专利名称：肠递送用组合物的制作方法
背景技术：
(a)发明领域本发明涉及一种组合物和一种口服生理活性产物并经肠递送的方法。本发明给药的生理活性产物能够获得较好的全身性递送和免疫诱导，并已证实提高了营养、营养药(nutraceutical)和治疗能力。
(b)现有技术的描述包括蛋白质和肽药物的治疗的常规途径是经肠道外给药(例如通过注射)。这主要是由于这些药物通过胃肠道不能吸收。然而，注射很痛苦并且相对其它剂量形式有时给药困难。患者顺从是一个重要原因，也是由于这些药物中一些可能需要给药到年少或年老的患者。对患者接受性来说口服递送由于痛苦小且方便，因此要比注射优选。然而，通过胃肠(GI)道递送治疗用多肽具有许多问题如胃中pH低、药物在小肠中蛋白水解降解、通过肠膜的吸收低、以及这些制剂的稳定性有限，特别是作为水溶液，都是多肽在口服之后吸收的潜在障碍。
最近口服递送多肽已集中在使用吸收增强剂上。这使得发现水杨酸钠的过量油悬液能够增强来自胃肠道的人生长激素的吸收。尽管通过这种组合使吸收得到了提高，但是生物可利用率仅不超过蛋白质的约10-20％(相对静脉内)，甚至更低。结果，为了在血浆内提供蛋白质的所需治疗水平，必需口服大量蛋白质。对蛋白质和多肽而言这是一个严重的问题，甚至在生物工程方面，利用率仍然相对有限并且化学实体复杂，结果非常昂贵。此外，现有技术中的液体或半固体组合物难以配制或包装成口服递送的剂量形式。
可以考虑到其它方面。在哺乳动物中，胃蛋白消化的重要性必然是次要的，因为在患恶性贫血的全胃萎缩症的个体中没有严重的蛋白吸收障碍。胃的贮存作用相当重要，因为在饭后蛋白质能够持续地进入到十二指肠中并且确保与胰液充分混合。低pH和消化活性组合可能使得大多数食品蛋白质变性，从而暴露出对小肠内进一步水解敏感的键。
被覆胃肠道的上皮还清楚地起身体的外部环境和内部环境之间的“边界”的作用。它们含有选择性生理机构从而部分地控制分子进入和离开身体，在这种情况下起与具有与肾(具有“出口阀”性能的另一器官)的特别相似的生物化学性能的“阀”的作用，尽管术语“阀”贬低了产生该功能的活性代谢过程。肠上皮的确起着重要的物理屏障的作用，这是潜在脆弱的细胞的单层的显著功能，该单层一直受物理和化学有害消化材料的攻击。然而，必需意识到，它不是如经常假设那样“绝对”的屏障。因此，旧的观念是整个蛋白不能简单地进入健康循环，对身体的胃肠道进入恒定地具有高选择性，并且微粒材料恒定地被排除了，为了更慎重且综合地了解屏障功能，必需抛弃这种旧的观念。除了不完全的物理屏障功能，胃肠道上皮起着免疫屏障和酶屏障的作用，这些相当复杂的机理是蛋白质和肽作为整体形式吸收的观念的中心并且与其是不可分开的。
已研究了当经口或肠递送时通过不同途径的肽和蛋白质的酶屏障，在吸收之前(或期间)酶降解无疑给肽药在小肠中的吸收提供了决定性障碍并且对肽和蛋白质通过胃肠道吸收提供了主要屏障。
因此，为了通过肠途径药用递送肽，抑制蛋白酶或肽酶或防止这种降解的发明制剂是注意的重要目标，可能比吸收增强策略更重要。尽管应避免目的论，但是胃肠道中屏障机理的多重性可能是外来生物活性物质未控制地进入的严重后果的进化反映。因此，这些机理不可避免地给发明有效递送肽和蛋白质药的模式带来相当大的困难。具有保护功能的消化表面的观念建议刷状缘结合的蛋白酶和肽酶具有“水解屏障”的作用从而补充具有保护功能的“物理屏障”和“免疫屏障”，然而细胞质肽酶(仅)具有消化功能。如果通过细胞旁(paracellular)途径的大规模通道(通过溶剂拖动驱动)得到证实，以便腔和表面水解(细胞旁通道之前)对生物活性肽从膳食蛋白的部分消化进入到身体内最小化是决定性的，那么该模式将是更相关的。
原则上，通过上皮的潜在途径可以分成(a)跨细胞的(包括屏障介导机制和内吞机制；以及通过膜的水通道或脂质部分的扩散途径)和(b)细胞旁的(包括通过“紧密”连接和挤出区的通道，天然细胞更新过程中产生的那些并且在物理和化学损害时出现的那些)。
常规观念是，与自由氨基酸进入循环的量相比，整个肽或蛋白质从膳食的吸收量小，其直接营养重要性可以忽略。然而，这些分子以整个形式吸收是或者可以是有益的，有两个原因。首先，经M-细胞途径的抗原抽样是天然获得粘膜免疫性的重要部分。其次，该途径可以潜在地开发为治疗目的。与非肠道和直肠途径相比，除了口服途径的这种相对容易、安全、(例如不需要无菌仪器)、无损伤性、和患者接受性之外，肠途径可以给肝提供益处更大的入口(相对胰岛素给药)。另一方面，一些整个肽和蛋白质进入到循环可能是有害的，尽管这种事实证据目前还不完整，并且由食品蛋白质或肽产生的病理结果的许多断言都是以不超过轶事或主观证据为基础的。尽管这种保留性，但是肠胃食品变应性现在是一种公认现象，并且整个蛋白吸收以增加到上皮下肥大细胞的进入是该机制的一部分。
当然，吸收的整个蛋白的潜在生物效应并不限于免疫效应。
提高肠吸收的试剂在口服生物活性肽和蛋白质用于不同应用的领域尤为重要。关于使用增强剂的有效保留性与它们基本上是膜或连接破坏性试剂的事实有关。增强剂，特别是慢性使用的，可能具有毒性并促使不想要的分子进入。通过剧烈增加细胞旁渗透性可能产生有害影响的色氨酸补充是吸引人的结果。可能一些个体对色氨酸特别敏感。
已评估使用脂质体捕获防止肽和蛋白质降解，并且发现接下来的结果令人失望。使用脂溶性途径的另一方法，即跨细胞扩散，应将肽或蛋白质配制成微乳剂。已花费大量精力试图设计口服递送胰岛素的方式。几乎每个努力都成功了，但是仅非常有限的程度。已开发出油包水微乳剂，它含有胆固醇、卵磷脂和脂肪酸，其关键比例模拟乳糜微粒的组成。令人失望的是，当接下来批量配制发现被格列本脲污染时，这些发现的可信性受到质疑。
从现有技术中了解到，蛋白质的肛门给予比口服相同剂量时获得更大的吸收和组织累积。这样就引出这种问题通过口服途径的吸收是否能够得到提高。可能存在将口服吸收值至少增加至通过直肠刺激获得的值的可能。已考虑了几种防止肠的作用保护药理活性肽和蛋白质的方法，包括肠和类似保护性包衣，与抗酸剂和酶抑制剂共给药和在细菌细胞和活食物中递送(生物包封)。
例如，当与大豆胰蛋白酶抑制剂共同递送到虹鳟鱼中时，HRP(辣根过氧化物酶)的口服吸收增加。在相同研究中，共同递送人造洗涤剂Maga-9，当与对照比较时发现几乎双倍的血浆HRP存在。由于粘液层胶凝并且接下来蛋白质-肠细胞相互作用增加，因此获得增加的蛋白质浓度。同样，可能GI上皮的整体性破裂，允许跨细胞吸收。Mega-9，当与重组牛生长激素(rbGH)和抗酸剂一起经口插管饲喂时，与仅用该生长激素喂食的鱼比较，coho鲑在7周的试验期间生长性能显著增加。
在裸盖鱼A.fimbria的诱导排卵研究中还将洗涤剂(L-溶血磷脂酰胆碱)与促性腺素释放激素促效药(GnRHA)共同递送，分别使GI吸收最大和升高胃pH。用鲑鱼脑垂体提取物和0.2％聚丙烯酸经口插管饲喂金鱼产生拮抗作用。
已测定作为增强剂的抗生素莫能星。选择该化合物的基本原理是由于其降低胞饮蛋白质在囊泡和溶酶体隔室之间转移的能力。而且，已证实莫能星使不同细胞类型中的酸隔室的pH上升。然而，没有看出对HRP吸收的影响。使用可生物降解的微粒包装，由此防止蛋白质消化，已使用复杂蛋白质大分子进行了测定。在这些研究中，将HGG用于大西洋鲑鱼Salmo salar中，经口插管施用之后蛋白质的血浆存在延长的特别长(高达8周)，这暗示捕获的HGG可能经过细胞旁以及跨细胞途径具有增加的进入，导致持续的血浆停留。还以保护形式递送了GH，其中将该分子掺入到在酸性条件下保持为整体但是在肠的碱性条件下降解的聚合物基质中。当加入到食品中时，在对照看到的时间内和之后捕获的GH增加虹鳟鱼的生长。保护口服递送药物的另一方法(已用于鱼的接种)，是它们在另一生物体内的递送。就生物活性蛋白质而言，仅通过对虹鳟鱼GH使用酵母重组物的一种情况评价了该策略。在深入研究中，用补充有GH酵母重组物的膳食喂食条纹胭脂鱼，相对对照，处理过的动物的生长速度显著。然而，这种方法受到这些生物体的限制，例如酵母，它们能够以未修饰形式贮存重组产物。最近还证实开发了许多基因工程植物，它们表达感兴趣药物的基因。研究证实，当口服递送时保留了基于植物的重组产物的生物活性。给药与水产养殖有关的生产定位性蛋白质的类似方法因生产经济性而特别吸引人。
