专利名称：纯化的黄体生成激素的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种黄体生成激素(LH)的纯化方法，具体地说，涉及从原始重组黄体生成激素(LH)样本纯化重组黄体生成激素(r-LH)的方法，其包括联合使用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法。
这些促性腺激素刺激男性和女性体内的性腺活动及性激素分泌。女性的促卵泡激素刺激卵泡和卵细胞的发育和成熟。随着卵泡的发育，它产生的雌激素增加，在生长半周期产生的雌激素可刺激黄体生成激素释放出来。这会导致卵泡在排卵时破裂，把卵泡转变成分泌孕激素的黄体素。男性的黄体生成激素刺激睾丸的间质细胞分泌睾丸激素，其反过来又直接影响输精管。具有黄体生成激素或促卵泡激素活性或均具备该二种活性的促性腺物质主要被用于治疗女性不育的疾病，但也可用于男性。这些物质包括具有黄体生成激素(LH)活性的绒毛膜促性腺激素及具有黄体生成激素(LH)和促卵泡激素(FSH)活性的人的绝经期促性腺激素。现在人们正研究用重组脱糖核氧核酸(DNA)衍生的人体黄体生成激素(rechLH)作为绒毛膜促性腺激素的一种替代物或与促卵泡激素一起施用。
目前已有很多方法来分离和纯化黄体生成激素，如离子交换、凝胶过滤和免疫亲和色谱法[Jack，G.W.，Blazek，R.，James，K.，Boyd，J.E.和Micklem，L.R.等人，”The automated production by immunoaffinity chromatograpHy of the human pituitaryglycoprotein hormones thyrotropin，follitropin and lutropin”，Journal of ChemicalTechnology and biotechnology39，45-58页，(1987)]。
离子交换色谱法可用于分离这些激素，不过，由于垂体组织中黄体生成激素的大量的电荷不均分性，采用这种方法会产生一些相关问题。首先，因为糖蛋白和促卵泡激素的电荷重叠，要将它们完全分离是非常困难和繁复的。第二，很难把这些激素纯化成单馏分[Stockell Hartree，A.，Thomas，M.，Furnival，B.E.，Bruns，T.W.和Langley，P.等人，”Thyroid-stimulating and lipolytic activities of purifled preparations of humanthyroid-stimulating hormone”，Journal of Endocrinology53，95-100页，(1972)]。因此，就黄体生成激素而论，如下推荐在纯化过程中可以选择一些带电型式的激素[Storring，P.L.Zaidi，A.A.，Mistry，Y.G.Lindberg，M.，Stenning，B.E.和Diczfalusy，E.等人，”Acomparison of preparations of high1y purified human pituitary luteinising hormonedifferences in the luteinising hormone potencies as determined by in vivo bioassays，invitro bioassay and immunoassay”，Acta Endocrinologica101，339-347页，(1982)]。选择性纯化将会导致这些不同一的形式的特性鉴定更加复杂，包括其碳水化合物组分的结构分析。带有唾液酰和硫酸根的阴离子低聚糖的含量变化可能是造成黄体生成激素不均匀带电的主要原因。
