专利名称：抗宿主细胞伴随疱疹病毒的免疫接种的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗所谓的宿主细胞伴随(host cell associated)疱疹病毒的免疫接种领域，所述病毒如家禽的Marek’s病病毒(MDV)和人水痘-带状疱疹病毒(Varicella Zoster Virus)(VZV，从潜伏期复活后导致水痘和带状疱疹)，并涉及抗这些病毒所致疾病的免疫接种，尤其涉及家禽疾病特别是抗Marek’s病的免疫接种领域。
特别地，Marek’s病是从大量生产家禽肉开始就存在于家禽业的一个问题。这是一种疱疹病毒所致疾病，引起许多临床症状，从免疫抑制，神经功能失调，贫血和不明淡漠(unspecified apathies)开始，并在感染后期以严重淋巴癌终止。原先对Marek’s病没有治疗和预防措施。随后从火鸡中分离了一种非致病性(apathogenic)相关的(血清型3)病毒(HVT)，并开始用于接种。
然而，在用HVT接种后一段时间，Marek’s病再次出现，而变得明显了，循环的野生病毒改变而抵御由HVT毒株引起的保护作用发生。在此时，发现了一种新的非致病性病毒(Rispens毒株)，其通常具有与导致疾病的病毒相同的血清型。这种疫苗株非常迅速进入市场，并产生良好的接种结果。
然而，在大约10年后，发生了新的疾病爆发，循环野生病毒再一次改变而抵御由所用疫苗株引起的保护作用发生。随后将两种疫苗(HVT和Rispens)组合使用以对所述动物加以保护，然而只暂时见到满意的结果。目前，尽管使用所有的这些接种措施，仍发生了疾病的新爆发。这种现象的原因还不清楚，但明显需要新的强力有效的疫苗。
与抗Marek’s病接种相关的问题是尽管生产Marek疫苗已经很长时间了，但疫苗的制备方法没有改良。这归因于通常宿主细胞伴随病毒只能生长于原代宿主细胞中，如MDV或HVT生长于没有病原体的原代细胞如制备自家禽如鸡的成纤维细胞中，水痘带状疱疹病毒生长于(基本上为原代的)人细胞(同样，当然没有病原体)中，而且离开了各自宿主的特异细胞不能或非常难以获得。这通常使得在实践水平生产抗病毒感染或由这些类型病毒所致疾病的疫苗非常困难，几乎是不可能的，而且因此非常昂贵。
例如，抗Marek’s病的Rispens疫苗，是目前认为唯一足够有效的疫苗，与所有血清型-1 Marek病毒相同均是严格宿主细胞伴随的。细胞伴随病毒(例如血清型1和2)的感染性在正常冷冻或冻干期间完全丧失。因此制备这种疫苗包括非常复杂和昂贵的步骤，其中全部细胞必须在液氮中冷冻。所述疫苗必须在液氮中贮存，运输和保持直至使用，因此在运输期间成本巨大且非常困难。
随后，在使用地点，所述疫苗必须非常小心使用，因为感染的细胞对环境因素非常敏感。环境因素如温度提高，暴露于光照，所用的玻璃器具上残余的清洁剂通常会损害所述病毒，由此不能制备出足够存活的疫苗，导致完全疫苗失败。只有当疾病已经开始爆发及感染的家禽显示出疾病症状时，才可以意识到这种失败。
简而言之，迄今为止提供灭活疫苗，亚单位疫苗或重组疫苗以抗Marek’s病的所有尝试均失败了，因此目前仍没有选择包含Marek’s病病毒的活的细胞伴随疫苗的方法。Marek’s病仍然是通过应用感染的细胞制品作为疫苗加以控制的。这些制品不仅含有悬浮于含有DMSO的培养基中的活细胞和所有种类的细胞抗原，它们还必须贮存于液氮中。相继地，冷冻环节必须从疫苗生产开始至使用者直至施用为止。另外，一旦解冻，所述疫苗必须在短时间内施用，而且每只鸟均要注射。由于出现的这些问题，希望制备抗其它细胞伴随疱疹病毒如水痘带状疱疹病毒的疫苗。
Marek’s病病毒(MDV)是疱疹病毒科(Herpesviridae)的α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)的一个成员(Lee等，2000，Murphy等，1995)。基于对鸡的毒力及诱导T细胞淋巴瘤的能力，MDV通常分为3个血清型(MDV-1，MDV-2和MDV-3)。MDV-3代表火鸡的疱疹病毒(HVT)，其广泛用于抗MDV相关疾病的免疫接种。然而，在免疫接种失败及产生所谓的毒性或烈毒性MDV-1后(Witter，1985)，减毒的MDV-2毒株和稍后减毒的MDV-1毒株(例如毒株CVI988 Rispens)用于疫苗配制品中(Witter，1985)。近年来首先在美国报道了毒性更强的MDV-1，所谓的烈毒加(vv+)的MDV-1变体出现，并导致高发生率的Marek’s病，和由肿瘤发生所致的死亡率及在感染后早期免疫抑制(Witter，1997)。一种vv+毒株584A已经在鸡胚成纤维细胞(CEF)上传代100次以上，并示出对鸡丧失致病性(Witter，1997)。然而，vv+MDV-1的致病性提高及丧失毒力的分子学基础还不清楚，因为对所有这些变体MDV-1病发生的分子学分析不足。原因是难以进行分析。一方面，在培养的细胞中没有或只有少量感染病毒子代释放，另一方面，MDV-1重组的产生是很费力的，及归因于细胞培养物中所述制剂的高度细胞伴随性质，需要多次纯化病毒重组(Cantello等，1991；Sakaguchi等，1993；Parcells等，1994；Schat等，1998；Anderson等，1998)。
最首要的是，如上所述，免疫接种不能保证保护动物免于Marek’s病病毒感染。所述病毒与所有疱疹病毒一样，能发现避免所述疫苗诱导的免疫应答的方式。因此需要疫苗迅速适应野外情况。目前，这是通过分离局野外分离株(例如HVT或Rispens)和/或在体外进一步减毒进行的。所述分离本身就引起极大问题，因为难以从鸡中获得细胞伴随感染性病毒及感染细胞培养物中的细胞。随后的减毒步骤是非常费力的，而且费时，因为噬斑纯化非常难，这同样是由于所述病毒的细胞伴随性质所致。
减毒的结果一般没有确定。这些因素的结果是长期以来没有可信赖的疫苗进入市场，目前的HVT和Rispens型疫苗是失败的。另外，在生产疫苗期间通常发生过度减毒，因为所述病毒已经传代过多次。这进一步加重了HVT和Rispens型疫苗的低效力。简而言之，以下问题构成了目前MDV控制僵局的大部分。这些问题是传统疫苗生产的低重复性，疫苗病毒的过度减毒，疫苗病毒减毒的不确定性，高生产成本，高贮存和运输成本，所述疫苗对环境因素的高敏感性，及新疫苗毒株尤其细胞伴随病毒株开发太慢。
以下事实使得这些问题更复杂化，目前循环的野外病毒在家禽生产原料中产生高抗体效价，而这些高抗体效价通过卵中的亲代抗体传给子代。这些亲代抗体在现有疫苗病毒的初始感染期间的影响，进一步降低了抗Marek’s病的免疫接种的现有效力。
本发明提供了一种抗宿主细胞伴随疱疹病毒感染的疫苗，所述疫苗包含衍生自所述疱疹病毒的一种重组病毒基因组，所述基因组使得重组基本没有所述宿主细胞。由此本发明提供了衍生自据认为是宿主细胞伴随疱疹病毒的一种重组病毒基因组，所述基因组优选在所述宿主细胞中至少能复制，同时使重组基本没有或不依赖于所述宿主细胞，不再需要在真核细胞中同源重组。在详细描述中，这样的基因组用于预防Marek’s病样病毒。