生物技术领域的发展已提供了以经济上可行的水平生产实质上无限供给的生物活性肽和蛋白质的方法。因此，可以想到的是，动物(包括人)肠的天然渗透性可以用作递送肽和蛋白质药的装置从而影响生理控制过程。明显定位应用领域包括控制再生、生长加速、免疫提高、治疗和营养改善。
接种用的口服途径具有显著优点，它降低了劳动成本、节约了时间、减少了用针交叉污染的可能性并且不涉及存货操作或者需要处置处理水。然而，就本讨论而言，仅仅以抗原组份为基础考虑口服接种。已报道在高等脊椎动物中用合成肽基病毒疫苗的试验是成功的，尽管相反结果已开始出现在大量试验中。就免疫程序而言，可以想到可以将由糖蛋白/核蛋白组成的重组亚单元疫苗加入饲料中。
可以控制所有个体感染的策略将是任何形式的防止或大大降低微生换载运(carriage)及传播的免疫。当用流感嗜血杆菌，例如b类多糖-蛋白结合体对小孩进行免疫时，已观察到载运从约4％降低至低于1％，可以解释伴随的群体免疫。如果疫苗可以防止微生物定居的话，那么这种疫苗将被希望事实上预防所有免疫患者或动物中相同性(gender)的微生物的感染。由于甚至未免疫的患者必需从其它个体获得微生物，因此减少载运的疫苗应降低无免疫应答、以及未免疫的患者中的感染。事实上，侵犯性免疫过程，与证实带菌者的抗生素处理相伴，可以去除这种生物体的贮存。
在粘膜表面的特异性免疫的主要决定因素是分泌型IgA(S-IgA)，它在生理和功能上与循环免疫系统的组份分开。粘膜S-IgA反应主要是通过共同粘膜免疫系统(CMIS)产生的，其中免疫原是通过专门化淋巴-上皮结构(总称为与粘膜有关的淋巴组织(MALT))吸收的。
因此，肠内的免疫性可以引起上呼吸道中的粘膜免疫，反之亦然。公知的MALT结构是肠淋巴集结。而且，重要的是注意到，除了粘膜IgA抗体之外，口服免疫可以诱导全身性隔室中抗原特异性IgG反应。
大多数可溶性且非复制的抗原是差的粘膜免疫原，特别是通过经口途径，这可能由于消化酶降解它们并对肠有关的淋巴组织(GALT)具有少量或者没有向性。值得注意的例外是霍乱毒素(CT)。CT是有效的粘膜免疫原，这可能是由于其结合亚单元CTB的GM1神经节苷脂结合性能，使它能够被淋巴集结的M细胞吸收并传递给下面的免疫活性细胞。除了为良好的粘膜免疫原之外，CT是提高与其共给药的其它可溶性抗原的粘膜免疫原性的佐剂。尽管它保留了几分争论，但是纯或重组CTB当作为佐剂经胃给药(i.g.)时可能没有这些性能。然而，很少量(＜1mg)的整体CT能够与CTB协同地起口服佐剂的作用。这种发现可以解释经常含有少量污染CT的CTB的许多工业制剂的表观佐剂活性。
尽管具有营养和治疗价值的肽化合物的发现在最近几年内快速进行着，但是开发许多这些化合物用的可行的生理活性剂递送系统经常证实有问题。这些胃肠道分泌许多代谢多肽的试剂。
这些分解代谢试剂的例子是胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧基多肽酶、氨基多肽酶和二肽酶。避开胃和小肠中分解代谢的多肽被运输通过被覆胃肠道的细胞进入门脉循环，它载着吸收的多肽到肝中。吸收的多肽经受无数肝代谢的进一步降解。来自血液的吸收物质进入全身循环之前的这种肝降解在药物领域称之为“第一关卡效应”。
因此，这些化合物中大多数，如果不是所有的话，都必需经肠道外给药，例如经皮下、肌内或腹膜内注射。由于大多数患者不能自给药肠道外药剂，因此经常必需将这种药在门诊病人环境中给药，使得它们使用时成本增加。
以生物活性肽和蛋白质口服递送到几种动物，如农场和水产养殖类将提供益处的假设为基础，可以认为能够改善药剂的吸收是有益的。
因此，迫切需要一种新的、有效的、成本有效且非侵入性的方法将本身不适于口服的含有营养和治疗剂，特别是肽的组合物给予患者和动物。
本发明的另一目的是提供一种治疗动物内肠微生物感染的方法，包括给药足够量的本发明组合物，其中所述生理活性剂是抗微生物剂。
根据本发明，提供了一种给动物口服用于肠递送生理活性剂的组合物，本发明的组合物含有至少一种浓度为约1％-60％w/w的中和剂、浓度为约1％-50％w/w的酶抑制剂、和浓度为约0.1％-50％w/w的吸收增加剂。
本发明的组合物，还包括选自以下的生理活性剂治疗剂、营养品、粘多糖、脂类、糖类、类固醇类、激素类、生长激素(GH)、生长激素释放激素(GHRH)、上皮生长因子、血管内皮生长和渗透性因子(VEGPF)、神经生长因子、细胞因子、白介素、干扰素、GMCSF、激素类产品、神经因子、神经营养因子、神经递质、神经调质、酶、抗体、肽、蛋白片段、疫苗、佐剂、抗原、免疫刺激或抑制因子、造血(heomatopoietic)因子、抗癌产品、消炎药、抗寄生物化合物、抗微生物药、核酸片段、质粒DNA载体、细胞繁殖抑制剂或活化剂、细胞分化因子、血液凝固因子、免疫球蛋白、抗血管生成产品、负选择标记物或“自杀”药、毒性化合物、抗血管生成药、多肽、抗癌药、产酸药、和组胺H2-受体拮抗剂。
本发明的组合物含有中和剂，其量足以中和宿主动物的消化系统中的酸降解并允许将生理活性剂递送到动物肠中，其中所述中和剂可以选自抗酸剂、碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、磷酸钙、碳酸钙、镁盐、碳酸镁、三硅酸镁、氢氧化镁、磷酸镁、氧化镁、碱式碳酸铋及其组合。
本发明的组合物可以含有由以下物质组成的中和剂浓度为组合物的10％-20％w/w的碳酸钠和浓度为10％-20％w/w的碳酸钙中的至少一种。
根据本发明，提供了一种组合物，含有至少一种酶抑制剂，其量足够基本上抑制人或动物的消化系统中消化酶降解生理活性剂并允许将该生理活性剂递送到所述人或动物的肠中。
消化酶的抑制剂可以选自抗蛋白酶类、卵白蛋白、得自含油种子(oilseed)、大豆、菜豆、蚕豆、米糠、麦麸的植物源抑制剂、乙二胺四乙酸盐、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、卵白蛋白和蛋白酶体。
本发明的组合物可以含有浓度为10％-20％w/w的胃蛋白酶抑制剂、肠肽酶抑制剂和/或白蛋白。
本发明的组合物可以含有这样的吸收增加剂，该吸收增加剂可以由胆汁盐、皂甙、脱氧胆酸盐、水杨酸钠、月桂基硫酸钠、油酸、亚油酸、油酸单甘油酯、卵磷脂、溶血卵磷脂、聚氧乙烯山梨糖醇酯、对叔辛基苯氧基聚氧乙烯、N-月桂基-β-D-吡喃型麦芽糖苷(N-lauryl-β-D-maltopyranoside)、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-氮酮(1-dodecylazacycloheptane-2-azone)和磷脂。
所述吸收增加剂可以是浓度为1％-5％的脱氧胆酸钠。
本发明的组合物还可以含有至少一种选自以下的其它组份乙二胺四乙酸盐、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、粘合剂、示踪剂、一种或多种甜味剂、表面活性剂、脱模剂(unmoulding agents)、风味剂、粗粉(meal)、豆类、酵母、啤酒酵母、矿物油、植物油、动物油、润滑剂、软膏及其组合。