叶已揭示，用一般分馏方法来制备人尿黄体生成激素(LH)，其药效以生物分析为982 i.u./mg，以放射免疫测定为1166 i.u.[Donini S.和Donini P.Acta endor.等人，”Copenh.“63，Supp.142，257-277页，(1969)]。使用纯化的人体绒毛膜促性腺激素(HCG)的兔抗血清的免疫吸附剂从绝经期尿液制备促卵泡激素(FSH)的过程中得到主要和次要馏分来纯化黄体生成激素[van Hell，H.，Schuurs A.H.W.M.和denHollander，F.C.等人，”In Symposium on gonadotropHins”，New York，1971年6月17日，及Eds B.B.Saxena，C.G.Beling和H.M.Gandy等人，New YorkJohn Wiley& Son，Inc，(1972)]。所得的制剂不但黄体生成激素的效力高，而且其促卵泡激素/黄体生成激素(FSHLH)的比率也比Donini & Donini在1969年制成的制剂大。
重组黄体生成激素的优点是不含有其它促性腺激素，如促卵泡激素和甲状腺刺激素。但是，重组黄体生成激素的原制剂含有供重组生产用的细胞中的所有其它蛋白质及污染物，因此迫切需要一种能使重组黄体生成激素完全纯化的方法。
纯化过程是以离子交换色谱法和反相高效液相色谱法为基础进行的。进一步选择使用凝胶渗透柱可使纯黄体生成激素制剂的残留污染物完全除去。用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法各洗脱两次所得的结果为最好。
本发明的方法可以用于纯化以经过重组后得到的培养基样本为原料的重组黄体生成激素，所得的高纯度黄体生成激素完全不含，例如，在培养基中常有的胎牛血清蛋白质、供重组过程用的宿主细胞所含有的核酸或其它污染物。
本发明的方法也可用于纯化以绝经期后尿液原浓缩液为原料的尿液黄体生成激素，以及纯化来自其它物种的黄体生成激素，特别是哺乳动物，例如，包括牛、马、猪、羊、鼠、耗子和猴。
因此，本发明的目的在于提供一种样本的黄体生成激素的纯化方法，其包括联合使用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法。该方法包括以下步骤把样本(若需要把样本浓缩)用离子交换色谱法洗脱，再把洗脱液用反相高效液相色谱法洗脱。还加上使洗脱液通过凝胶渗透柱的步骤。
根据原制剂的纯度，优选用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法各洗脱两次以便纯化后得到最好结果。这样一种方法包括如下步骤(a)样本用二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖离子交换色谱柱洗脱；(b)用Q琼脂糖离子交换色谱柱洗脱；(c)用硅胶C18反相高效液相色谱柱洗脱；(d)再次用硅胶C18反相高效液相色谱柱洗脱(优选采用与步骤(c)不同的洗脱液)；以及(e)用凝胶渗透柱洗脱。
在本发明的优选实施例中，用二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖离子交换色谱柱洗脱时采用pH值等于8的磷酸钠缓冲液。
用Q琼脂糖离子交换色谱柱洗脱时优选采用pH值等于7.5的乙酸铵缓冲液。
反相高效液相色谱柱步骤(c)优选以异丙醇/乙酸铵作为流动相。
反相高效液相色谱柱步骤(d)优选以异丙醇/三盐酸作为流动相。
本发明的黄体生成激素优选是人体黄体生成激素，更好是重组人体黄体生成激素，其衍生自重组过程用的哺乳动物细胞(优选为CHO细胞)的培养基。
本发明的另一个目的在于提供一种药物组合物，它包括一由上述重组过程制备的有效治疗量的重组黄体生成激素，以及使冻干产品稳定所必需的适当赋形剂，如蔗糖。重组黄体生成激素的药物组合物特别适合于皮下施用。
本发明使用生物原料，特别是含有黄体生成激素和其它污染蛋白质的原混合物，本文称为原料样本。下面详细叙述的实施例均采用含有重组人体黄体生成激素(r-hLH)的原料样本，其由一生物反应器的上清液培养基制成。另一个样本是人体绝经期促性腺激素(hMG)，它是一种绝经期后尿液原浓缩液。
样本是新鲜采集并在生物反应器灌流的细胞上清液培养基。最好将样本过滤澄清。然后把原溶液浓缩，若需要，通过超滤以除去分子量小于10的物质。在超滤时也可将缓冲液换成pH值等于8的磷酸钠。