在此，例如将Marek’s病病毒血清型1(MDV-1)，毒株584Ap80C的基因组克隆入大肠杆菌中，作为细菌人工染色体(BAC)。在用病毒DNA和重组质粒pDS-pHA1一起转染鸡胚成纤维细胞后，BAC载体序列通过同源重组被导入MDV-1基因组的Us2基因座中，所述重组质粒pDS-pHA1含有BAC序列及取代MDV-1Us2基因的Eco-gpt基因和侧翼序列。将转染子代在存在霉酚酸和黄嘌呤/次黄嘌呤的情况下，在CEF细胞上传代。在4轮选择后，制备病毒DNA并用于转化大肠杆菌菌株DH10B。鉴别一些携带完整MDV-1基因组的菌落。将这些MDV-1BAC转染入CEF细胞中，并从转染后第3天回收感染性MDV-1。回收自各种BAC的MDV-1的生长通过噬斑形成及确定生长曲线分析与亲代病毒无区别。
本发明因此提供了一种产生或获得一种重组的、基本上为宿主细胞伴随疱疹病毒基因组的方法，包括衍生自MDV和/或VZV分离株的(如果需要几乎完整或完整的)感染性疱疹病毒核酸。
当然，既然获得了不含最初被认为与其牢固结合的宿主细胞的基本上完整的基因组，本发明还提供了一种基因组，其使得可以全面应用分子生物学领域技术人员已知的所有重组技术，因此例如本发明还提供了一种至少包含(复制型)小基因组的疫苗。
例如，本发明提供了一种小基因组，其只表达仅仅几个糖蛋白(如gB，gC，gD或其组合物)，及例如ICP4或已经示出在疱疹病毒中诱导细胞免疫的另一种基因产物。考虑到所述基因组不再在(真核)宿主细胞中复制，这种小基因例如适合鉴别在保护方面有重要作用的基因。另外，例如在每个基因或基因构建体之前加上HCMV或SV40启动子将使得最小保护单位得以最终鉴别出。针对有复制能力的小基因组，本发明还提供了缺失全部或主要部分的US区域，从而所得小病毒在宿主细胞内也复制。
在另一个实施方案中，本发明提供了这样的基因组，其包含衍生自所述疱疹病毒的基本上全长的拷贝，所述基本上全长在本文中是指所述病毒基因组的大部分基因均存在，除了一些优选(至少功能性)缺失的基因，如病毒在宿主或宿主细胞培养物中复制或传播所必需的基因，如本发明的详细描述中所提供的那些。在此，例如在根据本发明回收的一个基因组BAC20中，使用一个线性DNA片段将编码糖蛋白B(gB)的序列通过一步recE介导的诱变而缺失。在gB阴性BAC20 DNA(20DgB)转染后重构的糖蛋白B阴性MDV-1只能在反式提供gB的细胞上生长，表明gB是MDV-1在培养的宿主细胞中生长所必需的。生长所必需的并可以提供给细胞以产生反式基因产物的其它基因是gH，ICP4，UL15，UL28和UL9，或以下所列的据认为是生长所必需的另一基因。
另外，本发明提供了本发明的基因组制备疫苗的用途，在一个实施方案中，这种疫苗抗由基本上是宿主细胞伴随疱疹病毒所致疾病，然而，在另一个实施方案中，这种疫苗可以用作载体疫苗并可以包含其它或额外的病原体或编码其的核酸序列。针对MDV，优选的额外病原体核酸包含衍生自例如新城疫病毒，艾美虫属物种，沙门氏菌，鸡传染性贫血病毒，流感病毒，传染性粘液囊病病毒，呼肠孤病毒或在家禽中常见的其它病原体的核酸。
因此，本发明还提供了一种疫苗，其中所述基因组包含功能性缺失所述疱疹病毒在宿主细胞中复制和/或传播所必需的基因，或者其中所述病毒基因组至少包含一种核酸，所述核酸编码一种能激发抗所述疱疹病毒对个体的感染的(优选保护性)免疫应答的抗原性物质。一种典型的有待缺失的必需基因或其片段可以例如是如下基因的MDV同源物，UL1＝糖蛋白L；UL5；UL8；UL9；UL15；UL18；UL19；UL22＝糖蛋白H；UL26；UL26.5；UL27＝糖蛋白B；UL28；UL29；UL30；UL52；UL53；ICP4或选自所述基因组US区域的基因或其片段(
图1)。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种疫苗，其包含激发特异于所述疱疹病毒的标记免疫应答所必需的基因的功能缺失，这样用所述疫苗接种的个体和用所述基本上细胞伴随疱疹病毒感染的个体之间有免疫学区别。优选的标记应答例如是针对gC，gM，gD，或gE的，在详细描述段落中进一步说明了(在gM情况下)在激发标记免疫应答的基因中的这种缺失。
另外，本发明提供了一种疫苗，其中所述病毒基因组至少包含一种编码一种蛋白质物质的核酸，所述蛋白质物质能调节一种编码一种能激发抗所述疱疹病毒对个体的感染的免疫应答的抗原性物质的核酸的转录和/或翻译。
优选地，所述疫苗包含一种衍生自所述疱疹病毒的基本上全长的拷贝，以保持有效调节疫苗基因组在接种的宿主中转录和/或翻译所需的许多功能，然而，本发明还提供了小基因组接种。当从所述基因组中表达额外的病原体或衍生自其中的抗原性物质时，当然优选有效调节编码外源病原体或衍生自其中的抗原性物质的核酸转录和/或翻译，还应理解的是，当提供具有编码额外病原体的核酸的本发明疫苗时，为所述基因组也提供了外源(即非疱疹病毒)调节元件。
特别地，本发明提供了一种疫苗，其中所述疱疹病毒包含Marek′s病样病毒。特别是优选提供一种疫苗，其中所述Marek′s病样病毒包含血清型1。另外，本发明既然提供了超出基因最初所伴随的宿主细胞之外的基因组的操作方法，本发明还提供一种疫苗，其不是衍生自常规减毒的或无毒性Marek′s病样病毒分离株，而是衍生自毒性，烈毒或烈毒加野生病毒，因为现在从野生分离株中快速分离感染性克隆是可能的，可以制备DNA疫苗以预防鸡和火鸡中Marek’s病，其中在所述基因组中可以非常迅速地引入突变。针对其它基本上细胞伴随疱疹病毒如水痘-带状疱疹病毒可以使用相同的系统。
使用本发明提供的含有部分或全部感染性Marek′s病病毒(MDV-1)基因组的复制型病毒基因组，提供了产生更有效的，生物学安全的和稳定的MDV-1疫苗的各种各样的新可能性。由于重组MDV-1是回收自克隆的DNA，因此得自DNA转染的病毒子代可以更好定性，并可以避免疫苗病毒的“过减毒”。例如与减毒相关的132bp重复数目(Maotani et al.，1986)可以精确测定，而且如果需要，可以根据疫苗生产或野外情况的需要减少或增加(如下所示)。突变体MDV-1的产生得以大大改善。迄今为止，MDV-1突变体是在真核细胞中通过费力和耗时的同源重组和选择程序产生的。这些选择程序，如针对其它疱疹病毒所报道的，通常导致不希望的基因组突变，尤其在MDV-1的情况下不能获得无细胞病毒，这使选择程序和回收及增殖突变体更复杂。与之形成对照的是本发明提供了一种操纵病毒基因组的方法，这种方法基于通过质粒pGETrec上存在的recE，recT和recB/C-抑制性λgam基因进行诱变(Narayanan等，1999)。这个系统的优势是(i)只需要30-50bp同源臂定向于缺失的特异序列，即可以实现任何开放读框的缺失而不需要克隆重组盒，(ii)所述方法非常快速，及(iii)在没有氨苄青霉素的情况下，赋予诱变系统及表达氨苄青霉素抗性的pGETrec载体迅速自细菌细胞中丧失。