本发明的另一目的是生理活性剂当递送到人或动物肠中时可以被肠吸收用于全身递送，或者对肠壁具有有效的生理影响。
本发明的组合物还可以允许生理活性剂当递送到人或动物肠中时生理影响肠的内容物。这种应用还可以用于刺激食品通过消化道或者治疗感染性疾病。
根据本发明，生理活性剂能够在宿主人或动物中诱导抗粘膜感染性疾病的粘膜免疫或者全身免疫反应。提供了一种免疫宿主抗粘膜微生物的方法，包括使宿主口服免疫量的以杀死的整个微生物形式的微生物表面蛋白、微生物溶解产物或分离抗原或其免疫片段。
本发明还提供了一种口服给宿主，优选给药到宿主的消化道(胃、消化道)的组合物，从而赋予保护或引出抗微生物感染的免疫反应。
根据本发明，提供了一种治疗动物中肠微生物感染的方法，包括给药本发明的组合物，所述组合物含有足够治疗效果量的抗微生物剂。
微生物感染可以是由选自以下的微生物引起的细菌、蘑菇、酵母、病毒、葡萄球菌属、链球菌属、微球菌属、消化球菌属、消化链球菌属、肠球菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、乳杆菌属、利斯特氏菌属、丹毒丝菌属、丙酸杆菌属、真杆菌属、棒杆菌属、枝原体属、尿枝原体属、链霉菌属、嗜血菌属、奈瑟氏球菌属、艾肯氏菌属、莫拉氏菌属、放线杆菌属、巴斯德氏菌属、拟杆菌属、梭杆菌属、普雷沃氏菌属、卟啉单胞菌属、韦荣氏球菌属、密螺旋体属、光岗菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、弯曲杆菌属、克雷伯氏菌属、衣原体属和大肠菌类(Coliforms)。
用于治疗微生物感染的抗微生物剂可以选自抗生素、细菌素、羊毛硫抗生素、微生态制剂、抗真菌剂、抗霉剂、抗寄生虫剂、氨基糖苷类、万古霉素、利福平、林可霉素、氯霉素和fluoroquinol、青霉素、β-内酰胺类、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、哌拉西林、替卡西林、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢噻吩、亚胺青霉烯、氨曲南、庆大霉素、奈替米星、妥布霉素、四环素、磺胺、大环内酯、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、多粘菌素B、克林霉素抗生素及其组合。
本发明还提供了一种全身递送的方法，包括向动物口服治疗动物健康紊乱的治疗剂，还可以包括可接受的药用载体。
本发明的组合物可用于生产药物或食品。
本发明还提供了一种提高人或动物的肠吸收的方法，包括口服生理有效量的生理活性剂。
为了本发明的目的，以下术语定义如下。
术语“治疗剂”以常规观念使用并包括治疗剂、预防剂和替代剂、抗微生物剂。
术语“共同粘膜免没系统”是指在任何粘膜位置的免疫可以在所有其它粘膜位置引出免疫反应的事实。
术语蛋白”、“肽”和“多肽”是指天然存在的化学实体和由内源、外源或合成源得到的结构相似的生物活性等价物并将其用于指通过已知为肽键的酰胺类键连接在一起的氨基酸聚合物。
术语“结构相似的生物活性等价物”意思是具有氨基酸序列的多肽，尽管与天然存在的肽不同，但是所述氨基酸序列在结构上足够相似从而对患者产生与天然肽本身所产生的基本上等价的治疗效果。
术语药物的“治疗有效量”意思是足够量的化合物，从而以可用于任何药物治疗的合理的益处/危险比例获得所需治疗益处。然而，应理解为，本发明药物和组合物的总日用量将由具有可靠医学判断范围的主治医师来决定。任何特定患者的特定治疗有效剂量水平将取决于各种因素，包括所治疗的疾病和疾病的严重程度；所用化合物的活性；所用的特定组合物；年龄、体重、综合健康严重状况、性别和患者饮食；给药时间、给药途径和所用特定化合物的排泄速度；治疗时间；组合使用或者与所用特定化合物同时使用的药物；和医学领域公知的类似因素。例如，本领域技术人员公知以比达到所需治疗效果的剂量低的剂量开始并且逐渐增加剂量直到获得所需效果。
图1描述了在所有罐中增加脱氧胆酸钠(g脱氧胆酸钠/kg避绕鸡尾酒)对虹鳟鱼重量增加的影响；图2描述了在末端罐中增加脱氧胆酸钠(g脱氧胆酸钠/kg避绕鸡尾酒)对虹鳟鱼重量增加的影响；图3描述了具有增加水平的脱氧胆酸钠的补充有bST的避绕鸡尾酒中溪红点鲑(brook trout)重量增加的百分数；图4描述了对照和注射过的鱼的鱼体重增加。
图5描述了OraljectTM制剂的冻干卵白蛋白的抑制曲线。
图6描述了OraljectTM制剂的红菜豆的抑制曲线。
图7描述了OraljectTM制剂的大豆的抑制曲线。
图8描述了OraljectTM制剂的蚕豆的抑制曲线。
图9描述了OraljectTM制剂的EDTA的抑制曲线。
图10描述了OraljectTM制剂的麦麸的抑制曲线。
图11描述了OraljectTM制剂的喷雾干燥卵白蛋白的抑制曲线。
图12描述了OraljectTM制剂的组合组份的抑制曲线。
图13描述了HRP在虹鳟鱼血浆中的标准曲线；和图14描述了OraljectTM对HRP吸收的影响。
发明详述本发明涉及以口服剂量形式给药治疗用蛋白质和多肽。与现有技术相比，本发明提供了通过胃肠道的增加的吸收并且大大提高了蛋白质/肽的生物利用率。本发明可用于人和兽医营养、治疗和处理。正如本文和附加权利要求书中所用的，术语“多肽”范围包括蛋白质和肽以及多肽。
本发明的化合物和组合物可用于将生物或化学活性剂给药到任何动物如鸟类、鱼类、哺乳动物(例如灵长目并且尤其是人)和昆虫。该系统对在给药的动物体内递送这样的生理、生物或化学活性剂是特别有益的，所述活性剂否则将被活性剂到达其靶区域(即，递送组合物的活性剂将要释放的区域)之前遇到的条件降解或者使其有效性降低。尤其是，本发明的化合物和组合物可用于口服活性剂，特别是通常不能口服递送的那些。
本发明尤其可用于给药多肽，包括蛋白质，例如，但不限于，治疗剂、营养品、粘多糖、脂类、糖类、类固醇类、激素类、生长激素(GH)、生长激素释放激素(GHRH)、上皮生长因子、血管内皮生长和渗透因子(Vasculav endothelial growth and permeabilityfactor，VEGPF)、神经生长因子、细胞因子、白介素、干扰素、GMCSF、激素类产品、神经因子、神经营养因子、神经递质、神经调质、酶、抗体、肽、蛋白片段、疫苗、佐剂、抗原、免疫刺激或抑制因子、造血因子、抗癌产品、消炎药、抗寄生物化合物、抗微生物药、核酸片段、质粒DNA载体、细胞繁殖抑制剂或活化剂、细胞分化因子、血液凝固因子、免疫球蛋白、抗血管生成产品、负选择标记物或“自杀”药、毒性化合物、抗血管生成药、多肽、和抗癌药、核苷酸等、及其结构相似的等价物。
根据本发明的一个实施方式，提供了一种组合物，它用于口服并且肠递送可以和脱氧胆酸盐和皂甙配制的营养化合物或治疗用多肽(但不限于本文所述的产品)，其比例可提供宿主肠对所述肽实质上增加的吸收和全身的生物利用率。所述组合物还含有pH中和剂，例如但不限于碳酸钠和碳酸钙，以及至少一种消化酶抑制剂，例如但不限于卵白蛋白。这种组合物优选是固体，以便在配制口服组合物形式时易于操作。pH的中和意思是将消化道中的pH增加至可以与天然或合成的大多数已知活性生物产品相容的酸碱平衡。消化道的pH可以是，但不限于，约5-9，优选约6.5-7.5。
