专利名称：制备嗜中性粒细胞抑制因子的方法
技术领域：
本申请是美国专利申请系列号09/644,942(2000年8月23日提交)的部分继续申请，其公开内容在此引入以供参考。
本发明涉及一种制备嗜中性抑制因子(NIF)的方法，包括在无动物成分的生长培养基中培养哺乳动物细胞。本发明可用于大规模制备NIF。另外，本发明提供了一种制备重组蛋白质的通用方法，包括在无动物成分的培养基中培养哺乳动物细胞，特别是CHO细胞，它们表达外源性重组蛋白。
背景技术：
和引言NIF是作为嗜中性粒细胞活性的特异性抑制剂的蛋白质。嗜中性粒细胞是被称为粒细胞的细胞类型组的一员，粒细胞是细胞的白细胞家族的一个亚类。
嗜中性粒细胞在宿主抵抗微生物攻击的防御系统中是一个重要的组成。在对损伤位点细胞释放的可溶性炎症介体的应答中，嗜中性粒细胞从血流进入受损组织区域，当活化时，通过吞噬作用和/或释放细胞毒性化合物，例如氧化剂、蛋白酶和细胞因子杀死外源细胞。虽然嗜中性粒细胞的作用对于抵抗感染是重要的，但也知道它们损伤宿主组织。嗜中性粒细胞会引起异常炎症应答，从而会在血管壁或未损伤组织中释放毒性物质，导致显著的组织损伤。另外，粘附在毛细血管壁或在微静脉中聚集的嗜中性粒细胞可产生局部缺血的组织损伤。
异常炎症应答与各种临床疾病的发病机制有关，包括成人呼吸窘迫综合征(ARDS)；心肌梗塞后的局部缺血-再灌注损伤、休克、中风和器官移植；急性和慢性同种异体移植排斥；脉管炎；败血症；类风湿性关节炎；头部创伤；和炎症性皮肤疾病。Harlan等，Immunol.Rev.1145(1990)。
已报道NIF抑制的特别活性之一是嗜中性粒细胞对血管内皮细胞的粘附。
用重组方法制备了从钩虫和相关物种，特别是犬钩虫(Ancylostoma caninum)中分离的某些NIF，Moyle等，J.Biol.Chem.26910008-15(1994)。当从寄生虫中分离时，NIF是糖蛋白。报道了某些表达系统产生的重组NIF，它们显示翻译后糖基化和唾液酸化。
已报道NIF抑制嗜中性粒细胞活性的其它方面，包括过氧化氢的释放，超氧化阴离子的释放，髓过氧化物酶的释放，弹性蛋白酶的释放，同型嗜中性粒细胞聚集，对弹性表面的粘附，对血管内皮细胞的粘附，趋化作用，穿过内皮细胞单层迁移和吞噬作用。特别是NIF在大鼠中风的重灌注模型中显示了有效减少梗塞体积的作用。Jiang等，Ann.Neurology，38935-942(1995)；Jiang等，Brain Res.，78825-34(1998)。
在美国专利号5,919,900，1999年7月6日提交，美国专利号5,747,296，1998年5月5日提交和美国专利号5,789,178，1998年8月4日提交中更详细描述了一些嗜中性粒细胞抑制因子和从天然来源分离它们，以及通过重组方法克隆它们的方法。这些专利文件在此完整引入以供参考。
迄今，在含有牛血清清蛋白的生长培养基中培养了表达NIF的细胞。见例如美国专利号5,919,900。
作为一般事件，培养表达重组蛋白质的细胞最通常是在含有动物衍生的血清，或动物提取的蛋白质的培养基中进行的。然而，由于对使用动物成分，特别是对于病原体对牛产品的污染，包括对爆发牛海绵状脑病(BSE)的生物的污染愈来愈关注，需要一种没有动物成分，例如血清和蛋白质的生长培养基。在美国专利号5,122,469中，描述了无血清培养基。然而，无血清培养基常常不对细胞生长、蛋白质生产和翻译后修饰进行优化。
本发明提供了无动物血清和无动物蛋白质的培养基，以及用所述无血清和无蛋白质的培养基制备NIF，以提供高产量的NIF的方法。
发明简述本发明针对一种制备嗜中性粒细胞抑制因子(NIF)的方法，包括步骤在无动物成分的生长培养基中培养表达NIF的细胞系。优选本发明产生的NIF是一种257个氨基酸的蛋白质，成熟NIF-1FL(也称为“NIF1”)(SEQ ID NO3)。如此产生的NIF被糖基化，并具有约38.3-64.1kDa的相对分子量。聚糖结构通常是分枝的，可用唾液酸残基加帽。糖基化程度可变，但优选产生的NIF具有一、二、三和四天线聚糖结构。更优选产生的NIF约5-25％一唾液酸化，约10-30％二唾液酸化，约15-35％三唾液酸化，约15-45％四唾液酸化和约1-20％非唾液酸化。
根据本发明的优选方面，表达NIF的细胞系是中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞系，它含有NIF基因，更优选是非锚定依赖的细胞系。
根据本发明的最优选方面，细胞系是CHO-K1细胞系(ATCC CCL-61)，通过用表达NIF1基因的谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺亚胺共扩增载体pEE14转染改良。WO87/04462和89/10404描述了重组DNA序列、载体和在表达系统中使用谷氨酰胺合成酶系统。
根据本发明的过程和方法所用的最优选细胞系是细胞系PFG01(ATCC PTA-2503)。
表达NIF的最优选细胞系的制备和培养如下文实施例1和2所述。
本发明的优选例是其中无动物成分的生产生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液(ii)次黄嘌呤钠(iii)胸苷；和(iv)酵母提取物。
“CHO-III-PFM”指对于悬浮培养CHO细胞优化的无蛋白质培养基，它不含次黄嘌呤和胸苷，购自Life Technologies(Grand Island，NY)。“CHO-III-PFM葡萄糖溶液”指添加葡萄糖制备的CHO-III-PFM培养基，一种也购自LifeTechnologies的制备物。优选的CHO-III-PFM/葡萄糖溶液是定制配方号98-0289(Life Technologies，Rockville，MD，Grand Island，NY，Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA的子公司)，它是具有额外的葡萄糖(3.45g/L D-葡萄糖)的CHO-III-PFM/葡萄糖溶液，不含次黄嘌呤、胸苷或L-谷氨酰胺。
CHO-III-PFM/葡萄糖溶液本身是无动物成分的(无动物血清和动物蛋白质)。然而应注意到，其它无动物成分，具有上述性质并掺入CHO-III-PFM培养基的成分的市售CHO细胞培养基也可用于本发明的范围。
优选酵母提取物以商品名Bacto(Difco/Becton-Dickinson)购得。也可使用其它市售酵母提取物。
可在培养基中加入酚红溶液，优选其约0.5％w/v的溶液作为肉眼pH指示剂。这种酚红溶液更优选以约0-3.0ml/l培养基的量使用。
本发明更优选的实施例是其中无动物成分生产生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii每升(i)约50-100μmol次黄嘌呤钠；(iii)每升(i)约8-32μmol胸苷；和(iv)每升(i)约0.5-5.0克酵母提取物。
根据优选方面，加入次黄嘌呤钠和胸苷作为10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液。优选每升(i)加入约5-20ml次黄嘌呤钠/胸苷溶液。
本发明的最优选例是其中无动物成分生产生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)每升(i)约10.0ml 10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液；和(iii)每升(i)约1.5g酵母提取物。
可任选的可在培养基中加入每升(i)约0.5ml 0.5％w/v的酚红溶液。
本发明还针对制备嗜中性粒细胞抑制因子(NIF)的方法，包括步骤(i)提供接种物，该接种物是通过在无动物成分的接种生长培养基中培养表达NIF的细胞系制备的；和(ii)将所述接种物转移到含有无动物成分生产生长培养基的容器内。
根据本发明该方面的优选例，接种生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)次黄嘌呤钠；(iii)胸苷；(iv)氨基酸溶液，含有选自L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-甲硫氨酸；(v)可任选的，L-甲硫氨酸磺亚胺(“MSX”)；和(vi)L-半胱氨酸。
可任选的，可在该接种培养基中加入含有酚红的溶液，优选约0.5％w/v酚红的溶液，用作肉眼pH指示剂；优选溶液以约0-0.3ml/升培养基的量加入。
本发明的该方面的更优选例是其中接种生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；
(ii)每升(i)约50-100μmol次黄嘌呤钠；(iii)每升(i)约8-32μmol胸苷；(iv)每升(i)加入下列指定量的氨基酸L-天冬氨酸(约15-90mg)、L-谷氨酸(约12-75mg)、L-天冬酰胺(约50-300mg)、L-脯氨酸(约6-38mg)、L-丝氨酸(约15-90mg)和L-甲硫氨酸(约7-45mg)；(v)每升(i)约0-75μmol L-甲硫氨酸磺亚胺(MSX)；和(vi)每升(i)约10-40mg半胱氨酸。
(iv)的氨基酸可以方便地以作为每升(i)约5-30ml的氨基酸溶液加入，该溶液含有L-天冬氨酸(约3.0g/L)、L-谷氨酸(约2.5g/L)、L-天冬酰胺(约10.00g/L)、L-脯氨酸(约1.25g/L)、L-丝氨酸(约3.0g/L)和L-甲硫氨酸(约1.50g/L)。可任选的加入MSX，其量为每升(i)约0.5-3ml 25mM的L-甲硫氨酸磺亚胺(MSX)溶液，以得到每升约12.5-75μmol MSX。可方便地以约5-20ml 10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液加入次黄嘌呤钠和胸苷。
本发明最优选的实施例是其中接种生长培养基含有(i)CHO-III-PPM/葡萄糖溶液；(ii)每升(i)约10.0ml的10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液；(iii)每升(i)约20.0ml氨基酸溶液，含有L-天冬氨酸(约3.0g/L)、L-谷氨酸(约2.5g/L)、L-天冬酰胺(约10.0g/L)、L-脯氨酸(约1.25g/L)、L-丝氨酸(约3.0g/L)和L-甲硫氨酸(约1.50g/L)；(iv)可任选的每升(i)约1.0ml 25mML-甲硫氨酸磺亚胺(MSX)溶液；和(v)每升(i)约25.0mg L-半胱氨酸。可任选的，可在接种培养基中每升(i)加入约0.5ml约0.5％w/v的酚红。
本发明还涉及一种上述的无动物成分生长培养基。另外，本发明涉及无动物成分接种生长培养基。
另外，本发明还涉及一种制备重组蛋白质的方法，包括在本发明的无动物成分生长培养基中培养表达外源重组蛋白的哺乳动物细胞。在优选例中，哺乳动物细胞是被谷氨酰胺合成酶质粒载体转染的中国仓鼠卵巢细胞，该质粒含有具有重组蛋白DNA编码区的核酸分子。优选载体是谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺亚胺共扩增载体，例如pEE14或pEE14.1(Lonza Biologics，Slough，UK)。
定义“嗜中性粒细胞抑制因子”或“NIF”指可从天然来源分离或用重组方法制备的蛋白质。嗜中性粒细胞抑制因子是一种蛋白质，它既不是抗体，整联蛋白或选择蛋白家族的成员，也不是粘着蛋白的免疫球蛋白超家族的成员，当从寄生虫分离时，它被糖基化。重组NIF可以或可以不是糖基化的，或可以是糖基化到不同程度的；这可以通过用于生产重组NIF的表达系统和/或培养条件影响。
NIF1或成熟NIF-1FL指一种以NIF-1FL(SEQ ID NO2)的形式表达，然后在合成后被切割(当在细胞内)，得到成熟NIF-1FL或NIF1(SEQ ID NO3)的蛋白质。
“NIF1cr”指NIF1的编码序列。
术语“NIF基因”指编码嗜中性粒细胞抑制因子的核酸分子。在美国专利号5,919,900中描述了一些编码NIF的核酸分子。
术语“表达NIF的细胞系”指被编码NIF的核酸分子转化，从而表达嗜中性粒细胞抑制因子的细胞系。
细胞系PFG01是CHO-K1(ATCC-CCL-61)细胞系，它被表达NIF1基因的谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺亚胺共扩增载体pEE14转染。Pfizer Inc.，一家Delaware公司，在纽约州纽约东42街235号营业，在美国典型培养物保藏中心于2000年9月27日保藏了细胞系PFG01(ATCC PTA-2503)。
术语“CHO-III-PFM/葡萄糖溶液”指由Life Technologies(Grand Island，NY；PFM＝无蛋白培养基)生产的生长培养基，其中加入对于CHO细胞培养特别开发的葡萄糖。