通过使用所谓的E/T克隆方法这种高效技术，在大肠杆菌中可以进行一步突变和选择(Muyrers等，1999；Narayanan等，1999；Zhang等，1998)。这种技术还可以缺失MDV-1基因而不需要使用互补细胞系，因为本发明提供的突变的MDV-1基因组的复制不需要反式互补缺失的必需基因。另外，完全不需要克隆程序。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种产生MDV-1或其它病毒(细胞伴随疱疹病毒)BACs的方法，包括用质粒pBADαβγ，pGETrec或任何其它可诱导地或稳定地表达recE，recT和λgam基因的质粒转化大肠杆菌DH10B细胞，随后从取自例如源于体内的裂解或潜在感染的细胞或细胞培养物中制备环形病毒DNA。在一组平行的或单独的程序中，提供了携带BAC载体序列和使BAC载体序列与病毒DNA同源重组的序列的线性DNA。这种线性DNA可以例如是通过PCR或通过线性化质粒DNA产生的。然后，提供了recE，recT和gam基因在大肠杆菌中的表达，并提供了电感受态细胞(例如Sambrook等，1989)。然后将病毒DNA与携带BAC载体序列的线性DNA一起电穿孔入感受态大肠杆菌中。如详细描述部分所述，铺板于含有适当抗生素的琼脂上以收获菌落并制备BAC DNA。克隆的BAC DNA的感染性通过转染易感细胞而检测。本发明提供了一种方法，用以遗传重组衍生自宿主细胞或组织的基本上宿主细胞伴随疱疹病毒基因组，而不需要在真核细胞中进行(同源)重组，使得可以获得衍生自野生分离株或减毒分离株的(如果需要是接近完整或完整的)感染性基因组或疱疹病毒核酸。
本发明的方法还可以进一步减毒候选疫苗MDV-1或产生携带其它重要鸡病原体基因的MDV-1突变体。另外，不断出现的具有可能不同的和改变的抗原性质的野生MDV-1分离株，可以通过基于克隆的MDV-1和现有的野生分离株之间各自的突变基因的置换提供一种疫苗而对抗。这些改变，如上所述，可以用相同的E/T克隆方法进行，而且这样提供了非常迅速对野外MDV-1的变化作出反应的可能性。然而，如本发明所述，回收感染性MDV-1的另一个有吸引力的优势是本发明提供的基因组作为DNA疫苗的应用。迄今为止，Marek′s病是通过应用感染的细胞制品控制的。
这些制品不仅含有悬浮于含有DMSO的培养基中的活细胞和所有种类的细胞抗原，而且还必须贮存于液氮中。从而冷冻环节必须从疫苗生产保持至疫苗使用者直至施用。另外，一旦解冻，疫苗必须在非常短的时间内施用，而且每只鸟均需注射。用本发明提供的MDV-1基因组DNA，纯化所述“疫苗”(DNA)是易行的及可重复的。DNA非常稳定，不再需要冷冻环节，而且感染性DNA可以通过一些途径(肌内，皮内，卵内，通过呼吸道途径等)和在不同配方中(有或无载体)施用。另外，存在亲代抗体不妨碍免疫原的初次注射。
这样，本发明提供的MDV-1基因组首次使得可以生产及工程化高效的及生物学安全的抗肿瘤和经济意义重大的疾病的疫苗。本发明因此提供了限制个体患有获得性或显然由宿主细胞伴随疱疹病毒感染所致疾病的风险的方法，包括为所述个体施用本发明的疫苗或基因组。
详细描述Marek′s病病毒(MDV)是疱疹病毒科α疱疹病毒亚科的一个成员(Regenmortel等，1999)。基于对鸡的毒力，导致T细胞淋巴瘤的能力和抗原性质，将MDV分成3个血清型(MDV-1，MDV-2和MDV-3)(Payne，1985)。MDV-3表示火鸡疱疹病毒(HVT)，其已经广泛用于抗MDV相关疾病的接种。根据最近的命名法，MDV-1分类为gallid疱疹病毒2(GHV-2)，MDV-2为GHV-3，HVT为meleagrid疱疹病毒。所有这三种病毒均属于α疱疹病毒亚科内的新Marek′s病样病毒。
以前控制MDV-1感染主要通过用HVT接种实现，然而，在接种失败和关于所谓的“烈毒”MDV-1的阐述后(Witter，1989)，MDV-2毒株及后来减毒的MDV-1毒株(例如毒株CVI 988 Rispens)已经用于疫苗配方中(Witter，1985)。
近年来及首先在美国报道出现了更毒性的MDV-1，“烈毒+”(vv+)MDV-变体，而且甚至在接种的家禽中也导致高死亡率(Witter，1997)。将这些vv+毒株之一，584A，在鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续传代，其丧失对鸡的致病性(Witter，1997)。vv+MDV-1的致病性提高及类似地毒力丧失的分子学机制还不清楚，因为难以进行MDV-1的分子学分析。
一方面，在培养的细胞中没有感染性病毒子代释放，另一方面，MDV-1重组体的产生很费力，及由于所述制剂在体外的高细胞伴随性质，需要多次纯化病毒重组体(Cantello等，1991；Sakaguchi等，1993；Parcells等，1994，1995；Schat等，1998；Anderson等，1998)。另外，必须使用原代细胞培养MDV-1(Payne)，导致分析必需的MDV-1基因几乎不可能，因为不能产生反式互补细胞系。
使用这种方法，小鼠和人巨细胞病毒(MCMV和HCMV；Messerle等，1997；Borst等，1999)，1型单纯疱疹病毒(HSV-1；Suter等，1998)，假狂犬病病毒(PrV；Smith等，1999，2000)和Epstein-Barr病毒(EBV；Delecluse等，1998)的基因组已经克隆为感染性BAC。
本研究的目的是提供快速和有效生产MDV-1重组体的基础，通过将完整的180kbp的基因组克隆入大肠杆菌中进行。在用克隆的MDV-1 BAC DNA转染CEF细胞后，易于回收感染性MDV-1，在CEF细胞中进行几轮细菌生长或系列增殖后，MDV-1 BAC仍是稳定的。
最后，因为在大肠杆菌中可以进行必需MDV-1基因的一步缺失，所述系统具有非常大的潜力，便于进一步分析必需的和非必需的MDV-1基因，及作为生产生物学安全的经修饰的活病毒和/或DNA疫苗的工具。
方法和材料病毒和细胞 将原代或次级鸡胚成纤维(CEF)细胞或鹌鹑肌(QM7)细胞保持在补加5-10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s改良的基本培养基(DMEM)中。MDV-1毒株584Ap80C是由Dr.RichardWitter惠赠，美国密歇根州东兰辛ADOL。毒株584Ap80C表示vv+毒株584A细胞培养物传代的一种无毒后代(Witter，1997)，并将其生长于前述原代或次级CEF细胞上(Osterrieder，1999)。针对基因组的不同区域，通过PCR和Southern印迹杂交测试QM7细胞没有MDV-1序列，之后将它们用于增殖MDV-1(Zelnik和Osterrieder，未公布)。如述作病毒生长曲线并略修改(Parcells等，1994)。简而言之，将100噬斑形成单位(p.f.u.)用于感染2×106个新鲜种植的CEF细胞。在感染后的不同时间(0，12，24，48，72，96，120小时)，将感染的细胞用胰蛋白酶消化并在新鲜的CEF细胞上滴定。确定噬斑的数目，结果是两次单独试验的平均值。