应理解的是，上面所列药物仅仅是为了举例说明的目的，并不是提供为所有可以使用本发明的口服递送组合物有益地配制或者再配制的药物的所有包括的列表。可以包封在本发明组合物中的其它生理活性化合物包括生物活性化合物，例如蛋白质、酶、抗酶、肽、儿茶酚胺、抗组胺、止痛药等。为了本发明的目的，“生物的”定义为得自生物源的任何营养或药用有用的成分和/或其合成药用等价物，例如胰岛素、血红素、血色素(牛、人或合成的)、和激素；“酶”或“酶系统”定义为生物或合成生产并且起生物催化剂作用的任何蛋白质或结合蛋白。本领域技术人员已知的其它药用成分，例如球蛋白、一种或多种糖蛋白，例如红细胞生成素，也可以加入到本发明组合物中。
治疗用多肽的量可以广泛地变化，这取决于各种因素如待递送的特定肽、待治疗的指征、各个患者等。其量是治疗有效量，即，提供治疗效果的量，它是根据已确立的医药实践测定的。
本发明的另一实施方式是使用肠包衣，可以用片剂和胶囊获得。肠包衣在胃中保持整体，但是一旦它们到达小肠它们就快速溶解，之后在肠的下游位置(例如回肠和结肠)释放药物。肠包衣在本领域为公知。或者，可以使用一种控释的口服递送容器递送本发明制品，所述容器经过设计在预定时间之后，并且因此在容器进入回肠或结肠之后释放药物。这种容器包括CHRONSETTM递送装置(ALZA公司，Palo Alto，Calif.)和PulsincapTM递送装置(R.P.Scherer Co.)。
所述组合物还可以含有离子对形成试剂，其中离子对形成试剂与药物的摩尔比为约2∶1至约10∶1。加入离子对形成试剂以增加溶解的生理活性剂或药物的亲脂性并由此增加其膜渗透性。药物亲脂性增加也可以对药物提供一些保护以防止酶促失活，因为体内发生的许多肽降解在胃肠道的含水环境中进行。代表性的离子对形成试剂包括癸磺酸钠、月桂基硫酸钠和苯甲酸钠。
在本发明的一个实施方式中，所述组合物可以任选含有以组合物总体积计约1％-5％的肠粘膜运输增强剂脱氧胆酸盐。这些试剂使治疗剂易于通过肠粘膜内的粘膜组织吸收并直接进入患者的血流中。同样，适用于本发明的组织运输增强剂选自精油或挥发油或选自无毒、药用可接受的有机和无机酸或其盐和酯。可用于该组合物中的精油或挥发油选自大豆油、蚕豆油、米糠油、鱼油。优选的精油是鱼油。
在本发明的另一实施方式中，组合物可以含有其它试剂如防腐剂和抗氧化剂。典型的防腐剂包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸甲酯和丙酯(对羟基苯甲酸酯类)。代表性的抗氧化剂包括丁基化羟基回香醚、丁基化羟基甲苯、去甲二氢愈创木酸、没食子酸酯类如没食子酸丙酯、氢醌、丙烯基甲基guaethol和硫代丙酸烷基酯类、或水溶性试剂如烷醇胺类、醇类和丙二醇。最优选的抗氧化剂是TenoxTMGT1(1∶1维生素E-大豆油)，以液滴总体积计以约5％-约25％的浓度存在。
当与脱氧胆酸盐一起递送时，鲤鱼口服吸收重组人GH增加至1000倍。
为了制备本发明的药用制剂，将这些组份干混在一起，之后加入少量油。将这些物料混合在一起直到获得均匀的组份混合物。将所得固体制剂压制成片剂，然后可以用合适的肠溶衣包覆。或者，可以将所述固体制剂放入由明胶等形成的胶囊中并用肠化合物包覆，或者放入控释的递送设备如CHRONSETTM中。该固体制剂提供了一种容易且方便制造剂量形式的装置。
在本发明的一个实施方式中，组合物含有药物 5mg/ml卵白蛋白 10-20％碳酸钠10-20％碳酸钙10-20％EDTA 1-10％大豆 5-10％蚕豆 5-10％米壳 5-10％脱氧胆酸盐1-5％鱼油 5-10％啤酒酵母 1-5％本发明的一个实施方式提供了一种向动物或人宿主递送激素和药物的方法。在农业生产领域中，重点指出了生产不同的鱼种。繁殖生理学的控制尤其重要。通过喂食生物活性物质控制鱼繁殖的本发明第一指示是通过使用哺乳动物和两栖动物的脑垂体的研究提供的。因此，已观察到膳食替代或补充脑垂体制剂将在苦鱼Acheilognathusinrer-medium中诱导婚色，在泥鳅Misgurnus anguillicaudatus中，部分成熟，并增加卵直径，在剑尾鱼Xiphophorus helleri中导致排卵并将孵育间隔缩短10-15天，并增加溪红点鲑salvelinusfontinalis卵大小和诱导雌性早熟。类似地，给金鱼C.auratus口服鲑鱼脑垂体提取物，将诱导排卵并增加精子。这些数据的重要性在于伴随着血浆鲑鱼促性腺素(sGtH)、睾酮和17α-20β-二羟基-4-孕烷-3-酮增加，提供了早期研究中其它脑垂体制剂观察到的效果的可能基于内分泌物的解释(即，GtH的吸收)。
由于使用脑垂体制剂和部分提纯的激素所固有的问题，在使用口服途径控制培养种繁殖方面，除非配制于本发明组合物中，不可能出现这些制剂将提供任何重要益处。在控制成熟方面的相对近的创新是使用促性腺素释放激素。GnRH的许多类似形式在诱导排卵方面比天然形式有效50-100倍，并包括加入D氨基酸并具有用乙酰胺代替的末端的那些。这些操作具有提高分子抗蛋白水解的效果。GnRH刺激天然释放GtH，呈现广泛的种潜力，相对容易地生产，并且因此是经济的。此外，这些肽在广泛的温度下稳定，并且表达非变化的潜能。重要的是，这些肽在无限时间内都稳定，只要它们在无菌条件下贮存于-20℃的温度下。因此这些GnRHA提供了用于控制繁殖的口服方法中优异的候选分子。事实上，已累积了足够的试验证据，以致现在在有或没有多巴胺促效药时膳食递送GnRHA指示为一种控制鱼成熟最后阶段的方法。尽管比常规方法(注射、植入)贵，但是膳食给药赋予了无压力的优点。这种繁殖生物技术的优点尤其可用于操作易受损和/或安全注射太小的物种(即观赏性物种)。此外，用GnRHA慢性治疗提供了诱导早熟的方式，在鱼卵生产过程中或用于性逆转的亲鱼群体时被认为是有益的。
与控制繁殖相似，使用脑垂体作为饲料补充物的研究也提供了在硬骨鱼中使用口服递送技术操纵生长的可能性的早期指示。因此，已观察到与对照相比，用垂体前叶粉末喂食gruppies Lebistesreticulatus显著提高了生长性能。同样，对剑尾鱼从出生仅喂食干垂体前叶观察到长度增加50％，同时溪红点鲑喂食垂体前叶每周2次后的其它试验观察到重量翻倍且长度为3倍。用生长激素(GH)和相关的肽处理培养的硬骨鱼赋予了大量潜在优点，并且几个试验已证实，口服递送的GH不仅进入血流，而且增加了鱼的生长速度。供应重组GH目前稳定并且随着需要增加生产可以增加许多倍。而且，这些重组蛋白质，当以工业水平生产时，成本有效并且易于加入商业膳食中。尽管GH分子的结构整体性作为翻译后修饰形式的前体可能是重要的，但是提高分子结构整体性或潜能的方法从口服角度可以提供优点。GH分子中促进生长的片段的描述也可以提供在内腔降解下表达更大稳定性的产品。
本发明的一个特定实施方式是提供允许使用口服途径用于接种的组合物和方法，它提供的显著优点在于它降低了劳动成本、节约了时间、减少了用针交叉污染的可能性并且不涉及存货操作或需要处置处理水。
在粘膜表面的特异性免疫的主要决定物是分泌的IgA(S-IgA)，它在生理和功能上与循环免疫系统的组份分离。S-IgA抗体反应可以局部地通过将合适的免疫原应用到特定粘膜位置来诱导。然而，大量的粘膜S-IgA反应是通过共同粘膜免没系统(CNIS)产生的免疫的结果，其中免疫原被特化淋巴上皮结构(总称为与粘膜有关的淋巴组织(MALT))吸收。最好的免疫淋巴上皮结构是与肠有关的淋巴组织(GALT)，例如肠淋巴集结。其它结构和功能相似的淋巴小囊存在于其它粘膜表面，包括呼吸道的那些。
根据本发明，宿主可以通过口服细菌蛋白免疫原，优选与佐剂如霍乱毒素(CT)混合进行免疫。当然，作为佐剂，霍乱毒素的使用量对宿主无毒。
疫苗防止微生物定居的能力，正如本文所提供的，意思是所述活性组份不仅可以在免疫过的宿主中防止疾病，而且通过消除免疫过的个体中的载运，可以从作为一个整体的种群中消除该病原体及其带来的任何疾病。
