专利名称：抗黄瓜黄脉病毒的甜瓜种植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗黄瓜黄脉病毒(CVYV)的甜瓜种棺物,和衍牛的棺物部分。本发明进 一步涉及生产所述植物的方法，及通过所述方法获得的抗CVYV的植物，和从所述抗CVYV植 物获得的植物部分。
背景技术：
CYVY为Potyviridae科番薯属(Ipomovirus)的病毒。它是一个相当不稳定的病 毒，有多个杆状的颗粒，一般长为740-800nm、宽为15-18nm。据知该CVYV的病毒核酸包括 双链RNA。该病毒的宿主范围有限,宿主主要限于葫芦科棺物。该科包括重要的经济作物如 黄瓜，南瓜类(包括南瓜)、甜瓜类和西瓜。一般来讲，尽管CVYV感染是黄瓜产量的一个难 题，南瓜、西葫芦、西瓜和甜瓜的产量也会受影响。CVYV 一般是由白粉虱传播，感染CVYV的甜i属植物(甜瓜)会出现叶脉变黄、或 叶脉透明并阻碍植物的生长从而导致产量下降。CVYV感染也可以导致植物的死亡。因此，当植物被感染时，CVYV可以对作物造成灾难性的影响。通过例如在无白粉 虱的环境下培育种子，或使用如杀虫剂处理这样的方法预防感染一般是费用高和/或对环 境不利。此外，这些方法并不能总是提供令人满意的结果。尽管进行过多次寻找抗CVYV的尝试，但至今尚未有关于抗CVYV的甜瓜种棺 物的报道。有可抵抗CVYV的其它黄瓜属棺物的报道，如C. africanus, C. dipsaceus和 C. prophetarum (Nieto et al. BMC Plant BiologH2007) 7 :34)。本发明的目的是提供抗 CVYV的甜瓜种棺物。
发明内容
本发明的目的是提供一种MJi种植物，该植物中的基因组中含有一个遗传成 分，所述遗传成分包含一抗黄瓜黄脉病毒(CVYV)的数量性状基因位点toTL)，或者其 抗CVYV的部分，其至少与一个分子标记基因地连接，在此所述的标记是选自包含E13/ M48-259. 69-P2(扩增引物 SEQ ID Nos 1 和 2，迁移率 259460bp)，E16/M48-377. 36-P2 (扩 增引物 SEQ ID Nos :3 和 4，迁移率 377-378bp)，E13/M48-261. 30-P2(扩增引物 SEQ ID Nos 5 和 6，迁移率和 E^/M62_076. 8_P2(扩增引物 SEQ ID NOs 7 和 8，迁移 率76-77bp)的组中，并且，其所述的植物对CVYV有抗性。根据本发明，术语“抗CVYV的”和“CVYV抗性”是指与非抗性植物例如在相似的环 境条件和病虫的压力下易感染的植物相比，植物在正常病原体的压力下，限制病毒生长和 发育的能力。抗性和易感染植物的区别能够通过例如机械接种的方法确定。为此，一种CVYV接 种混合物，是在磷酸缓冲液(KH2P04pH = 7. 0)中研磨IOg感染CVYV的新鲜甜瓜(C. sativus LJ叶子制得。接着，向混合物中添加活性炭和碳化硅粉末。在接种前，使甜瓜幼苗沾上碳化硅。在此术语“QTL”用于领域识别方法中。术语“抗CVYV的QTL”指的是定位于甜瓜 的一个特定染色的区域，该区域与至少一个编码为抗CVYV的基因或至少一个调节区如一 个可控制涉及CVYV抗性的的一个或多个基因表达的染色体区连接。QTL可以例如为包含其产物具有遗传抗性的一个或多个基因。可选择地，QTL可以 例如为包含调节基因或序列，其产物能影响植物的基因组上其他基因位点上的基因表达， 从而具有CVYV抗性。根据本发明的内容，术语“分子标记”指的是一种指示剂，用于使各核苷酸序列本 质的区别可见的方法中。这些指示剂的例子有限制性片段长度多态性(RFLP)标记、扩增 片段长度多态性(AFLP)标记、单核苷酸多态性(SNPs)、插入突变、小随体标记、特异序列扩 增区域(SCARs)、切割的扩增产物多态性序列(CAPQ标记、或同工酶标记、或本发明所定义 的一种特定基因和染色体定位的标记联合体。在此所说的“连接QTL的分子标记”是指SNPs、插入突变及更多惯用的AFLP标记 或用于本领域的任何类型标记。使用分子标记检测本发明的抗黄瓜黄脉病毒(CVYV)的数量性状遗传位点OiTL)， 或者CVYV抗性的部分的最佳方法是扩增片段长度多态性(AFLP)法。