组成型表达MDV-1gB的QM7细胞系是通过用10μg pcMgB(图1)转染1×106个QM7细胞而获得的，pcMgB基于pcDNA3(Invitrogen)并含有在人巨细胞病毒立即早期启动子控制下的来自毒株Rispens CVI988的MDV-1gB基因。在存在1mg/ml G418的情况下选择含有pcMgB的QM7细胞，并使用抗gB单克隆抗体(mab)2K11(由Dr.Jean-Francois Vautherot惠赠，INRA，Tours，法国)鉴别表达gB的克隆。所得表达MDV-1gB的细胞系称为MgB1。
构建MDV-1BAC如前所述通过十二烷基硫酸钠-蛋白酶K提取法，从感染的细胞中纯化MDV-1 DNA(Morgan等，1990)。如下构建质粒pDS-pHA1。将MDV-1 US2基因任一侧的2.1和3.1kbp片段(图1)，通过聚合酶链反应(PCR)扩增，使用含有适当限制酶位点的标准引物(表1)，并将两个片段均克隆入pTZ18R(Pharmacia-Amersham)。含有在HCMV立即早期启动子控制下的Eco-gpt基因的BAC是从质粒pHA1(由Dr.M.Messerle惠赠，德国慕尼黑LMU；Messerle等，1997)中释放的，并将其插入质粒pDS中存在的2.1和3.1kbp片段中导入的PacI位点中(图1)。
将原代CEF细胞用2μg 584Ap80C DNA和10μg pDS-pHA1共同转染。在转染5天后，将细胞铺板于具有250μg/ml霉酚酸(MPA)，50μg/ml黄嘌呤和100μg/ml次黄嘌呤的原代CEF细胞中。重复MPA/黄嘌呤/次黄嘌呤选择，共4次。在4次选择后，在已经发生完全致细胞病变(cpe)后，从感染的细胞中制备病毒DNA，并将1μg感染的细胞DNA电穿孔入DHB10大肠杆菌细胞中。在含有30μg/ml氯霉素的琼脂平板上转染16小时后，开始检测菌落(Sambrook等，1989)。挑取单个的菌落，并根据标准碱性裂解方法从大肠杆菌中制备BAC DNA(Sambrook等，1989)。通过基于二氧化硅的亲和层析，使用可商购的试剂盒(Qiagen，Macherey & Nagel)，大规模制备BACDNA。选择3个MDV-1584Ap80C BAC克隆(BAC19，BAC20，BAC24)进行进一步分析。
诱变MDV-1BAC为在大肠杆菌中诱变克隆的MDV-1DNA，进行recE-催化的促进线性DNA片段之间同源重组的反应，称为E/T克隆(Zhang等，1998；Narayanan等，1999)。将携带recE，recT和噬菌体1gam基因的质粒pGETrec(由Dr.Panos Ioannou提供，澳大利亚墨尔本Murdoch学院)，转化入含有BAC20的DH10B细胞中(Narayanan等，1999)。在通过加入0.2％阿拉伯糖诱导recE，recT和gam后，如述制备电感受态细胞(Narayanan)。为缺失BAC20中的gB基因，将质粒pEGFP-N1(Clontech)的卡那霉素抗性基因(kanR)通过PCR扩增。所设计的引物含有与gB内所希望的缺失部位交界的50个核苷酸同源臂，及20个核苷酸以扩增kanR(表1)。将所得1.6kbp片段从琼脂糖凝胶(Qiagen)中纯化，并电穿孔入含有pGETrec的BAC20中。携带gam和kan基因的菌落在含有这两种抗生素的平板上鉴别(Narayanan等，1999)。
DNA分析 将BAC或病毒584Ap80C DNA用EcoRI，BamHI，BglII或StuI酶切，并在0.8％琼脂糖凝胶上分离。将DNA片段移至带正电荷的尼龙膜上(Pharmacia-Amersham)，使用洋地黄毒苷标记的BAC19 DNA或MDV-1毒株GA的各个BamHI片段(Fukuchi等，1991；Osterrieder，1999)进行Southern印迹杂交。
另外，制备来自质粒pcgB的gB特异性探针和携带kanR基因的探针，以分析gB-阴性MDV-1BAC。根据厂商指导(RocheBiochemicals)，使用CSPD TM进行DNA杂交体的化学发光检测。
间接免疫荧光 为进行间接免疫荧光分析(IIF)，将细胞生长于6孔或24孔平板上(Greiner)，或生长于玻璃盖片上，随后在指定处感染。在感染或转染后的不同时间，将细胞用90％丙酮固定，并如述精确进行IIF(Meindl和Osterrieder，1999)。通过荧光显微镜或聚焦激光扫描显微镜(CLSM)分析样品。所用的抗体是抗gB mab2K11，抗pp38 mab H19(由Dr.Lucy Lee提供，ADOL，East Lansing，MI)，或是来自用MDV-1感染鸡的恢复期血清(MDSI)。
结果构建和分析含有BAC的完整MDV-1基因组将1×106个原代CEF用1×104p.f.u.的MDV-1毒株感染，即将感染的细胞与未感染的细胞混合。在发生完全致细胞病变作用后，从感染的细胞中制备DNA，并将2μg病毒DNA与10μg pDS-pHA1质粒DNA一起转染入1×106个原代CEF细胞中。在转染后5天，将细胞与新鲜CEF一起种植，并用选择培养基覆盖。
将此程序共重复4次。最后，从能在存在MPA/黄嘌呤/次黄嘌呤情况下生长的重组MDV-1中分离DNA，并使用标记的pHA1作为探针进行Southern印迹分析。可以证实一部分病毒DNA含有插入的F质粒序列(数据未示出)。将1μg这种病毒DNA用于转化大肠杆菌DH10B细胞。将转化的细菌铺板于含有30μg/ml氯霉素的琼脂上，并挑取单个菌落。通过标准质粒制备方法提取细菌菌落的DNA(Sambrook等，1989)并在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。
一些细菌菌落示出含有高分子量的染色体外DNA，从中选择3个克隆(BAC19，BAC20和BAC24)进行进一步分析(图2)。为进一步定性分离的BAC克隆，将用BamHI或EcoRI酶切后的584Ap80C和BAC DNA，使用标记的BAC19 DNA作探针进行Southern印迹分析。当与亲代584Ap80C相比较时，可以证实BAC19，BAC20，和BAC24 DNA呈现几乎相同的限制酶片段模式(图3A和B)。然而，易于识别两个明显的例外。在所有分析的BAC克隆中，均没有584Ap80C DNA中存在的20kbp BamHI-A片段。取而代之，在BAC19，BAC20和BAC24的DNA中检测到大小为16和10kbp的片段(图3B)。这两个条带代表扩大的BamHI-A片段，其中通过插入F质粒和缺失US2序列，产生一个额外的BamHI位点(图1)。