术语“酵母提取物”指一种复杂的补充物，其中含有从酵母细胞提取的肽，且是不含动物衍生的化合物。
附图简述
图1描述了NIF1(SEQ ID NO1)的编码序列，对应的氨基酸翻译(SEQ ID NO2)和成熟NIF1的氨基酸序列(SEQ ID NO3)。核苷酸从5’-末端开始编码，氨基酸从成熟多肽的起始处开始编码(SEQ ID NO3)(标出了N-末端Asn)。沿左手空白的数字表示每行第一个输入的核酸序列的核苷酸数目或成熟NIF1序列的氨基酸数目(黑体)。在用氨基酸测序鉴定的肽下方划线。肽T-20(SEQ ID NO4)、T-22(SEQ IDNO5)、D-96(SEQ ID NO6)和D-102(SEQ ID NO7)在最初和随后的克隆中用作正向和反向引物。下方的核苷酸序列代表在拯救用于克隆入BSII穿梭载体(SEQ IDNO8)的编码区时，PCR引物加入的核苷酸。该图代表用{BSII/}{pEE14}{pSG5}NIF1cr构建物的两条DNA链测定的序列。
图2描述了如钩虫mRNA制备物获得的，在将cDNA克隆入λgt10/EcoRI载体，然后亚克隆入BSII拯救载体后获得的全长cDNA序列(SEQ ID NO9)。用Sanger二脱氧核苷酸测序法确定NIF1的核苷酸序列。左侧空白的数字表示从序列5’-末端的核苷酸编号。用黑体标出的核苷酸(33-1137)(SEQ ID NO1)代表NIF1的编码区。
图3是产NIF细胞系构建物的示意图，并描述了从NIF1 cDNA到用于转染CHO-K1细胞的pEE14载体的途径。
图4描述了用于构建NIF表达细胞系的pEE14表达载体构建物。如其名称所示，pEE14/NIF1cr表达质粒衍生自广泛使用的9.4kb pEE14表达载体(LonzaBiologics，Slough，UK)。pEE14载体含有(1)人CMV主要立即早期启动子(hCMV-MIE)，(2)多克隆位点(MCS)，(3)SV40早polyA位点(pA)，(4)Col E1复制起始点(Col E1)，(5)氨苄青霉素抗性基因(Amp)，和(6)SV40晚期启动子(SV40L)，它驱动谷氨酰胺合成酶小基因(GS-小基因)。在该图中标出了多克隆位点中的限制性内切核酸酶位点。5’HindIII插入位点在MCS的稍5’位置。
图5描述了在克隆过程中(SEQ ID NO10和11)掺入编码序列两端的插入物(上方，侧接“NIF1cr”)的其它非编码序列(下方)。显示插入序列的5’-末端在pEE14表达载体中从HindIII位点(图4中未显示该位点)开始，它与pBluescriptII穿梭载体(“BSII”)多接头的5’-HindIII位点的互补序列连接。5’HindIII位点后是EcoRI位点，由5’-PCR NIF1cr拯救引物提供，用于将NIF1cr序列克隆入BSII。NIF1的NIF1编码区域序列从该EcoRI位点开始，延伸大约850个核苷酸。
发明详述本发明的方法可如下进行。
本发明的优点之一是它在任何培养基，包括接种生长培养基，生产生长培养基和营养物进料中不涉及使用动物成分。由于对于在药物生产中使用动物衍生的物质愈来愈关注(例如，担心BSE(牛海绵状脑病)的传播)，该优点是显著的。另外，与先前使用含动物衍生的成分的培养基的方法相反，本发明的方法具有短几天的生产期，通常得到高3-4倍的合适糖基化的NIF滴度。
优选细胞系和NIF优选用哺乳动物细胞系，更优选衍生自CHO-K1(ATCC CCL-61)的重组中国仓鼠卵巢细胞系，该细胞系被NIF-表达质粒载体转化，优选含有NIF1 DNa的pEE14载体(Lonza Biologics；含有HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI和BcII克隆位点的谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺亚胺共扩增载体，其中载体表达谷氨酰胺合成酶和克隆基因)(实施例1)实施本发明。
产NIF细胞系的构建根据产生重组蛋白的细胞培养物的建立方法，它们是本领域已知的，公开于美国专利号5,919,900；5,747,296；5,789,178；5,591,639；5,658,759；5,849,522；5,122,464；5,770,359；和5,827,739；国际专利出版号WO 87/04462；WO 89/01036；WO 86/05807和WO 89/10404；Bebbington等，Bio/Technology，10169-175(1992)，它们在此全部完整引入以供参考。
应该优选选择细胞系并在使用前改造，使其容易形成悬浮培养物，因此不是锚定依赖的，并可从经过几代后戒除含动物血清和动物蛋白的培养基。一般实现这种改造的方法可以通过如下文实施例2所述的类似地培养细胞系来进行。
称为PFG01(ATCC PTA-2503)的细胞系对本发明的方法是优选的。PFG01细胞系衍生自CHO-K1细胞系(ATCC CCL-61)，如下文实施例1和2所述。PFG01细胞系是通过用含有NIF1基因的pEE14质粒载体转染CHO-K1细胞系(ATCC CCL-61)建立的。通过从锚定依赖性品系和使重组细胞戒除牛血清，产生悬浮培养物，完成PFG01细胞系的开发。
可根据本发明的方法产生用上述方法转化的细胞产生的任何NIF。优选本发明方法产生的NIF是257氨基酸蛋白质，成熟NIF-1FL(NIF1)(SEQ ID NO3)，如图1所述。NIF1是转化的细胞产生的，作为糖基化和唾液酸化的蛋白质，具有约38.3-64.1kDa的相对分子量。根据优选方面，NIF1是作为41kD糖蛋白表达的，其中约30％-50％的分子量是由糖基团(聚糖)寡糖构成的，它们可以是分支或用唾液酸残基加帽的。该特别的NIF在Moyle等，见上中详述；另见R.Webster等，Xenobiotica，291141-1155(1999)和其中引用的文献。
NIF的制备根据本发明制备NIF的方法涉及通过用无动物成分的接种生长培养基制备接种物，将接种物悬浮在含有生产生长培养基的容器中，维持活细胞的培养物并收集NIF产物。在本发明的一个实施例中，通过培养PFG01细胞的培养物产生接种培养物，然后用于“接种”生产反应器。该接种培养物是在摇瓶或容器中产生的，一般尺寸比实际的生产容器要小。
起始的种子细胞一最初悬浮在预温的接种生长培养基中。如果种子细胞是冷冻的，在约30-38℃之间的水浴中融化表达NIF的种子细胞，优选PFG01细胞系(表达NIF1)的种子细胞，直到冰沉淀几乎完全融化。融化的试管一般转移到生物安全容器装置或箱中，用标准方法对试管外部消毒，例如用酒精棉擦拭等。
然后在预温的接种生长培养基中悬浮细胞，它含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)次黄嘌呤钠，优选每升(i)约50-100μmol；(iii)胸苷，优选每升(i)约8-32μmol；(iv)氨基酸溶液，含有选自L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-甲硫氨酸；(v)可任选的L-甲硫氨酸磺亚胺；和(vi)L-半胱氨酸。
根据优选方面，接种生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液，优选Life Technologies，定制配方号98-0289，加入3.45g/L D-葡萄糖；不含次黄嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺；(ii)次黄嘌呤钠/胸苷溶液，优选HT补充物(100×)(Life Technologies，目录号11067-030)；(iii)氨基酸溶液，优选氨基酸选自L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-甲硫氨酸；(iv)可任选的L-甲硫氨酸磺亚胺；和(v)L-半胱氨酸溶液。
可任选地，可在培养基中加入含有酚红溶液，优选约0.5％w/v的溶液作为肉眼pH指示剂。更优选以每升培养基约0-3.0ml 0.5％w/v的量加入。
上述氨基酸溶液可方便地通过将氨基酸溶于去离子水，用碱水溶液，优选氢氧化钠水溶液调节pH至约8.0，然后无菌过滤制备。
MSX溶液可以通过将MSX溶于去离子水，用0.2微米滤膜过滤溶液制备。将MSX溶液等份置于无菌试管中，在一定温度，优选5℃以下可保存三个月或更长。
更优选的接种生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液(Life Technologies，定制配方号98-0289；含有3.45g/L D-葡萄糖；不含次黄嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺)；(ii)每升(i)约5-20ml的10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液；(iii)每升(i)所述量的氨基酸溶液L-天冬氨酸(约15-90mg)、L-谷氨酸(约12-75mg)、L-天冬酰胺(约50-300mg)、L-脯氨酸(约6-38mg)、L-丝氨酸(约15-90mg)和L-甲硫氨酸(约7-45mg)；更优选通过每升(i)加入约5-30ml氨基酸溶液加入氨基酸，该溶液含有L-天冬氨酸(3.0g/L；22.5mM)、L-谷氨酸(2.50g/L；17.0mM)、L-天冬酰胺(10.00g/L；75.7mM)、L-脯氨酸(1.25g/L；10.9mM)、L-丝氨酸(3.0g/L；28.5mM)和L-甲硫氨酸(1.50g/L；10.1mM)；(iv)可任选的每升(i)约12.5-25μmol L-甲硫氨酸磺亚胺，如果加入，优选每升(i)约0.5-3ml 25mM的L-甲硫氨酸磺亚胺(MSX)溶液；和(v)每升(i)约10-40mg L-半胱氨酸。
最优选的接种生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液(Life Technologies，定制配方号98-0289；含有3.45g/L D-葡萄糖；不含次黄嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺)；(ii)每升(i)约10.0ml的10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液；(iii)每升(i)约20.0ml氨基酸溶液，含有L-天冬氨酸(约3.0g/L)、L-谷氨酸(约2.5g/L)、L-天冬酰胺(约10.00g/L)、L-脯氨酸(约1.25g/L)、L-丝氨酸(约3.0g/L)和L-甲硫氨酸(约1.50g/L)；(iv)可任选的每升(i)约1.0ml 25mM的L-甲硫氨酸磺亚胺(MSX)溶液；和(v)每升(i)约25.0mg L-半胱氨酸。
然后将得到的接种生长培养基转移入摇瓶或其它容器，用于建立接种物，将种子细胞悬浮于其中。
在开始时，可用例如台盼蓝染料排除法对接种培养物采样并计数，以确定细胞浓度和存活率，如《细胞和组织培养生物技术中的实验室方法》，(Cell andTissue CultureLaboratory Procedures in Biotechnology)A.Doyle和J.B.Griffiths编(John Wiley & Sons，Ltd.，1998)所述。如果细胞浓度大于约7.0×105活细胞/ml(“vc/ml”)，可加入更多预温的生长培养基，以实现在约2.0×105-6.0×105vc/ml范围内的最终浓度，但优选约5.0×105vc/ml的浓度。
然后可在约30-38℃，优选约36.5±1℃；约2-10％，优选5±1％的CO2浓度，在约40-90％，优选70±5％的相对湿度下；搅拌速率约50-200rpm，优选150±20rpm(偏心距离＝直径3/8英寸)，搅拌培养摇瓶或容器。每天对摇瓶取样，监测细胞浓度和存活率。每天加入更多预温的生长培养基，维持2.0×105-6.0×105vc/ml，优选约5.0×105vc/ml的浓度。如果再加入培养基超出容器的体积，或细胞密度达到约1.0×106vc/ml，将培养物分层两份或多份培养物，可以在新的容器中稀释到约5.0×105vc/ml。
随后，每次细胞密度达到约1.0×106vc/ml，应将培养物在其它容器中分成约2.0×105vc/ml。应该重复该步骤，以扩大种子系列，直到达到足够的体积以对于生物反应器容器获得约1.5×105vc/ml-4.0×105vc/ml，优选约2.0×105vc/ml的接种密度。接种物比(接种后接种培养物体积/反应器液体体积)是约10-20％。接种培养物中的细胞密度应该在1.0×106vc/ml-2.5×106vc/ml，优选约1.0×106vc/ml-1.5×106vc/ml之间。在用于实际生产期之前，接种培养物的寿命是约3-4天。