AFLP是一种以聚合酶 链反应(PC 技术为基础的遗传指纹技术，该技术是在90年代初由荷兰的Keygene N. V.， Wageningen开发出来的。在AFLP方法中，先用用限制性内切酶切割基因组DNA，接着把互补的双链接头与 限制性片断末端相连，然后使用互补于接头和限制位点的片段的引物对，对一个限制性片 断的亚型进行扩增。使得片段可见，迁移率或片段大小通过预测其相对于标准DNA带型的 分子量(bp)来测定。这个可以在例如变性聚丙烯酰胺凝胶中通过放射自显影方法或荧光 方法中做到(Vos et al. Nucleic Acids Res. 199523(21) :4407)。一般来讲，上述的AFLP方法可以产生大量的不同大小的核酸扩增片段。通过对比 从例如易感植物和抗性植物获得的核酸扩增片段，表明一个特殊的数量性状遗传位点的存 在和分离的核酸扩增片段被鉴别出，这样被识别区分的扩增片段常被作为一种特殊表型的 标记，例如抗性表型。本发明人意外的发现，在基因组中包含标记E13/M48-259. 69-P2 (扩增引物SEQ ID Nos 1 和 2，迁移率 259-260bp)，E16/M48-377. 36_P2(扩增引物 SEQ ID Nos 3 和 4，迁移 率 377-378bp)，Ε13/Μ48461.30-Ρ2(扩增引物 SEQ ID Nos :5 和 6，迁移率和 E26/M62-076. 8-P2(扩增引物SEQ ID NOs :7和8，迁移率76_77bp)的植物都有抗黄瓜黄脉 病毒(CVYV)的表型，而缺少这些标记的植物则为黄瓜黄脉病毒(CVYV)的易感表型。因此， 该标记遗传地连接到可识别的CVYV抗性的遗传成分。根据本发明优选的实施例，连接到当前抗性数量性状遗传位点的标记，是选 自包含 E16/M48-377. 36-P2 (扩增引物 SEQ ID Nos :3 和 4，迁移率 377_378bp)，E13/ M48-261. 30-P2(扩增引物 SEQ ID Nos :5 和 6，迁移率和似6/M62-076. 8-P2 (扩 增引物SEQ ID NOs 7和8，迁移率76_77bp)的组。更优选地，连接到本发明的抗性QTL的标记为E13/M48461. 30_P2(扩增引物SEQ ID Nos 5 和 6，迁移率 261-262bp) ·
本发明特别优选的方案为，抗CVYV的QTL，或它的部分，是源自甜瓜当地品种 Cuc6491(编号为 NCIMB 41582).在此所述甜瓜Cuc6491可用于表示被识别的抗CVYV的QTL的来源，而且包含该植 物可从任何技术人员熟知的任何公开的收集和保藏机构获得，以及从而得到的抗CVYV的 衍生物。随后，所述的抗性已被引入到显1种植物中。本发明发现可以提供一种具有完全 抗性的植物，其从Cuc6491 (编号为NCIMB 41582)确定的抗性标记是已稳定混合到甜瓜植 物的基因组中，且无坏死症状。一旦接种CVYV，包含适当的Cuc6491(编号为NCIMB 41582) 片段的甜瓜植物，与易感对照植物相反，缺乏典型的CVYV花斑病症状。本发明因此也涉及一种甜瓜种植物，所述植物包含一种遗传成分，例如，一种基因 渗入片段，其包含一个抗CVYV的QTL或一个抗CVYV的部分，所述植物对CVYV有抗性。在 一个具体实施例中，本发明的抗CVYY植物不是甜瓜Cuc6491 (编号为NCIMB 41582)。在此所述甜瓜Cuc6491 (编号为NCIMB 41582)可用于表示抗CVYV的QTL的来源， 而且该植物可从任何技术人员熟知的任何公开的收集和保藏机构中获得，正如从而得到的 抗CVYV的衍生物本发明进一步涉及到衍生自所述的抗CVYV甜瓜种植物的植物部分。该植物部分 可以是甜瓜植物的任何一个组成部分，包括单个细胞和细胞组织例如在植物中是完整的的 植物细胞，甜瓜植物可再生的细胞团和组织。植物的部分包括，但不限于例如来自于花粉， 胚珠，叶，胚，根，根尖，花药，花，果，茎芽和种子的单个细胞和组织；和花粉，胚珠，叶片，胚， 根，根尖，花药，花，果，茎，苗，接穗，根茎，种子，原生质体，愈伤组织等等。优选的，该植物部 分是种子或果实。