专利名称：通过阻断淋巴细胞信号和阻断lfa－1介导的粘附作用调节细胞介导的免疫应答的方法
技术领域：
本发明涉及通过阻断至少三种细胞表面分子和其天然配体的相互作用，调节细胞介导的免疫应答的改进方法。
背景技术：
获得性(特异性)免疫是机体采用的一种策略，用于扩展便于对抗抗原侵袭的能力。获得性免疫由在骨髓内造血作用产生的淋巴细胞介导。反应于抗原识别与结合而产生的淋巴细胞介导的免疫导致淋巴细胞两种主要亚群B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)的激活。
T和B细胞以一种互相依赖的模式激活。在抗原侵袭宿主后，一些宿主细胞例如B细胞、巨噬细胞和树突状细胞捕获、内化、并呈递抗原至细胞表面。T细胞(特指称为辅助T细胞的T细胞亚型)识别并结合呈递抗原后，该T细胞激活其它的T细胞和B细胞。而激活的B细胞又刺激静止的T细胞。已知调节B细胞和T细胞活性的复杂的相互作用由一些细胞表面分子介导。
已证实调节识别与结合异源抗原后的T细胞激活需要由细胞表面分子介导的两种不同的分子信号。第一种信号通过抗原识别并结合T细胞受体提供给T细胞，而第二种信号被认为通过配体识别并结合一种或多种推测的T细胞表面受体分子提供(1)。到目前为止，这些细胞表面受体分子最可能为CD28(2-5)，CTLA4(60-61)和CD154(也被称为CD40L或gp39)(6-9)。CD28分子在几乎所有CD4+T细胞和约50％的CD8+T细胞上表达(4)。CD28的配体已被证实为表达于抗原呈递细胞例如B细胞表面的B7-1和B7-2分子(也被分别称为CD80和CD86)(4；5；10)。CD28和B7分子间的相互作用激活T细胞。
B7分子也是存在域激活T细胞的细胞表面受体CTLA4的配体。CTLA4和B7间的相互作用诱导T细胞的无反应状态，CD28/B7的相互作用诱导T细胞的激活。
CD28和/或CTLA4与B7配体的相互作用可以被可溶性CTLA4Ig(编码CTLA4Ig的DNA于1991年5月31日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Blvd.，Manasas，VA 20110-2209，ATCC保藏号为68629，表达CTLA4Ig的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系CTLA4Ig-24于1991年5月31日保藏于ATCC，保藏号为CRL-10762)，即一种较CD28与B7-1和B7-2有更高的亲合力的融合蛋白(11-13)有效地阻断。许多研究已证实，该受体途径的阻断导致T细胞体外(13；14)和体内(12；15；16)的抗原激活的抑制。
CD154分子主要表达于激活的T细胞，而CD40表达于抗原呈递细胞例如B细胞表面。CD154和CD40间的相互作用激活B细胞和更多的T细胞。通过单克隆抗体阻断CD40/CD154途径已被证实为抑制体外(17；18)和体内(19-21)淋巴细胞介导的免疫应答的有效方法。
虽然CD28，CTLA4和CD154是研究最广泛的淋巴细胞受体，细胞调节过程也包含其它细胞表面分子。这些分子包括4-1BB，ICOS，CD99和整联蛋白家族的一些粘附分子，例如淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)(22-23)。
LFA-1分子由整联蛋白αL亚基(CD11a)和整联蛋白β2亚基(CD18)组合而成。LFA-1表达于许多类型的白细胞表面，包括淋巴细胞(例如T细胞)、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等，LFA-1被具体描述为通过与不同配体，包括ICAM家族分子(例如ICAM-1，ICAM-2和ICAM-3)的相互作用介导细胞-细胞和细胞-基质间相互作用。LFA-1β2亚基(CD18)的其它配体包括α-辅肌动蛋白、细丝蛋白和细胞粘附蛋白(cytohesin)-1。很久前已认识到LFA-1作为粘附分子增强LFA-1阳性细胞和白细胞、上皮细胞和内皮细胞上的ICAM-1等LFA-1结合配体间相互作用的功能；然而最近也指出LFA-1在抗原识别后T细胞信号传递中起作用(26；27；34-38)。
在同种异体器官或组织移植后，细胞介导的移植排斥反应仍是移植物长期成功存活的主要阻碍。使用单克隆抗体阻断LFA-1/ICAM-1相互作用已被证明可以延长移植物的存活(39-44)。而且，阻断淋巴细胞间相互作用的试剂例如CTLA4Ig和抗CD40/CD154单克隆抗体已于目前在包括非人灵长类动物的多种动物模型中，被证实可以有效地抑制移植物排斥过程(14；45-51)。而且，CD28与CD40/CD154的联合阻断明显增加移植物的存活，在一些移植动物模型中达到长期移植物耐受和同种异体低应答性(52-54)。然而，其它同种异体移植模型，例如BALB/c-＞C57BL/6鼠皮肤移植模型，已被证实抗CD28+CD154阻断(55)，提示在同种异体移植识别中可能存在其它的信号途径。
目前，存在提供调节抗原呈递后细胞介导的免疫应答的需要，例如抑制组织移植后移植物(如同种异体移植物)排斥反应，以便增加移植组织的存活。
CD28/B7，CTLA4/B7和/或CD40/CD154信号阻断导致的免疫应答的抑制是强效的，但在一些情况下是不完全的。此处给出的结果说明，除了LFA-1之外的一些途径的阻断，出乎意料地增加了移植物存活并调节反应于抗原呈递的细胞介导的免疫应答。
发明概述此处公开的发明提供调节细胞介导的免疫应答的方法，包括阻断细胞表面分子，例如CD28，CTLA4，B7，CD40，CD154，和粘附分子，例如LFA-1，与其天然配体间的相互作用。本发明包括阻断这些分子并提供促进移植物长期存活的方法。使用直接对抗LFA-1的试剂极大增加用直接对抗B7(例如可溶性CTLA4分子)和直接对抗CD154(例如抗CD-154单克隆抗体)的试剂处理的小鼠的同种异体皮肤和心脏移植存活。使用例如分别直接针对CD28/CTLA4/B7，CD40/CD154和LFA-1/ICAM途径的每一种的三种试剂的组合，也可增强小鼠皮肤移植物的存活。本发明也提供调节如与同种异体移植相关的免疫系统疾病的方法。
附图简述
图1是说明可溶性CTLA4-Ig和单克隆抗体MR1及抗LFA-1对皮肤移植排斥率影响的图表，见下文实施例1描述。
图2是说明可溶性CTLA4-Ig和单克隆抗体MR1及抗LFA-1抗体对心脏移植排斥率影响的图表，见下文实施例2描述。
图3说明小鼠异种心脏移植模型中，移植及可溶性CTLA4-Ig和单克隆抗体MR1及抗LFA-1处理后，剩余心肌的百分数，见下文实施例2描述。
图4说明小鼠异种心脏移植模型中，移植及可溶性CTLA4-Ig和单克隆抗体MR1及抗LFA-1处理后，炎症严重评分，见下文实施例2描述。
图5说明以前导序列附着其分子N末端的人类CTLA4Ig的氨基酸和核酸序列，见下文实施例3描述。
图6说明以前导序列附着其分子N末端的人类L104EA29YIg的氨基酸和核酸序列，见下文实施例3描述。
图7是CTLA4Ig(第1道)，L104EIg(第二道)和L104EA29YIg(第三道)的SDS胶电泳图(图7A)；和CTLA4Ig(图7B)与L104EA29YIg(图7C)的大小排阻层析。
图8A和8B显示由NMR频谱测定的溶液结构产生的CTLA4细胞外IgV样折叠带状图。图8B显示S25-R33区和MYPPPY区的透视图，说明L104和A29亲和力增强突变的位置及侧链方向。
图9A和9B说明FACS分析的数据，显示L104EA29YIg，L104EIg和CTLA4Ig与人类CD80-或CD86-转染的CHO细胞的结合，见下文实施例3描述。
图10A和10B描述CD80阳性和CD86阳性CHO细胞增殖的抑制，见下文实施例3描述。
图11A和11B说明L104EA29YIg较CTLA4Ig在抑制初次和二次同种异体刺激T细胞增生中更为有效，见下文实施例3描述。
图12A-C说明L104EA29YIg较CTLA4Ig在抑制同种异体刺激的T细胞产生IL-2(图12A)，IL-4(图12B)和γ干扰素(图12C)细胞因子中更为有效，见下文实施例3描述。
图13说明L104EA29YIg较CTLA4Ig在抑制植物凝集素(PHA)刺激的猴T细胞增殖中更为有效，见下文实施例3描述。
发明详述定义本申请在此使用的以下词或短语有指定的意义。
在此使用的＂配体＂指识别并结合其它分子的分子。
在此使用的＂调节＂表示抑制或刺激某应答，例如，＂调节淋巴细胞介导的免疫应答＂表示抑制或刺激淋巴细胞相关的免疫应答。
在此使用的＂受体＂表示一种分子，当它与配体结合时引发细胞内途径级联，该级联导致细胞状态的改变。受体可以存在于一些细胞类型，包括淋巴细胞。
在此使用的＂阻断＂或＂抑制＂受体、信号或分子表示通过本领域认可的测试检测到干扰受体、信号或分子的激活。例如，细胞介导的免疫应答的阻断可以通过测定同种异体移植存活的增强而检测。阻断或抑制可以是部分或全部的。
在此使用的＂抑制细胞-细胞＂或＂细胞-基质粘附＂表示阻止细胞表面粘附分子和另一细胞或细胞外基质中其配体间的相互作用。粘附分子和配体包括，但并不仅限于，LFA-1(也称为CD11a/CD18或整联蛋白αLβ2)，Mac-1(CD11b/CD18)，p150，95(CD11c/CD18)，ICAM-1(CD54)，ICAM-2，ICAM-3，VLA-1，CD44，CD62(E，L和P)，CD106，纤维蛋白原，α辅肌动蛋白，细丝蛋白和细胞粘附蛋白-1。
在此使用的分子的＂部分＂或＂片段＂表示保持结合活性的完整分子的任意部分。例如，＂CTLA4的片段＂或＂CTLA4的部分＂是识别并结合其靶，例如B7的CTLA4的细胞外结构域或其片段。
在此使用的＂衍生物＂是具有其母分子的序列同源性和活性的分子。例如，CTLA4的衍生物包括可溶性CTLA4分子，或可溶性CTLA4突变分子，其与野生型CTLA4的识别并结合B7的细胞外结构域的氨基酸序列至少70％相似。一种可溶性CTLA4分子的实例是CTLA4Ig(于1991年5月31日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Blvd.，Manasas，VA 20110-2209，ATCC保藏号为68629)。CTLA4Ig-24，即一种表达CTLA4Ig的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系于1991年5月31日保藏于ATCC，保藏号为CRL-10762。一种可溶性CTLA4突变分子的实例是L104EA29YIg(于2000年6月19日保藏于ATCC，保藏号为PTA-2104)。