经过这些初始步骤后，就可以用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法对样本进行处理，优选各洗脱两次。第一次离子交换步骤优选采用二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖。这是必需的黄体生成激素”直通”步骤，该步骤可除去大部分非黄体生成激素蛋白质。第二次离子交换步骤优选采用Q琼脂糖柱。这也是黄体生成激素的”直通”步骤，用于除去可能存在的DNA和宿主细胞或培养基蛋白质污染物。在一优选实施例中，该步骤是以pH值为7.5的乙酸铵为缓冲液在5℃下进行洗脱。
优选以硅胶C18反相高效液相色谱法洗脱两次，有效除去残留的胎牛血清(FBS)、细胞蛋白质和内毒素污染物。第一次高效液相色谱法步骤优选以异丙醇/乙酸铵作为流动相。第二次高效液相色谱法步骤优选以异丙醇/三盐酸作为流动相。浓缩存留液，并用pH值等于8的碳酸氢铵回收。浓缩的产品优选再用SepHacryl S100 HR凝胶渗透色谱法洗脱。在该步骤中，用pH值等于8的碳酸氢铵洗脱使分子按大小进行分离，先将洗脱液过滤除去病毒性污染物，再在pH值等于8的磷酸钠缓冲液中用截留分子量为10KD的滤膜进行超滤。将过滤后的纯黄体生成激素本体溶液优选低温冷藏于消毒瓶中。
表1是重组人体黄体生成激素(r-hLH)纯化过程的流程简图，简要列出中间各步骤操作的要点。
表1重组人体黄体生成激素(r-hLH)纯化过程的流程简图
第一步收集液的澄清、浓缩、透析和过滤在这一步(步骤1)中，把缓冲液变成可控制组分，并将溶液初步浓缩。步骤1在5℃下进行，对生物反应器生产周期中每批收集液重复步骤1。优选温度范围是5±3℃。
(i)收集液的澄清从生物反应器收到新鲜收集的培养基后，对物质进行处理时优先将上清液溶液过滤澄清。
(ii)收集液的浓缩和透析在0.05M氢氧化钠溶液中储存的一些滤膜，在两批料之间要用注射水冲洗直至pH值下降到约等于8。
用0.025M pH8的磷酸钠平衡缓冲液代替水。一旦经调节，使生物反应器的原重组人体黄体生成激素(r-hLH)溶液浓缩和透析以除去分子量小于10KD的物质(滤膜的截留分子量为10KD)。
所得的浓缩液于-15℃冻存。第二步二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖CL-6B离子交换色谱法本色谱步骤是黄体生成激素的”直通”步骤，其中大部分非黄体生成激素蛋白质被去除，并将溶液进一步浓缩和透析。产品流经色谱柱的色谱法步骤均在冷冻环境下进行。
(i)二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖CL-6B离子交换色谱法用弱电性阴离子交换树脂二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖填充色谱柱，先用0.15MpH8的磷酸钠溶液平衡。优选pH值范围是8±0.3。
然后用0.025M pH8的磷酸钠流动缓冲液调节色谱柱。优选pH值范围是8±0.3。
色谱柱上设有一保护过滤装置，通过该过滤装置把重组人体黄体生成激素(r-hLH)溶液装入色谱柱。
向色谱柱通入0.025M pH8的磷酸钠溶液。优选pH值范围是8±0.3。层析的过程由280nm分光光度计监控。
排出主要废液，直至基线超过5％吸收界线。
收集含有r-hLH的游离馏分直到基线下降至10％。
(ii)超滤一超滤装置储存在0.05M氢氧化钠溶液中，其滤膜的截留分子量为100KD，用注射水冲洗该超滤装置直至渗透液的pH值在8左右。
以0.08M pH7.5的乙酸铵平衡缓冲液代替水。优选pH值范围是7.5±0.3。
经离子交换色谱法洗脱过的重组人体黄体生成激素(r-hLH)溶液在截留分子量为100KD的滤膜上过滤，收集渗透馏分。
用等量0.08M pH7.5的乙酸铵溶液清洗超滤装置，将所有清洗馏分同收到渗透液中。