本发明进一步涉及到获得一个抗CVYV甜瓜种植物的方法，包括引入一个遗传 成分到所述植物的基因组中，该遗传成分包含一个抗黄瓜黄脉病毒的数量性状遗传位点 (QTL)，或抗黄瓜黄脉病毒的部分，其与至少一个分子标记遗传地连接，在此所述的分子标 记选自包括 E13/M48-259. 69-P2(扩增引物 SEQ ID Nos 1 和 2，迁移率 259460bp)，E16/ M48-377. 36-P2(扩增引物 SEQ ID Nos :3 和 4，迁移率 377_378bp)，E13/M48461. 30-P2 (扩 增引物SEQ ID Nos :5和6，迁移率和似6/M62-076. 8-P2(扩增引物SEQ ID NOs 7和8，迁移率76-77bp)的组，。根据本发明的方法，标记优选自包括E16/M48-377. 36_P2(扩增引物SEQ ID Nos 3 和 4，迁移率 377-378bp)，和 E13/M48-261. 30_P2(扩增引物 SEQ ID Nos 5 和 6，迁移率 261-262bp)的组，尤其优选的是，该标记是E13/M48461. 30-P2(扩增引物SEQ ID Nos :5和 6，迁移率 261-262bp)。特别优选的实施方式是，抗CVYV的QTL或所述的部分是衍生自编号为NCIMB 41582 的甜瓜 Cuc6491。本发明的方法的另一个优选具体实施方式
为，植物不是编号为NCIMB 41582的甜 瓜 Cuc6491。根据本发明，遗传成分例如包含本发明的QTL或抗CVYV的部分的核苷酸(最好是 DNA)被用于生产抗CVYV的甜瓜植物。因此，本发明提供QTL，或其部分的用途，用于生产抗 CVYV的甜瓜植物，所述用途涉及在一个易感CVYV的甜瓜植物受体中引种一个含所述QTL的核苷酸序列。所述核苷酸序列可来自一个适当的抗CVYV的供体甜瓜植物。优选的，从甜瓜Cuc6491 (编号为NCIMB 41582)获得包含抗CVYV的QTL或其部 分的遗传成分(核苷酸片段)。其他相关的甜瓜种，出现CVYV抗性和包含一个或多个编码 CVYV抗性的基因，可以使用如本发明所述该材料可以被识别一样作为CVYV抗性的供体植 物。将遗传成分例如一个(单独的)包含本发明QTL的核苷酸或者抗性的部分引入到 一个甜瓜植物中，可以通过技术人员知道的任何方法实行。更好是采用杂交。在一个具体 的方式中，本发明的方法可以包含甜瓜Cuc6491或者它的抗CVYV衍生物与一个易感CVYV 甜瓜植物的杂交步骤；收集杂交的种子，种植所述种子来生产Fl子代植物；所述的FI子代 植物自交或与供体或受体亲代回交，去生产F2子二代种子；种植所述F2种子去生产F2子 二代植物；测定在至少一个所述F2子代植物的基因组中抗CVYV的QTL存在度。在此的QTL 存在度是通过检测所述在至少一个F2子代植物的DNA中连接所述QTL标记的存在度来确 定。所述的遗传成分还可以是通过转变、原生质融合、重双单倍体技术或胚胎拯救或 者任何其他核苷酸输送系统引入，接着随机的选择包含QTL并表现CVYV抗性的子代植物。 用转基因的方法转移，一个包含本发明的抗CVYV的QTL或其抗CVYV的部分的核苷酸序列， 可以使用本领域已知的方法从供体植物中分离出来，并且在此被分离出来的核苷酸序列可 以通过基因方法例如通过一个载体，在一个配子中，或在任何其它适合的传递元件，例如一 个表面有所述核苷酸序列的冲击粒子而转移到受体植物，。植物的转变一般包含一个在植物细胞中有功能的表达载体的构成。在本发明中， 这样的载体包含一个由本发明的抗CVYV的QTL或其抗CVYV的部分组成的核苷酸序列，该 载体可以包含一个抗CVYV基因，该基因是在控制之下的或有效的连接到一个调控元件，例 如一个启动基因。该表达载体可以包含一个或多个这样的可手术连接的基因/调控元件的 联合体，提供包含在联合体中的至少一个基因用于抗CVYV编码。在一种使用本领域公知的 转化方法，例如农杆菌属转化系统，生产抗CVYV的转基因植物的方法中，载体(们)可以是 质粒的形式，并可被单独或与其它质粒结合使用。根据本发明，术语“引入”或“渐渗现象”是指一个天然和人工的过程，借此，基因， 或一个种、变种或栽培变种的核苷酸被转移到另一种、变种或栽培变种的基因组中，例如通 过杂交这些不同种。这个过程可以随机的通过回交亲本完成。本发明进一步还涉及通过上述描述的方法获得的抗CVYV的甜瓜种植物，和从所 述植物得到的任何植物部分，例如，但不限于，种子和/或果实。所述的抗CVYV甜瓜植物， 或者其部分因此在其基因组中包含与CVYV抗性相关的QTL，或者它的抗CVYV的部分，鉴于 上述已经定义，来自甜瓜Cuc6491 (编号为NCIMB 41582)，或者它的抗CVYV衍生物的所述 的QTL或所述的抗CVYV的部分是不在它的天然遗传背景中。这种植物可以通过本领域已 知的各种方法，转基因或非转基因而获得。