在此使用的＂试剂＂指通过阻断介导免疫应答的分子而调节细胞介导的免疫应答的分子。
在此使用的＂第一种试剂＂是识别并结合淋巴细胞上的CD28，CTLA4或B7分子的分子，或其一个或多个部分。例如，＂第一种试剂＂可以是，但并不仅限于，可溶性CTLA4分子(例如可溶性CTLA4突变分子)、可溶性CD28分子、可溶性B7分子、抗CD28单克隆抗体、抗CTLA4单克隆抗体或抗B7单克隆抗体，包括其片段或衍生物。
在此使用的＂第二种试剂＂是识别并结合淋巴细胞上的CD40或CD154(也称为CD40L或gp39)的分子，或其一个或多个部分。例如，＂第二种试剂＂可以是，但并不仅限于，可溶性CD40、可溶性CD154、抗CD40单克隆抗体或抗CD154单克隆抗体，包括其片段或衍生物。
在此使用的＂第三种试剂＂是干扰LFA-1粘附其配体例如ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、α辅肌动蛋白，细丝蛋白或细胞粘附蛋白-1的分子，或其一个或多个部分。例如，＂第三种试剂＂可以是，但并不仅限于，抗LFA-1单克隆抗体、抗ICAM-1单克隆抗体、抗ICAM-2单克隆抗体、抗ICAM-3单克隆抗体、抗CD11a单克隆抗体、抗CD18单克隆抗体和LFA-1、CD11a、CD18、ICAM-1(CD54)、ICAM-2或ICAM-3的可溶形式，包括其片段或衍生物。
在此使用的＂B7＂指B7家族成员，包括B7-1(也称为CD80)、B7-2(也称为CD86)和B7-3分子，其识别并结合CD28和/或CTLA4。
在此使用的＂野生型CTLA4＂具有天然存在的全长CTLA4的氨基酸序列(美国专利5,434,131，5,844,095，5,851,795)，或其结合B7并/或干扰B7与其配体结合的细胞外结构域。在特定实施方案中，野生型CTLA4的细胞外结构域以+1位的甲硫氨酸起始，以+124位的天冬氨酸终止；或以-1位的丙氨酸起始，以+124位的天冬氨酸终止。野生型CTLA4是一种细胞表面蛋白，含有N末端细胞外结构域、跨膜结构域和C末端细胞质结构域。细胞外结构域结合靶抗原，例如B7。细胞中天然存在的野生型CTLA4蛋白翻译为包含N末端信号肽的未成熟多肽。该未成熟多肽进行翻译后处理，包括剪切和去除信号肽而产生CTLA4剪切产物，它具有不同于未成熟形式N末端的新生N末端。本领域技术人员可以理解，可能发生额外翻译后处理，它从CTLA4剪切产物的新生N末端去除一个或更多氨基酸。CTLA4分子的成熟形式包括CTLA4的细胞外结构域，或其结合B7的任意部分。
＂CTLA4Ig＂是可溶性融合蛋白，包含野生型CTLA4细胞外结构域或其结合B7的一部分，该细胞外结构域与Ig尾结合。特定实施方案中包括以+1位的甲硫氨酸起始，以+124位的天冬氨酸终止；或以-1位的丙氨酸起始，以+124位的天冬氨酸终止的野生型CTLA4的细胞外结构域；+125位的连接氨基酸残基谷氨酰胺；包含+126位谷氨酸至+357位赖氨酸的免疫球蛋白部分(图5)。
在此使用的＂融合蛋白＂定义为使用本领域熟知方法和美国专利5,434,131或5,637,481描述的方法连接在一起的一个或更多氨基酸序列。由此连接的氨基酸序列形成融合蛋白。
在此使用的＂可溶性＂指不结合或附着细胞，即循环的任何分子，或其片段和衍生物。例如，CTLA4、B7或CD28可以通过把免疫球蛋白(Ig)部分分别附着于CTLA4、B7或CD28的细胞外结构域而产生可溶性。此外，CTLA4等分子可以通过去除其跨膜结构域得到可溶性。本发明方法中使用的可溶性分子可以包括或不包括信号(或前导)序列。典型的分子并不包含前导序列。
在此使用的＂可溶性CTLA4分子＂表示循环的或非细胞表面结合的CTLA4分子或与B7结合的CTLA4分子的任意功能部分，包括但并不仅限于，CTLA4Ig融合蛋白，其中CTLA4的细胞外结构域融合于免疫球蛋白(Ig)部分，产生可溶性融合分子或其片段和衍生物；CTLA4的细胞外结构域融合或连接有生物活性或化学活性蛋白的蛋白，所述生物活性或化学活性蛋白例如乳头瘤病毒E7基因产物(CTLA4-E7)、黑色素瘤相关抗原p97(CTLA4-p97)或HIV env蛋白(CTLA4-envgp120)，或其片段和衍生物；杂交(嵌合)融合蛋白如CD28/CTLA4Ig，或其片段和衍生物；去除跨膜结构域而产生蛋白的可溶性的CTLA4分子，或其片段和衍生物。＂可溶性CTLA4分子＂也包括其片段、部分或衍生物，以及可溶性CTLA4突变分子，它们具有CTLA4结合活性。本发明方法使用的可溶性CTLA4分子可以包括或不包括信号(或前导)序列。典型的分子并不包含前导序列。
在此使用的＂CTLA4突变分子＂表示有一处或多处突变(优选在野生型CTLA4的细胞外结构域)的野生型CTLA4或其部分(衍生物或片段)。CTLA4突变分子有与野生型CTLA4分子相似但不完全相同的序列，其仍与B7结合。该突变包括一个或多个用具有保守的(例如用异亮氨酸取代亮氨酸)或非保守的(例如用色氨酸取代甘氨酸)结构或化学特性的氨基酸取代的氨基酸、氨基酸缺失、添加、移码或截短。突变CTLA4分子可以包括其中的或与其附着的非CTLA4分子，例如连接于免疫球蛋白恒定区的CTLA4的细胞外结构域或其部分及片段，产生CTLA4Ig分子(ATCC 68629)或L104EA29YIg分子(ATCC PTA-2104)，它们共同未决于美国专利申请60/287,576和60/214,065，在此引入作为参考。突变分子可以是可溶性的(即循环的)或结合于细胞表面。额外的CTLA4突变分子描述于美国专利申请09/865,321，60/214,065和60/287,576；美国专利6,090,914、5,844,095和5,773,253等。CTLA4突变分子可以合成或重组。
本领域技术人员可以理解，核苷酸序列的突变可以导致或不导致氨基酸序列的改变。在这方面，某些密码子编码同样的氨基酸。实例包括密码子CGT，CGG，CGC和CGA编码精氨酸(R)；密码子GAT和GAC编码天冬氨酸(D)。因此，由特异核苷酸序列不同的一种或多种核酸分子编码的蛋白分子有相同的序列。氨基酸编码序列如下氨基酸符号单字母符号密码子丙氨酸 AlaA GCU，GCC，GCA，GCG半胱氨酸CysC UGU，UGC天冬氨酸AspD GAU，GAC谷氨酸 GluE GAA，GAG苯丙氨酸PheF UUU，UUC甘氨酸 GlyG GGU，GGC，GGA，GGG氨基酸符号单字母符号密码子组氨酸 HisH CAU，CAC异亮氨酸IleI AUU，AUC，AUA亮氨酸 LysK AAA，AAG赖氨酸 LeuL UUA，UUG，CUU，CUC，CUA，CUG甲硫氨酸MetM AUG天冬氨酸AsnN AAU，AAC脯氨酸 ProP CCU，CCC，CCA，CCG谷氨酰胺GlnQ CAA，CAG精氨酸 ArgR CGU，CGC，CGA，CGG，AGA，AGG丝氨酸 SerS UCU，UCC，UCA，UCG，AGU，AGC苏氨酸 ThrT ACU，ACC，ACA，ACG缬氨酸 ValV GUU，GUC，GUA，GUG色氨酸 TrpW UGG酪氨酸 TyrY UAU，UAC在此使用的＂CTLA4的细胞外结构域＂是识别并结合B7的CTLA4的任意部分。例如，CTLA4的细胞外结构域包括+1位的甲硫氨酸至+124位的天冬氨酸(图5)。可选择的CTLA4细胞外结构域包括-1位的丙氨酸至+124位的天冬氨酸(图5)。细胞外结构域包括结合于B7的CTLA4片段或衍生物。
在此使用的＂淋巴细胞＂指介导体液或细胞免疫的单核细胞。主要的淋巴细胞亚型包括B和T细胞。
在此使用的＂免疫系统疾病＂指自身免疫、免疫增生疾病和移植相关疾病，包括但并不仅限于移植物抗宿主病(GVHD)(例如骨髓移植，或耐受的诱导中所导致)、移植排斥相关的免疫疾病(例如慢性排斥，组织或细胞的同种或异种移植物，包括实体器官、皮肤、胰岛、肌肉、肝细胞、神经元等)、T细胞淋巴瘤、牛皮癣、急性T细胞型淋巴母细胞白血病、睾丸血管中心T细胞淋巴瘤、良性淋巴细胞脉管炎、和自身免疫性疾病例如狼疮(例如红斑狼疮、狼疮肾炎)、桥本氏甲状腺炎、原发粘液性水肿、格雷夫斯病、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、阿狄森病、糖尿病(例如胰岛素依赖型糖尿病，非胰岛素依赖型糖尿病)、肺出血-肾炎综合征、重症肌无力、天疱疮、克隆氏病、交感神经性眼炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎、溃疡性结肠炎、干燥综合症、风湿病(例如类风湿性关节炎)、多发性肌炎、硬皮病和混合性结缔组织疾病。
在此使用的＂受试者＂表示为了调节免疫应答而给予试剂的任何活生物。受试者包括但并不仅限于，人、猴、小鼠、大鼠、猫、狗、仓鼠、任何转基因动物、任何同种异体移植受体、任何异种移植受体或任何移植受体。
在此使用的＂给药＂表示通过任何方便的方法向受试者提供试剂，包括但并不仅限于口服给药、吸入给药、静脉内给药、腹膜内给药、皮下给药、肌肉内给药、通过栓剂或局部接触给药、或通过例如泡囊或胶囊等缓释装置给药。
在此使用的＂基因治疗＂是通过基因操作治疗疾病的过程，一段核酸序列被转移入细胞，该细胞然后可表达由这段核酸编码的基因产物。例如，如本领域技术人员熟知的，可以在体内或体外通过多种方法把包含感兴趣核酸的表达载体插入细胞进行核酸转移，这些方法包括磷酸钙沉淀、二乙基氨基乙基葡聚糖、聚乙二醇(PEG)、电穿孔、直接注入、脂质转染或病毒感染(63，64，65)。感兴趣的核酸序列也可以通过多种载体和方法在体内转移入细胞，包括例如直接把核酸给予受试者(66)或在病毒载体上插入该核酸并用该病毒感染受试者(67-70)。其它体内转移方法包括使用脂质体包裹核苷酸，直接转移脂质体或结合血凝仙台病毒的脂质体入受试者(71)。被转染或感染的细胞表达由核酸编码的蛋白产物，以便改善疾病或缓解其症状。表达的蛋白产物可以分泌出或保留在被转染或感染的细胞内。
在此使用的＂可药用载体＂表示为了以任意形式向受试者给药而与试剂结合的所有材料。例如，载体包括能在给药于受试者时保持试剂有效活性且与受试者免疫系统无反应性的所有材料。可能的载体可以包括但并不仅限于，任何溶剂、介质、悬液、乳状液或其它赋形剂，例如淀粉、牛奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸、硬脂酸盐、滑石、油、树胶、乙二醇、芳香剂、防腐剂或着色剂等。可能的载体形式可以包括无菌溶液、气溶胶、脂质体、泡囊、栓剂、丸剂、片剂或胶囊。