在EcoRI-消化的BAC DNA中，观测到通过缺失US2基因产生的一个额外的5.8kbp条带(BAC序列)和大小略变化的片段(图1和图3B)。使用标记的质粒pDS或pHA1插入物作为探针，通过Southern印迹杂交进一步分析各种克隆中BAC序列的正确插入，在BamHI消化的或EcoRI-消化的DNA中观测到预期的反应模式。在BamHI-消化的BAC DNA中，16和10kbp BamHI片段与pDS探针特异性反应，而只有10kbp片段与衍生自质粒pHA1的探针反应(图1；图3C和D)。
在EcoRI-消化的BAC19，BAC20或BAC24 DNA中，4.3，2.8和1.7kbp的片段与pDS探针特异性反应，而5.8和1.7kbp的片段与pHA1探针特异性杂交(图1，图3C和D)。这些片段精确相当于在插入pHA1序列后推测的那些片段(图1)，而且得出结论F质粒序列正确插入所有分析的MDV-1 BAC中代替了US2 ORF。例外，在BamHI或EcoRI消化的DNA中，注意到BAC19，BAC20，和BAC24的条带模式中的一些变化，例如在BamHI消化的BAC19 DNA中的一个大约6.2kbp的额外条带，或在EcoRI消化的BAC20和BAC24的DNA中额外的条带(图2，3A和B)。为研究观测的各个限制酶片段的大小变化，与标记的BamHI-D片段进行杂交，因为在独特的长区域的末端重复和内部重复(TRL和IRL)中的大小变化是常见的。
通过Southern印迹示出在BamHI或EcoRI消化的BAC19，BAC20或BAC24的DNA中观测的额外的片段，确实得自TRL和IRL中的变化。在用BamHI消化的病毒584Ap80C DNA中用探针检测到两条不清晰的宽条带，其范围是大约9-15kbp和4-8kbp(分别相当于毒性MDV-1的BamHI-D和-H片段；图1)，在分析的所有BAC克隆中均观测到独特但不同的条带(图4)。不同BAC克隆的所有其它限制酶片段表现为与病毒584Ap80C DNA的那些片段是相同的。这可以通过使用一些其它标记的BamHI片段作探针而证实，包括BamHI-A，-B，-C和-I2片段(图4中举例示出的数据是针对BamHI-C探针的)。
从克隆的DNA中重构感染性MDV-1将BAC19，BAC20或BAC24的DNA转染入原代CEF中。在转染后3-7天，出现MDV-1特异性病毒噬斑，这通过使用抗MDV-1gB单克隆抗体通过IIF证实。然后将在转染各种BAC后拯救的MDV-1与新鲜CEF一起种植，并将噬斑大小与通过亲代584Ap80C诱导的那些噬斑相比较。如在感染后第2天染色的噬斑所示，检测到在重组的和亲代的病毒之间噬斑大小没有可感知的不同(图5A)。
为进一步定性在BAC感染后回收的MDV-1的生物学性质，将这些病毒的生长动力学与亲代584Ap80C相比较。在BAC情况中，将感染后5天回收的病毒用于感染种植于6孔平板上的新鲜CEF细胞(将50p.f.u.的病毒用于感染含有1×106个细胞的一个孔)。相似地，将50p.f.u.的584Ap80C以相同反式用于感染新鲜CEF。在感染后不同时间，收获病毒并通过将10倍病毒稀释液与新鲜CEF细胞一起种植而滴定。这些试验的结果示于图5B。
可以证实所有测试的MDV-1BAC均呈现与亲代584Ap80C几乎相同的生长特性(图5B)。在感染后72小时达到最大效价，并保持恒定直至在感染后120小时的观测期末。从噬斑大小和生长特性中，我们得出结论MDV-1BAC在体外的生物学性质与亲代毒株实际上是不能区别的。
为确定BAC衍生的病毒的稳定性，将BAC19和BAC20的BAC转染子代传代4次并制备病毒DNA。将病毒DNA用BamHI或EcoRI酶切，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，并移至尼龙膜上。使用pDS或pHA1探针进行杂交。用这两个探针分析，观测到如上述相似DNA片段，而且随着转染子代的系列传代，条带模式不改变(图6)。从这些结果中，我们总结出即使在CEF细胞中系列传代后，F质粒衍生的序列保持稳定插入在回收自各个MDV-1BAC克隆的584Ap80C基因组内。
然而，通过与BamHI-D片段杂交和PCR分析所示，132bp重复序列的可变性恢复，及在首次病毒传代后转染子代的BamHI或EcoRI酶切的DNA中观测到一条弥散的不清晰的反应条带(数据未示出)。
诱变BAC20和缺失gB编码序列在接下来的试验中，应用一种最近揭示的诱变BAC的方法，以从BAC20中除去2.8kbp gB基因的2.3kbp(图7)。在将质粒pGETrec(Narayanan)转化入含有BAC20的DH10B中后，用可以与MDV-1gB序列同源重组的引物扩增kanR基因(表1；图8)，并电穿孔入BAC20-pGETrec细胞中。将细菌铺板于含有氯霉素和卡那霉素的LB琼脂上，并提取双抗性菌落。在分离各个菌落的DNA后，对在gB基因内携带缺失的重组BAC20(20DgB)进行Southern印迹分析。在用BamHI，EcoRI，BglII或StuI酶切后，一种kanR和一种gB特异性探针检测到20DgB的片段，这与在将kanR抗性基因插入gB编码序列后的计算结果完全一致(图9)。如前所报道的，注意到赋予氨苄青霉素抗性的pGETrec易于从在没有抗生素情况下生长的大肠杆菌细胞中丧失(图9)。从这些结果我们得出结论gB开放读框几乎完全从20DgB中除去。
分析从20DgB中重构的gB阴性MDV-1因为gB是至今所分析的所有疱疹病毒生长所必需的(参见Pereira)，因此产生一种QM7细胞系，其表达在HCMV立即早期启动子控制下的MDV-1gB。间接免疫荧光分析表明实际上细胞系MgB1的每个细胞均组成型表达MDV-1gB，这通过使用单克隆抗体2K11或恢复期鸡血清(MDSI)表明(图10)。为分析BAC20和20DgB在各种细胞系中的生长，制备DNA并用于转染CEF，QM7或MgB1细胞。在转染后3-5天，在用BAC20转染的所有细胞中均观测到病毒噬斑(图10)。
然而，在20DgB DNA转染后，只在表达gB的MgB1细胞中观测到噬斑(图11)。在用20DgB转染的CEF和QM7细胞中，个别细胞表达早期pp38基因，这通过与单克隆抗体H19的反应表明(Lee等，但噬斑形成被抑制(图11))。gB是MDV-1在体外细胞之间传播所必需的这些结果，是通过将20DgB感染的MgB1细胞与CEF，QM7或新鲜的MgB1细胞一起种植证实的。在初次转染后示出，噬斑形成只是在与表达gB的细胞一起种植后观测到(表2)。从这些结果中总结出MDV-1gB是MDV-1在培养的细胞之间传播所必需的。
尽管Marek′s病病毒是鸡的一种重要病原体，在感染的动物中导致T细胞肿瘤和高死亡率，但关于在感染的裂解，潜伏或肿瘤时期各个基因和基因产物的功能了解的还很少。由于两种主要的原因极大地削弱了对MDV-1基因和基因产物的分析。首先，用MDV-1感染的培养的细胞不产生游离的感染性病毒，其次，MDV-1在培养细胞中的有效生长受到原代或次级鸡胚成纤维细胞的限制。