口服也可以预防给予微生物引起的脓毒病，以便该疫苗可以防止微生物定居和脓毒病(全身感染)。
例如，PspA是肺炎球菌感染用的优选抗原。在公开的国际专利申请WO 92/14488中(将其整个内容加入本文作为参考)，描述了来自肺炎链球菌Rxl的PspA基因的DNA序列，通过基因工程生产了PspA的截短形式并证实这种截短形式的PspA可保护小鼠免受活肺炎双球菌攻击。
从该PspA基因的序列已显示，PspA蛋白大小可变(约70kDa)。分子中C-端37％主要由20个氨基酸重复单元组成，它们形成一结合位点，使得PspA与肺炎球菌脂磷壁酸质的磷酸胆碱残基相连。PspA的中心区域富含脯氨酸并猜测是通过细胞壁的分子部分。分子中N-端80％的序列主要是β螺旋并且含有可以引起防止脓毒病的抗体的PspA区域。尽管PspA大多数总是彼此至少轻微不同，但是在它们之间存在足够的交叉反应性，以致针对一个PspA的抗体或免疫反应就PspA而言可检测所有肺炎双球菌或对其有效。而且，用一个PspA免疫可以防止基本上所有不同攻击菌株引起的死亡或者延迟这种死亡。因此，少量PspA的混合物可以赋予有效的抗大多数肺炎双球菌的免疫。
WO 92/14488中所述的免疫保护性截短PspA可用于本发明作为上述口服用的PspA片段。
已知有不同的体外和体内表达重组蛋白质用的载体系统；例如细菌系统如大肠杆菌；和病毒系统如细菌性病毒、痘病毒(牛痘、禽痘病毒，例如金丝雀痘病毒、鸟痘病毒)、杆状病毒、疱疹病毒；酵母；等；并且可以使用其编码基因将这些系统用于生产重组PspA。
如果将其抗原与佐剂共给药，通常以0.001％-50％的磷酸缓冲盐水溶液使用，那么抗原提高免疫原性。佐剂增强了抗原的免疫原性，但是自身不必然有免疫原性。佐剂可以通过将抗原局部地保留在给药位置附近来起作用，从而产生贮藏处效果，便于慢且持续地将抗原释放给免疫系统的细胞。佐剂也可以将免疫系统的细胞吸引到抗原贮藏处并刺激这些细胞产生免疫反应。
免疫刺激剂或佐剂已使用多年了，用来提高宿主对例如疫苗的免疫反应。内部佐剂，例如脂多糖类，通常是用作疫苗的杀死或减毒细菌的组份。外部佐剂是通常非共价地与抗原相连并经配制以提高宿主免疫反应的免疫调节剂。氢氧化铝和磷酸铝(总称为明矾)常用作人和兽医疫苗的佐剂。明矾在增加对白喉和破伤风类毒素的抗体反应的功效已为公知，并且最近，HBsAg疫苗已用明矾配制。
各种外部佐剂可以刺激对抗原的有力免疫反应。这些包括与膜蛋白抗原复合的皂甙(免疫刺激性复合物)、与矿物油的多聚物、矿物油中的杀死分支杆菌、弗氏完全佐剂、细菌产品，例如胞壁酰二肽(MDP)和脂多糖(LPS)、以及脂类A和脂质体。为了有效地诱导体液免疫反应(HIR)和细胞介导的免疫(CMI)，优选将免疫原乳化于佐剂中。
本发明的组合物，特别是用于口服的，可以方便地以液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬液、乳剂或粘性组合物，可以缓冲至所选pH。然而，由于优选递送到消化道，因此本发明的组合物抗原是丸剂、片剂、胶囊、囊片等的“固体”形式，包括定时递送或者具有液体填充物如明胶覆盖的液体的“固体”制剂，由此明胶溶于胃和/或小肠中用于递送到消化道和/或消化系统。
本发明的组合物也可以含有药用可接受的风味剂和/或着色剂以使它们更吸引人。粘性组合物也可以是凝胶、洗剂、软膏、霜等的形式并且典型地含有足够量的增稠剂，以便粘度为约2500-6500cps，尽管可以使用更粘的组合物，甚至高达10,000cps。粘性组合物具有优选2500-5000cps的粘度，这是由于该范围之上它们变得难以给药。然而，在该范围之上，组合物可以接近固体或凝胶形式，然后容易地以口摄取用的吞咽丸剂给药。
液体制剂通常比凝胶和其它粘性组合物和固体组合物更易制备。此外，液体组合物或多或少更方便给药，特别是对动物、小孩，尤其是小小孩，和可能难以吞咽丸剂、片剂、胶囊等的其它人。粘性组合物，另一方面可以配制在适当粘度范围内以便与粘膜，例如胃或肠的被覆的接触时间更长。
合适的非毒性药用可接受的载体，特别是口服载体，对制药，尤其是口服或经口的药用制剂领域的技术人员来说是显而易见的。显然，合适载体的选择取决于具体剂量形式的精确性质，例如液体剂量形式(例如，组合物是否配制到溶液、悬液、凝胶或另一液体形式、或固体剂量形式中，或者例如组合物递送配制成丸剂、片剂、胶囊、囊片、定时递送形式或填充液体的形式)。
除了抗原之外，溶液、悬液和凝胶，通常含有大量的水(优选净化水)。也可以存在少量的其它组份如pH调节剂(例如碱如NaOH)、乳化剂或分散剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、胶凝剂(例如甲基纤维素)、着色剂和/或风味剂。组合物可以是等渗，即它可以与血液和泪液具有相同的渗透压。
本发明组合物所需的等渗性可以使用氯化钠、或者其它药用可接受的试剂如葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质获得。对含有钠离子的缓冲剂尤其优选氯化钠。
组合物的粘度可以使用药用可接受的增稠剂保持在所选水平。优选甲基纤维素，这是由于容易获得并且获得较经济并容易操作。其它合适的增稠剂包括，例如，黄原胶、树胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的优选浓度取决于所选试剂。重点是使用达到所选粘度的量。粘性组合物通常是由溶液通过加入这些增稠剂制备的。
可以使用药用可接受的防腐剂增加组合物的货架期。苯甲醇可以是合适的，尽管也可以使用各种防腐剂包括，例如对羟基苯甲酸酯类、硫汞撒、氯丁醇或氯化苄烷铵。以总重量为基础，防腐剂的合适浓度为0.02％-2％，尽管可以根据所选试剂进行合适的改变。
本领域技术人员将认识到，组合物的组成可以经过选择相对微生物抗原为化学惰性。这对化学和制药领域的技术人员将不会存在问题，或者根据此公开的，问题可以根据标准试验或者通过简单试验容易地避免(不包括过多的试验)。
本发明的免疫有效的组合物是通过将这些组份混合，然后通过常规可接受的步骤制备的。例如所选组份可以简单地在混合机中、或者其它标准设备中混合生产浓缩混合物，然后可以通过加入水或增稠剂调整其最终浓度和粘度并且可能的话加入缓冲剂控制pH或者加入其它溶质控制紧张性。通常其pH可以为约3-7.5。组合物可以按剂量并通过医药和兽医领域技术人员公知的技术，考虑如下因素具体患者或动物的年龄、性别、重量和状况、以及给药用的组合物形式(例如固体和液体)，来给药。人或其它哺乳动物的剂量是在本领域技术人员不用过多试验的情况下确定的。
当使用CT作为口服免疫用的佐剂时，诱导分泌的特异性IgA抗体。也可以诱导强循环免疫反应，在血清中产生IgG和IgA抗体，在脾中产生分泌IgG和IgA的细胞。通过口服(经口；胃内)给药微生物抗原和CT引起的循环(或全身)免疫反应可与通过胃内途径给药相似免疫原诱导的相比，或者比其更强。因此，显然口服免疫是刺激常规粘膜反应和循环抗体反应的有效途径并且可以需要比其它免疫途径少的抗原。
大多数可溶性或非复制性抗原为差的免疫原，特别是通过经口途径，可能原因是它们被消化酶降解并对GALT具有低的向性或者没有向性。明显例外是CT，它是一有效的粘膜免疫原，可能原因是其结合子单元CTB的G.sub.M1神经节甙脂结合性能，使其能够被淋巴集结的M细胞吸收并使其传递给下面的免疫活性细胞。除了为良好的粘膜免疫原之外，CT是一强大的佐剂。当以微克剂量给药时，CT大大提高了与其共给药的其它可溶性抗原的免疫原性。