为了使在此描述的本发明能够被更充分的理解，列出以下说明。
本发明的方法本发明提供通过阻断淋巴细胞上的受体如CTLA4、CD28、B7、CD40或CD154与它们配体的相互作用及阻断LFA-1介导的相互作用调节细胞介导的免疫应答的方法。该方法包括使淋巴细胞上的CD28、CTLA4或B7等分子接触第一种试剂而阻断第一种淋巴细胞信号；使淋巴细胞上的CD40或CD154等分子接触第二种试剂而阻断第二种淋巴细胞信号；使粘附分子(例如LFA-1)或其配体接触第三种试剂而阻断粘附分子介导的与其配体的相互作用。
本发明提供通过阻断淋巴细胞受体如CTLA4、CD28、B7、CD40或CD154与它们配体的相互作用及阻断LFA-1介导的相互作用治疗免疫系统疾病的方法。该方法包括至少给予三种试剂第一种试剂通过结合CD28、CTLA4或B7阻断CD28/CTLA4/B7介导的信号；第二种试剂通过结合CD40或CD154阻断CD40/CD154介导的信号；第三种试剂通过结合LFA-1、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、α辅肌动蛋白，细丝蛋白或细胞粘附蛋白-1阻断粘附分子介导的相互作用。三种试剂任意组合产生的阻断作用可以治疗免疫系统相关疾病。
第一种试剂优选通过干扰淋巴细胞上的受体(例如CD28和/或CTLA4)与其配体(例如B7-1和/或B7-2)的相互作用起作用。第一种试剂的实例包括但并不仅限于，识别并结合受体或配体的抗体(或其部分或衍生物)等分子；受体或配体的可溶形式(或其部分或衍生物)例如可溶性CTLA4；设计为通过受体/配体介导的相互作用干扰淋巴细胞信号的肽片段或其它小分子。在优选实施方案中，第一种试剂是可溶性CTLA4分子，例如CTLA4Ig(ATCC 68629)或L104EA29YIg(ATCC PTA2104)、可溶性CD28分子，例如CD28Ig(ATCC68628)、可溶性B7分子，例如B7Ig(ATCC 68628)、抗B7单克隆抗体(例如ATCC HB-253，ATCC CRL-2223，ATCC CRL-2226，ATCC HB-301，ATCC HB-11341和参考文献80-81中描述的单克隆抗体)、抗CTLA4单克隆抗体(例如ATCC HB-304和参考文献82-83中描述的单克隆抗体)和/或抗CD28单克隆抗体(例如ATCC HB-11944和参考文献79中描述的mAb 9.3)。
第二种试剂通过干扰淋巴细胞上的第二种受体(例如CD154)与其配体(例如CD40)的相互作用而起作用。第二种试剂的实例包括但并不仅限于，识别并结合第二种受体或配体的抗体(或其部分或衍生物)等分子，例如抗CD154单克隆抗体；受体或配体的可溶性形式(或其部分或衍生物)；设计为通过第二种受体/配体介导的相互作用干扰淋巴细胞信号的肽片段或其它小分子。在优选实施方案中，第二种试剂是抗CD154单克隆抗体(例如参考文献56中描述的MR1，ATCC HB-10916，ATCC HB-12055和ATCC HB-12056)和/或抗CD40单克隆抗体(例如ATCC HB-9110)。
第三种试剂干扰粘附分子(例如LFA-1)与其配体的相互作用。粘附分子与配体的实例包括但并不仅限于，能够定位于其它细胞或细胞外基质的LFA-1(CD11a/CD18)、Mac-1(CD11b/CD18)、p150，95(CD11c/CD18)、ICAM(1，2和3)、VLA-1、CD44、CD62(E，L和P)、CD106、纤维蛋白原、α辅肌动蛋白、细丝蛋白和细胞粘附蛋白-1等。第三种试剂的实例包括但并不仅限于，识别并结合粘附分子或其配体的抗体分子(或其部分或衍生物)等；粘附分子或其配体的可溶性形式(或其部分或衍生物)；设计为干扰粘附分子/配体相互作用的肽片段或其它小分子。在优选实施方案中，第三种试剂是抗LFA-1(例如ATCC HB-9579和ATCC TIB-213)、抗ICAM-1(例如ATCC CRL-1878和ATCC HB-233)、抗ICAM-2、抗ICAM-3、抗α辅肌动蛋白(例如ATCCCRL-2252)、抗细丝蛋白、抗细胞粘附蛋白-1、抗CD-11a(例如M17/5.2ATCC TIB-237，ATCC HB-202，ATCC HB-244和ATCC TIB-217)和/或抗CD18(ATCC HB-203，ATCC HB-226和ATCC TIB-218)单克隆抗体。
本发明的优选实施方案通过阻断至少三种细胞途径调节细胞介导的免疫应答第一种试剂CTLA4Ig阻断CD28/CTLA4/B7介导的途径；第二种试剂抗CD154单克隆抗体MR1阻断CD40/CD154介导的途径；第三种试剂抗LFA-1单克隆抗体M17/5.2阻断粘附分子介导的途径。
本发明的另一方面包含靶定于以上描述的一种或多种途径从而调节免疫应答的一种或多种试剂。例如，第一种和第二种试剂可以干扰CD28/CTLA4/B7途径(例如CTLA4Ig加抗B7单克隆抗体)，第三种试剂可以干扰粘附分子介导的途径(例如抗LFA-1单克隆抗体)。另外，所有三种试剂可以干扰一条途径(例如CTLA4Ig，抗B7单克隆抗体加抗B7-2单克隆抗体)。
本发明包括用于治疗免疫系统疾病的药物组合物，其中包含药学有效量的上述三种试剂。因此给予受试者至少三种试剂的组合以破坏三种细胞接触，这样可以调节针对抗原侵袭的细胞介导的免疫应答。受试者可以包括但并不仅限于，人类、猴、小鼠、大鼠、狗、猫、仓鼠等。组合物可以额外包含其它治疗试剂，包括但并不仅限于，药物毒素、酶、抗体(或其部分或衍生物)或缀合物。
试剂的给药可以在同一时间或不同时间。例如，可以依照特殊的顺序给药、以时间依赖性方式同时或序贯给药或其任意组合。试剂可以序贯或同时，并以任意顺序给药。可以依据给药剂量和方式在针对抗原呈递的免疫应答前、同时或之后(或其任意组合)用试剂对受试者进行处理。
试剂剂量取决于多种因素，包括但并不仅限于，受试者类型(即物种)、使用的试剂(例如CTLA4Ig或L104EA29YIg)、抗原侵袭位点、受影响组织的类型、接受处理的免疫系统疾病类型、疾病的严重程度、受试者的健康状况和对试剂处理的反应。因此，试剂的剂量可以依据每个受试者、试剂和给药方式的不同而变化。例如，可溶性CTLA4分子如L104EA29YIg(包括于图6种，由ATCC保藏号为PTA-2104的DNA编码，并见美国专利申请09/579,927，60/287,576和60/214,065的描述，在此引入作为参考)的给药量为0.1-20.1mg/kg受试者体重/天，优选0.5-10.0mg/kg/天。
试剂的给药可以通过许多可行的方法，包括但并不仅限于，注射(例如静脉注射、皮内注射、肌肉内注射等)、口服、吸入、局部接触、基因治疗、通过机械释放装置例如泵给药、通过缓释装置给药例如泡囊、胶囊或栓剂。试剂可以根据给药的方式与药学可以接受的载体组合以便于给药并有效使用该试剂。
药物组合物优选包含适当的载体和佐剂，其包括与本发明分子(例如可溶性CTLA4突变分子，如L104EA29Y或L104E)结合后能保持分子的活性并与受试者免疫系统无反应的任何材料。适当的载体和佐剂的实例包括但并不仅限于，人血清白蛋白、离子交换剂、氧化铝、卵磷脂、缓冲物质如磷酸、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、以及盐或电解液如硫酸鱼精蛋白。其它的实例包括任何标准的药学载体，例如磷酸缓冲液、水、乳状液如油/水乳状液和多种类型的润湿剂。其它的载体也可以包括无菌溶液、片剂，包含包被的片剂与胶囊。代表性的这些载体包含赋形剂，例如淀粉、牛奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石粉、植物脂肪或油、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。这些载体也包括芳香剂和着色剂或其它成份。
包含这些载体的组合物通过已熟知的传统方法制备。该组合物可以在不同的液体组合物中制备，例如脂质体和各种聚合组合物，如聚合微球体。
以任何形式给予该试剂以调节细胞介导的免疫应答，从而可以影响免疫系统疾病的发生，例如免疫系统的免疫增生性疾病或自身免疫性疾病/紊乱的发生。免疫系统疾病的实例包括但并不仅限于，移植物抗宿主病(GVHD)(例如骨髓移植，或耐受的诱导中所导致)、移植排斥相关的免疫疾病(例如慢性排斥，组织或细胞的同种或异种移植物，包括实体器官、皮肤、胰岛、肌肉、肝细胞、神经元等)、T细胞淋巴瘤、牛皮癣、急性T细胞型淋巴母细胞白血病、睾丸血管中心T细胞淋巴瘤；良性淋巴细胞脉管炎、和自身免疫性疾病例如狼疮(例如红斑狼疮、狼疮肾炎)、桥本氏甲状腺炎、原发粘液性水肿、格雷夫斯病、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、阿狄森病、糖尿病(例如胰岛素依赖型糖尿病，非胰岛素依赖型糖尿病)、肺出血-肾炎综合征、重症肌无力、天疱疮、克隆氏病、交感神经性眼炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎、溃疡性结肠炎、干燥综合症、风湿病(例如类风湿性关节炎)、多发性肌炎、硬皮病和混合性结缔组织疾病。
本发明进一步提供在受试者中治疗免疫系统疾病的方法。免疫系统疾病的实例见上述描述。在一个实施例中，本发明提供治疗自身免疫疾病的方法。许多自身免疫疾病来自对自身抗原有反应性的T淋巴细胞的不适当的激活，这种激活促进与疾病病理有关的细胞因子和自身抗体产生。向已患或怀疑患有自身免疫紊乱的受试者给予本发明的三种试剂可以防止自身反应性T细胞的激活并可以减轻或消除疾病症状。
在本发明的优选实施方案中，同种异体移植存活分析的检测到，至少三种试剂CTLA4Ig、抗CD154单克隆抗体和抗LFA-1单克隆抗体的联合给药可以调节免疫应答。
本发明进一步提供抑制受试者同种异体移植排斥反应的方法。一般地，被移植体对移植物的排斥反应起始于T细胞将移植物识别为外来物，然后产生损害移植物的免疫应答。本发明的三种试剂通过抑制细胞表面分子与其配体的相互作用阻断同种异体移植后的免疫应答。试剂在给药后影响免疫应答的实例包括抑制T淋巴细胞增殖和/或细胞因子分泌而减少组织损伤并诱导抗原特异性T细胞的无反应性，而不需要一般的免疫抑制。本发明因此增加了同种异体移植的存活。