具体实施例方式在以下的例子中进一步说明了本发明，并不是以任何方式限制本发明的范围。实施例1
甜瓜中抗CVYV的QTL的定位介绍有300个个体的F2个体群，是由易感CVYV的Galia系ML100_PI和CVYV抗性系 Cuc6491(编号为NCIMB 41582)杂交构成的。在两个植物的生长阶段，所有300个植物的的 表型是抗CVYV。随后，使用QTL定位的方式，鉴定出连接到控制CVYV抗性的QTLs的标记。材料与方法获得300个ML100 X Cuc6491 (编号为NCIMB 41582)的F2子二代个体叶子和来
自亲本品系的叶子。用于QTL分析的表型的数据包括每一个子二代植物的抗性水平。在一个位点先后 两天(2007年5月和6月)测定表型。两个表型的等级区别如下R =抗性S=易感性结果对两个亲本品系ML 100和Cuc6491 (编号为NCIMB 41582)进行筛选，筛选出48 个来自EcoRI/Msel基质的AFLP引物组合(PCs).表1中列有每个PC的标记数量。表1:在MLlOOx Cuc6491 (编号为NCIMB 41582)的基因图中每个PC被记分和定 位的标记数
权利要求
1. 一种Miilt植物，在其染色体中包含一个遗传成分，所述的遗传成分包含一种抗黄 瓜黄脉病毒(CVYV)的数量性状遗传位点toTL)，或其抗CVYV的部分，其与至少一个分子标 记基因地连接，在此所述的分子标记选自包括E13/M48-259.69-P2(扩增引物SEQ ID Nos 1 和 2，迁移率 259-260bp)，E16/M48-377. 36_P2(扩增引物 SEQ ID Nos 3 和 4，迁移率 377-378bp)，Ε13/Μ48461. 30-P2(扩增引物 SEQ ID Nos :5 和 6，迁移率和 E26/M62-076. 8-P2(扩增引物SEQ ID NOs :7和8，迁移率76_77bp)的组，并在此所述的植物对 CVYV有抵抗力，且无坏死症状。
2.根据权利要求1所述的植物，其特征在于所述的标记选自包括E16/ M48-377. 36-P2 (扩增引物 SEQ ID Nos 3 和 4，迁移率 377_378bp)和 E13/ M48-261. 30-P2(扩增引物 SEQ ID Nos 5 和 6，迁移率 261-262bp)的组。
3.根据权利要求1或2所述植物，其特征在于所述标记为E13/M48461.30-P2 (扩增 引物 SEQ ID Nos :5 和 6，迁移率 。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的植物，其特征在于所述的抗CVYV的QTL，或抗 CVYV的部分，是来自编号为NCIMB 41582的甜瓜Cuc6491。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的植物，其特征在于所述的植物不是编号为NCIMB 41582 的甜瓜 Cuc6491。
6.来自权利要求1-5中任一项所述的植物的植物部分。
7.根据权利要求6所述的植物部分，其特征在于所述植物部分是种子或果实。