在一个实施方式中，根据本发明，提供了一种治疗宿主疾病或紊乱的方法，它是在口服之后将治疗剂给药到宿主。
在另一实施方式中，根据本发明可以治疗的癌细胞包括恶性肿瘤。可以治疗的恶性(包括原发性和转移性)肿瘤包括，但不限于，在肾上腺、膀胱、骨、胸、颈、内分泌腺(包括甲状腺、脑垂体腺和胰腺)、结肠、直肠、心、造血组织、肾、肝、肺、肌肉、神经系统、脑、眼、口腔、咽、喉、卵巢、前列腺、皮肤(包括黑素瘤)、睾丸、胸腺和子宫中产生的那些。然而，应理解的是本发明的范围并不限于任何具体肿瘤的治疗。
然而，应理解的是本发明的范围并不限于特定的生物活性组份作为治疗剂。
根据本发明的另一优选的实施方式，通过递送这种试剂能够抑制、预防或破坏癌细胞的试剂是负选择性标记物；即与化学治疗或相互作用试剂组合可抑制、预防或破坏癌肿瘤细胞生长的物质。
因此，通过全身性递送负选择性标记物，向动物或人宿主给药相互作用试剂。相互作用试剂与该负选择性标记物相互作用以便预防、抑制或破坏肿瘤的生长。该负选择性标记物可以是例如，但不限于，胸腺嘧啶核苷激酶和胞嘧啶脱氨酶。
所述相互作用试剂以有效地抑制、预防或破坏癌细胞生长的量给药。例如，相互作用试剂可以约5mg-约15mg/kg体重，优选约10mg/kg的量给药，这取决于对患者的整体毒性。
参照以下实施例将更容易地理解本发明，所述实施例用于描述本发明，而不是限制其范围。
实施例I虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)和溪红点鲑(Salvelinus fontinalis)的生长增强使用新型递送系统喂食重组牛生长激素在过去二十年内世界范围内的水产养殖业经历了快速膨胀并且目前代表最快发展的农业部门。自从1984年以来该部门以每年10.9的百分比生长，而相比地球上的牲畜肉产量增长3.1。相同时期内最快生长的牲畜是鸡肉产量，其APR为5.3，接下来是猪肉为3.4，羊肉和小羊肉是1.4，牛肉和小牛肉是0.9。水产养殖对全世界食品鱼码头的贡献从1984年到1995年增加了2倍多，为从11.5％到25.6％。对海产品凸出的增加需求，已与对野生原料的捕捞降低相连，并将连续有利于水产养殖业的发展。
水产养殖业，与其它农业部门类似，面临着许多与传统牲畜生产相关的生产挑战。40-50％的鲑鱼生产成本是喂养。定量配给含有高百分比的昂贵的鱼蛋白并且为了达到市场重量鲑鱼类需要相对长的喂养时间。当鱼快速生长时，脂肪快速堆积既是生产者也是消费者所关心的。
食用动物业的目标是通过使饲养、劳力和资金投入最小化，同时使高质量蛋白产量最大化来使生产效率最佳化。在过去，经济上重要的参数已通过遗传选择或营养改进来加以改变。最近，已出现了许多方法，包括操纵内分泌系统以影响饲养动物的生长和身体组成。外来化合物成功地改变家庭动物的生长性能并潜在地节约生产成本的能力，已促使在鱼中使用这些试剂进行研究。
给药从各种来源获得的生长激素(GH)已证实该激素在刺激肉体生长并降低鱼中脂肪堆积起着关键作用。已将天然和重组鱼GH用于几个鱼种，并且当注入完整鲑鱼时是等效的。同样，已报道得自哺乳动物和鸟类源的GH在改变幼小鲑鱼的生长性能中是有效的。向鲑鱼给予牛GH(bGH)使得生长速度增加2-3倍，食欲和喂食效率增加并且脂肪组织减少。在年长(接近成年的)鱼中，在低水温下生长速度受到抑制时外生GH也是有效的。
口服GH是一种可行的方法，它提供了口服之后将完整蛋白运输到硬骨鱼循环中的机理的组织化学和生物学证据。现已显示口服的辣根过氧化物酶在1小时内运输到循环中。
已报道在将bGH加入到1岁大虹鳟鱼的消化道的腔中之后该激素转移到其循环系统中。同样，已证实口服重组鲑鱼生长激素(rsGH)，显著提高血浆rsGH浓度。这些相同结果显示每周胃内给药rsGH使得与对照鱼相比重量增加和鱼长增加50％。
上面的研究支持口服来自不同源的GH可以影响几个硬骨鱼种的生长性能，通过保护以消除胃和肠消化以便它保持完整和生物活性。这样产生了几种开发在胃的酸性环境中保护活性蛋白(生长激素、抗原等)的系统的方法。经口或直肠给予鱼是递送生物活性蛋白通过胃的有效方法，然而，它们不能用于工业应用。已尝试将生物活性蛋白与洗涤剂和抗酸剂引起共给药以降低胃中的酸性环境。尽管这些研究已证实降低了蛋白质降解，但是所用处理可能影响其它重要膳食因子的吸收。另一选择是使用pH-选择性聚合物，它包封并保护肽，防止在胃中酸性降解并允许在小肠中释放。
由本发明的方法清楚地显示，经口递送化合物(激素、疫苗、抗体等)通过单胃动物(包括人)的胃以便绕过胃消化至小肠和/或大肠中的吸收位置。至今，大量该工作集中在使用一定范围的制剂和感兴趣的形式开发包封策略。这种制剂和形式可以简单地调节特定化合物以预定方式递送，或者可以使用特定生理决定物(例如pH、温度等)触发包封的材料释放。
在其它形式的递送系统中使用的复合聚合物有时难以表征。同样，利用某些通常不认为安全(GRAS)的聚合物使得这些系统的管理批准成为一个长期且危险的过程。而且，许多聚合物系统成本相对高，使得大规模利用不可行。
目前试验的重点是允许口服递送生物活性肽(在这种情况下为bST)的一种新战略。通过喂食感兴趣的生物活性化合物和临时抑制消化酶功能的抗营养因子与增加肠吸收的产品的鸡尾酒(称之为“避绕鸡尾酒(bypass cocktail)”)，我们已显示我们可以有效地避开该酶促过程，并增强前述化合物的肠吸收以获得所需生物效果。材料和方法避绕鸡尾酒制剂避绕鸡尾酒制剂示于表1.未处理的含油种子和豆类(pulse)组份是由当地供应商获得的并经机械去壳。鱼粉、米糠、啤酒酵母、碳酸钠、碳酸钙和EDTA都是饲料级并且购自当地供应商。脱氧胆酸钠和粗卵白蛋白购自Sigma Chemical Co.(St Louis Mo)。将这些膳食如所示混合并使用1mm筛粉碎。
表1避绕鸡尾酒制剂
1试验中变化的浓度参见材料和方法部分。鱼和喂食使用两种鲑鱼进行一系列试验(试验1虹鳟鱼；试验2溪红点鲑)。这些鱼种经过选择以便它们既代表了适宜研究的试验模型又代表了经济上重要的饲养鱼种。
对试验1而言，将虹鳟鱼(n＝20；最初重量＝52g)放在6-60L圆柱-圆锥罐中于密封水循环系统中2周，之后开始本试验。水温保持在15℃并且光周期设定在12hL12hD循环。在试验2中，将溪红点鲑(n＝400；最初重量38g)放在8-800L圆柱圆锥罐中于密封水循环系统中2周，之后开始本试验。试验期间水温为11℃；鱼经受天然光周期(约14hL10hD)。在这两个试验中每周监控水质量(氨、亚硝酸盐)并且每天测定氧浓度。在适应环境期间和非处理期间鱼喂食商业饲料(CoreyFeed Mills Ltd.Fredericton，NB)。试验操作在试验1中，包括重组牛生长激素(rbST；Monsanto Co.St LouisMO)，以20μg/g鱼提供给鱼。3个重复组喂食不同量的0(对照)、4或40g脱氧胆酸钠/kg避绕鸡尾酒。在第二个试验中，4个重复处理组接收补充有0、1、5或10mg脱氧胆酸盐/kg避绕鸡尾酒和20μgrbST/g鱼的食品。
在试验1和2中，以周为单位监控鱼重量和饲料消耗。将鱼称重，然后绝食36小时，之后喂食含有bST的避绕鸡尾酒。喂食饲料之后保持另外12小时。从这时起，鱼每天喂食2次直到接近饱足。结果在这两个试验中，注意到处理后没有死亡，暗示bST或避绕鸡尾酒对虹鳟鱼和溪红点鲑的健康没有副作用。喂食避绕鸡尾酒中的bST的鱼相对对照的生长速度显著提高。在试验1中，处理过的鱼的生长速度平均增加25％；最快生长罐比对照的生长大40％(图1和2)。在试验2中，相对对照，bST处理组显示生长速度提高，尽管喂食含有5g/kg脱氧胆酸盐的避绕鸡尾酒的那些显示生长速度最高，相对对照生长速度增加90％(图3)。