而且，本发明的试剂可以和其它药剂同时给药，包括但并不仅限于其它药物。例如和以下药物联合给药，钙神经素抑制剂如环孢霉素A或FK506、免疫抑制性大环内酯类药物如雷怕霉素或其衍生物，如40-O-(2-羟基)乙基-雷怕霉素、淋巴细胞返回(homing)剂如FTY720或其类似物、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、leflunomide或其类似物、咪唑立宾、霉酚酸、霉酚酸莫非替克、15-deoxyspergualine或其类似物、免疫抑制性单克隆抗体(或其部分或衍生物)如淋巴细胞受体的单克隆抗体(或其部分或衍生物)，如MHC、CD2、CD3、CD4、CD11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB或它们的配体、或其它免疫调控化合物，如选择蛋白拮抗剂和VAL-4拮抗剂。
本发明的可溶性CTLA4突变分子与其它免疫抑制/免疫调控或抗炎治疗如上述特指药物联合给药时，联合给药的免疫抑制、免疫调控或抗炎化合物的给药剂量应根据共同使用的药物类型不同，例如是类固醇或环孢霉素、使用的特定药物、治疗状况等而变化。
依照以上说明，本发明提供上述方法的另一方面，包括共同给予，如同时或序贯给予治疗有效量的以游离或可药用盐形式存在的本发明的分子和第二种药物，所述第二种药物是上述免疫抑制、免疫调控或抗炎药物。进一步提供的是治疗上的组合，例如用于上述方法种的试剂盒，包含游离或可药用盐形式的本发明的分子，所述分子与包括免疫抑制、免疫调控或抗炎药物的至少一种药物组合物同时或序贯使用。
目前使用基因治疗进行多种免疫系统疾病例如免疫增生疾病(例如癌症)或自身免疫疾病(例如糖尿病)的治疗。本发明试剂可以通过基因治疗给予受试者，以便调节移植排斥反应并治疗免疫系统疾病。基因治疗方法包括但并不仅限于，直接将基因递送至受试者，用于原位转移至受试者的体内方法，将基因转移至培养细胞，然后将培养细胞移植至受试者体内的离体或体外方法。一旦编码一种或多种治疗剂的感兴趣基因被插入受试者细胞，基因产物就得以表达并起到改善疾病或症状的作用。
把感兴趣基因直接插入细胞的可能的体内方法包括使用重组病毒载体，例如猿猴病毒40、腺病毒、人免疫缺陷病毒-1或其它病毒。把感兴趣基因直接微注射入细胞或其它转移程序均可使用。
把感兴趣基因插入细胞的可能的离体或体外方法包括磷酸钙介导的转染、脂类介导的转染、使细胞在高压电流下通透(电穿孔)、微注射或包裹感兴趣基因至红细胞血影并导入细胞等转移程序。
基因治疗可以用于治疗或增强各种疾病的治疗。例如，本发明中编码一种或多种试剂如可溶性CTLA4Ig或可溶性gp39的DNA可以被插入逆转录病毒载体并包裹进病毒颗粒。使用病毒颗粒感染受试者细胞，将感兴趣的基因转移到受试者。一旦基因被转移到受试者，基因产物得到充分表达，即可调节移植排斥反应和治疗免疫系统疾病。
本发明提供通过阻断细胞表面分子与多种配体的相互作用调节细胞介导的免疫应答，诱导免疫应答调节的改进并治疗免疫系统疾病的方法。被阻断的特定相互作用包括但并不限于，CTLA4/B7、CD28/B7、CD154/CD40和LFA-1/ICAM途径。阻断三种或更多的相互作用导致免疫应答调节增强、移植存活增加和免疫增生调节的增强。
本发明提供用于本发明方法的试剂盒。试剂盒可以包含游离或结合可药用载体形式的本发明的三种试剂。而且，试剂盒也包含与本发明三种试剂联合使用的一种或多种免疫抑制剂。可能的免疫抑制剂包括但并不限于，皮质类固醇、非甾体类抗炎药(例如Cox-2抑制剂)、环孢霉素、强的松、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、TNFα阻滞剂或拮抗剂、infliximab、任何靶定炎症性细胞因子的生物试剂、羟基氯喹、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazopryine)、金盐、etanercept和anakinra。
除了本发明方法在此鉴定的分子，其它分子(即配体)用标准技术如结合分析也可鉴定。例如，本发明的任何分子(例如CTLA4、CD28、B7、CD154、CD40、LFA-1、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、α辅肌动蛋白，细丝蛋白或细胞粘附蛋白-1相互作用)都可以使用任何筛选技术筛选包括小分子文库在内的配体分子。这些筛选中使用的本发明分子可以是溶液中游离状态、固定于固体支持物或在细胞表面。可以测定本发明任意分子与被检测试剂间结合复合物的形成(例如，公开的PCT申请WO84/03564；Price，M.R.等，1986.Br.J.Cancer 54393(88)；Gallegher，G.等，1993.Tumour Immunobiology，63-79页，OxfordUniversity Press Inc.，New Year(89))。
另一种涉及高通量筛选与本发明分子具有适当结合亲和力的分子的筛选技术见公开的PCT申请WO84/03564描述。在此方法，如应用到本发明的分子的方法中，大量不同的被检测小分子可以在固体基质，例如塑料钉或其它物质表面上合成。被检测分子可以与本发明分子反应，并且冲洗。然后使用本领域熟知的方法检测本发明的结合分子。纯化的本发明分子可以直接包被在用于筛选分析的平板上。作为选择，非中和抗体(或其部分或衍生物)可以用于捕获本发明分子并固定其于固体支持物上。
另一种竞争性筛选分析涉及使用中和抗体(可以结合本发明的分子)与被检测分子特异性竞争与本发明分子的结合。如此即可使用抗体检测与本发明分子有一个或多个共同抗原决定簇的任何蛋白/肽分子的存在。
本发明涉及的领域对本领域技术人员是明显的，在不背离本发明精神和本质特征的前提下，可以以不同于此处具体公开的形式实施本发明。因此本发明在此描述的具体实施方式
应被认为是说明性的而无限制性。本发明范围在所附权利要求中列出，而并不仅限于以下描述的试剂.鼠CTLA4Ig(Linsley(13)和Wallace(87))和MR1单克隆抗体(仓鼠抗鼠CD40L/CD154)(56)和M17/5.2(抗鼠LFA-1/CD11a)在先前已有描述，并在使用前从培养上清液中纯化(62)。
鼠尾部皮肤移植.为了检测小鼠皮肤移植排斥反应率，研究尾部皮肤移植。简单地说，在无菌条件下从安乐死的供体小鼠割除供体尾部皮肤。受体尾部皮肤用酒精进行手术准备，割除受体尾部下侧约1×0.5cm面积的皮肤以形成移植床。从供体处得到的同样大小的皮肤被置于移植床并用手术胶带将覆盖的保护性玻璃管固定在尾部，2-3天后去除玻璃管和胶带。每日观察移植物的坏死情况，当＞75％坏死时认为移植物被排斥。
以尾部皮肤移植术操作日为第0天。腹膜内给予小鼠三种试剂，CTLA4Ig、MR1(仓鼠抗鼠CD40L/CD154)和M17/5.2(抗鼠LFA-1/CD11a)，单独或以两种或三种试剂的组合给药。CTLA4Ig以200μg的剂量在移植后第0，2和4天给药。MR1以250μg的剂量在移植后第0，2和4天给药。抗LFA-1单克隆抗体以200μg的剂量在移植后第0，1，2，3，4，5，6，14和21天给药。
结果抗LFA-1单克隆抗体增强淋巴细胞相互作用的阻断诱导的鼠皮肤移植术后移植物存活先前已证实阻断LFA-1/ICAM-1相互作用在鼠移植模型中增加同种异体皮肤移植存活。在这些模型中，长期移植存活仅在LFA-1抗体和ICAM-1抗体联合给药时达到。先前的研究也证实，在某些供体/受体株联合使用可溶性CTLA4Ig和抗CD154单克隆抗体MR1也可提供同种异体皮肤移植的长期存活。在BALB/c->C57BL/6系统，可溶性CTLA4Ig和抗CD154单克隆抗体MR1分别给药时并不增加移植物存活，当联合给药时也不能达到长期移植物存活。
为了分析抗LFA-1单克隆抗体与可溶性CTLA4Ig或抗CD154单克隆抗体联合给药的效应，供体BALB/c小鼠皮肤被移植于受体C57BL/6小鼠尾部，受体小鼠经抗LFA-1单克隆抗体M17/5.2、可溶性CTLA4Ig和抗CD154单克隆抗体MR1或三种试剂的联合处理。每日观测移植物的存活情况，观测结果在图1中说明。数据表明抗LFA-1和可溶性CTLA4Ig联合给药较两者分别使用能明显增加移植物存活。抗LFA-1+CTLA4Ig处理小鼠(55.0天)的平均移植物存活高于仅使用抗LFA-1(22.0天)或可溶性CTLA4Ig(21.0天)。数据同样说明联合使用抗LFA-1和抗CD154抗体MR1极大地增加了移植物存活，使分别使用抗LFA-1或抗CD154的平均移植存活从22.0天和14.0天达到34.0天。如以前的报道，在此鼠移植模型中联合使用可溶性CTLA4Ig和MR1并不能增加长期移植存活(MST＝29.0天)，然而在此方案中添加抗LFA-1单克隆抗体即可增加平均移植存活至65.0天。因此三种试剂的联合治疗较两种联合更为成功。实施例2鼠新生心脏至耳的移植材料和方法小鼠.6-8周的成年雄性小鼠C57BL/6和BALB/c小鼠购买于Harlan(Indianapolis，Indiana)。新生C57BL/6心脏供体小鼠以我们的设施哺育。C57BL/6小鼠是移植供体而BALB/c小鼠是移植受体。
试剂.鼠CTLA4Ig(Linsley(13)和Wallace(87))和MR1单克隆抗体(仓鼠抗鼠CD40L/CD154)(56)和M17/5.2(抗鼠LFA-1/CD11a)在先前已有描述，并在使用前从培养上清液中纯化(62)。
鼠新生心脏至耳的移植.心脏移植操作见Fulmer等(57)描述。新生心脏从出生后小于48小时的新生小鼠获得。心脏移植于麻醉准备下的受体小鼠，在其耳廓底部做小切口并轻柔地提起耳部皮肤形成小囊。切口允许供体心脏皮下插入至小囊。移植术后3-5天血管连接建立后，心脏才开始跳动。心脏的跳动通常可经过放大观察或通过合适的ECG监测设备测量收缩活性。每日观察小鼠并监测移植物的收缩活性。移植排斥时间定义为移植术后收缩活性停止的日期。
腹膜内给予小鼠三种试剂，CTLA4Ig、MR1(仓鼠抗鼠CD40L/CD154)和M17/5.2(抗鼠LFA-1/CD11a)，单独或以两种或三种试剂的组合给药。CTLA4Ig以200μg的剂量在移植后第0，2和4天给药。MR1以250μg的剂量在移植后第0，2和4天给药。抗LFA-1单克隆抗体以200μg的剂量在移植后第0，2和4天给药。