8.生产抗CVYV的甜瓜种植物的方法，包括引入一个遗传成分到所述植物的基因组 中，，该遗传成分含有抗黄瓜黄脉病毒(CVYV)的QTL，或者抗CVYV的部分，其至少与一 个分子标记遗传地连接，所述标记选自包括E13/M48-259.69-P2(扩增引物SEQ ID Nos 1 和 2，迁移率 259-260bp)，E16/M48-377. 36_P2(扩增引物 SEQ ID Nos 3 和 4，迁移率 377-378bp)，E13/M48-261. 30-P2(扩增引物 SEQ ID Nos :5 和 6，迁移率和似6/ M62-076. 8-P2(扩增引物 SEQ ID NOs :7 和 8，迁移率 76_77bp)的组。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述标记选自包括E16/ M48-377. 36-P2 (扩增引物 SEQ ID Nos :3 和 4，迁移率 377_378bp)，和 E13/ M48-261. 30-P2(扩增引物 SEQ ID Nos :5 和 6，迁移率的组。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于所述标记为E13/M48461.30_P2(扩 增引物SEQ ID Nos :5和6，迁移率。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其特征在于所述抗CVYV的QTL或抗 CVYV的部分，是来自编号为NCIMB 41582的甜瓜Cuc6491。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其特征在于所述植物不是编号为NCIMB 41582 的甜瓜 Cuc6491。
13.抗黄瓜黄脉病毒的甜瓜种棺物,可以根据权利要求8-12所述的任一方法获得。
14.使用至少一分子标记用于获得一个抗黄瓜黄脉病毒的Miffi植物的应用，所述标 记选自包括 E13/M48-259. 69-P2(扩增引物 SEQ ID Nos :1 和 2，迁移率 259460bp)，E16/ M48-377. 36-P2(扩增引物 SEQ ID Nos :3 和 4，迁移率 377_378bp)，Ε13/Μ48461. 30-P2 (扩 增引物SEQ ID Nos :5和6，迁移率和似6/M62-076. 8_P2 (扩增引物SEQ ID NOs 7和8，迁移率76-77bp)的组。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于所述标记选自包括E16/ M48-377. 36-P2 (扩增引物 SEQ ID Nos :3 和 4，迁移率 377_378bp)，和 E13/ M48-261. 30-P2(扩增引物 SEQ ID Nos :5 和 6，迁移率的组。
16.根据权利要求14或15所述的应用，其特征在于所述标记为E13/ M48-261. 30-P2(扩增引物 SEQ ID Nos 5 和 6，迁移率 261-262bp)。
17.抗黄瓜黄脉病毒(CVYV)的数量性状遗传位点WTL)，或其抗黄瓜黄脉病毒的部分， 遗传地连接至少一个分子标记，所述标记选自包括E13/M48-259.69-P2(扩增引物SEQ ID Nos :1 和 2，迁移率 259460bp)，E16/M48-377. 36-P2 (扩增引物 SEQ ID Nos :3 禾口 4，迁移 率 377-378bp)，E13/M48-261. 30-P2 (扩增引物 SEQ ID Nos :5 和 6，迁移率和 E26/M62-076. 8_P2(扩增引物 SEQ ID NOs 7 和 8，迁移率 76_77bp)的组。
全文摘要
本发明涉及抗黄瓜黄脉病毒(CVYV)的甜瓜种植物，及其衍生的各部分，且无坏死症状。本发明进一步涉及到生产所述植物的方法，以及根据所述方法获得的抗黄瓜黄脉病毒的植物，及衍生自所述具有抗黄瓜黄脉病毒植物的植物部分。尤其是，本发明涉及到一种特殊的甜瓜种植物，在其染色体中包含一种遗传成分，所述的遗传成分包含抗黄瓜黄脉病毒(CVYV)的数量性状遗传位点(QTL)，或者其抗CVYV的部分，因此，其基因地连接至少一个分子标记，所述的标记选自包括E13/M48-259.69-P2，E16/M48-377.36-P2，E13/M48-261.30-P2和E26/M62-076.8-P2的组。
文档编号C12Q1/68GK102149274SQ200880130968
公开日2011年8月10日 申请日期2008年9月2日 优先权日2008年9月2日
发明者南内·马希尔·法贝尔, 威尔斯彻·卡西斯, 安娜·贝伦·查帕塔·巴雷拉, 特雷莎·玛莉亚·蒙托罗·蓬索达, 雅各布·皮特·马泽利乌 申请人:安莎种子公司