(iii)浓缩和透析一超滤装置储存在0.05M氢氧化钠溶液中，其滤膜的截留分子量为10KD，用注射水冲洗该超滤装置直至渗透馏分的pH值在8左右。
以0.08M pH7.5的乙酸铵平衡缓冲液代替水。
浓缩r-hLH溶液。向该存留液加入0.08M pH7.5的乙酸铵溶液，把溶液进一步浓缩。然后开始透析，直至存留液的pH值和导电性与将要加入的缓冲液相同。回收所得的存留液。第三步Q琼脂糖快速流动的离子交换色谱法本步骤也是黄体生成激素的”直通”步骤，用于除去可能存在的DNA和宿主细胞或培养基蛋白质污染物。
(i)柱的平衡用流动缓冲液调节色谱柱，缓冲液为pH值等于7.5的乙酸铵溶液，优选pH值范围是7.5±0.3。
(ii)以Q琼脂糖FF纯化黄体生成激素(r-hLH)Q琼脂糖色谱柱上设有一保护过滤装置，通过该过滤装置把重组人体黄体生成激素(r-hLH)溶液装入色谱柱。
用0.08M pH7.5的乙酸铵溶液清洗色谱柱。
排出主要废液，直至基线超过5％吸收界线。
收集含有r-hLH的游离馏分直到基线下降至10％。
经步骤3处理过的r-hLH溶液冷冻储存，留待以后用。如果储存温度在-15℃或低于-15℃，r-hLH中间物可在+5±3℃解涷，在用反相高效液相色谱法(步骤4)处理前r-hLH溶液通常要储存24±8小时。第四步第一次制备的反相高效液相色谱法本步骤在室温下进行，有效去除残留的胎牛血清(FBS)、CHO细胞蛋白质和内毒素污染物。
(i)柱的填充和树脂的激活用C18宽孔硅胶填充色谱柱，若C18树脂未用过，需要先用异丙醇调节。
(ii)柱的平衡用含有12.4％(重量)异丙醇的0.05M pH7的乙酸铵缓冲液平衡色谱柱。优选pH值范围是7±0.2。
(iii)调节由步骤3制得的重组人体黄体生成激素(r-hLH)溶液的pH值和体积用浓乙酸将r-hLH溶液的pH值调至7。优选pH值范围是7±0.2。
然后加入异丙醇调节r-hLH溶液的体积，以使异丙醇的最后浓度等于12.4％(重量)。
(iv)调节后的重组人体黄体生成激素(r-hLH)溶液的过滤用含有12.4％(重量)异丙醇的0.05M pH7的乙酸铵缓冲液冲洗过滤装置，其设一过滤等级为0.22μm的过滤器。优选pH值范围是7±0.2。
过滤调节后的r-hLH溶液。
用等量含有12.4％(重量)异丙醇的0.05M pH7的乙酸铵缓冲液洗涤滤液，然后再过滤，将清洗液与r-hLH溶液合并。优选pH值范围是7±0.2。
(v)第一次C18反相高效液相色谱柱纯化黄体生成激素(r-hLH)步骤把r-hLH溶液装入色谱柱，层析的过程由280nm紫外光分光光度计监控。
向色谱柱通入含有12.4％(重量)异丙醇的0.05M pH7的乙酸铵缓冲液，直至A280恢复至基线，排出在基线上的游离馏分。
然后，以0.05M异丙醇/乙酸铵溶液为流动相，具异丙醇的浓度呈线性梯度由14.7％至20.7％(重量)，对r-hLH溶液进行洗脱。
当A280开始增加就会使黄体生成激素(r-hLH)分离。将所有在黄体生成激素峰值时重量超过原来20％的馏分合并。第五步第二次制备的反相高效液相色谱柱本步骤在室温下进行，有效去除残留的胎牛血清(FBS)、CHO细胞蛋白质和内毒素污染物。
(i)柱的填充和树脂的激活用C18宽孔硅胶填充色谱柱，若C18树脂未用过，需要先用异丙醇调节。
(ii)柱的平衡用含有14.7％(重量)异丙醇的0.5M pH7的三盐酸缓冲液平衡色谱柱。优选pH值范围是7±0.2。
(iii)调节由步骤4制得的重组人体黄体生成激素(r-hLH)溶液的pH值和体积向r-hLH样本加入2M pH7的三盐酸缓冲液，使异丙醇的浓度降至约等于色谱柱平衡缓冲液的浓度(14.7％，重量)。
用12M盐酸把r-hLH溶液的pH值调至7。优选pH值范围是7±0.2。
(iv)第二次C18反相高效液相色谱柱纯化黄体生成激素(r-hLH)步骤把r-hLH溶液装入色谱柱，层析的过程由280nm紫外光分光光度计监控。
向色谱柱通入含有14.7％(重量)异丙醇的0.5M pH7的三盐酸缓冲液。优选pH值范围是7±0.2。排出游离馏分。