小鼠于第10，17和40天施以安乐死并取出移植物置于福尔马林中进行组织病理观察，见图3和4。组织切片行苏木精和伊红(H&E)染色，检测炎症浸润和心肌损伤。图3给出心肌损伤分析结果，图中说明了每组移植物的剩余心肌组织百分比，即高分值是较高的心肌组织存活百分比和较少的组织损伤。图4给出不同治疗组炎症浸润结果，图中低分值说明移植物中较少的炎症浸润。
结果抗LFA-1单克隆抗体增强淋巴细胞相互作用的阻断诱导的鼠心脏移植术后移植物存活先前已证实LFA-1/ICAM-1相互作用的阻断在鼠移植模型中增加同种异体心脏移植存活。在这些模型中，长期移植存活仅在LFA-1抗体和ICAM-1抗体联合给药时达到。先前的研究也证实，联合给予可溶性CTLA4Ig和抗CD154抗体也可达到同种异体心脏移植的长期存活。某种试剂单独给药虽然明显低于联合给药的作用，但也可以增加移植物存活。
为了分析抗LFA-1单克隆抗体与可溶性CTLA4Ig或抗CD154单克隆抗体联合给药的效应，新生C57BL/6小鼠心脏被皮下移植入受体BALB/c成年小鼠耳廓，受体小鼠经抗LFA-1单克隆抗体M17/5.2、可溶性CTLA4Ig和抗CD154单克隆抗体或三种试剂的联合处理。这些心脏的收缩活性通过ECG每日监测，图2给出心脏移植物存活结果。数据表明抗LFA-1和可溶性CTLA4Ig联合给药较两者分别给予能明显增加移植物存活。抗LFA-1+CTLA4Ig处理小鼠的平均移植物存活(57天)高于仅使用抗LFA-1(18天)或可溶性CTLA4Ig(20天)的两倍。数据同样说明联合给予抗LFA-1和抗CD154抗体极大的增加了移植物存活，使分别使用抗LFA-1或抗CD154的平均移植存活18.0天和33.0天达到一起使用时67.5天。如先前的报道，联合给予可溶性CTLA4Ig和抗CD40L可以达到长期移植物存活(MST＞80天)数据结果进一步说明接受多种治疗的实验组(CTLA4Ig、MR1和抗LFA-1两种或三种联合给药)较其它治疗组获得更高的心肌组织存活百分比(图3)和较少的炎症浸入(图4)。实施例3构建人CTLA4Ig和L104EA29YIg本实施例描述产生编码人类可溶性CTLA4分子例如CTLA4Ig，L104EA29Yig的核苷酸序列的方法。编码CTLA4Ig的核苷酸序列如下文描述最初得到，接着从CTLA4Ig序列得到单位点突变L104Eig，并验证其对CD80和/或CD86的结合动力学。以L104EIg核苷酸序列为模板产生双位点突变的CTLA4Ig序列，L104EA29YIg，也验证其对CD80和/或CD86的结合动力学。
构建CTLA4Ig编码CTLA4Ig的基因构建体包含CTLA4Ig的细胞外结构域和IgCγ结构域，其构建方法见美国专利5,844,095和5,851,795描述，其内容在此引入作为参考。CTLA4基因的细胞外结构域基因使用对应于Dariavach等(72)描述的公开序列的合成寡核苷酸PCR克隆得到。
因为CTLA4基因内没有鉴定CTLA4的信号肽，用重叠寡核苷酸使用两个步骤把预测CTLA4序列的N末端与制瘤素M(73)的信号肽相融合。第一步，用寡核苷酸CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCAAGCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC(编码制瘤素M信号肽C末端15个氨基酸，融合于CTLA4的N末端的7个氨基酸)作为正向引物，TTTGGGCTCCTGATCAGAATCTGGGCACGGTTG(编码CTLA4受体的编码氨基酸序列的119-125位氨基酸残基，并且包含Bcl I限制性酶切位点)作为反向引物。该步骤的模板是从1mg H38细胞(Salahudin和Gallo博士，NCI，Bethesda，MD提供的HTLVII感染的T细胞白血病细胞系)总RNA合成的cDNA。第一步PCR反应的部分产物经编码制瘤素M信号肽的N末端部分并含HindIII限制性酶切位点的重叠正向引物CTAGCCACTGAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC和相同反向引物再扩增。PCR反应产物经HindIII和Bcl I消化，并与Bcl I/Xba I剪切的编码相应IgC1铰链区、CH2和CH3区氨基酸序列的cDNA片段连接至HindIII/Xba I剪切的表达载体CDM8或Hind III/Xba I剪切的表达载体piLN(也称为πLN)。
编码相应于CTLA4Ig的氨基酸序列的DNA已根据布达佩斯条约于1991年5月31日保藏于ATCC，并给予ATCC保藏号68629。
基于CTLA4Ig密码子的诱变产生双突变体开发了诱变和筛选技术用以鉴定与CD80和/或CD86分子具有更缓慢解离速度(＂脱离＂率)的突变CTLA4Ig分子。单点突变的核苷酸序列使用CTLA4Ig(美国专利5,844,095、5,851,795和5,885,796；ATCC保藏号为68629)为模板而产生。允许第1和2位为任意碱基，以及第3位仅仅是鸟嘌呤或胸腺嘧啶(XXG/T；也称为NNG/T)，设计用于进行特定cDNA密码子随机诱变的诱变寡核苷酸PCR引物。编码一种氨基酸的特定密码子即可如此随机突变为其它20种氨基酸的密码子。因此，XXG/T诱变产生编码20种氨基酸的每一种的32个可能的密码子。编码接近CTLA4Ig的-M97-G107的突变的PCR产物(见图5)经Sac I/Xba I消化，亚克隆入进行类似剪切的CTLA4IgπLN表达载体。使用该方法产生单位点突变的CTLA4分子L104EIg。
对于接近CTLA4Ig的S25-R33的诱变，通过PCR引物指导的突变，在该环5′首先引入NheI限制性位点。PCR产物经Nhe I/Xba I消化，亚克隆入进行类似剪切的CTLA4Ig或L104EIg表达载体。使用该方法产生CTLA4双位点突变分子L104EA29YIg(图6)。具体地，将编码单位点突变CTLA4分子L104EIg的核酸分子用作产生双位点突变CTLA4分子L104EA29YIg的模板。图6给出L104EA29YIg的序列，其包含N末端前导序列。
以下提供用于识别以上描述的单和双位点突变CTLA4多肽的筛选方法，该突变CTLA4多肽由上述构建体表达，与非突变CTLA4Ig分子相比，与CD80和CD86抗原有较高的结合亲和力。
目前体内和体外研究表明，CTLA4Ig本身不足以完全阻断抗原特异激活T细胞的激发。用CTLA4Ig和CD80或CD86的特异单克隆抗体进行了体外研究，测量了T细胞增殖的抑制，表明抗CD80单克隆抗体不能增强CTLA4Ig的抑制。然而，抗CD86单克隆抗体确实增强CTLA4Ig的抑制，说明CTLA4Ig在阻断CD86相互作用上并不十分有效。这些数据支持早期Linsley等的发现(74)，说明对于CD80介导的细胞应答的抑制较CD86介导的应答需要大约低100倍的CTLA4Ig浓度。基于这些发现可以推测，可溶性CTLA4突变分子较野生型CTLA4对CD86有更高亲和力，可以较CTLA4Ig更好地阻断抗原特异激活细胞的激发。
因此，使用一种新的筛选过程筛选以上描述的可溶性CTLA4突变分子，以便识别一些改进与CD80和CD86的结合亲和力的CTLA4细胞外结构域突变。这种筛选技术提供直接识别明显降低解离速度的突变的有效方法，而不需蛋白纯化或定量，因为如O′Shannessy等描述(75)，解离速度的测定是浓度非依赖性的。
COS细胞经分别小量制备的纯化质粒DNA转染并培养数日。将条件培养基施加于包被可溶性CD80Ig或CD86Ig的BIAcore生物传感芯片(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)上培养三天。突变蛋白的特异性结合和解离经表面等离子体共振检测(75)。所有实验在25℃下，BIAcoreTM或BIAcoreTM2000生物传感器上运行。配体使用标准N-乙基-N′-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺偶联，固定于研究级NCM5传感器芯片(Pharmacia)(76，77)。
筛选方法用编码突变CTLA4Ig的DNA瞬时转染24孔组织培养板内生长的COS细胞。三天后收集含分泌的可溶性突变CTLA4Ig的培养基。
使条件性COS细胞培养基流过用D80Ig或CD86Ig衍生的BIAcore生物传感器芯片，见Greene等描述(78)，即可识别比野生型CTLA4Ig的解离速度低的突变分子。对相应于所选培养基样品的cDNAs测序，并制备DNA进行大规模COS细胞瞬时转染，由此在培养基蛋白A纯化后制备突变CTLA4Ig蛋白。
BIAcore分析情况和平衡结合数据分析操作见Greene等描述(78)。
BIAcore数据分析传感图基线在分析前校准到零反应单位(RU)。由于溶液容量折射指数不同，样品通过模拟衍生的流式细胞检测本底反应单位值(RU)。平衡解离常数(Kd)由Req对C的图中计算得出，其中，Req为稳态反应减去模拟衍生芯片；C为分析物的摩尔浓度。结合曲线的分析使用的是商业非线性曲线拟合软件(Prism，GraphPAD软件)。
实验数据首先拟合到单配体结合单受体模型(1位点模型，即简单朗缪尔系统，A+B←→AB)，平衡缔合常数(Kd＝[A]×[B]\[AB])由方程R＝Rmax×C\(Kd+C)计算得到。接下来，数据拟合到最简单的2位点配体结合模型(即，由方程R＝Rmax1×C\(Kd1+C)+Rmax2×C\(Kd2+C)描述的具有2个非相互作用的独立结合位点的受体)。
这两种模型的匹配程度通过对比实验数据和由F检验得到的统计平方和进行分析。简单的1位点模型为最佳选择，除非2-位点模型明显拟合更佳(p＜0.1)。
缔合和解离分析使用BIA评估软件2.1(Pharmacia)进行分析。缔合速度常数kon通过两种方法来计算，假设具有同源1-位点相互作用和平行2-位点相互作用。对于1-位点相互作用，kon值通过方程Rt＝Req(1-exp-ks(t-t0))计算，其中Rt是在给定时间的反应，t；Req是稳态反应；t0是注射起始时间；ks＝dR/dt＝Kon×Ckoff，其中C为分析物浓度，由单体结合位点的形式计算。对于2-位点相互作用，kon值通过方程Rt＝Req1(1-exp-ks1(t-t0))+Req2(1-expks2(t-t0))计算。对于每个模型，kon值由ks对C的曲线计算的斜率(最大缔合的约70％)得到。