就NIF而言，用于实际生产阶段的培养基(生产生长培养基)与用于接种生产的不同。生产反应器优选以补料-分批条件下操作，即在生产期内营养物溶液被连续送入反应器。
NIF生产阶段的培养基(生产生长培养基)含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)次黄嘌呤钠；(iii)胸苷；和(iv)酵母提取物。
次黄嘌呤钠和胸苷可方便地作为次黄嘌呤钠/胸苷溶液加入，优选作为HT补充物(100×)(Life Technologies，目录号11067-030)加入。
优选生产生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii每升(i)约50-100μmol次黄嘌呤钠；(iii)每升(i)约8-32μmol胸苷；和(iv)每升(i)约0.5-5.0克酵母提取物。
CHO-III-PFM/葡萄糖溶液优选是Life Technologies，定制配方98-0289；含有3.45g/L D-葡萄糖；不含次黄嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺。
可任选的，为了促进pH测定可加入酚红，优选约0.5％w/v酚红的溶液；更优选约0-3.0ml/升培养基，最优选每升培养基约0.5ml溶液的量。
更优选的生产生长培养基包括(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液，由Life Technologies生产，定制配方号98-0289；含有3.45g/L D-葡萄糖；不含次黄嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺；(ii)每升(i)约5-20ml的10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液；和(iii)每升(i)约0.5-5.0克酵母提取物。
最优选的生长生产培养基包括(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液，由Life Technologies生产，定制配方号98-0289；含有3.45g/L D-葡萄糖；不含次黄嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺；(ii)每升(i)约10.0ml的10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液；和(iii)每升(i)约1.5克酵母提取物。
优选在生产阶段的过程中用两种营养物进料，以满足培养物有利的生长速率需要的物质。一种营养物进料是葡萄糖进料(营养物进料1)，其浓度是约100-500g/L。该葡萄糖进料用于将反应器中的葡萄糖浓度维持在约0.1-5.0g/L，优选约2.0g/L。该进料通常以每天约0.0-6.0g葡萄糖/L培养基的速率，用合适的泵或其它装置加入，使葡萄糖随时间分散。
第二种营养物进料(营养物进料2)含有(i)CHO-III-PFM(5倍浓度或“5X”)溶液(Life Technologies生产，定制配方99-0180；仅含1X(由于溶解度原因1倍)L-半胱氨酸，3X(由于溶解度原因3倍)L-酪氨酸；不含葡萄糖、次黄嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠或氯化钠)；(ii)每升(i)25-100ml 10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液；和(iii)每升(i)5-20g酵母提取物。更优选营养物进料含有(i)CHO-III-PFM(5X)溶液(Life Technologies生产，定制配方99-0180(5X))；含1×L-半胱氨酸，3×L-酪氨酸；不含葡萄糖、次黄嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、氯化钠；(ii)每升(i)50ml 10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液；和(iii)每升(i)7.5g酵母提取物。第二种进料是通过在CHO-III-PFM(5X)溶液中加入10mM次黄嘌呤/1.6mM胸苷溶液，优选HT补充物100X(Life Technology)和酵母提取物，溶解并混合成分，用氢氧化钠将pH调节到约6.8-7.6，然后无菌过滤最终溶液。第二种进料溶液在约48小时开始，以每天接种时约5-50ml/升培养物的速率连续供给反应器。该添加对于实现NIF的高产率和可接受的产物质量是必需的。
在2升Wheaton生物反应器(B.Braun Biotech Inc.，Allentown，PA)，通过Foxboro IA(Intelligence Application)计算机系统(Foxboro Company，Foxboro，MA)控制进行本发明的过程，然而可用任何可消毒容器作为生物反应器，只要它具有充分的搅拌能力，足够的进料入口，两个用于营养物进料，一个用于pH控制和一个采样口，配备气体入口，可使用冲洗功能。容器应该能允许足够的在线过程控制。优选容器是可透光或具有被遮盖以防止环境光线直接照射的性质。容器消毒后，可用无菌调理溶液漂洗容器，优选无谷氨酰胺的DMEM(LifeTechnologies/GibcoBRL；目录号11960-044)或Dulbecco磷酸盐缓冲盐(LifeTechnologies/GibcoBRL，目录号14190-136)。在足够的时间后，根据容器大小，用新鲜的无菌的生产培养基更换漂洗培养基。使培养基温度稳定在约30-38℃，优选约36.5±1℃，如需要在接种前pH应调节到约6.8-7.6，优选的7.4的pH。加入的接种培养物的体积优选在反应器中建立约1.0×105活细胞/ml-5.0×105活细胞/ml，优选2.0×105活细胞/ml的初始目标接种物密度。
应以约50-200rpm的速率搅拌容器的内容物，视容器大小和几何形状以及使用的叶轮而定，充分完全混合容器内容物。或者，应以实现相同程度混合的方式搅拌容器的内容物。生产培养物的pH应该通过合适的控制试剂，它不影响细胞培养物的存活率和活力，维持在约6.8-7.6，优选约7.40±0.05的范围内。对本发明而言，优选CO2气体和约7.5％(w/v)NaHCO3的溶液作为pH控制剂。然而，还可成功地使用其它常用碱溶液，例如NaHCO3和Na2CO3的混合液或稀NaOH。
溶解氧浓度应该用合适的控制剂维持在约10-100％空气饱和度，优选约60±5％空气饱和度。生产培养物的温度应维持在约30-38℃，优选约36.5±1℃。生产培养基的葡萄糖浓度优选通过葡萄糖进料溶液(营养物进料1)维持在约0.1-5.0g/l，优选约2.0g/l±0.5g/l的范围内，该营养物每隔一段时间以少量加入，维持所需的水平。
为了控制pH和溶解氧，可将二氧化碳气体和/或氧气和/或空气和/或氮气喷入培养物中。氮气或空气可导向顶部空间，以辅助溶解氧控制和/或减少泡沫产生。
营养物进料2以每天接种时，约5-50ml/升培养物的速率，优选以每天接种时，约25ml/升培养物的速率连续进料，该进料应该与葡萄糖进料同时开始，通常是在约48小时时。
生产培养物应在接种后立即采样。通常立即测定下列参数最初细胞密度和存活率；离线pH；初始葡萄糖浓度；初始乳酸盐浓度；初始氨浓度和初始重量克分子渗透压浓度。如需要应调节在线pH。生物反应器容积应优选是不透光的或用不透明的遮光罩遮住，以防止生产培养基与光接触。通常每天对生产培养物采样测定下列参数细胞密度；培养物存活率；离线pH；葡萄糖浓度；乳酸盐浓度；氨浓度；重量克分子渗透压浓度和NIF浓度，纯化或鉴定。
葡萄糖浓度应用营养物进料1维持在约0.1-5.0g/l，优选约1.5-2.5g/l。通常约48小时后用定量泵与开/关计时器，以30分钟循环以初始进料速率2.0g/(1-天)，或约2.0-3.0g葡萄糖/109活细胞/天。如需要应每天调节葡萄糖进料速率。葡萄糖消耗率通常随培养持续时间改变，但所需的进料速率通常维持在约0.0-6.0g/1-天的范围内。营养物进料2通常在约48小时时开始。
本发明的方法在2升搅拌罐生物反应器中，和在10，50，100升搅拌罐中成功地进行，因此实际上可以任何规模进行。在搅拌罐反应器中，使用PFG01细胞系，可在约11天中重复实现约4.0单位/毫升的NIF滴度。比较翻译后唾液酸化/糖基化和大鼠药物动力学(PK)研究后，产生的NIF1的产品质量是高的。用本发明的方法获得的NIF的PK研究可以根据Webster等，见上所述的方法和技术进行。
在实施例3-8中列出了实际2升搅拌罐实验的处理数据。在根据本发明的方法进行的20个相似反应器实验中，在11天内产生的NIF1的平均浓度是约4.2单位/毫升±0.4单位/毫升，如上述试验所测定的。这些实验中纯化出的样品显示可重现的翻译后修饰(糖基化/唾液酸化)。
NIF滴度的测定在给定样品中NIF的试验可以通过HPLC层析进行，或任何可以测定给定样品中NIF浓度的其它方法进行。
优选的HPLC方法利用在分析柱前线路内装配的Rheodyne SS柱入口滤膜(0.5微米)的HPLC柱(Atlantis C5 2.0×50mm，Phenomenex，Torrence CA)。柱附加梯度泵，可变波长紫外检测器，具有加热器和冷却器的自动样品注射器，柱加热器和数据收集综合系统。使用两个流动相A和B通常相A是水(J.T.Baker，HPLC级)，乙腈(HPLC级)和三氟乙酸(Sigma，蛋白质测序级，无水)的90/10/0.05混合物；B相是乙腈/水/三氟乙酸的90/10/0.04混合物。这些相是通过搅拌900ml和100ml90∶10的组分，然后过滤，搅拌数分钟脱气，转移到储器内，最后加入三氟乙酸(0.5或0.4ml)，一边搅拌约10秒钟制备的。
通常使用的HPLC条件是注射体积20微升(自动采样器中的试管中的样品维持在20℃)；210nm的紫外检测器；0.4ml/分的初流量；75∶25的寝a-b比；定为30℃的柱加热器。典型样品注射运行时间在这些条件下是约44分钟。
泵通常用梯度程序设定。典型的梯度程序如下(表I)，虽然这可以根据需要和设定调节表I
从浓缩液制备了NIF的标准样品，在PBS缓冲液(Dulbecco磷酸盐缓冲盐)中稀释到已知浓度。0.5ml稀释液等份可保持冷冻。将等份转移到两个自动采样试管中，分别注入。NIF的峰面积取平均数。(标准浓度/平均峰面积＝响应因子)。试验样品中NIF峰的面积乘以响应因子得到样品中的NIF浓度。
从培养物中分离/纯化当生产容器中的NIF浓度达到约1.0-8.0单位/毫升的NIF水平(或生产期在约5-20天之间)时，可从培养物中回收NIF。通过离心除去细胞得到澄清的培养液，然后无菌滤过合适的膜，优选0.22微米滤膜聚醚砜(PES)膜。一旦完成过滤，对澄清培养液进行许多纯化步骤A.层析步骤1Q琼脂糖快速流动阴离子交换层析含有NIF的澄清液体通过Q琼脂糖快速流动阴离子交换层析柱，其中NIF变为与柱结合，然后在较高浓度的盐溶液中洗脱。用1N氢氧化钠调节Q琼脂糖柱，然后用50mM Na2HPO4/100mM NaCl溶液(pH7.0)平衡。将0.22微米过滤的培养液加到柱上，然后用50mM Na2HPO4/100mM NaCl溶液(pH7.0)洗涤，用50mMNa2HPO4/250mM NaCl溶液(pH7.0)洗脱。
B.浓缩/渗滤步骤1用Pall 10000 MWCO Macrosep单元在离心机(Sorvall RC5c Plus，HS-4转子，4000rpm，40分钟)浓缩来自Q琼脂糖柱的纯化的洗脱液。在渗滤期间，浓缩的样品缓冲液进行3个循环的缓冲液加入与20mM Na2HPO4，pH6.0交换，，然后离心。
C.层析步骤2苯基琼脂糖快速流动疏水作用层析用1N氢氧化钠调节苯基琼脂糖柱，然后用20mM Na2HPO4/1.0M(NH4)2SO4溶液(pH6.0)平衡。在装样前在浓缩和渗滤过的Q琼脂糖洗脱液中加入等体积的20mM Na2HPO4/2.0M(NH4)2SO4溶液(pH6.0)。这样样品装在20mM Na2HPO4，1.0M(NH4)SO4溶液(pH6.0)中。将稀释的渗滤液加到柱上。NIF不和柱结合，用20mMNa2HPO4/1.0M(NH4)2SO4溶液(pH6.0)洗涤。
D.浓缩/透析步骤2浓缩来自苯基琼脂糖柱的纯化的洗脱液，然后用Pall 10000 MWCO Macropsep单元在离心机(sorvall RC5C)Plus，HS-4转子，4000rpm，40分钟渗滤。在渗滤过程中，浓缩的样品缓冲液进行3个循环的缓冲液加入与25mM CH3CO2Na，pH4.1交换，然后离心。
E.病毒灭活用乙酸将流过后渗滤液的pH调节到3.7。样品在pH3.7维持30-45分钟，一边搅拌，重新调节到pH4.1，然后滤过Millipore 0.22微米Steriflip滤膜。