实施例II虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)的生长增强。腹膜内注射重组牛生长激素。方法每周每条鱼经腹膜内(IP)给药剂量为20μg bST/g活体重，持续6周。结果图4描述了腹膜内注射重组bST显著诱导增加虹鳟鱼的体重增加。
实施例III存在于饲料组份中的蛋白水解酶抑制剂的评价提取酶方案材料1.离心机Sorvall型
2.Bench-top搅拌器3.解剖用材料(剪刀)4.离心瓶5.分光光度计用的一次性比色杯6.微量离心管1.5ml7.分光光度计8.涡旋机9.得自Biorad的微量培养板读数器10.50mM Tris-HCl pH＝7.511.考马斯蓝染色液12.BSA(1mg\ml)标准溶液13.TCA 20％14.虹鳟鱼胰腺和十二指肠组织15.含0.5％酪蛋白的50mM Tris-HCl pH＝916.50mM Tris-HCl+CaCl210mM pH＝7.5酶提取1.将虹鳟鱼称重并宰杀。
2.进行解剖以从鱼中除去近侧小肠。
3.称重之后，将这些组织匀浆于50mM Tris-HCl pH＝7.5(1∶10w\v)中。
4.在16000×g于4℃下离心30分钟。
5.保留上清液。等分并将它们贮藏在-20℃下用于进一步使用。
6.进行考马斯试验以测定存在于酶提取物中的蛋白质的量。考马斯蓝染色方法1.称重160mg的BSA于10ml的50ml Tris-HCl pH＝7.5中。
2.制备BSA(0μg/ml-1600μg/ml)的标准曲线。
3.在96孔平皿中的每一孔中加入4μl或者BSA、提取酶和稀释(1∶1)的提取酶。
4.加入200μl的考马斯蓝。
5.在655nm下用得自Biorad的微量培养板读数器读数。酶方法一式两份地进行这些试验。
空白1.向500μl的50mM Tris-HCl+10mM CaCl2pH＝7.5溶液中2.加入500μl的TCA 20％(蒸馏水)溶液。
3.加入20μl的酶提取物。
4.加入500μl的酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。
5.在4℃(冰)下培养15分钟。在12000×g下离心5分钟并在280nm下读数。试验1.向500μl的50mM Tris-HCl+10mM CaCl2pH＝7.5溶液中2.加入20μl酶提取物。
3.加入500μl的酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。
4.在室温下温育0、5、10、15和30分钟。
5.通过加入500μl的TCA 20％使反应停止。于4℃(冰)下温育15分钟。在12000×g下离心5分钟并在280nm下读数。抑制剂提取1.用工业粉碎机将工业生产的食品粉碎成细粉。
2.称重250mg该细粉并将其加入到10ml的50mM Tris-HClpH＝7.5(最终浓度应是25mg/ml)中。
3.用手持组织粉碎机将该溶液匀浆。
4.在室温下于2000×g下离心10分钟。*5.保持上清液。它将是酶方法用的抑制剂提取物。酶方法一式两份地进行这些试验。
空白1.向500μl的50mM Tris-HCl+10mM CaCl2pH＝7.5溶液中2.加入500μl的TCA 20％(蒸馏水)溶液。
3.加入不同体积的抑制剂提取物或50mM Tris-HCl pH＝7.5溶液。
4.加入10μl的酶提取物。
5.加入500μl的酪蛋白0.5％(50 mM Tris-HCl pH＝9)溶液。
6.在4℃(冰)下温育15分钟。于12000×g下离心5分钟并在280nm下读数。对照1.向500μl的50mM Tris-HCl+10mM CaCl2pH＝7.5溶液中2.加入不同体积的50mM Tris-HCl pH＝7.5溶液。
3.加入10μl酶提取物。
4.在室温下温育60分钟。
5.加入500μl的酪蛋白0.5％(50mM Tris-HCl pH＝9)溶液。
6.在室温下温育30分钟。
7.通过加入500μl的TCA 20％使反应停止。在4℃(冰)下温育15分钟。于12000×g下离心5分钟并在280nm下读数。试验1.向500μl的50mM Tris-HCl+10mM CaCl2pH＝7.5溶液中2.加入不同体积的抑制剂提取物。
3.加入10μl酶提取物。
4.在室温下温育60分钟。
5.加入500μl的酪蛋白0.5％(50mM Ttis-HCl pH＝9)溶液。
6.在室温下温育30分钟。
7.通过加入500μl的TCA 20％使反应停止。在4℃(冰)下温育15分钟。
8.于12000×g下离心5分钟并于280nm下读数。结果图5-12证实了OraljectTM鸡尾酒中单个蛋白酶抑制剂组份对体外蛋白水解抑制作用的影响，以及OraljectTM鸡尾酒的总体抑制作用。这些数据是以蛋白数据酶抑制的程度相对增加水平的抑制剂内含物呈现的。数据证实OraljectTM鸡尾酒中单个组份(冻干卵白蛋白、红菜豆、大豆、蚕豆、EDTA、麦麸、喷雾干燥的卵白蛋白，分别如图5-12)对体外蛋白数据酶活性有不同程度的抑制。而且整个鸡尾酒能有效地诱导整个蛋白数据酶抑制。最后，使用图5-12产生的曲线，外推最大抑制点以及提供最大抑制的50％时抑制剂的浓度。
实施例IV定量虹鳟鱼血中辣根过氧化物酶的酶试验材料1.96孔平板(得自VWR的ImmulonTMII)2.得自BioradTM的微量培养板读数器3.1.5ml的微量离心管4.15ml或50ml的离心管5.TMB片剂6.1型辣根过氧化物酶(Sigma)7.得自山羊IgG的抗辣根过氧化物酶(ICN)8.0.1M碳酸氢钠pH＝9.6缓冲液9.0.1M磷酸盐-柠檬酸盐pH＝5缓冲液10.PBS 1X+BSA 1％+0.5％吐温20缓冲液11.PBS 1X pH＝7.4缓冲液12.过氧化氢30％13.Saran包装材料14.37℃的培养箱15.蒸馏水16.虹鳟鱼(血浆)方法用抗原包覆平板1.将200μl得自山羊IgG的抗-HRP稀释1∶1000溶液(在0.1M碳酸盐-碳酸氢盐pH＝9.6缓冲液中)分散于96孔平板的每一孔中。
2.将包覆的平板包裹于saranTM包装物中密封并在4℃下温育过夜或者在37℃下温育2小时。
3.用PBS 1X pH＝7.4将包覆的平板冲洗3次。每次将磷酸盐缓冲盐水轻弹入污水槽中再次用蒸馏水冲洗3次。
4.将平板甩干并贮藏在4℃下直到使用。阻断平板的残余结合能力1.用200μl的PBS 1X+BSA 1％+0.5％吐温20缓冲液填充每一孔。
2.在室温下温育30分钟。
3.在一些孔中加入100μl含有HRP稀释1∶10的样品。
4.在其它孔中加入100μl标准曲线血浆。
5.将该平板包裹于赛纶包装物中并在37℃下培养1小时。
6.用PBS 1X+BSA 1％+0.5％吐温20缓冲液冲洗3次。标准曲线法1.将虹鳟鱼的血浆以1∶10用PBS 1X pH＝7.4稀释。
2.加入HRP以获得0.5-8ng/ml的最终浓度。酶试验1.在每一孔中加入200μl的TMB(在50mM柠檬酸盐-磷酸盐pH＝5缓冲液+30％的过氧化氢中)。
2.等待30分钟并加入50μl的l M硫酸以固定着色。
3.在415nm下用得自BioradTM的微量培养板读数器读数。结果对辣根过氧化物酶(HRP)进行ELISA，使其用作口服之后血浆吸收研究的示踪剂。该方法提供了一种证实HRP吸收的极其灵敏的方法，具有约2.5ng HRP/ml血浆的低检测限度和高达8ng/ml的线性部分(图13)。