根据1-位点(AB＝A+B)或2-位点(AiBj＝Ai+Bj)模型分析解离数据，由最佳拟合曲线得到速度常数(koff)。除残余比机器本底(2-10RU，根据机器)大时，使用结合位点模型，在残余比机器本底大时，使用2-结合位点模型。受体被占用的半衰期使用关系t1/2＝1.693/koff计算。
流式细胞术鼠mAb L307.4(抗CD80)购买于Becton Dickinson(San Jose，California)，IT2.2(抗B7-0[也称为CD86])购买于Pharmingen(SanDiego，California)。免疫染色时，CD80阳性和/或CD86阳性CHO细胞从培养试管移至含10mM EDTA的磷酸缓冲液(PBS)中培养。CHO细胞(1-10×105)先和mAbs或免疫球蛋白融合蛋白在含10％胎牛血清(FBS)的DMEM中孵育，接着洗涤细胞并和荧光素异硫氰酸盐偶联的山羊抗鼠或抗人免疫球蛋白第二步试剂(Tago，Burlingame，California)一起孵育。最后洗涤细胞并在FACScan(BectonDickinson)上分析。
SDS-PAGE和大小排阻层析SDS-PAGE在Tris/甘氨酸4-20％丙烯酰胺凝胶(Novex，SanDiego，CA)上进行。分析凝胶经考马司亮兰染色，使用数字扫描获得湿润凝胶的影像。使用TSK-GEL G300 SWXL柱(7.8×300mm，Tosohaas，Montgomeryville，PA)通过大小分离层析分析CTLA4Ig(25μg)和L104EA29YIg(25μg)，在含0.02％NAN3，流速为1.0ml/分的磷酸缓冲液中平衡。
CTLA4Xc120s和L104EA29YXc120s单链CTLA4Xc120s如先前描述(Linsley等，(1995)J.Biol.Chem.，27015417-15424(84))制备。简单地说，用制瘤素MCTLA4(OMCTLA4)表达质粒作为模板，正向引物GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG选择用于配对载体中的序列；反向引物GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC相当于CTLA4细胞外结构域中最后7个氨基酸(即118-124位氨基酸)，并且包含限制性酶切位点和终止密码子(TGA)。反向引物指定C120S(120位半胱氨酸取代为丝氨酸)突变。具体地，以上给出的反向引物核苷酸序列GCA(34-36位核苷酸)被以下核苷酸序列之一代替AGA、GGA、TGA、CGA、ACT或GCT。本领域技术人员可以理解，核苷酸序列GCA是半胱氨酸密码子TGC的反向互补序列。同样，核苷酸序列AGA、GGA、TGA、CGA、ACT或GCT是丝氨酸密码子的反向互补序列。聚合酶链产物经HindIII/Xba I酶消化并直接亚克隆入表达载体πLN(Bristol-MyersSquibb Company，Princeton，NJ)。L104EA29YXc120s用同样的方法制备。每种构建体均经DNA测序验证。
高亲和性突变体的鉴定和生化特性选择24种氨基酸诱变产生约2300种突变蛋白，通过表面等离子体共振(如以上描述的SPR)用于CD86Ig结合分析。表II总结了每个位点突变体的主要效应。S25-R33氨基酸的随机突变并不改变配体结合。E31、R33和M97-Y102残基的诱变明显导致配体结合减少。残基S25、A29和T30、K93、L96、Y103、L104和G105的诱变导致蛋白产生缓慢＂缔合＂和/或缓慢＂解离＂速度。这些结果证实了先前的发现，S25-R33区的残基和M97-Y102区内或附近的残基影响配体的结合(Peach等，(1994)，J.Exp.Med.1802049-2058(85))。
S25、T30、K93、L96、Y103和G105位的诱变导致可以识别与CD86Ig有缓慢＂解离＂速度的一些突变蛋白。然而，在这种情况下，缓慢＂解离＂速度被缓慢＂结合＂速度抵消，导致突变对CD86Ig的总体亲和力明显近似于野生型CTLA4Ig。而且，K93的诱变导致明显的聚集，其产生观测到的动力学改变。
随机诱变L104，然后用COS细胞转染，并通过固定的CD86Ig经培养基样品的SPR筛选，得到包含较野生型CTLA4Ig的＂解离＂速度慢约2倍的突变蛋白的六种培养基样品。对这些突变体的相应cDNA测序后，发现每一种都编码亮氨酸至谷氨酸的突变(L104E)。显然，亮氨酸104至天冬氨酸(L104D)的取代并不影响CD86Ig的结合。
然后在表II列出的每个位点重复诱变，这次使用L104E替代野生型CTLA4Ig作为PCR模板。再次使用固定的CD86Ig经SPR分析鉴定含29位丙氨酸诱变的较野生型CTLA4Ig的＂解离＂速度慢约4倍的六种培养基。最慢的两种为酪氨酸取代物(L104EA29Y)，两种为亮氨酸取代物(L104EA29L)，一种为色氨酸取代物(L104EA29W)并且一种为苏氨酸取代物(L104EA29T)。显然，在野生型CTLA4Ig中，当29位丙氨酸被随机诱变，不能鉴定到＂解离＂速度缓慢的突变体。
纯化L104E和L104EA29YIg的相对分子量和聚集状态通过SDS-PAGE和大小排阻层析估测。L104EA29YIg(～1μg；第3道)和L104EIg(～1μg；第2道)与CTLA4Ig(～1μg；第1道)在还原(～50kDa；+βME；加2-巯基乙醇)和非还原(～100kDa；-βME)情况下有明显相同的电泳迁移率(图7A)。大小排阻层析证实L104EA29YIg(图7C)和二聚体CTLA4Ig(图7B)有明显相同的迁移率。图7B中，主峰代表蛋白二聚体，而快速洗脱小峰代表更高分子量的聚集体。约5.0％的CTLA4Ig作为高分子量聚集体出现，但没有L104EA29YIg或L104EIg聚集的证据。因此，L104EIg和L104EA29YIg与CD86Ig更强的结合并不是因为由诱变诱导的聚集。
平衡和动力学结合分析使用表面等离子体共振(SPR)对蛋白A纯化的CTLA4Ig、L104EIg和L104EA29YIg进行平衡和动力学结合分析。表1显示分析结果。根据在一定浓度范围(5.0-200nM)产生的结合曲线计算观察到的平衡解离常数(Kd；表1)。L104EA29YIg较L104EIg或CTLA4Ig与CD86Ig有更强的结合力。L104EA29YIg(3.21nM)较L104EIg(6.06nM)或CTLA4Ig(13.9nM)的Kd值更低，说明L104EA29YIg与CD86Ig的亲和力较高。L104EA29YIg(3.66nM)较L104EIg(4.47nM)或CTLA4Ig(6.51nM)的Kd值更低，说明L104EA29YIg对CD80Ig的亲和力较高。
动力学结合分析揭示，CTLA4Ig、L104EIg和L104EA29YIg与CD80结合速度相似，对CD86Ig的＂缔合＂速度也相似(表1)。然而，这些分子的＂解离＂速度并不一致(表1)。与CTLA4Ig相比，L104EA29YIg从CD80Ig＂解离＂的速度慢约2倍，从CD86Ig解离＂的速度慢约4倍。L104E的＂解离＂速度在L104EA29YIg和CTLA4Ig之间。由于这些突变体的引入并不明显影响＂缔合＂速度，L104EA29YIg与CD80Ig和CD86Ig亲和力的升高可能主要是由于＂解离＂速度的降低。
为了测定L104EA29YIg与CD80Ig和CD86Ig亲和力的升高是否是由于突变影响了每个单体缔合成二聚体的方式，或每个单体内是否引入了导致亲和力增强的结构变化，通过以上描述和Linsley等，(1995)J.Biol.Chem.，27015417-15424(84)的描述，在120位半胱氨酸诱变至丝氨酸后，制备了CTLA4和L104EA29Y细胞外结构域的单链构建体。在使用SPR分析配体结合特性前，通过凝胶渗透层析验证了纯化蛋白CTLA4Xc120s和L104EA29YXc120s为单体(Linsley等，(1995)，supra(84))。结果显示两种单体蛋白与CD86Ig的结合亲和力比它们的对应二聚体低约35-80倍(表1)。结果支持先前公开的数据，认为CTLA4二聚化是高亲和力配体结合所必须的(Geene等，(1996)J.Biol.Chem.27126762-26771(78))。
L104EA29YXc120s与CD80Ig和CD86Ig两者的结合亲和力比CTLA4Xc120s与两者的亲和力高约2倍。亲和力的增加是由于与两种配体解离速度慢约3倍。因此，L104EA29Y与配体亲和力增高最可能是因为每个单链而非二聚体分子内引入使亲和力升高的结构改变。
亲和力升高突变的定位和结构分析CTLA4细胞外IgV样结构域的溶液结构已于最近通过NMR光谱检测(Metzler等，(1997)Nature Struct.Biol.，4527-531(86))。这容许104位亮氨酸和29位丙氨酸在三维折叠的精确定位(图8A-B)。104位亮氨酸位于高保守的MYPPPY氨基酸序列附近。29位丙氨酸位于S25-R33区C末端附近，与MYPPPY区的空间位置邻近。两个区域的残基有明显的相互作用，但L104和A29间没有直接的相互作用，虽然它们都包含蛋白中连续疏水核心的部分。两种亲和力增高突变体的结构结果通过建立模型进行分析。A29Y突变可以容易地容纳于S25-R33区和MYPPPY区之间的缝隙内，起到稳定MYPPPY区构象的作用。野生型CTLA4中，L104构成在MYPPPY区附近与L96和V94间广泛的疏水相互作用。两种原因导致谷氨酸突变很可能不采用L104突变的构象。第一，在不干扰S25-R33区的情况下，结构内没有充足的空间容纳更长的谷氨酸侧链。第二，在疏水区埋藏带负电的谷氨酸侧链的能量消耗将是很大的。模型研究预测，谷氨酸侧链翻转至表面时，其电荷可通过溶解而被稳定。G105可以容易地容纳这种构象改变，对这些区域地其它残基扭曲最小。
高亲和力突变体与表达CD80或CD86的CHO细胞的结合CTLA4Ig和突变分子结合稳定转染CD80+和CD86+CHO细胞的FACS分析(图9)使用在此描述的方法进行。CD80阳性和CD86阳性CHO细胞使用浓度逐渐升高的CTLA4Ig、L104EA29YIg或L104EIg培养，并洗涤。使用荧光素异硫氰酸盐偶联的山羊抗人免疫球蛋白检测结合的免疫球蛋白融合蛋白。