F.层析步骤3DEAE琼脂糖快速流动阴离子交换层析在该步骤中，NIF与柱结合，然后用具有较高盐浓度的溶液洗脱。用1N氢氧化钠调节DEAE琼脂糖快速流动阴离子交换柱，然后用25mM CH3CO2Na溶液(pH4.1)平衡。然后将无菌过滤(或DV50-过滤的)材料加到柱上。用25mM CH3CO2Na溶液(pH4.1)洗涤柱，然后用25mM CH3CO2Na/30mM NaCl溶液(pH4.1)或25mMCH3CO2Na/50mM NaCl溶液(pH4.1)洗涤，然后用25mM CH3CO2Na/30mM NaCl溶液(pH4.1)洗脱。洗脱液含有NIF产物。
G.浓缩/渗滤步骤3浓缩来自DEAE琼脂糖柱的纯化的洗脱液，然后用Pall 10000 MWCO Macrosep单元在离心机(Sorvall RC5C Plus，HS-4转子，4000rpm，40分钟)中渗滤。在渗滤期间，浓缩的样品缓冲液进行3个循环的缓冲液加入与25mM CH3CO2Na，pH7.0交换，然后离心。
糖基化的测定Webster等，Xenobiotica，29(11)1141-1155(1999)描述了测定0，1，2，3和4唾液酸化的百分数的方法，在此引入以供参考。
测定NIF的唾液酸化总程度的方法是使用PA-10柱(Dionex Ion Pac ATC-1流动相调节器，Dionex CarboPac 4.6×50mm PA-10保护柱和Dionex Carbopac 4.6×250mm PA-10分析柱)，配备Dionex GP40梯度泵、Dionex ED40(用于脉冲电流监测模式的EC检测器)、Dionex AS3500自动采样器和Dionex PeakNet 5.1软件(用于数据获得和处理)。试验使用两个流动相A(0.2M NaOH(Fisher)\50mM乙酸钠(Sigma ACS级)和B(0.2M NaOH)\300mM乙酸钠)。典型HPLC的运行条件是注射体积20微升，PAD检测(优化的糖类波形)，流速0.7ml/min，初始流动相。A100％，运行时间45分钟。
泵通常设定为梯度程序。典型的梯度程序(表II)如下，虽然这可以根据需要和设定调节
表II
制备浓度为约1.0×10-3单位/毫升的纯化的NIF样品和参比的唾液酸标准。在200微升等份的NIF和参比样品中加入200微升0.2N HCl。旋转等份并简单离心，然后80℃加热1小时。然后在冰浴中冷却样品约10分钟，接着再次旋转和离心，将它们恢复到室温。注射20微升样品用于分析。然后报道的结果作为参比标准的百分数。
嗜中性粒细胞抑制活性的测定测定嗜中性粒细胞抑制活性的试验可用于证实培养的细胞系产生的NIF的质量和生物活性，它们是下文列出的塑性粘附试验，钙黄绿素试验，过氧化氢释放试验和ELISA。
A.塑性粘附试验i.嗜中性粒细胞的分离用一步Ficoll-Hypaque梯度(Mono-poly，ICN Biomedicals，Irvine，CA)从肝素化的静脉血中分离嗜中性粒细胞。简单说，将5ml全血铺在16×100mm玻璃试管中的3ml Mono-poly分辨培养基上。通过在20℃ 300xg离心60分钟实现白细胞的分离。用Pasteur吸量管收集含有嗜中性粒细胞的细胞层，将细胞悬浮在10体积的冷Dulbeccos改进的Eagle培养基(DMEM，Life Technologies Inc.，Gaithersburg MD)。在4℃在200xg沉淀嗜中性粒细胞10分钟。将细胞沉淀的重新悬浮在5ml冷ACK缓冲液(155mM NH4Cl/10mM KHCO3，pH7.4)中，在室温培养5分钟，裂解污染的红血细胞。然后通过离心并以约107细胞/毫升重悬浮在HBSS(1.33mm CaCl2，0.5mM MgCl2，0.04mM MgSO4，140mM NaCl，5mM KCl，0.3mM KH2PO4，0.3mM Na2HPO4和5.6mM D-葡萄糖和30mg/l酚红)洗涤嗜中性粒细胞一次。通过台盼蓝排阻测定细胞存活率。如自动化差相计数测定的，这些制备物一致含有大于95％的嗜中性粒细胞。
ii.塑性粘附试验将激活的人嗜中性粒细胞与塑性组织培养物粘附，可用标准相差光学显微镜观测。洗涤一次在上面步骤A中分离的嗜中性粒细胞，以6.6×106细胞/毫升重悬浮在冷HAS缓冲液(不含磷酸钠的RPMI(Life Technologies)，1％人血清清蛋白(Calbiochem，San Diego，CA)，1.2mM CaCl2，1.0mM MgCl2，10mM HEPES，pH7.3)中。将嗜中性粒细胞(20微升)置于无菌微离心管中，用PMA(800nM溶液5微升或最终浓度160nM)37℃刺激5分钟。在含有经刺激的细胞的试管中加入测试样品(20微升)，温和混合，立即将10微升混合液转移到Terasaki式培养板(Nalge NuncInternational，Naperville，IL)的各孔中。37℃另外5分钟后，将整个平板浸入Hanks平衡盐溶液(JRH Biosciences，Lenexa，KS)，用自来水冲洗除去未粘附的细胞。冲洗/漂洗步骤重复总共6次。用相差光学显微镜观察粘附在塑料孔中的细胞。含有经刺激的细胞和未测试样品的对照孔评分为“++++”，含有经刺激的细胞和单克隆抗体CLB-54(针对整联蛋白CD11b/CD18)的对照孔评分为“-”。
B.嗜中性粒细胞-Huvec粘附(钙黄绿素)试验用预先装有荧光染料钙黄绿素-AM(乙酰氧基甲酯；Molecular Probes，Eugene，OR)的细胞监测人嗜中性粒细胞对HUVEC单层的粘附。用钙黄绿素如下标记人嗜中性粒细胞。沉淀嗜中性粒细胞，以最终细胞浓度约107细胞/毫升重悬浮在含有10微克/毫升的钙黄绿素-AM的HBBS溶液中。在使用钙黄绿素的二甲亚砜(10mg/ml，储藏在-20℃)的贮存液前，立即制备HBSS/钙黄绿素的工作液。嗜中性粒细胞与钙黄绿素-AM在37℃温育30分钟，每隔10分钟搅拌。标记的嗜中性粒细胞洗涤一次，以1.32×107细胞/毫升重悬浮在冷HSA缓冲液(不含磷酸钠的RPMI(Life Technologies)，1％人血清清蛋白(Calbiochem，San Diego，CA)，1.2mMCaCl2，1.0mM MgCl2，10mM HEPES，pH7.3)中。细胞保存在4℃直到使用。
20℃，在100ng/ml PMA(Sigma，St.Louis，MO)存在下，温育钙黄绿素标记的嗜中性粒细胞(175微升)和175微升测试组分10分钟。在二甲亚砜中制备1mg/mlPMA的贮存液，常规储藏在-70℃。将100微升测试组分/PMA-处理的细胞(6.6×105嗜中性粒细胞)加到96孔微量滴定板(Costar，Cambridge，MA)中培养的原代HUVEC的汇合单层中。37℃、30分钟后，通过倒置离心除去未粘附的细胞，于75xg密封平板3分钟。加入100微升0.1 Triton X-100(在50mM Tris-HCl，pH7.4)中裂解粘附的嗜中性粒细胞，用Cytofluor荧光测定平板阅读仪(Millipore，Bedford，MA)阅读485nm激发得到的530nm处的钙黄绿素的荧光发射。各数据点以一式三份进行。在这些实验中，在不存在抑制剂时，总输入嗜中性粒细胞的40％，或约2.6×105细胞与HUVEC单层结合。
C.过氧化氢释放试验用Pick等，J.Immun.Methods，38161-171(1980)所述的改良方法测定受刺激的人嗜中性粒细胞释放的过氧化氢。人嗜中性粒细胞(6.6×106细胞/毫升)重悬浮在含有10％胎牛血清的HBSS中。在细胞悬液中以分别为83微克/毫升和0.01单位/毫升的最终浓度加入酚红和IV型辣根过氧化物酶(Sigma)。在200微升测试样品(含有10％胎牛血清的HBSS)中加入500微升该细胞悬液。用fMLP(sigma)以最终浓度275μM活化细胞。制备fMLP(500nM)的二甲亚砜贮存液，储藏在-20℃。释放试验在1.5ml塑料管(Eppendorf，Madison，WI)中进行，该管用胎牛血清在37℃预包涂60分钟；包涂的试管用0.15N NaCl洗涤两次，然后使用。释放作用在37℃进行90分钟，然后在Eppendorf微离心机中2000xg沉淀细胞3分钟。将200微升上清液转移到96孔微量滴定板中，加入10微升1N NaOH终止反应。各数据点一式两份进行。用ThermoMax平板阅读仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在610nm定量样品。从内标曲线计算过氧化氢浓度。
D.NIF1的ELISA用标准计数制备针对NIF1的多克隆抗体。用含有与rNIF1偶联的均匀玻璃珠(Bioporcessing Ltd.，Consett，UK)的树脂免疫亲和纯化抗体。还在小鼠中用标准技术制备了针对NIF1的单克隆抗体。通过蛋白质A层析从小鼠腹水中纯化单克隆抗体，用标准方法与辣根过氧化物酶(“HRP”)(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)偶联。免疫亲和纯化的多克隆抗体吸附在Immulon 2聚苯乙烯免疫试验平板(Dynatech Labs，Chantilly，VA)的孔上，然后用牛血清清蛋白封闭。在免疫试验平板的孔中加入含有NIF1(100微升/孔)的测试样品，用平板振摇器混合，在37℃温育3小时。除去孔中的内容物，用含有0.02％Tween 20的磷酸缓冲盐洗涤孔。在孔中加入单克隆抗体-HRP偶联物(100微升/孔)，如前混合，37℃温育2小时。用含有0.02％Tween 20的磷酸缓冲盐漂洗去除未吸附的单克隆抗体-HRP偶联物，在孔中加入HRP底物(10ml 0.1M乙酸钠，pH4.5，0.012％过氧化氢，加0.4ml三甲基联苯胺，3mg/ml的0.1M HCl)。当用1M硫酸终止反应时，在室温显色10分钟。用Molecular Devices 96孔板阅读仪确定450nm过的光密度。用含有已知浓度的样品产生标准曲线。
配方可配制成NIF的药物组合物，并用作口腔给药的片剂、胶囊或酏剂；直肠给药的栓剂；注射给药的无菌容积、悬液等。给药的剂量和方法可为实现最佳效力而修改，但将视下列因素重量，饮食，目前的药物疗法和其它医学领域的技术人员将理解到的因素而定。通常，根据使用的组合物的效力，每天施用0.01-100mg/kg体重的剂量。优选例包括制备用于储藏和随后给药的药物组合物，它含有治疗有效量的NIF或NIF的富集组合物，如本文药学上可接受的载体或稀释剂所述的。治疗用的可接受载体或稀释剂在药学领域是已知的，在例如《Remington氏药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，Mack PublishingCo.(A.R.Gennaro编，1985)中有所描述。可在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料，甚至调味剂。例如，可加入苯甲酸钠、山梨酸和对羟苯甲酸的酯作为防腐剂。另外，可使用抗氧化剂和悬浮剂。
可以常规形式，即液体溶液或悬液，适合在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式，或乳液制备可注射制剂。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、卵磷脂、清蛋白、谷氨酸钠、半胱氨酸盐酸盐等。另外如需要，可注射药物组合物可含有少量无毒的辅助物质，例如湿润剂，pH缓冲剂等。如需要，可使用增加吸收的制备物(例如脂质体)。
实用性本发明的NIF可用于治疗哺乳动物的炎症病况，该病况的特征是异常嗜中性粒细胞活化或异常嗜伊红粒细胞活化，包括对所述哺乳动物施用治疗有效量的NIF或其药物组合物。在实施该优选方法中，可单独或彼此联合，或联合其它治疗剂或诊断剂使用NIF或其药物组合物。可在体内，通常在哺乳动物体内，优选在人体内，或体外利用这些组合物。
在体内使用NIF或其药物组合物时，组合物可用各种途径，包括肠道外、静脉内、皮下、肌肉内、结肠内、直肠内、鼻内或腹膜内，使用各种剂型施给哺乳动物。如本领域技术人员易理解的，要施用的有用的体内剂量和给药的具体模式将根据治疗的哺乳动物物种，使用的具体组合物，和这些组合物的具体用途而定。实现所需结果必需的剂量水平的确定在本领域技术人员能力范围内。通常在低剂量水平开始使用组合物，提高剂量水平直到获得所需效果。
根据所需效果和治疗的适应症，NIF或其药物组合物的剂量可广泛变化。通常合适的剂量应在约0.01-100mg/kg之间，优选约0.01-10mg/kg体重之间。给药优选是胃肠外，例如每天或视需要静脉内给药。