因此，使用常规同源重组诱变方法用于诱变其它α疱疹病毒亚科病毒是费力，费时的，而且还需要持续供给原代细胞。通过使用BAC技术的确便利了HSV和PrV的诱变，依赖于在真核细胞中同源重组的常规诱变方法是针对这两种病毒的一种标准方法，而且已经产生了许多突变的病毒。相反，针对诱变MDV-1，BAC克隆和诱变是一种主要的有益方法。一旦MDV-1基因组克隆为BAC并且可以稳定保持在大肠杆菌中，突变体的产生和对必需基因的分析应是相对容易的。事实上，可以将毒株584Ap80C的完整基因组克隆为感染性BAC。毒株584Ap80C是烈毒+(vv+)MDV-1毒株584A在CEF细胞上经过80次系列传代后的子代(Witter，1997)。对BAC19，BAC20和BAC24中存在的克隆的MDV-1基因组的分析表明限制酶模式的变化是显而易见的。
这种多样性可归因于BamHI-D和-H片段中的变化。已知在不同的MDV-1毒株中存在不同数目的132bp串联重复，而且在培养的细胞中系列传代后，所述重复数目提高(Maotani，Silva，Fukuchi)。例外，串联的132bp重复数目与丧失致瘤性相关，因为经证实在毒性毒株中这些单位是恒定数目的(Fukuchi等，1985；Bradley等，1989)，尽管近来对广泛使用的Rispens CVI 988疫苗毒株的研究表明，少量的132bp重复与毒性不直接相关。在MDV-1毒株584Ap80C的情况中，限制酶消化的病毒DNA与BamHI-D片段的杂交产生弥散的条带模式，表明病毒群中存在的重复数目是可变的。相反，用相同探针在每个BAC克隆中只鉴别一个强反应条带。然而，在用BamHI或EcoRI酶切后，反应条带的大小在BAC19，BAC20和BAC24之间是不同的，表明含有不同数目132bp重复的基因组已经克隆。这个结论通过定向132bp重复的PCR分析而证实。而用584Ap80C的DNA获得典型的梯形PCR产物(Becker等，1993)，在BAC19，BAC20或BAC24情况中，从克隆的病毒DNA中扩增出独特的条带。
因此总结出不同BAC克隆的可变限制酶模式得自各个克隆中存在的串联的132bp重复的不同数目，其不影响克隆的DNA的感染性，因为感染性病毒是在分离自每个不同BAC克隆的DNA转染后回收的。
在克隆完整的MDV-1基因组和检验克隆的MDV-1DNA的感染性之后，可以使用一种新近揭示的诱变系统缺失BAC20的gB编码序列，所述诱变系统中，一种线性DNA片段可以重组至细菌DNA中，而且其是通过recE催化的(Narayanan，muyrers)。所述诱变基于质粒pGETrec上存在的recE，recT和recB/C-抑制性λgam基因(Narayanan等，1999)。
首次用于操纵病毒基因组的所述系统的最大优势是(i)只需要30-50bp的同源臂定向缺失的特异性序列，即可以实现缺失任何开放读框而不需要克隆重组盒，(ii)所述方法是非常快速的，及(iii)赋予诱变系统和表达氨苄青霉素抗性的pGETrec载体，在没有氨苄青霉素的情况下迅速从细菌细胞中丧失。在将剔除gB的PCR产物电穿孔入含有pGETrec的BAC20细胞中后，获得10到30个camR和kanR双抗性菌落。将一个这种菌落称为20DgB-1，并选择进行进一步分析，因为在铺板于含有氯霉素和卡那霉素的琼脂上后，其立即丧失pGETrec。
Southern印迹分析表明在20DgB-1中成功缺失gB基因并插入kanR基因。在用20DgB-1转染CEF细胞后回收的MDV-1不能从感染的细胞中传播至邻近细胞，表明MDV-1gB与其它疱疹病毒中其相似物一样，是在细胞之间传播感染性所必需的。因为MDV-1在培养的细胞中是高度细胞伴随的，而且不在培养基中释放感染性病毒，因此不能研究MDV-1gB在病毒侵入方面的可能作用。产生的gB突变体是缺失基本基因的MDV-1的第一个实例，并表明尤其用于MDV-1情况中的BAC克隆和诱变系统的能力。使用MDV-1BAC和永久细胞系QM7，是彻底分析必需MDV-1基因的一种极好组合，所述永久细胞系QM7使MDV-1增殖而且与quail成纤维细胞QT35细胞系不同，其不携带MDV-1序列(Zelnik等，未公布)。例外，对各种Alphaherpesvirinae的基因功能的对比分析，现在可以包括MDV-1，并可以对一个病毒科的不太相关的成员如VZV或BHV-4进行研究。
根据本发明提供的克隆的基因组，提供了对其中遗传操纵非常受限的病毒的裂解的，潜伏的和产生肿瘤的基因的详细的进一步评估。
参考文献1.Anderson，A.S.，Parcells，M.S.，和R.W.Morgan.1998，糖蛋白D(US6)同系物不是Marek’s病病毒的致癌或水平传递所必需的，病毒学杂志722548-2553。
2.Becker，Y.，E.Tabor，Y.Asher，I.Davidson，M.Malkinson，和R.L.Witter.1993，在Marek’s病病毒1型(MDV-1)DNA中扩增的132bp重复的PCR检测可以作为引起病毒毒力减毒的关键基因组重排的指示，病毒基因7277-287。
3.Borst，E.M.，G.Hahn，U.H.Koszinowski，和M.Messerle.1999，克隆人巨细胞病毒(HCMV)基因组作为大肠杆菌中一个感染性细菌人工染色体一种构建HCMV突变体的新方法，病毒学杂志738320-8329。
4.Bradley，G.，M.Hayashi，G.Lancz，A.Tanaka，和M.Nonoyama.1989，Marek′s病病毒BamHI-H基因家族的结构推断的对肿瘤产生有重要意义的基因，病毒学杂志632534-2542。
5.Bradley，G.，G.Lancz，A.Tanaka，and M.Nonoyama.1989，Marek′s病病毒致瘤性丧失与在BamHI-H内转录的RNAs的截短相关，病毒学杂志634129-4235。
6.Brune，W.，C.Menard，U.Hobom，S.Odenbreit，M.Messerle，和U.H.Koszinowski.1999，通过直接转座子诱变快速鉴别必需的非必需的疱疹病毒基因，国家生物技术学17360-364。
7.Brunovskis，P.，and L.F.Velicer.1995，Marek′s病病毒(MDV)独特的短区域α疱疹病毒同系物，禽痘病毒同系物和MDV特异性基因，病毒学206324-38。
8.Cantello，J.L.，A.S.Anderson，A.Francesconi，和R.W.Morgan.1991，含有稳定插入MDV US2基因内的大肠杆菌lacZ基因的Marek’s病病毒(MDV)重组物的分离，病毒学杂志651584-1588。
9.Cui，Z.Z.，D.Yan，和L.F.Lee.1990，编码病毒特异性磷酸化多肽的Marek’s病病毒基因克隆和融合蛋白的血清学定性，病毒基因3309-322.