如图9所示，CD80阳性和CD86阳性CHO细胞(1.5×105)使用指出浓度的CTLA4Ig(方块)、L104EA29YIg(圆圈)或L104EIg(三角)23℃孵育2小时，洗涤细胞，并用荧光素异硫氰酸盐偶联的山羊抗人免疫球蛋白抗体孵育。在FACScan上分析(单测定)在总共5,000个存活细胞上的结合，使用PC-LYSYS从数据柱状图测定平均荧光强度(MFI)。检测仅用第二步试剂孵育的细胞(MFI＝7)所测定的本底荧光强度进行数据校正。对照L6 mAb(80μg/ml)的MFI＜30。这些结果代表四个独立的实验。
L104EA29YIg、L104EIg和CTLA4Ig与人CD80转染的CHO细胞的结合几乎相同(图9A)。L104EA29YIg和L104EIg较CTLA4Ig与用人CD86稳定转染的CHO细胞有更强的结合力(图9B)。
功能测定通过免疫磁性负选择分离人类CD4阳性T细胞(Linsley等，(1992)J.Exp.Med.1761595-1604(83))。在滴定浓度的抑制剂存在下，用佛波醇豆蔻酸乙酸酯(PMA)加CD80阳性或CD86阳性CHO细胞刺激分离的CD4阳性T细胞。在有或无辐射的CHO细胞刺激物的1nM PMA存在的条件下，培养CD4阳性T细胞(8-10×104/孔)。在培养的72小时的最后7小时通过添加1μCi/孔[3H]胸苷检测增生反应。用L104EA29YIg和CTLA4Ig进行PMA加CD80阳性或CD86阳性CHO刺激的T细胞的抑制。结果在图10中给出。L104EA29YIg较CTLA4Ig对CD80阳性PMA处理的CHO细胞增殖有更强的抑制(图10A)。L104EA29YIg较CTLA4Ig对CD86阳性PMA处理的CHO细胞增殖也有更强的抑制(图10B)。因此，L104EA29YIg是CD80-和CD86介导的T细胞共刺激的更有效的抑制剂。
图11说明了L104EA29YIg和CTLA4Ig对按上述方法制备，并且用表达CD80和CD86的称为PM的人类B淋巴母细胞系(LCL)进一步进行同种异体刺激的人T细胞的抑制(T细胞3.0×104/孔，PM8.0×103/孔)。初次同种异体刺激6天后，然后用3H胸苷脉冲细胞7小时，再测定放射性标记的掺入。
第二次同种异体刺激依以下方法进行。从淋巴细胞分离培养基(LSM)(ICN，Aurora，OH)上收获经7天初次同种异体刺激的T细胞并静置24小时。在滴定量的CTLA4Ig或L104EA29YIg存在下，依上述比例添PM，对T细胞再刺激(第二次)。刺激3天后，按上述方法用放射标记脉冲细胞并收集细胞。图11A给出L104EA29YIg对初次同种异体刺激T细胞的作用。图11B给出L104EA29YIg对第二次同种异体刺激T细胞的作用。L104EA29YIg较CTLA4Ig能更好抑制初次和第二次T细胞增殖。
为了检测细胞因子产量(图12)，建立双份第二次同种异体刺激平板。3天后，在生产商推荐的条件使用ELISA试剂盒(BiosourceCamarillo，CA)测定培养基。发现甾第二次同种异体刺激后，L104EA29YIg较CTLA4Ig能更有效阻断T细胞IL-2、IL-4和γ-IFN细胞因子的产生(图12A-C)。
图13给出L104EA29YIg和CTLA4Ig对猴混合淋巴细胞应答(MLR)的影响。通过淋巴细胞分离培养基(LSM)纯化来自2只猴的外周血单核细胞(PBMC′S；每只猴3.5×104细胞/孔)，并与2μg/ml植物凝集素(PHA)混合。刺激细胞3天后，在收获前用放射性标记脉冲16小时。L104EA29YIg较CTLA4Ig能更好地抑制猴T细胞增殖。
表1平衡和表观动力学常数在下表给出(值为平均值±标准差，来源于三个不同的实验)固定的蛋白分析物kon(×105) koff(×10-3) KdM-1S-1S-1nMCD80IgCTLA4Ig 3.44±0.292.21±0.186.51±1.08CD80IgL104EIg 3.02±0.051.35±0.084.47±0.36CD80IgL104EA29YIg 2.96±0.201.08±0.053.66±0.41CD80IgCTLA4XC120S12.0±1.0 230±10 195±25CD80IgL104EA29YXC120S8.3±0.26 71±5 85.0±2.5CD86IgCTLA4Ig 5.95±0.578.16±0.5213.9±2.27CD86IgL104EIg 7.03±0.224.26±0.116.06±0.05CD86IgL104EA29YIg 6.42±0.402.06±0.033.21±0.23CD86IgCTLA4XC120S16.5±0.5 840±55 511±17CD86IgL104EA29YXC120S11.4±1.6 300±10 267±29表2在列出位点的CTLA4Ig诱变对CD86Ig结合的作用由上文所述SPR测定。主要的作用以＂+＂标记表示。诱变位点 诱变的作用明显的缓慢“缔合”无作用结合减少 配体速度/缓慢的“解离”速度S25 +P26+G27+K28+A29 +T30 +E31+R33+K93 +L96 +M97+Y98+P99+P100 +P101 +Y102 +Y103 +L104 +G105 +I106 +G107 +Q111 +Y113 +I115 +
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权利要求
1.一种调节细胞介导的免疫应答的方法，包括给予a.通过结合CD28、CTLA4或B7阻断CD28/CTLA4/B7介导的信号的第一种试剂；b.通过结合CD40或CD154阻断CD40/CD154介导的信号的第二种试剂；和c.通过结合LFA-1、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、α辅肌动蛋白，细丝蛋白或细胞粘附蛋白-1阻断粘附分子介导的相互作用的第三种试剂，由此通过第一种、第二种和第三种试剂阻断，调节细胞介导的免疫应答。
2.通过权利要求1的方法调节细胞介导的免疫应答从而治疗免疫系统疾病的方法。
3.一种抑制受试者免疫系统疾病的方法，包括给予受试者a.通过结合CD28、CTLA4或B7阻断CD28/CTLA4/B7介导的信号的第一种试剂；b.通过结合CD40或CD154阻断CD40/CD154介导的信号的第二种试剂；和c.通过结合LFA-1、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、α辅肌动蛋白，细丝蛋白或细胞粘附蛋白-1阻断粘附分子介导的相互作用的第三种试剂，由此通过第一种、第二种和第三种试剂阻断，抑制免疫系统疾病。
4.一种抑制受试者中移植排斥的方法，包括给予接受移植的受试者a.通过结合CD28、CTLA4或B7阻断CD28/CTLA4/B7介导的信号的第一种试剂；b.通过结合CD40或CD154阻断CD40/CD154介导的信号的第二种试剂；和c.通过结合LFA-1、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、α辅肌动蛋白，细丝蛋白或细胞粘附蛋白-1阻断粘附分子介导的相互作用的第三种试剂，由此通过第一种、第二种和第三种试剂阻断，抑制细胞介导的对移植排斥的免疫应答。
5.权利要求1、3或4的方法，其中第一种试剂结合B7，并且是可溶性CTLA4分子、可溶性CD28分子或抗B7单克隆抗体；其中第一种试剂结合CTLA4，并且是抗CTLA4单克隆抗体或可溶性B7分子；和/或其中第一种试剂结合CD28，并且是抗CD28单克隆抗体或可溶性B7分子。
6.权利要求5的方法，其中可溶性CTLA4分子是CTLA4Ig(ATCC68629)或L104EA29YIg(ATCC PTA-2104)；其中可溶性CD28分子是CD28Ig(ATCC 68628)；其中可溶性B7分子是B7Ig(ATCC 68627)；其中抗B7单克隆抗体是ATCC HB-253，ATCC CRL-2223，ATCC CRL-2226，ATCC HB-301或ATCC HB-11341；其中抗CTLA4单克隆抗体是ATCC HB-304；并且其中抗CD28单克隆抗体是ATCC HB 11944或mAb9.3。
7.权利要求1、3或4的方法，其中第二种试剂结合CD154，并且是抗CD154单克隆抗体，和/或其中第二种试剂结合CD40，并且是抗CD40单克隆抗体。
8.权利要求7的方法，其中抗CD154单克隆抗体是MR1、ATCCHB-10916、ATCC HB-12055或ATCC HB-12056，并且其中抗CD40单克隆抗体是ATCC HB-9110。
9.权利要求1、3或4的方法，其中第三种试剂结合LFA-1，并且是抗LFA-1单克隆抗体；其中第三种试剂结合ICAM-1，并且是抗ICAM-1抗体；其中第三种试剂结合ICAM-2，并且是抗ICAM-2抗体；其中第三种试剂结合ICAM-3，并且是抗ICAM-3抗体；其中第三种试剂结合α-辅肌动蛋白，并且是抗α-辅肌动蛋白抗体；其中第三种试剂结合细丝蛋白，并且是抗细丝蛋白抗体；其中第三种试剂结合细胞粘附蛋白-1，并且是抗细胞粘附蛋白-1抗体；其中第三种试剂结合CD18，并且是抗CD18抗体；和/或其中第三种试剂结合CD11a，并且是抗CD11a抗体。
10.权利要求1、3或4的方法，其中第三种试剂结合ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、α-辅肌动蛋白、细丝蛋白或细胞粘附蛋白-1中的任意一种，并且是可溶性LFA-1；和/或其中第三种试剂结合LFA-1，并且是可溶性ICAM-1、可溶性ICAM-2、可溶性ICAM-3、可溶性α-辅肌动蛋白、可溶性细丝蛋白或可溶性细胞粘附蛋白-1。
11.权利要求10的方法，其中抗LFA-1单克隆抗体是ATCC HB-9579或ATCC TIB-213；其中抗ICAM-1单克隆抗体是ATCC CRL-1878或ATCC HB-233；其中抗CD11a单克隆抗体是M17/5.2(ATCC TIB-237)，ATCC HB-202，ATCC HB-244或ATCC TIB-217；其中抗CD18单克隆抗体是ATCC HB-203，ATCC HB-226或ATCC TIB-218；并且其中抗α-辅肌动蛋白单克隆抗体是ATCC CRL-2252。
12.权利要求1、3或4的方法，其中阻断粘附分子介导的相互作用的第三种试剂阻断LFA-1/ICAM-1，ICAM-2，ICAM-3，α-辅肌动蛋白，细丝蛋白，细胞粘附蛋白-1相互作用。