本发明方法制备的NIF具有强嗜中性粒细胞抑制活性，因此可用作嗜中性粒细胞活性，包括体外嗜中性粒细胞活化的抑制剂，和用于预防或治疗特征为异常嗜中性粒细胞活化的哺乳动物炎症病况。因此，NIF可用于治疗炎症，在该炎症中嗜中性粒细胞的异常活化起到了重要作用。虽然申请人不希望限于任何理论或作用模式，相信该化合物影响炎症应答，它是由嗜中性粒细胞-内皮细胞相互作用付诸实行的。因此，由于防止嗜中性粒细胞粘附在内皮上，嗜中性粒细胞将不能迁移到组织上引起炎症前应答，随之发生组织损伤。这些NIF抑制嗜中性粒细胞-嗜中性粒细胞粘附和/或聚集还应预防微血管堵塞。因此，这些NIF将用于治疗各种临床病症，包括休克、中风、急性和慢性移植物排斥、脉管炎、自身免疫性糖尿病、类风湿性关节炎、头部创伤、炎症性皮肤病、炎症性肠病、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、心肌梗塞后的缺血-再灌注损伤(其中涉及嗜中性粒细胞渗透和活化)，和细菌感染引起的急性炎症，例如败血症或细菌性脑膜炎。
本发明制备的NIF抑制嗜中性粒细胞的活性使其能用于抑制炎症、缺血和其它嗜中性粒细胞介导的组织损伤的生理过程。NIF在进行这些相关功能中的专一活性使其特别能用作治疗剂和/或诊断剂。
针对本发明产生的NIF的单克隆和多克隆抗体用于诊断目的，并用于鉴定各种生物液中的目标肽的浓度水平。利用这些抗体的免疫试验可用作诊断试验，例如检测寄生虫对哺乳动物宿主的感染，或检测哺乳动物宿主中来自寄生虫的NIF。这些免疫试验还可用于检测和分离组织匀浆、克隆的细胞等中的NIF。在本发明的另一个方面，NIF可用于测试方法，以筛选其它化合物，以检测NIF模拟物或检测NIF拮抗剂影响NIF与CD11b/CD18受体结合的能力。
在本发明的另一个方面，本发明生产的NIF和合适的佐剂可用作针对哺乳动物中寄生虫感染的疫苗。用NIF疫苗免疫可用于预防和治疗寄生虫感染。NIF片段和具有NIF的氨基酸序列的合成的多肽也可用作疫苗。可通过对被这些寄生虫感染的动物施用拮抗NIF的物质(例如NIF拮抗剂)，来治疗寄生虫引起的病况。可根据如上所述的筛选方法筛选化合物的抗NIF作用。这些抗蠕虫剂的例子包括NIF的抗体，它包括从血清分离的天然存在的抗体和上述多克隆和单克隆抗体。作为NIF抑制剂的化学合成的化合物也是合适的抗蠕虫剂。
下列实施例用于说明本发明的方法。对于过程控制参数和过程规模的实际允许范围可能更广。
实施例实施例1表达NIF的细胞系A.编码NIF的核酸重组NIF的编码序列衍生自犬钩虫(Ancylostaoma)cDNA文库，其中在质粒构建过程中加入标准表达调控序列。NIF-1FL、成熟NIF-1FL(NIF1)的核苷酸序列以及对应的全长cDNA分别如图1和2所示。图2中的核苷酸序列具有822个核苷酸的开放阅读框，它编码274个氨基酸多肽(核苷酸313-1134)。
B.表达载体的构建将上述NIF1 cDNA如下克隆入一系列穿梭载体和宿主，最终克隆入pEE14载体。图3是示意图，表示以NIF1 cDNA到pEE14载体的途径，它用于转染CHO-K1细胞。用于细胞系构建过程的一些生物化学品及其各自的供应商如下(表III)
将NIF1编码区域(“NIF1cr”)(SEQ ID NO1)拯救入pSG5载体，测定核苷酸序列。编码区域本身(不考虑紧靠改变成启动表达的ATG起始位点上游的序列)正好对应于图2所示的原始NIF1 cDNA克隆的碱基313-1137。
用pSG5/NIF1cr转染的COS-7细胞产生活性NIF1。产生的NIF1和钩虫衍生的NIF一样，以浓度依赖性方式抑制人嗜中性粒细胞的H2O2产生。对照感染(用携带氯霉素乙酰转移酶的质粒转染的细胞或模拟转染的细胞)都不产生类似NIF的活性。
pSG5的有限多克隆位点需要NIF1cr通过能提供编码区域的两端上的不同限制性位点的质粒传代。选择pBluescript IIKS+，因为在其广泛多克隆位点的中部存在EcoRI位点和它方便操作。然后将其克隆入pEE14表达质粒。表达构建物pEE14/NIF1cr用于转染CHO K1细胞。
在关键步骤通过限制性作图或者测序验证准确的分离和最终或中间构建的序列。首先在克隆入pcDNA1/Amp测序载体(测序见图2)时测序，验证全长NIF序列。通过双向测序在克隆入PSG5穿梭载体后验证经测序的编码区。
C.表达载体如其名称所指出的，pEE14/NIFcr表达质粒衍生自图4所示的广泛使用的9.4kb pEE14表达载体(Lonza Biologics)。pEE14载体含有(1)人CMV主要立即早期启动子(hCMV-MIE)，(2)多克隆位点(MCS)，(3)SV40早期polyA位点(pA)，(4)Col E1复制起始点(Col E1)，(5)氨苄青霉素抗性基因(Amp)，和(6)SV40晚期启动子(SV40L)，它驱动谷氨酰胺合成酶小基因(GS-小基因)。在该图中标出了多克隆位点中存在的限制性内切核酸酶位点.5’Hind III插入位点到MCS稍差5’。可从Bebbingtong等，Bio/Technology，10169-175(1992)和Stephens和Cockett，Nucleic Acids Research，177110(1989)获得载体部分的核酸序列。
pEE14/NIF1cr插入物含有825bp的NIF1编码序列(SEQ ID NO1)，它编码图1中标出的274个氨基酸(SEQ ID NO2)。成熟NIF-1FL(NIF1)蛋白含有257个氨基酸，它由密码子18开始的序列编码，如图1所示(SEQ ID NO3)。如图5所示，在克隆过程中，在编码序列的两端其它非编码序列(SEQ ID NO10和11)掺入插入物。
对pEE14载体的基本修饰是将NIF1编码序列插入pEE14 HindIII(bp9292)和SmaI位点(bp9334)之间的载体的插入物表达区。该构建能在pEE14人CMV主要中间早期(“hCMV-MIE”)启动子的控制下表达高水平的NIF1。NIFcr(cr＝编码区)插入物的构建如图5所示。
如图5所示，插入物5’末端序列在pEE14表达载体中的HindIII位点开始(图4中位点未显示)，它与来自pBluescriptII穿梭载体(“BSII”)多接头的5’-HindIII位点的互补序列连接。5’HindIII位点后随一个EcoRI位点，由5’-PCR NIFcr拯救引物提供，用于将NIF1cr序列克隆入BSII。在该EcoRI位点开始，NIF1的NIF1编码区序列延伸约850个核苷酸。
NIFcr后面是EcoRI位点，它是由3’-PCR NIF1拯救引物建立的，用于建立将NIF1cr克隆入BSII所需的3’末端。编码区域的3’末端后随来自pBluescriptII穿梭载体的PstI位点，最后是来自pEE14的SmaI位点和其它序列(图4和5)。NIF1蛋白质编码序列用大写标出，条表明指定限制性酶的切割点。在NIF1cr克隆过程中，HindIII和SmaI位点之间的pEE14序列被除去。
D.表达载体的转染用如下的标准钙方法将pEE14/NIF1cr载体引入CHO-K1细胞(ATCC CCL-61)。为了转化，在37℃，在7.5-10％CO2气体中，T-75烧瓶中的DMEM(LifeTechnologies/Gibco)中增殖CHO-K1细胞。在500ml DMEM中加入标准营养物和50ml胎牛血清(FBS)。在转染前，用猪胰蛋白酶从烧瓶中如上所述除去细胞，用DMEM-S(DMEM如上制备，但用透析过的FBS)洗涤，以1×106细胞/板接种在10cm直径的组织培养板(Costar)上。37℃培养细胞过夜。就在要转化细胞之前，用不含FBS的DMEM漂洗一次。如下在两步中制备DNA-磷酸钙沉淀物。首先将62微升2M氯化钙与10微克pEE14/NIF1cr DNA混合，并用无菌水加到500微升。接着将该混合物滴加到500微升2X HEPES缓冲盐中，一边用冒泡气流经常的温和搅拌。一旦加入所有DNA混合物，旋转含有DNA-磷酸钙沉淀的试管。用2mL不含FBS的DMEM稀释DNA-磷酸钙沉淀，并加到含有CHO K1细胞的10cm直径培养皿中。将平板置于37℃，7.5％CO2，温和振摇4小时。从细胞中除去培养基和DNA-磷酸钙沉淀，并用3ml 15％甘油的HEPES缓冲盐溶液替换。37℃90秒钟后，加入10ml不含FBS的DMEM，立即吸去。然后用10ml DMEM-S覆盖细胞，37℃，7.5％o温育24小时。用含有25μM甲硫氨酸磺亚胺(MSX)的新鲜DMEM-S置换培养基。当将CO2提高到10％，以降低培养基pH时，平板再培养7天。在此时，平板含有许多各种大小的集落。用猪胰蛋白酶如前处理从培养皿中除去细胞，如前离心收集，并重悬浮在50ml等体积的条件培养基和补充有20％透析的FBS和25μM MSX的新鲜DMEM-S的混合物中。将重悬浮的细胞转移到96孔培养板(100微升/孔)中，并在37℃，10％CO2温育，以获得单集落。铺板7天后，加入100微升克隆培养基(50％CHO K1条件的DMEM-S，具有20％经透析的FBS，具有20％透析的FBS的50％新鲜DMEM-S，25μM MSX)，以替换由于蒸发损失的培养基。铺板10天后，201个孔含有单集落，3个孔含有2或3个集落。
铺板20天后，15个孔显示汇合生长，用塑性粘附试验(上述用于NIF活性，因此可用于NIF1活性)测试无细胞上清液。将阳性克隆在24孔培养板中如下扩增。通过用猪胰蛋白酶处理将细胞与96孔板分离，用胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶的消化。在各孔中加入1ml克隆培养基，37℃，10％CO2温育平板。3天后加入500微升含有25μM MSX的克隆培养基。扩增7天后，用塑性粘附和钙黄绿素试验测定细胞的NIF1活性。阳性克隆在10cm直径的组织培养皿中扩增。将表达最高水平NIF1活性的克隆以约1×106细胞/ml冷冻在含有20％透析的FBS、25μM MSX和10％二甲亚砜的克隆培养基中。
该克隆通过限制的稀释进行两轮克隆，以确保最终细胞系来自单一转染的细胞。克隆在含有10％透析的FBS和25μM MSX的DMEM-S中生长至汇合，通过胰蛋白酶处理从培养皿中除去，用克隆培养基稀释到每毫升25个细胞，以每孔2.5个细胞铺在96孔板中。在37℃，10％CO2温育平板。培养17天后，用钙黄绿素试验测定33个孔(显示生长)的NIF活性。根据生长速率和NIF活性的表达，几个克隆在含有10％透析的FBS和25μM MSX的DMEM-S中生长至汇合，并以约1×106细胞/ml冷冻在克隆培养基中。用ELISA确定产生NIF1的所有培养物(见本发明的详述)。
实施例2适应悬浮培养和无血清培养基A.在T-烧瓶培养物中细胞系的传代培养将实施例1制备的培养物之一在含有DMEM∶RPMI1640 50∶50(无谷氨酰胺)(50∶50 DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基，Gibco目录号11960)和RPMI1640(Rosewell Park Memorial Institute，Gibco目录号21870)的混合物)；10％合格的热灭活的胎牛血清(Gibco)；每升培养基1ml 25mM(1000X)L-甲硫氨酸磺亚胺贮存液(Sigma)的培养基中再次培养。
倒去培养基。用10ml Dulbecco PBS(无钙和镁)漂洗单层2次；倒去DulbeccoPBS，在单层中加入2ml依地酸。含有依地酸的培养物在37℃培育5分钟。轻敲烧瓶数次使细胞脱落并重悬浮在另外18ml新鲜培养基中，以1∶5分到新的T-烧瓶中。培养物在37℃，5％CO2和70％湿度培育养，称为X+1代。在T-烧瓶中所有的随后传代培养中用0.25％胰蛋白酶EDTA的溶液代替依地酸。培养物通常每周两次按需要分成1∶10到1∶25。如可能不使细胞达到100％汇合。
B.使培养物适应悬浮培养培养物适应在补充有血清的CHO III PFM培养基的摇瓶中悬浮生长。在X+4代用来自T-烧瓶的细胞接种悬浮培养。悬浮培养基配方含有CHO III PFM(Gibco配方#96-03345A)；10％合格的热灭活胎牛血清(Gibco 10082)；1ml/L 25mM(1000X)L-甲硫氨酸磺亚胺溶液；和10ml/l 100X HT补充物(Gibco 11067)。
以1.7×105细胞/毫升的密度接种悬浮培养物。250mlCorning一次性摇瓶中，培养基体积是50ml。培养物在37℃，5％CO2，70％湿度下在摇床上以130rpm培养。当细胞密度达到1×106细胞/ml时，将培养物分成1∶3-1∶5，不分到密度低于2×105细胞/毫升。
细胞在悬浮摇瓶培养中的第一代被称为X代(来自T-烧瓶的X+5代)。培养物继续传代到含有10％胎牛血清的X+7代。在补充血清的培养基中适应悬浮生长花费约20天。
C.适应无血清悬浮生长逐渐降低培养基中的血清浓度，使悬浮培养物适应无血清生长。在戒除过程中培养基配方的所有其它成分不变。随着悬浮生长适应，如需要通过分成1∶3或1∶5将细胞维持在2.5×105-1×106细胞/毫升之间。培养物在130rpm的振摇器上，37℃，5％CO2，70％湿度培养。在第8代，将血清减少到5％，在第9代，到2％；在第10代，到1％；在第11代，离心细胞并重悬浮在40ml新鲜培养基/10ml条件培养基中，将血清浓度维持在1％(使大团和细胞碎片从培养物中沉淀出来，并除去)；在12-15代，血清维持在1％；在第15代，用60mg/L L-天冬氨酸、120mg/L L-丝氨酸、200mg/L L-天冬酰胺补充培养基，加入作为50x贮存液的60mg/L甲硫氨酸，调节到pH7.5并无菌过滤；在第16-21代，将血清减少到0℃，维持氨基酸补充物；在第21代，以1×107细胞/小瓶制备预接种贮存液(PSS)冷冻小瓶库。适应无血清培养基需要约55天。本文产生的无血清悬浮培养物称为PGF01。
