔·M·弗雷泽, 让尼娜·D·戈凯恩 申请人:人体基因组科学有限公司