然后，以0.5M异丙醇/三盐酸溶液为流动相，其异丙醇的浓度呈线性梯度由14.7％至20.7％(重量)，对r-hLH溶液进行洗脱。
当A280开始增加就会使黄体生成激素(r-hLH)分离。将所有在黄体生成激素峰值时重量超过原来20％的馏分合并。
(v)透析用注射水稀释由第二次C18反相高效液相色谱法步骤制得的r-hLH溶液，优选采用8倍注射水。
将稀释的r-hLH溶液在截留分子量为10KD的滤膜(见步骤4)上过滤对注射水透析。加入等量pH值等于8的碳酸氢铵溶液，继续透析直至满足碳酸氢铵缓冲液的特性。
把存留液浓缩至最后体积约1升并回收。用0.5M pH8的碳酸氢铵溶液冲洗过滤器，将滤液和存留液合并，可选择再进一步浓缩。是否进一步浓缩取决于下一步(即步骤6)中所采用的色谱柱尺寸。第六步 SepHacryl S100 HR凝胶渗透色谱法及超滤在本步骤中，按分子的大小进行分离，并把溶液过滤。本步骤的所有操作均于+5℃下进行。优选温度的范围是+5±3℃。
(i)SepHacryl S100HR凝胶渗透色谱法用SepHacryl S100HR填充色谱柱，首先用注射水平衡。
然后用0.5M pH8的碳酸氢铵溶液平衡色谱柱。
把0.5M pH8的碳酸氢铵溶液装入色谱柱，层析的过程由280nm分光光度计监控。
当A280开始增加就会使黄体生成激素(r-hLH)分离。将所有在黄体生成激素峰值时重量超过原来20％的馏分合并。
从SepHacryl S100 HR凝胶渗透色谱柱洗脱出来的r-hLH溶液再优选用过滤器过滤一次，如VirosolveTM，以去除病毒性污染物。
(ii)重组黄体生成激素(r-hLH)的透析及浓缩0.05M氢氧化钠溶液中储存的一些滤膜(超滤膜的截留分子量为10KD)，在纯化操作之间要用注射水冲洗这些滤膜直至pH值下降到约等于8。
将稀释的r-hLH溶液在10KD滤膜上过滤(超滤膜的截留分子量为10KD)对注射水透析。再加入等量0.01M pH值8的磷酸钠缓冲液，继续透析直至满足磷酸钠缓冲液的特性。
若需要，把存留液浓缩至最后体积约等于500毫升并回收。用0.01M pH8的磷酸钠缓冲液冲洗过滤器，将滤液与存留液合并。
根据储存条件，可选择再加上一步黄体生成激素(LH)的浓缩步骤。
过滤r-hLH溶液，把滤液收集到消毒瓶中。
纯化后的r-hLH本体溶液优选在-15℃冻存于消毒瓶中。试剂、缓冲液、洗脱液及化学药品色谱树脂纯化过程选用下列色谱树脂及平衡树脂。
步骤2二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖CL-6B(来自Pharmacia，瑞典)步骤3Q琼脂糖FF(来自Pharmacia，瑞典)步骤4C18硅胶反相高效液相色谱法(来自waters，美国)步骤5C18硅胶反相高效液相色谱法(来自waters，美国)
步骤6SepHacryl S100 HR(来自Pharmacia，瑞典)供货商Amersham Pharmacia Biotech， Waters CorporationBj_rkgatan 3034 Maple StreetS-751 84，Uppsala Milford，MA 01757SwedenUSA结果生物活性表2列出采用本发明方法纯化之后，重组人体黄体生成激素(r-hLH)的不同批料的生物活性。由276.5nm分光光度计测量蛋白质浓度(以毫升LH蛋白质含有的毫克计)，根据氨基酸序列分析a＝0.812从实验得出吸附性。
重组人体黄体生成激素(r-hLH)制剂的平均比活度特别高，约等于25.000IU/mg(以毫升LH蛋白质计)。
表2 重组人体黄体生成激素(r-hLH)本体溶液各批料的比活度
制剂用本发明的高纯度重组人体黄体生成激素(r-hLH)制成了冻干制剂。
其中一个典型例子是，在DIN 2R瓶内以蔗糖为赋形剂制成了强度为75 IU的冻干制剂(见表3)，这种制剂稳定性好，于4℃可储存几个月。
表3
权利要求