D.冷冻培养物将细胞以500rpm在Beckman GPR离心机中离心10分钟，制备如上所述的细胞，用于冷冻和储藏。将细胞重悬浮在含有50％完全培养基(CHO-III-PFM，含有1ml/L 25mM 1000X甲硫氨酸磺亚胺贮存液，10ml/L HT补充物，20ml/L 50X氨基酸贮存液，3g/L L-天冬氨酸、6g/l L-丝氨酸、10g/L L-天冬酰胺、3g/L L-甲硫氨酸)的冷冻培养基中。“条件”培养基是一种细胞已在其中生长数天，离心细胞并分离出，然后无菌过滤；加入10g/l牛血清清蛋白作为保护剂；和75mg/lDMSO(Sigma Cell Culture Tested D2650)，密度为1×107细胞/ml，分散在冷冻小瓶中。在速度控制的冷冻器中以1℃/分钟冷冻细胞到-75℃，然后转移到液氮中储藏。
E.无血清悬浮主细胞库(MCB)的制备从液氮储藏中取出1小瓶的第X+21代培养物，在37℃水浴中快速融化，从X+21代细胞培养物中制备主细胞库。将小瓶的内容物转移到含有9ml新鲜培养基的15ml锥形管中，该培养基含有CHO III PFM(Gibco配方#96-03345A)；1ml/l25mM(1000X)L-甲硫氨酸磺亚胺贮存液；10ml/L 100x HT补充物(Gibco 11067)；20ml/L 50X氨基酸贮存液，调节到pH7.5，无菌过滤(贮存液3g/L-天冬氨酸、6g/LL-丝氨酸；10g/L L-天冬酰胺和3g/L L-甲硫氨酸)。
在Beckman GPR离心机中500rpm离心试管10分钟。弃去上清液，细胞从试管底部取出。在试管中加入10ml新鲜培养基，将悬浮的细胞转移到Corning 250ml摇瓶中。调节培养基体积至50ml，使培养物中的最初细胞密度是2×105细胞/ml。在37℃，5％CO2，70％湿度，在旋转摇床上以100rpm过夜培育培养物。培养第一天后，旋转摇床速度增加到130rpm。在无血清/无动物蛋白质悬浮培养中传了5代后，以1×107细胞/小瓶制备MCB。
实施例3A.产生接种培养物的培养基用下列成分制备接种培养物的培养基
1.0升含葡萄糖的CHO-III-PFM溶液(Life Technologies，定制配方98-0289；含有3.45g/l D-葡萄糖；不含次黄嘌呤、胸腺嘧啶、L-谷氨酰胺)；10.00ml/L HT补充物(Life Technologies，目录号11067-030；100x＝10mM次黄嘌呤钠，1.6mM胸腺嘧啶)；20.00ml/l氨基酸贮存液(如下文3B制备)；1.00ml/L 25mM L-甲硫氨酸磺亚胺储液(如下文3C制备)；25.00mg/l L-半胱氨酸(Sigma)；和0.50ml/l酚红(Sigma，0.5％(w/v)溶液)。
B.氨基酸贮存液通过在去离子水中溶解3.00g/l L-天冬氨酸(sigma)、2.50g/l L-谷氨酸(sigma)、10.00g/L L-天冬酰胺(Sigma)、1.25g/l L-脯氨酸(Sigma)、3.00g/L L-丝氨酸(Sigma)和1.50g/L L-甲硫氨酸(Sigma)，制备1升溶液，用5N氢氧化钠水溶液调节pH至8.0，然后无菌过滤得到的溶液，制备用于上述接种培养基的氨基酸贮存液。
C.L-甲硫氨酸磺亚胺贮存液将L-甲硫氨酸磺亚胺(25mmol，FW180.2，Sigma)溶于1升去离子水。用0.2微米滤膜过滤得到的溶液。可将该溶液维持在4℃达3个月，或可以在-2 0℃或以下冷冻储藏较长的时间。
实施例4接种物产生将1小瓶冷冻的PFG01种子细胞融化在36.5±1℃的水浴中，直到仅剩一小块冰。将小瓶转移到生物安全箱中，用无菌的70％异丙醇抹布对外部消毒。将细胞重悬浮在如实施例3a中制备的25ml预温生长培养基，并转移到125ml的摇瓶中。用台盼蓝染料排阻法(Cell and Tissue Culturelaboratory Procedures inBiotechnology，A.Doyle and J.B.Griffiths编(John Wiley & Sons，Ltd.，1998))对培养物进行采样。如需要，加入更多预温的生长培养基，将最终细胞浓度调节到约5.0×105vc/ml。在36.5±1℃，5±1％CO2浓度，70±5％相对湿度和170±5rpm的搅拌速率温育烧瓶。每天对烧瓶采样，检查细胞浓度和存活率。
每天加入足够的预温的生长培养基，以维持烧瓶中5.0×105vc/ml的浓度。当摇瓶体积达到50ml和细胞密度达到1.0×106vc/ml时，将培养物转移到250ml摇瓶中，稀释到100ml中5.0×105vc/ml。当细胞密度再次达到1.0×106vc/ml时，将培养物分开，一半转移到另一个250ml摇瓶中，稀释到2.5×105vc/ml。继续这些使种子系列扩增的步骤，直到达到足够的体积，在生物反应器中获得2.0×105vc/ml的接种密度。判断理想的接种比(接种培养物/接种后的反应器液体体积)是约10-20％。因此，将接种培养物中的细胞密度理想地调节到1.0×106-2.0×106vc/ml之间。接种培养物的寿命是约3天。
实施例5用于生产生物反应器中的培养基A.批量培养基混合下列成分制备NIF1生产的批量培养基1.0升含葡萄糖的CHO-III-PFM溶液(Life Technologies，定制配方98-0289；含有3.45g/l D-葡萄糖；不含次黄嘌呤、胸腺嘧啶、L-谷氨酰胺)；10.00ml/L HT补充物(Life Technologies)；1.50g/l酵母提取物(Bacto，Difco/Becton-Dickinson)；和0.50ml/l酚红(Sigma，0.5％(w/v)溶液)。
B.营养物进料1为了用作营养物进料1，将200g葡萄糖(来自结晶葡萄糖，Corn ProductsInternational)溶于去离子水，制备1升溶液。用该葡萄糖进料将反应器中的葡萄糖浓度控制在约1.5-2.5g/l。
C.营养物进料2为了用作营养物进料2，混合下列成分1.0升CHO-III-PFM 5X(调节到pH7.4)(Life Technologies，定制配方99-0180；含5X的1XL-半胱氨酸、3X L-酪氨酸；不含葡萄糖、次黄嘌呤、胸腺嘧啶、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠和氯化钠)。
50ml/l HT补充物(Life Technologies，目录号11067-030，100x＝10mM次黄嘌呤钠，1.6mM胸腺嘧啶)。
7.50克酵母抽提物(Difco，Bacto/Becton-Dickinson)。
在CHO-III-PFM 5X中加入HT补充物和酵母提取物。混合成分直到完全溶解，然后用5N氢氧化钠将pH调节到7.4，然后无菌过滤得到的溶液。
实施例6操作2升搅拌罐生物反应器在2升Wheaton生物反应器(B.Braun Biotech Inc.，Allentown，PA)中进行NIF1的生产，用Foxboro IA(智能应用)计算机系统(Foxboro Company，Foxboro，MA)控制。在生物反应器灭菌后，加入1升无菌调节溶液，无谷氨酰胺的DMEM(Life Technologies/Gibco BRL)。4小时后，用如实施例5A中制备的1升新鲜无菌生产批量培养基置换漂洗培养基。使培养基温度稳定在36.5±1℃，将pH调节到pH7.4。为了在反应器中获得约2.0×105活细胞/ml的目标密度，加入体积约200ml的接种培养物，以获得1.2升最初液体体积。
A.操作设定点设定了下列参数用于操作生物反应器。
搅拌100rpm(4英寸直径的单塑料垂直叶片)。
pH7.40±0.15(控制剂CO2气体和7.5％(w/v)NaHCO3溶液)。
溶解氧浓度60％±5％空气饱和(控制剂O2和N2)。
温度36.5℃营养物进料1200g/l葡萄糖溶液-以每天约0.0-6.0g/l进料。
气流量在顶部空间200-300ml/分钟稳定空气流量。根据控制pH和溶解氧的需要，将CO和CO2(出于安全目的使用N2中的60％O2)喷到培养物中。在溶解氧浓度超过其上限(65％)时，在顶部空间常常导入氮气。
以30ml/天的恒定速率(即在每天接种时，以25ml/升培养物的速率)连续供给营养物进料2。该进料与葡萄糖进料在48小时时通式开始，并在生产进行的整个过程中维持在该水平。
B.采样和维持接种后立即对生物反应器采样。采用下列测量值初始细胞密度和存活率；离线pH；初始葡萄糖浓度；初始乳酸基浓度；初始氨浓度；和初始重量克分子渗透压浓度。当需要时调节在线pH。用黑色塑料覆盖生物反应器，以保护培养基免受光。
每天对生物反应器采样，测定下列参数细胞密度；培养物存活率；离线pH；葡萄糖浓度；乳酸盐浓度；氨浓度；重量克分子渗透压浓度；和成熟NIF1浓度(在4天开始)。葡萄糖浓度用营养物进料1维持在0.1-3.0g/升。营养物进料1在48小时后开始进料，最初进料速率是每天约2.0g/升，或每天约2.0-3.0g葡萄糖/109活细胞，用定量泵与开/关定时器连接，周期为30分钟。如需要每天上午调节葡萄糖进料速率。所需的进料速率通常维持在每天0.0-6.0g/l范围内。恒定的营养进料2与葡萄糖进料同时开始。
C.用PFG01的NIF1生产方案在下文表IV中列出下列测量值，以观察使用PFG01细胞生产NIF1的进程。
表IV
根据Cell and Tissue Culturelaboratory Procedures in Biotechnology，A.Doyle and J.B.Griffiths编(John Wiley & Sons，Ltd.，1998)列出的台盼蓝染料排阻法测定细胞计数和存活率。用在发明详述中列出的方案测定NIF1滴度。用Kodak生物分析快速分析系统进行葡萄糖、乳酸盐和氨的测定。用先进的微量渗透计(3330型，Advanced Instruments，Inc.，Norwood，MA)测定重量克分子渗透压浓度。
实施例7NIF1唾液酸化/糖基化方案测试了从许多不同生物反应器过程中收集的NIF1唾液酸化/糖基化的程度，与标准样品的结果比较。从如实施例2中列出的，适合悬浮生长，但在含有牛血清清蛋白的培养基上培养的实施例1的细胞获得标准NIF1(STD)。通过Webster等，Xenobioteca，29(11)，pp.1141-55(1999)列出的方法如下检测唾液酸化/糖基化方案。
A.NIF1的去唾液酸化NIF1的去唾液酰化的方案用酸水解来释放唾液酸。加入0.2N HCl(1∶1 v/v)，80℃加热1小时使NIF1样品(2mg/ml)去唾液酸化。用Warren，J.Biol.Chem.，234，pp.1971-5(1995)开发的硫代巴比土酸法测定用酸水解反应释放的唾液酸。当观察到不再增加游离唾液酸时，终止温育。
B.总唾液酸测定唾液酸残基是从NIF1用酸水解(上文A部分)释放的，用具有脉冲电流检测的离子层析分析与NIF蛋白的聚糖、5-乙酰神经氨酸(neu5ac)结合的大部分唾液酸。将纯化的NIF样品稀释到0.1mg/ml的浓度。然后将样品(200微升)与200微升0.2N HCl混合，并在80℃加热1小时。然后在冰浴中冷却样品10分钟并离心。用Dionex Carbopac(PA-10 4.6×250mm柱(保护柱4.6×50mm Carbopac(PA-10)，具有0.2M NaOH和0.05M C2H30Na的流动相(流速＝0.7ml/分钟，用Dionex Ion PacATC-1流动相调节器调节流动相))分析含有5-乙酰基神经氨酸的上清液(20微升)，并用Dionex ED40检测器，用优化的糖类波形设定进行检测。在以上HPLC条件下，5-乙酰神经氨酸标准有10分钟的保留时间。在5-乙酰神经氨酸洗脱后进行洗脱步骤(0.2M NaOH和0.3M C2H3O2Na 5分钟)，在下一次注射之前重新平衡柱30分钟。列出的数据作为对照批量(即适应悬浮但是在牛血清清蛋白存在下制备的实施例1细胞制备的NIF1(STD)的标准样品)的百分数，唾液酸化表示的值中的增长代表了NIF1分子上唾液酸量的增加。表V列出了总唾液酸化数据。