13.权利要求2或3的方法，其中免疫系统疾病选自移植物抗宿主病(GVHD)、牛皮癣、移植排斥相关的免疫疾病、T细胞淋巴瘤、急性T细胞型淋巴母细胞白血病、睾丸血管中心T细胞淋巴瘤、良性淋巴细胞性脉管炎、狼疮(例如红斑狼疮、狼疮肾炎)、桥本氏甲状腺炎、原发粘液性水肿、格雷夫斯病、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、阿狄森病、糖尿病(例如胰岛素依赖型糖尿病，非胰岛素依赖型糖尿病)、肺出血-肾炎综合征、重症肌无力、天疱疮、克隆氏病、交感神经性眼炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性活动性肝炎、溃疡性结肠炎、干燥综合症、风湿病(例如类风湿性关节炎)、多发性肌炎、硬皮病和混合性结缔组织疾病。
14.权利要求1、3或4的方法，其中第一种、第二种和第三种试剂经局部或全身给药。
15.权利要求1、3或4的方法，其中第一种、第二种和第三种试剂续贯或同时、并且以任意顺序给药。
16.权利要求3或4的方法，其中受试者选自人、猴、猿、狗、猫、牛、马、兔、小鼠和大鼠。
17.一种通过阻断细胞介导的免疫应答调节免疫系统疾病的方法，采用以下试剂a.第一种试剂，该试剂为可溶性CTLA4；和b.第二种试剂，该试剂为抗CD154单克隆抗体；和c.第三种试剂，该试剂为抗LFA-1单克隆抗体，由此第一种、第二种和第三种试剂抑制细胞介导的免疫疾病。
18.一种通过阻断细胞介导的免疫应答抑制同种异体移植排斥的方法，采用以下试剂a.第一种试剂，该试剂为可溶性CTLA4；和b.第二种试剂，该试剂为抗CD154单克隆抗体；和c.第三种试剂，该试剂为抗LFA-1单克隆抗体，其中第一种、第二种和第三种试剂抑制对移植物的细胞介导的免疫应答。
19.一种药物组合物，包含第一种、第二种和第三种试剂，并且其中a.第一种试剂通过结合CD28、CTLA4或B7阻断CD28/CTLA4/B7介导的信号；b.第二种试剂通过结合CD40或CD154阻断CD40/CD154介导的信号；和c.第三种试剂阻断LFA-1/ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、α辅肌动蛋白、细丝蛋白或细胞粘附蛋白-1相互作用。
20.一种治疗移植排斥的试剂盒，所述试剂盒包含有效量的第一种试剂，第二种试剂和第三种试剂，并且a.第一种试剂通过结合CD28、CTLA4或B7阻断CD28/CTLA4/B7介导的信号；b.第二种试剂通过结合CD40或CD154阻断CD40/CD154介导的信号；和c.第三种试剂阻断LFA-1/ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、α辅肌动蛋白、细丝蛋白或细胞粘附蛋白-1相互作用。
21.权利要求19的药物组合物，进一步包含至少一种免疫抑制剂，其中免疫抑制剂选自皮质类固醇、非甾体类抗炎药(例如Cox-2抑制剂)、环孢霉素强的松、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、TNF α阻断剂或拮抗剂、infliximab、任何靶定炎性细胞因子的生物试剂、羟基氯喹、柳氮磺胺吡啶、金盐、etanercept和anakinra。
22.权利要求19的药物组合物，其中第一种试剂结合B7，并且是可溶性CTLA4分子、可溶性CD28分子或抗B7单克隆抗体；其中第一种试剂结合CTLA4，并且是抗CTLA4单克隆抗体或可溶性B7分子；和/或其中第一种试剂结合CD28，并且是抗CD28单克隆抗体或可溶性B7分子。
23.权利要求22的药物组合物，其中可溶性CTLA4分子是CTLA4Ig(ATCC 68629)或L104EA29YIg(ATCC PTA-2104)；其中可溶性CD28分子是CD28Ig(ATCC 68628)；其中可溶性B7分子是B7Ig(ATCC68627)；其中抗B7单克隆抗体是ATCC HB-253，ATCC CRL-2223，ATCCCRL-2226，ATCC HB-301或ATCC HB-11341；其中抗CTLA4单克隆抗体是ATCC HB-304；并且其中抗CD28单克隆抗体是ATCC HB 11944或mAb 9.3。
24.权利要求19的药物组合物，其中第二种试剂结合CD154，并且是抗CD154单克隆抗体，和/或其中第二种试剂结合CD40，并且是抗CD40单克隆抗体。
25.权利要求24的药物组合物，其中抗CD154单克隆抗体是MR1，ATCC HB-10916，ATCC HB-12055或ATCC HB-12056并且其中抗CD40单克隆抗体是ATCC HB-9110。
26.权利要求19的药物组合物，其中第三种试剂结合LFA-1，并且是抗LFA-1单克隆抗体；其中第三种试剂结合ICAM-1，并且是抗ICAM-1抗体；其中第三种试剂结合ICAM-2，并且是抗ICAM-2抗体；其中第三种试剂结合ICAM-3，并且是抗ICAM-3抗体；其中第三种试剂结合α-辅肌动蛋白，并且是抗α-辅肌动蛋白抗体；其中第三种试剂结合细丝蛋白，并且是抗细丝蛋白抗体；其中第三种试剂结合细胞粘附蛋白-1，并且是抗细胞粘附蛋白-1抗体；其中第三种试剂结合CD18，并且是抗CD18抗体；和/或其中第三种试剂结合CD11a，并且是抗CD11a抗体。
27.权利要求19的药物组合物，其中第三种试剂结合ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、α-辅肌动蛋白、细丝蛋白或细胞粘附蛋白-1中的任意一种，并且是可溶性LFA-1；和/或其中第三种试剂结合LFA-1，并且是可溶性ICAM-1、可溶性ICAM-2、可溶性ICAM-3、可溶性α-辅肌动蛋白、可溶性细丝蛋白或可溶性细胞粘附蛋白-1。
28.权利要求27的药物组合物，其中抗LFA-1单克隆抗体是ATCCHB-9579或ATCC TIB-213；其中抗ICAM-1单克隆抗体是ATCC CRL-1878或ATCC HB-233；其中抗CD11a单克隆抗体是M17/5.2(ATCCTIB-237)，ATCC HB-202，ATCC HB-244或ATCC TIB-217；其中抗CD18单克隆抗体是ATCC HB-203，ATCC HB-226或ATCC TIB-218；并且其中抗α-辅肌动蛋白单克隆抗体是ATCC CRL-2252。
29.权利要求20的试剂盒进一步包含至少一种免疫抑制试剂，其中免疫抑制试剂选自皮质类固醇、非甾体类抗炎药(例如Cox-2抑制剂)、环孢霉素、强的松、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤、TNFα阻断剂或拮抗剂、infliximab、任何靶定炎性细胞因子的生物试剂、羟基氯喹、柳氮磺胺吡啶、金盐、etanercept和anakinra。
30.权利要求20的试剂盒，其中第一种试剂结合B7，并且是可溶性CTLA4分子、可溶性CD28分子或抗B7单克隆抗体；其中第一种试剂结合CTLA4，并且是抗CTLA4单克隆抗体或可溶性B7分子；和/或其中第一种试剂结合CD28，并且是抗CD28单克隆抗体或可溶性B7分子。
31.权利要求30的试剂盒，其中可溶性CTLA4分子是CTLA4Ig(ATCC 68629)或L104EA29YIg(ATCC PTA-2104)；其中可溶性CD28分子是CD28Ig(ATCC 68628)；其中可溶性B7分子是B7Ig(ATCC68627)；其中抗B7单克隆抗体是ATCC HB-253，ATCC CRL-2223，ATCCCRL-2226，ATCC HB-301或ATCC HB-11341；其中抗CTLA4单克隆抗体是ATCC HB-304；并且其中抗CD28单克隆抗体是ATCC HB 11944或mAb 9.3。
32.权利要求20的试剂盒，其中第二种试剂结合CD154，并且是抗CD154单克隆抗体，和/或其中第二种试剂结合CD40，并且是抗CD40单克隆抗体。
33.权利要求32的试剂盒，其中抗CD154单克隆抗体是MR1，ATCCHB-10916，ATCC HB-12055或ATCC HB-12056并且其中抗CD40单克隆抗体是ATCC HB-9110。
34.权利要求20的试剂盒，其中第三种试剂结合LFA-1，并且是抗LFA-1单克隆抗体；其中第三种试剂结合ICAM-1，并且是抗ICAM-1抗体；其中第三种试剂结合ICAM-2，并且是抗ICAM-2抗体；其中第三种试剂结合ICAM-3，并且是抗ICAM-3抗体；其中第三种试剂结合α-辅肌动蛋白，并且是抗α-辅肌动蛋白抗体；其中第三种试剂结合细丝蛋白，并且是抗细丝蛋白抗体；其中第三种试剂结合细胞粘附蛋白-1，并且是抗细胞粘附蛋白-1抗体；其中第三种试剂结合CD18，并且是抗CD18抗体；和/或其中第三种试剂结合CD11a，并且是抗CD11a抗体。
35.权利要求20的试剂盒，其中第三种试剂结合ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、α-辅肌动蛋白、细丝蛋白或细胞粘附蛋白-1中的任意一种，并且是可溶性LFA-1；和/或其中第三种试剂结合LFA-1，并且是可溶性ICAM-1、可溶性ICAM-2、可溶性ICAM-3、可溶性α-辅肌动蛋白、可溶性细丝蛋白或可溶性细胞粘附蛋白-1。
36.权利要求35的试剂盒，其中抗LFA-1单克隆抗体是ATCCHB-9579或ATCC TIB-213；其中抗ICAM-1单克隆抗体是ATCC CRL-1878或ATCC HB-233；其中抗CD11a单克隆抗体是M17/5.2(ATCCTIB-237)，ATCC HB-202，ATCC HB-244或ATCC TIB-217；其中抗CD18单克隆抗体是ATCC HB-203，ATCC HB-226或ATCC TIB-218；并且其中抗α-辅肌动蛋白单克隆抗体是ATCC CRL-2252。
全文摘要
本发明提供通过干扰三种不同的细胞表面分子与其天然配体的相互作用，调节细胞介导的免疫应答、免疫系统疾病和同种异体移植排斥的方法。第一种细胞间相互作用由CD28/B7/CTLA4介导。第二种相互作用由CD40/CD154介导。第三种相互作用由LFA－1与其配体的相互作用介导。对细胞介导的免疫应答的调节影响例如与同种异体移植相关的免疫系统疾病。
文档编号A61P21/00GK1438894SQ01810894
公开日2003年8月27日 申请日期2001年6月8日 优先权日2000年6月9日
发明者R·M·汤森德, C·G·托德鲁德, R·J·皮奇 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司