使用该方法跟踪HRP吸收，向虹鳟鱼强迫喂食含HRP(2.5ng/g)的鱼粉基对照基质和OraljectTM鸡尾酒，在给药之后的选择时间下取血样。如图14中所述的，经口递送OraljectTM制剂中HRP的血浆吸收显著高于鱼粉对照的。而且，在给药之后6小时内检测到HRP的循环浓度。
尽管结合其具体实施方式
描述了本发明，但是应理解的是能够进一步改进，并且本申请打算覆盖一般说来遵循本发明原理的本发明的任何变化、用途或改变，并包括如下本文的背离内容可由本发明所属领域的已知或常规实践得出的，可适用于本文前面所述的基本特征的，以及在如下附加权利要求书的范围内的。
权利要求
1.一种给人或动物口服用于肠递送生理活性剂的组合物，所述组合物包含a)增加所述动物消化系统中的pH从而防止所述生理活性剂变性的至少一种中和剂；b)防止所述生理活性剂酶促消化的至少一种消化酶抑制剂；和c)增加所述生理活性剂的肠吸收的至少一种吸收增加剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述中和剂的浓度为1％-60％w/w，所述抑制剂的浓度为1％-50％w/w，并且所述吸收增加剂的浓度为0.1％-50％w/w。
3.如权利要求1所述的组合物，还包含选自以下的生理活性剂治疗剂、营养品、粘多糖、脂类、糖类、类固醇类、激素类、生长激素(GH)、生长激素释放激素(GHRH)、上皮生长因子、血管内皮生长和渗透因子(VEGPF)、神经生长因子、细胞因子、白介素、干扰素、GMCSF、激素样产品、神经因子、神经营养因子、神经递质、神经调质、酶、抗体、肽、蛋白片段、疫苗、佐剂、抗原、免疫刺激或抑制因子、造血因子、抗癌产品、消炎药、抗寄生物化合物、抗微生物药、核酸片段、质粒DNA载体、细胞繁殖抑制剂或活化剂、细胞分化因子、血液凝固因子、免疫球蛋白、抗血管生成产品、负选择性标记物或“自杀”药、毒性化合物、抗血管生成药、多肽、抗癌药、产酸药、和组胺H2受体拮抗剂。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述中和剂的量足以中和所述动物消化系统中的酸降解并允许将所述生理活性剂递送到所述动物肠中。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述中和剂选自抗酸剂、碳酸氢钠、碳酸钠、柠檬酸钠、碳酸氢钠、磷酸钙、碳酸钙、镁盐、碳酸镁、三硅酸镁、氢氧化镁、磷酸镁、氧化镁、碱式碳酸铋及其组合。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述中和剂是浓度为组合物的10％-20％w/w的碳酸钠和浓度为组合物的10％-20％w/w的碳酸钙中的至少一种。
7.如权利要求1所述的组合物，其中所述抑制剂的量足够抑制所述动物消化系统中消化酶对所述生理活性剂的降解并允许将所述生理活性剂递送到所述动物的肠中。
8.如权利要求1所述的组合物，其中所述消化酶抑制剂选自抗蛋白酶、卵白蛋白、得自含油种子、大豆、菜豆、蚕豆、米糠、麦麸的植物源抑制剂、乙二胺四乙酸盐、α-1-抗胰蛋白酶、白蛋白、卵白蛋白和蛋白酶体。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述抑制剂含有胃蛋白酶抑制剂和肠肽酶抑制剂中的至少一种。
10.如权利要求8所述的组合物，其中所述抑制剂是浓度为10％-20％w/w的白蛋白。
11.如权利要求1所述的组合物，其中所述吸收增加剂选自胆汁盐、皂甙、脱氧胆酸盐、水杨酸钠、月桂基硫酸钠、油酸、亚油酸、油酸单甘油酯、卵磷脂、溶血卵磷脂、聚氧乙烯山梨糖醇酯、对叔辛基苯氧基聚氧乙烯、N-月桂基-β-D-吡喃型麦芽糖苷、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-氮酮和磷脂。
12.如权利要求11所述的组合物，其中所述吸收增加剂是浓度为1％-5％的脱氧胆酸盐。
13.如权利要求1所述的组合物，还包括至少一种选自以下的其它组份乙二胺四乙酸盐、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、粘合剂、示踪剂、甜味剂、表面活性剂、脱模剂、风味剂、粗粉、豆类、酵母、啤酒酵母、矿物油、植物油、动物油、润滑剂、软膏及其组合。
14.如权利要求3所述的组合物，其中所述生理活性剂当在所述人或动物肠中递送时被肠吸收用于全身递送。
15.如权利要求3所述的组合物，其中所述生理活性剂当在所述人或动物肠中递送时对肠壁具有有效的生理影响。
16.如权利要求3所述的组合物，其中所述生理活性剂当在所述人或动物肠中递送时对肠的内容物具有生理影响。
17.如权利要求1所述的组合物，其中所述动物是鸟、哺乳动物、昆虫或鱼。
18.如权利要求3所述的组合物，其中所述生理活性剂能够在所述人或动物中诱导抗粘膜感染性疾病的免疫反应。
19.一种治疗人或动物中肠道微生物感染的方法，包括给药足够量的权利要求3、14、15或16的组合物，其中所述生理活性剂是抗微生物剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述微生物感染是由选自以下的微生物引起的细菌、蘑菇、酵母、病毒、葡萄球菌属、链球菌属、微球菌属、消化球菌属、消化链球菌属、肠球菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、乳杆菌属、利斯特氏菌属、丹毒丝菌属、丙酸杆菌属、真杆菌属、棒杆菌属、枝原体属、尿枝原体属、链霉菌属、嗜血菌属、奈瑟氏球菌属、艾肯氏菌属、莫拉氏菌属、放线杆菌属、巴斯德氏菌属、拟杆菌属、梭杆菌属、普雷沃氏菌属、卟啉单胞菌属、韦荣氏球菌属、密螺旋体属、光岗菌属、二氧化碳嗜纤维菌属、弯曲杆菌属、克雷伯氏菌属、衣原体属和大肠菌类。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述抗微生物剂选自抗生素、杀菌素、羊毛硫抗生素、微生态制剂、抗真菌剂、抗霉菌剂、抗寄生虫剂、氨基糖苷、万古霉素、利福平、林可霉素、氯霉素和fluoroquinol、青霉素、β-内酰胺类、阿莫西林、氨苄青霉素、阿洛西林、羧苄青霉素、美洛西林、萘夫西林、苯唑西林、哌拉西林、替卡西林、头孢他啶、头孢唑肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢噻吩、亚胺青霉烯、氨曲南、庆大霉素、奈替米星、妥布霉素、四环素、磺胺、大环内酯、红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、多粘菌素B和克林霉素抗生素。
22.一种向人或动物全身递送生理活性剂的方法，所述方法包括给所述人或动物口服权利要求3、14、15或16中定义的组合物。
23.一种增加人或动物的肠吸收的方法，包括口服生理有效量的权利要求3中定义的组合物。
24.权利要求1-18中定义的组合物在给人或动物口服生理活性剂以便肠吸收中的用途。
25.权利要求1-18的组合物在生产药物或食物中的用途。
全文摘要
本发明涉及给人或动物口服生理活性剂的新组合物、用途和方法，所述生理活性剂包括增加消化系统中的pH以防止变性的中和剂、基本上防止酶促消化的消化酶抑制剂、和至少一种增加生理活性剂的肠吸收的吸收增加剂、药物和/或营养物。
文档编号A61K47/04GK1406112SQ01805605
公开日2003年3月26日 申请日期2001年1月25日 优先权日2000年1月27日
发明者G·W·范登伯格 申请人:水溶液公司