C.寡糖负荷情况分析用酶肽-N-糖苷酶F(PNGase-F)从NIF1释放N-连接的寡糖。用2-氨基苯并酰胺(2-AB)标记释放的寡糖，并用阴离子交换层析分离。纯化的NIF1首先稀释成约0.05mg/ml浓度；加入4微升5％(w/v)的SDS和6微升1.44Mβ-巯基乙醇使50微升稀的NIF变性。在将样品静置约5分钟后，在样品中加入20微升7.5％NP-40和30微升(100mM Na2HPO4、10mM EDTA-二钠，pH7.6)的缓冲液。然后，加入10微升1mU/ml PNGase-F，将样品储藏在温箱里37℃、18-24小时。通过乙醇沉淀从去糖基化的蛋白质分离释放的寡糖，除去上清液并干燥。用标记试剂盒(用5微升标记试剂重悬浮样品，Signal 2-AB标记试剂盒(Oxford Glycoscience，产品号K-404))标记含有寡糖的干燥样品。在温育结束时通过在亲水膜(和试剂盒一起提供)上层析除去过量的标记试剂。将试剂混合液加到乙腈中的盘上，依次用乙腈和乙腈/水洗涤除去过量试剂。用水从盘中洗脱2-AB标记的寡糖并干燥。然后在Glycosep C HPLC柱(100×4.6mm，Oxford Glycosystems)上阴离子交换HPLC分析用2-AB标记的寡糖。在从80％水/20％乙腈-80％250mM乙酸铵，pH4.5/20％乙腈的梯度中洗脱寡糖35分钟，流速为0.3ml/分钟。用激发波长330nm和发射波长420nm进行荧光检测。典型的色谱图包括峰簇，首先洗脱的是不带电的物质，然后是一、二、三和四唾液酸化的簇。
指定一批NIF1(STD)用于方案控制。唾液腺化概况数据如表V所示。
实施例8NIF1药物动力学概况测试了从许多不同生物反应器收集的NIF的药物动力学清除率和半衰期数据，并将结果与从实施例1的细胞获得的NIF1的标准样品的结果比较，该细胞适应实施例2中列出的悬浮生长，但是在动物蛋白(BSA)存在下产生的。结果列于下表，作为与NIF1标准样品的比较。
A.动物的准备通过在颈静脉中插入导管(0.58mm内径，0.9mm外径，聚乙烯管，Portex Ltd.)准备颈静脉插管的Fischer 344大鼠，用常规兽医学技术将导管外置于颈后。在手术过程中，用70mg/kg盐酸开他敏(Vetalar，Parke-Davis Veterinary；100mg/ml)/10mg/kg赛拉嗪(Rompun注射2％，Bayer)，腹膜内注射麻醉大鼠。手术后，用1ml/kg皮下注射1/5稀释的Antisedan(Pfizer Animal Health，阿替美唑；5mg/ml)，逆转赛拉嗪。在实验期间皮下注射提供镇痛(盐酸丁丙诺非，0.1毫升1/4稀释的Vetergesic(Reckitt and Colman；0.3mg/ml))。恢复两天后，在尾静脉(推注)用剂量水平为2mg/kg的NIF1(剂量浓度为2mg/ml，以1ml/kg基础施用)对大鼠给药。对使用颈静脉插管的大鼠系列采样，并用两只大鼠确定各批NIF1的药物动力学。在下列时间点，用内在导管将血样(50微升)移入肝素化的试管中给药前，0.25，1，2，4，8，12，24和48小时。离心血样，除去血浆并冷冻储藏用于随后分析。用Delfia免疫试验(实施例8C)分析血浆样品的NIF1。
B.经分离灌注的大鼠肝脏制备物用Gardner等，Xenobiotica，25，pp185-187(1995)详述的方法，进行分离灌注的大鼠肝脏(IPRL)的制备。麻醉(静脉内，Intraval)所选的重量约250g的雄性大鼠，进行手术，给胆道、肝门静脉和上腔静脉插管。
以15ml/min流速对肝脏灌注含有经洗涤的人红细胞(13％)和10％(w/v)牛血清清蛋白(26％)的pH7.4 Krebs高碳酸氢盐缓冲液(61％)的灌注液。用95％氧/5％二氧化碳对该灌注液充氧，并通过肝门静脉进入肝脏，从腔静脉流出。在再循环模式中用总灌注体积150ml进行IPRL。在实验期间，以1.33ml/h速率灌注含有牛磺胆酸(24mg/ml)的溶液，以维持胆汁流。在储器中加入唾液酸缺乏的NIF1(0.25mg，实施例7A)，在2、5、10、15、20、30、45、60、75和90分钟后从储器除去灌注样品。在实验期间收集胆汁(0-90分钟)。对于竞争性研究，唾液酸缺乏的NIF(0.25mg)与唾液酸缺乏的胎球蛋白(10mg，Sigma A1908)一起施用。离心灌注样品并除去上清液，冷冻储藏用于随后分析。还冷冻储藏胆汁样品用于分析。用对血浆详述的Delfia免疫试验测定IPRL灌注液和胆汁样品中的NIFI浓度(实施例8C)。
C.NIF1血浆样品的分析用解离增强镧荧光免疫试验(Delfia)分析血浆样品。该试验是使用铕标记的单克隆抗-NIF抗体作为检测试剂的“夹心非竞争性免疫试验”。多克隆家兔抗-NIP抗体与用抗家兔抗体包涂的平板结合。样品或标准中的NIF与多克隆抗体结合，最后铕标记的单克隆抗体与结合的NIF上的另一个表位结合。加入“增强”溶液后，确定铕。为了进行该试验，需要5微升血浆。
血浆中的分析范围是0.1-40微克/毫升。评估了该试验的准确性，累积变动在0.1，3和40微克/毫升分别为10.5、3.4、6.3％。用质量控制样品检测试验日与日之间的表现。Delfia免疫试验的特性良好，先前用于确定许多含有分子的蛋白质的血浆浓度，包括干扰素(Ronnblom等，APMIS，105，pp.531-536(1997))、载脂蛋白D(Knipping等，J.Immunological Methods，202，pp.85-95(1997))、甲状腺球蛋白(Dai等，Clinical Biochemistry，29，pp.461-465(1996)和脂蛋白脂肪酶(Wicher等，J.Immunological Methods，192，pp.1-11(1996)))。
D.药物动力学分析用标准算法测定药物动力学。用log(血浆浓度)对时间的线性回归从血浆浓度的时间图确定消除速率常数(Kel)。用下列等式确定半衰期半衰期＝(Ln2)/Kel-用线性梯形法则从时间0到最后数据点计算在血浆浓度时间曲线(AUC)下的面积。用消除速率常数将AUC外推到无穷大。用下列关系计算消除率剂量除以AUC(0-∞)。分布体积是用下列关系计算的消除率除以消除速率常数。
IPRL中的肝脏提取值是通过IPRL中获得的清除率值除以IPRL流速(15ml/分钟)，并将该值乘以100计算的。清除率和半衰期测定的结果列于下表V。用说明书中上文所述的方法测定NIF1滴度。
表V
序列表<110>S.B.普卢希尔(Pluschkell，Stefanie B.)R.W.吉尔达特(Geldart，Roderick W.)L.何(Ho，Lewis)M.A.科勒尔(Koehler，Mark A.)C.A.奥基迪(Okediadi，Centy A.)S.J.皮亚(Pias，Steven J.)M.M.朱(Zhu，Marie M.)<120>制备嗜中性粒细胞抑制因子的方法<130>018813-0301456<140>
<141>
<160>11<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>825<212>DNA<213>犬钩虫(Ancylostoma caninum)<220>
<221>CDS<222>(1)..(822)<400>1atg gag gcc tat ctt gtg gtc tta att gcc att gct ggc ata gct cat 48Met Glu Ala Tyr Leu Val Val Leu Ile Ala Ile Ala Gly Ile Ala His1 5 10 15tcc aat gaa cac aac ctg agg tgc ccg cag aat gga aca gaa atg ccc 96Ser Asn Glu His Asn Leu Arg Cys Pro Gln Asn Gly Thr Glu Met Pro20 25 30ggt ttc aac gac tcg att agg ctt caa ttt tta gca atg cac aat ggt 144Gly Phe Asn Asp Ser Ile Arg Leu Gln Phe Leu Ala Met His Asn Gly35 40 45tac aga tca aaa ctt gcg cta ggt cac atc agc ata act gaa gaa tcc 192Tyr Arg Ser Lys Leu Ala Leu Gly His Ile Ser Ile Thr Glu Glu Ser50 55 60gaa agt gac gat gat gac gat ttc ggt ttt tta ccc gat ttc gct cca 240Glu Ser Asp Asp Asp Asp Asp Phe Gly Phe Leu Pro Asp Phe Ala Pro65 70 75 80agg gca tcg aaa atg aga tat ctg gaa tat gac tgt gaa gct gaa aaa 288Arg Ala Ser Lys Met Arg Tyr Leu Glu Tyr Asp Cys Glu Ala Glu Lys85 90 95agc gcc tac atg tcg gct aga aat tgc tcg gac agt tct tct cca cca 336Ser Ala Tyr Met Ser Ala Arg Asn Cys Ser Asp Ser Ser Ser Pro Pro100 105 110
gag ggc tac gat gaa aac aag tat att ttc gaa aac tca aac aat atc 384Glu Gly Tyr Asp Glu Asn Lys Tyr Ile Phe Glu Asn Ser Asn Asn Ile115 120 125agt gaa gct gct ctg aag gcc atg atc tcg tgg gca aaa gag gct ttc 432Ser Glu Ala Ala Leu Lys Ala Met Ile Ser Trp Ala Lys Glu Ala Phe130 135 140aac cta aat aaa aca aaa gaa gga gaa gga gtt ctg tac cgg tcg aac 480Asn Leu Asn Lys Thr Lys Glu Gly Glu Gly Val Leu Tyr Arg Ser Asn145 150 155 160cac gac ata tca aac ttc gct aat ctg gct tgg gac gcg cgt gaa aag 528His Asp Ile Ser Asn Phe Ala Asn Leu Ala Trp Asp Ala Arg Glu Lys165 170 175ttt ggt tgc gca gtt gtt aac tgc cct ttg gga gaa atc gat gat gaa 576Phe Gly Cys Ala Val Val Asn Cys Pro Leu Gly Glu Ile Asp Asp Glu180 185 190acc aac cat gat gga gaa acc tat gca aca acc atc cat gta gtc tgc 624Thr Asn His Asp Gly Glu Thr Tyr Ala Thr Thr lle His Val Val Cys195 200 205cac tac ccg aaa ata aac aaa act gaa gga cag ccg att tac aag gta 672His Tyr Pro Lys Ile Asn Lys Thr Glu Gly Gln Pro Ile Tyr Lys Val210 215 220ggg aca cca tgc gac gat tgc agt gaa tac aca aaa aaa gca gac aat 720Gly Thr Pro Cys Asp Asp Cys Ser Glu Tyr Thr Lys Lys Ala Asp Asn225 230 235240acc acg tct gcg gat ccg gtg tgt att ccg gat gac gga gtc tgc ttt 768Thr Thr Ser Ala Asp Pro Val Cys Ile Pro Asp Asp Gly Val Cys Phe245 250 255att ggc tcg aaa gcc gat tac gat agc aag gag ttt tat cga ttc cga 816Ile Gly Ser Lys Ala Asp Tyr Asp Ser Lys Glu Phe Tyr Arg Phe Arg260 265 270gag tta tga 825Glu Leu<210>2<211>274<212>PRT<213>犬钩虫(Ancylostoma caninum)<400>2Met Glu Ala Tyr Leu Val Val Leu Ile Ala Ile Ala Gly Ile Ala His1 5 10 15Ser Asn Glu His Asn Leu Arg Cys Pro Gln Asn Gly Thr Glu Met Pro20 25 30Gly Phe Asn Asp Ser Ile Arg Leu Gln Phe Leu Ala Met His Asn Gly35 40 45Tyr Arg Ser Lys Leu Ala Leu Gly His Ile Ser Ile Thr Glu Glu Ser50 55 60Glu Ser Asp Asp Asp Asp Asp Phe Gly Phe Leu Pro Asp Phe Ala Pro65 70 75 80Arg Ala Ser Lys Met Arg Tyr Leu Glu Tyr Asp Cys Glu Ala Glu Lys85 90 95Ser Ala Tyr Met Ser Ala Arg Asn Cys Ser Asp Ser Ser Ser Pro Pro