10.Delecluse，H.J.，T.Hilsendegen，D.Pich，R.Zeidler，和W.Hammerschmidt.1998，从原核细胞至人体细胞中增殖和回收完整的感染性Epstein-Barr病毒，美国科学院院报958245-8250。
11.Fuckuchi，K.，M.Sudo，Y.S.Lee，A.Tanaka，和M.Nonoyama.1984，Marek’s病病毒DNA的结构详细的限制酶图，病毒学杂志51102-109。
12.Lee，L.F.，P.Wu，D.Sui，D.Ren.J.Kamil，H.J.Kung，和R.L.Witter.2000，Marek’s病病毒的GA毒株的完整的独特的长序列和全部基因组组构，美国科学院院报976091-6096。
13.Maotani，K.，K.Kanamori，K.Ikuta，S.Ueda，S.Kato，和K.Hirai.1986，在体外系列传代期间Marek’s病病毒DNA的反向重复内串联重复的扩增，病毒学杂志58657-659。
14.Meindl，A.and N.Osterrieder.1999，马疱疹病毒1型Us2同系物编码一种必需的膜结合的毒粒成分，病毒学杂志73，3430-3437。
15.Messerle，M.，I.Crnkovic，W.Hammerschmidt，H.Ziegler，和U.H.Koszinowski.1997，疱疹病毒的克隆和诱变作为感染性细菌人工染色体，美国科学院院报9414759-14763。
16.Morgan，R.W.，J.L.Cantello，and C.H.McDermott.1990，用Marek’s病病毒DNA转染鸡胚成纤维细胞，鸟类疾病34345-351。
17.Muyrers，J.P.，Y.Zhang，G.Testa，和A.F.Stewart.1999，通过ET重组快速修改细菌仍染色体，核酸研究271555-1557。
18.Narayanan，K.，R.Williamson，Y.Zhang，A.F.Stewart，和P.A.Ioannou.1999，使用一种可诱导的同源重组系统，在大肠杆菌DH10B中有效和精确工程化一个200kb的β球蛋白人/细菌人工染色体，基因治疗6442-447。
19.Osterrieder，N.1999，血清型1Marek’s病病毒的UL10(糖蛋白M)和UL11同源物基因的系列和初步定性，Arch.Virol.144，1853-63。
20.Osterrieder，N.，A.Neubauer，C.Brandmüller，B.Braun，O.-R.Kaaden，和J.D.Baines.1996，马疱疹病毒1型糖蛋白gp21/22a，单纯疱疹病毒1型gM同系物，参与病毒侵袭和毒粒在细胞之间的传播，病毒学杂志704110-4115。
21.Parcells，M.S.，A.S.Anderson，J.L.Cantello，和R.W.Morgan.1994，Marek’s病病毒插入和缺失突变体的定性，所述突变体缺失US1(ICP22同系物)，US10和/或US2和邻近的短成分开放读框，病毒学杂志688239-8253。
22.Parcells，M.S.，A.S.Anderson，和R.W.Morgan.1994，缺失6个独特短区域基因的Marek’s病病毒致瘤性的保持力，病毒学杂志697888-7898。
23.Parcells，M.S.，A.S.Anderson，和R.W.Morgan.1994，在US6(gD)同源基因中插入lacZ的Marek’s病病毒突变体的定性，病毒基因95-13。
24.Payne，L.N.1985.Pathology.InLN Payne(ed)Marek′s Disease.KluwerAcademic Publishers，Hingham，MA，U.S.A.，pp.43-76。
25.Pereira，L.1994，疱疹病毒家族的糖蛋白B同源物的功能，感染性因素疾病39-28。
26.Ross，N.L.J.，Binns，M.M.，和J.Pastorek.1991，在Marek’s病病毒(毒株RB1B)的短独特节段中作图的5.5kbp的EcoRI片段中基因的DNA系列和组构，普通病毒学杂志72949-954。
27.Sakaguchi，M.，T.Urakawa，Y.Hirayama，N.Miki，M.Yamamoto，G.S.Zhu，和K.Hirai.1993，在病毒基因组的短独特区域内鉴别的Marek′s病病毒蛋白激酶基因不是病毒在细胞培养物中复制及在鸡中疫苗诱导的免疫性所必需的，病毒学195140-1488。
28.Sambrook，J.，D.F.Fritsch，and T.Maniatis.1989，分子克隆实验指导，冷泉港实验室出版社，冷泉港。
29.Schat，K.A.1985.Characteristics of the virus.InLN Payne(ed)Marek′sDisease.Kluwer Academic Publishers，Hingham，MA，U.S.A.，pp.77-112。
30.Scha，K.A.，B.J.van Iddekinge，H.Boerrigter，P.H.O′Connell，和G.Koch.1998，Marek′s病疱疹病毒的开放读框L1不是体外和体内病毒复制和潜伏所必需的，普通病毒学杂志79841-849。
31.Silva，R.F.，and R.L.Witter.1985，Marek′s病病毒DNA的基因组扩展是与在体外系列传代相关的，病毒学杂志54690-696。
32.Smith G.A.，和L.W.Enquist.1999，在大肠杆菌中假狂犬病毒(一种α疱疹病毒)的全长感染性克隆的构建和转座子诱变，病毒学杂志736405-6414。
33.Smith，G.A.，and L.W.Enquist.2000，一种半重组的细菌人工染色体及其分析疱疹病毒病原性的应用，美国科学院院报974873-4878。
34.Suter，M.，A.M.Lew，P.Grob，G.J.Adema，M.Ackermann，K.Shortman，和C.Fraefel.1999，BAC-VAC，一种新产生的(DNA)疫苗含有具有复制能力的包装缺陷的病毒基因组的一种细菌人工染色体(BAC)，其诱导抗单纯疱疹病毒1的保护性免疫应答，美国科学院院报9612697-12702。
35.van Iddekinge，B.J.，L.Stenzler，K.A.Schat，H.Boerrigter，和G.Koch.1999，Marek′s病病毒株CVI-988的基因组分析在反向的重复区域上细胞培养传代的作用，鸟类疾病43182-188。
36.van Regenmortel，M.H.V.，C.M.Fauquet，D.H.L.Bishop，E.Carstens，M.K.Estes，S.Lemon，J.Maniloff，M.A.Mayo，D.McGeoch，C.R.Pringle，和R.B.Wickner(eds).1999，病毒分类法，国际病毒分类委员会的第七次报告，学术出版社，纽约，San Diego。
37.Wagner，M.，S.Jonjic，U.H.Koszinowski，和M.Messerle.1999，在病毒重组期间从BAC克隆的疱疹病毒基因组中系统性载体序列，病毒学杂志737056-7060。
38.Witter，R.L.1985，Principles of vaccination.InL.N.Payne(ed)Marek′sDisease.Kluwer Academic Publishers，Hingham，MA，U.S.A.，pp.203-250。
39.Witter R.L.1997，Marek′s病病毒野生分离株的增加的毒力，鸟类疾病41149-163。
40.Witter，R.L.，J.M.Sharma，and A.M.Fadly.1980，不同的Marek’s病病毒分离株在接种的和未接种的鸡中的致病性，鸟类疾病24210-232。
41.Zhang，Y.，F.Buchholz，J.P.Muyrers，和A.F.Stewart.1998，在大肠杆菌中使用重组方法工程化DNA的一种新逻辑，Nature Genet.20123-128。