1.一种从样本纯化黄体生成激素(LH)的方法，其特征在于所述方法包括使用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤(a)用离子交换色谱法使样本洗脱以得到一第一洗脱液；(b)用反相高效液相色谱法使第一洗脱液洗脱以得到一第二洗脱液；以及(c)用凝胶渗透色谱法使第二洗脱液洗脱。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述离子交换色谱法和反相高效液相色谱法各洗脱两次。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述离子交换色谱法和反相高效液相色谱法在不同基质和/或操作条件下各洗脱两次。
5.如权利要求1至4中任何一项所述的方法，其特征在于所述离子交换色谱法的一步骤是以二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖为固体载体来进行。
6.如权利要求1至5中任何一项所述的方法，其特征在于所述离子交换色谱法的一步骤是以Q琼脂糖为固体载体来进行。
7.如权利要求1至6中任何一项所述的方法，其特征在于所述反相高效液相色谱法的一步骤是以硅胶C18为固体载体来进行。
8.如权利要求1至4中任何一项所述的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤(a)用二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖离子交换色谱柱使样本洗脱；(b)用Q琼脂糖离子交换色谱柱洗脱；以及(c)用硅胶C18反相高效液相色谱柱洗脱。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法包括一附加步骤用(d)硅胶C18反相高效液相色谱柱再洗脱一次。
10.如权利要求5至9中任何一项所述的方法，其特征在于所述在二乙氨基乙烷(DEAE)琼脂糖离子交换色谱柱的洗脱是在pH值等于8的磷酸钠缓冲液中进行的。
11.如权利要求5至10中任何一项所述的方法，其特征在于所述在Q琼脂糖离子交换色谱柱的洗脱是在pH值等于7.5的乙酸铵缓冲液中进行的。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述步骤(c)是以异丙醇/乙酸铵作为流动相。
13.如权利要求9所述的方法，其特征在于所述步骤(d)是以异丙醇/三盐酸作为流动相。
14.如权利要求1至13中任何一项所述的方法，其特征在于所述黄体生成激素(LH)是人体黄体生成激素。
15.如权利要求1至14中任何一项所述的方法，其特征在于所述黄体生成激素(LH)是重组黄体生成激素。
16.如权利要求1至15中任何一项所述的方法，其特征在于所述样本来源于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞培养基。
17.一种药物组合物，其特征在于所述药物组合物包括一由权利要求15所述方法制备的有效治疗量的黄体生成激素(LH)及适当赋形剂。
18.如权利要求17所述的药物组合物，其特征在于所述赋形剂是蔗糖。
19.如权利要求17或18所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物适合在皮下施用。
全文摘要
一种从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上清液的原重组黄体生成激素(LH)样本纯化重组人体黄体生成激素的方法，其包括联合使用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法。用离子交换色谱法和反相高效液相色谱法各洗脱两次，最后通过凝胶渗透柱使黄体生成激素纯化至完全不含任何污染物。由这种方法可制成高度纯化的黄体生成激素，其比生物活度非常高，约为25.000IU/mg。
文档编号A61K38/24GK1404486SQ01805364
公开日2003年3月19日 申请日期2001年1月22日 优先权日2000年2月22日
发明者G·帕拉迪斯, M·罗西, L·斯卡利亚 申请人:应用研究系统Ars股份公司