表1用于产生质粒pDS和pcMgB的引物和缺失gB引物序列 产生的片段/质粒MUS215′ CGTGTTTGAATACTGG-3′a2.1kbpDSMUS225′ CCGGTAGTCATTAGC-3′ 2.1kbpDSMUS235′ TTTGGCAAAACGGAATAGG-3′ 3.1kbpDSMUS245′ AATATGAATCTCTAAAACTTCTCGGC-3′ 3.1kbpDSgB-up5′ ATGCACTATTTTAGGCGG-3′ pcMgBgB-low 5′ TTACACAGCATCATCTTCTG-3′pcMgBgBkana 5′ 用于gB缺失的kanR基因 AAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGC-3′bgBkanb 5′ 用于gB缺失的kanR基因 ATTGATTGTCTCCTTCCGTGTTTCAGTTAGCCTC-3′a黑体字表示限制酶位点，斜体序列表示不存在于MDV-1序列中的额外碱基b下划线序列代表来自用于扩增kanr基因的pEGFP-N1的序列，黑体斜体序列表示用于同源重组和recE/T介导的gB缺失的gB序列附图简述图1产生携带完整MDV-1基因组的BAC的克隆程序示意图。示出的是根据Fukuchi等(11)所述，大约180kbp MDV-1基因组(A)和BamHI限制图(B)组构。示出了独特的短区域(Us)和位于Us中的ORFs(C和D)。将邻近Us2基因(灰色区)的一个2.1kbp和一个3.1kbp的片段通过PCR扩增，并克隆入质粒pTZ18R中，产生重组质粒pDS。将释放自重组质粒pHA1(15)的7.2kbp BAC载体插入pDS中，产生质粒pDS-pHA1(E)。根据(2)的限制酶位点是简写的B＝BamHI，E＝EcoRI，P＝PstI，Pa＝PacI，S＝SalI。
图2溴化乙锭染色的0.8％琼脂糖凝胶的数码扫描图。将分离自大肠杆菌DH10B克隆BAC19，BAC20和BAC24的DNA用BamHI或EcoRI酶切并分离。限制酶消化是在1kb梯两侧(Gibco-BRL)。*表示3个BAC克隆之间各个片段的额外条带或大小变化。
图3584Ap80C(V)，BAC19，BAC20和BAC24的DNA的数码扫描图，所述DNA是用BamHI或EcoRI酶切，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色(左侧)。在通过Southern印迹将DNA片段移至尼龙膜上之后，与释放自质粒pDS或pHA1的洋地黄毒苷标记的片段杂交。给出了大小标志(1kb梯，Gibco-BRL)和反应条带大小。
图4分析BAC19，BAC20和BAC24 DNA中大小变化的Southern印迹的数码扫描图。将毒株584Ap80C(V)和各个BAC的病毒DNA用BamHI或EcoRI酶切，并移至尼龙膜上。将所述膜用洋地黄毒苷标记的BAC19 DNA或标记的BamHI-C或BamHI-D片段温育。给出了大小标志(1kb梯，Gibco-BRL)。当与BamHI-D序列杂交时，在584Ap80C DNA情况中呈现不清晰的条带用括号表示。
图5(A)在BAC19，BAC20或BAC24 DNA转染后MDV-1噬斑的IIF分析。在转染后5天，将感染的细胞固定并使用抗gB单克隆抗体2K11进行间接免疫荧光测定。用抗小鼠Alexa TM 488(分子探针)检测接合的抗体，并用碘化丙锭将核复染。放大倍率＝400×。
(B)MDV-1毒株584A和各种BAC的生长曲线。在用100p.f.u.的584Ap80C感染CEF细胞，或者转染BAC19，BAC20或BAC24的子代后，通过与新鲜CEF细胞一起种植，在感染后指定时间确定病毒效价。在用单克隆抗体2K11免疫荧光染色后计数噬斑。
图6分析BAC载体序列在BAC19和BAC20转染后回收的病毒中的稳定性的Southern印迹数码扫描图。将转染子代传代4次，并在每次传代后分离病毒DNA。将病毒DNA用BamHI或EcoRI酶切，通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离并移至尼龙膜上。使用洋地黄毒苷标记的质粒pDS或pHA的片段进行Southern印迹杂交。缩写V＝584Ap80C，19＝BAC19，20＝BAC20。BAC19 DNA转染后第1-4次传代用数字1-4表示。BAC20 DNA转染后第4次传代分别加样于最后泳道中，并以4a表示。给出了反应片段的大小。*表示所述标记(1kb梯，Gibco-BRL)的起反应的1.6kb条带。
图7(A)诱变BAC20以除去gB编码序列的示意图。将编码L-阿拉伯糖可诱导的recE，recT，和gam基因的重组质粒pGETrec转化入含有BAC20的DH10B细胞中。在用引物从质粒pEGFP-N1(Clontech)中经PCR扩增kan基因后，将一个1.6kbp的PCR扩增子电穿孔入携带BAC20和pGETrec的DH10B细胞中。将细菌悬浮液铺板于含有30μg/ml卡那霉素和30μg/ml氯霉素的琼脂上。挑取双抗性集落并进行进一步分析。
(B)MDV-1中gB基因的位置和BAC 20DgB中存在的缺失的示意图。
图8溴化乙锭染色的0.8％琼脂糖凝胶的扫描图，所述凝胶含有用BamHI，EcoRI，BglI，或StuI酶切的及通过0.8％琼脂糖凝胶电泳分离的BAC20和20DgB DNA(左侧)。将DNA片段移至尼龙膜并与洋地黄毒苷标记的kan或gB特异性探针杂交。标示了起反应的DNA片段的大小。缩写B＝BamHI，E＝EcoRI，Bg＝BglI，S＝Stul。
图9组成型表达MDV-1gB的MgB1细胞的聚焦激光扫描分析。将MgB1或QM7细胞种植于盖玻片上并用抗gB单克隆抗体2K11或恢复期鸡血清MDSI温育。二级抗体是抗小鼠或抗鸡IgG AlexaTM488缀合物(分子探针)。用碘化丙锭将核复染。Bar表示10μm。
图10在用BAC20(上面)或20DgB(下面)转染MgB1，QM7 or CEF细胞后的IIF分析。在转染后5天，将细胞用丙酮固定并用抗pp38单克隆抗体H19温育。二级抗体是抗小鼠IgG AlexaTM488(分子探针)。尽管用BAC20 DNA转染后在所有细胞系上均观测到MDV-1噬斑，但在用20DgB转染的MgB1细胞上只观测到病毒噬斑。在QM7和CEF细胞上只观测到单个感染的细胞(箭头所指)。放大倍数＝400×。
权利要求
1.一种抗由基本上为宿主细胞伴随性疱疹病毒所致感染的疫苗，所述疫苗包含衍生自所述疱疹病毒的重组基因组，所述基因组使得可以进行基本上不含所述宿主细胞的重组。
2.权利要求1的疫苗，所述基因组在所述疱疹病毒在宿主细胞中复制和/或传播所必需的一个基因中包含一种功能性缺失。
3.权利要求1或2的疫苗，所述基因组至少包含一种核酸，所述核酸编码能激发抗所述疱疹病毒对个体的感染的免疫应答的抗原性物质。
4.权利要求1-3任一项的疫苗，所述基因组在激发特异于所述疱疹病毒的标记免疫应答所必需的一个基因中包含一种功能性缺失，使得可以区分用所述疫苗接种的个体和用所述基本上细胞伴随疱疹病毒感染的个体。
5.权利要求1-4任一项的疫苗，所述基因组至少包含一种核酸，所述核酸编码能调节一种编码能激发抗所述疱疹病毒对个体的感染的免疫应答的一种抗原性物质的核酸的转录和/或翻译的蛋白质物质。
6.权利要求1-5任一项的疫苗，其中所述基因组包含衍生自所述疱疹病毒的基本上全长的拷贝。
7.上述任一权利要求的疫苗，还具有至少编码一种额外病原体的抗原性物质的核酸。
8.上述任一权利要求的疫苗，其中所述疱疹病毒包含Marek′s病病毒。
9.权利要求8的疫苗，其中所述Marek′s病病毒包含血清型1。
10.权利要求8或9的疫苗，其中所述Marek′s病病毒衍生自一种毒性、烈毒性或烈毒+野生病毒。
11.一种衍生自基本上为宿主细胞伴随性疱疹病毒的重组病毒基因组，所述基因组使得可以进行基本上不含所述宿主细胞的重组。
12.权利要求11的基因组，其至少包含一种复制型小基因组。
13.权利要求11的基因组，其中所述基因组包含衍生自所述疱疹病毒的基本上全长的拷贝。
14.权利要求11-13任一项的基因组在制备一种抗基本上为宿主细胞伴随性疱疹病毒感染所致疾病的疫苗中的应用。
15.一种限制个体患有基本上为宿主细胞伴随性疱疹病毒感染所致疾病风险的方法，包括给予所述个体权利要求1-10任一项的疫苗或权利要求11-13任一项的基因组。
16.权利要求15的方法，其中所述个体是鸟。
全文摘要
本发明涉及所谓的宿主细胞伴随疱疹病毒领域，如家禽的Marek′s病病毒(MDV)和人类的水痘—带状疱疹病毒(VZV)，还涉及抗这些病毒所致疾病的接种。本发明提供了一种抗宿主细胞伴随疱疹病毒感染的疫苗，其包含一种衍生自所述疱疹病毒的重组病毒基因组，所述基因组使得可以进行基本上不含所述宿主细胞的重组。
文档编号A61K39/255GK1503843SQ01816795
公开日2004年6月9日 申请日期2001年8月1日 优先权日2000年8月3日
发明者弗兰克·费勒, 克劳斯·奥斯泰里德尔, 奥斯泰里德尔, 弗兰克 费勒 申请人:洛曼动物健康两合公司