100 105 110Glu Gly Tyr Asp Glu Asn Lys Tyr Ile Phe Glu Asn Ser Asn Asn Ile115 120 125Ser Glu Ala Ala Leu Lys Ala Met Ile Ser Trp Ala Lys Glu Ala Phe130 135 140Asn Leu Asn Lys Thr Lys Glu Gly Glu Gly Val Leu Tyr Arg Ser Asn145 150 155 160His Asp Ile Ser Asn Phe Ala Asn Leu Ala Trp Asp Ala Arg Glu Lys165 170 175Phe Gly Cys Ala Val Val Asn Cys Pro Leu Gly Glu Ile Asp Asp Glu180 185 190Thr Asn His Asp Gly Glu Thr Tyr Ala Thr Thr Ile His Val Val Cys195 200 205His Tyr Pro Lys Ile Asn Lys Thr Glu Gly Gln Pro Ile Tyr Lys Val210 215 220Gly Thr Pro Cys Asp Asp Cys Ser Glu Tyr Thr Lys Lys Ala Asp Asn225 230 235 240Thr Thr Ser Ala Asp Pro Val Cys Ile Pro Asp Asp Gly Val Cys Phe245 250 255Ile Gly Ser Lys Ala Asp Tyr Asp Ser Lys Glu Phe Tyr Arg Phe Arg260 265 270Glu Leu<210>3<211>257<212>PRT<213>犬钩虫(Ancylostoma caninum)<220>
<221>PEPTIDE<222>(1)..(257)<400>3Asn Glu His Asn Leu Arg Cys Pro Gln Asn Gly Thr Glu Met Pro Gly1 5 10 15Phe Asn Asp Ser Ile Arg Leu Glu Phe Leu Ala Met His Asn Gly Tyr20 25 30Arg Ser Lys Leu Ala Leu Gly His Ile Ser Ile Thr Glu Glu Ser Glu35 40 45Ser Asp Asp Asp Asp Asp Phe Gly Phe Leu Pro Asp Phe Ala Pro Arg50 55 60Ala Ser Lys Met Arg Tyr Leu Glu Tyr Asp Cys Glu Ala Glu Lys Ser65 70 75 80Ala Tyr Met Ser Ala Arg Asn Cys Ser Asp Ser Ser Ser Pro Pro Glu85 90 95Gly Tyr Asp Glu Asn Lys Tyr Ile Phe Glu Asn Ser Asn Asn Ile Ser100 105 110Glu Ala Ala Leu Lys Ala Met Ile Ser Trp Ala Lys Glu Ala Phe Asn115 120 125Leu Asn Lys Thr Lys Glu Gly Glu Gly Val Leu Tyr Arg Ser Asn His130 135 140Asp Ile Ser Asn Phe Ala Asn Leu Ala Trp Asp Ala Arg Glu Lys Phe
145 150 155 160Gly Cys Ala Val Val Asn Cys Pro Leu Gly Glu Ile Asp Asp Glu Thr165 170 175Asn His Asp Gly Glu Thr Tyr Ala Thr Thr Ile His Val Val Cys His180 185 190Tyr Pro Lys Ile Asn Lys Thr Glu Gly Gln Pro Ile Tyr Lys Val Gly195 200 205Thr Pro Cys Asp Asp Cys Ser Glu Tyr Thr Lys Lys Ala Asp Asn Thr210 215 220Thr Ser Ala Asp Pro Val Cys Ile Pro Asp Asp Gly Val Cys Phe Ile225 230 235 240Gly Ser Lys Ala Asp Tyr Asp Ser Lys Glu Phe Tyr Arg Phe Arg Glu245 250 255Leu<210>4<211>8<212>PRT<213>犬钩虫(Ancylostoma caninum)<400>4Lys Ala Met Ile Ser Trp Ala Lys1 5<210>5<211>8<212>PRT<213>犬钩虫(Ancylostoma caninum)<400>5Glu Phe Tyr Arg Phe Arg Glu Leu1 5<210>6<211>11<212>PRT<213>犬钩虫(Ancylostoma caninum)<400>6Asp Ile Ser Asn Phe Ala Asn Leu Ala Trp Asp1 5 10<210>7<211>30<212>PRT<213>犬钩虫(Ancylostoma caninum)<400>7Asp Glu Asn Lys Tyr Ile Phe Glu Asn Ser Asn Asn Ile Ser Glu Ala1 510 15Ala Leu Lys Ala Met Ile Ser Trp Ala Lys Glu Ala Phe Asn20 25 30
<210>8<211>885<212>DNA<213>部分犬钩虫(Ancylostoma caninum)<400>8ggcgaattca ccatggaggc ctatcttgtg gtcttaattg ccattgctgg catagctcat 60tccaatgaac acaacctgag gtgcccgcag aatggaacag aaatgcccgg tttcaacgac 120tcgattaggc ttcaattttt agcaatgcac aatggttaca gatcaaaact tgcgctaggt 180cacatcagca taactgaaga atccgaaagt gacgatgatg acgatttcgg ttttttaccc 240gatttcgctc caagggcatc gaaaatgaga tatctggaat atgactgtga agctgaaaaa 300agcgcctaca tgtcggctag aaattgctcg gacagttctt ctccaccaga gggctacgat 360gaaaacaagt atattttcga aaactcaaac aatatcagtg aagctgctct gaaggccatg 420atctcgtggg caaaagaggc tttcaaccta aataaaacaa aagaaggaga aggagttctg 480taccggtcga accacgacat atcaaacttc gctaatctgg cttgggacgc gcgtgaaaag 540tttggttgcg cagttgttaa ctgccctttg ggagaaatcg atgatgaaac caaccatgat 600ggagaaacct atgcaacaac catccatgta gtctgccact acccgaaaat aaacaaaact 660gaaggacagc cgatttacaa ggtagggaca ccatgcgacg attgcagtga atacacaaaa 720aaagcagaca ataccacgtc tgcggatccg gtgtgtattc cggatgacgg agtctgcttt 780attggctcga aagccgatta cgatagcaag gagttttatc gattccgaga gttatgaata 840agtcgagacg tataaagaag ccaaggcaac gtaagcgaga atttc 885<210>9<211>1845<212>DNA<213>犬钩虫(Ancylostoma caninum)<400>9agttctcaga tagtcacagt agcccttctt ttcattgtac acaagtgaag atgggcactt 60catggtagtc gcgactcctt cattacagta aacatagtcg gatgtgcatc ccaacgaata 120gtagccattc tgctttgtct tgcagtcaac ggtcttcgca atttgtggta cagcagcagg 180agccggaggc tgcatcgctg gagctgctgg tggagctggc acaacagaag ccggaggtgg 240agcaaccagt tcaggcgtgc agttctcagg atagtcgcag tagcccttct tctcatggta 300tacaagtgaa gaatggaggc ctatcttgtg gtcttaattg ccattgctgg catagctcat 360tccaatgaac acaacctgag gtgcccgcag aatggaacag aaatgcccgg tttcaacgac 420tcgattaggc ttcaattttt agcaatgcac aatggttaca gatcaaaact tgcgctaggt 480cacatcagca taactgaaga atccgaaagt gacgatgatg acgatttcgg ttttttaccc 540gatttcgctc caagggcatc gaaaatgaga tatctggaat atgactgtga agctgaaaaa 600agcgcctaca tgtcggctag aaattgctcg gacagttctt ctccaccaga gggctacgat 660gaaaacaagt atattttcga aaactcaaac aatatcagtg aagctgctct gaaggccatg 720atctcgtggg caaaagaggc tttcaaccta aataaaacaa aagaaggaga aggagttctg 780taccggtcga accacgacat atcaaacttc gctaatctgg cttgggacgc gcgtgaaaag 840tttggttgtc gcagttgtta actgcccttt gggagaaatc gatgatgaaa ccaaccatga 900tggagaaacc tatgcaacaa ccatccatgt agtctgccac tacccgaaaa taaacaaaac 960tgaaggacag ccgatttaca aggtagggac accatgcgac gattgcagtg atacacaaaa 1020aaagcagaca ataccacgtc tgcggatccg gtgtgtattc cggatgacgg agtctgcttt 1080attggctcga aagccgatta cgatagcaag gagttttatc gattccgaga gttatgaata 1140agtcgagacg tataaagaag ccaaggcaac gtaagcgagc aagtctcgaa gacgatggag 1200tcagcgaaag aggcggctgc caaagttggc gagcaggtgt cagatttttt ccaagggaac 1260ccattttcca cgcctgtggg ccgcaagata gaacttgcca cgaacgcttc gattcttgca 1320ctgagaattg gggtttgaac atggaaatct gtgatttcgt caataacact gaggacggtg 1380
ccaaagatgc tgtacgggct attcgcaaac gtctgcacac aaatatgtgt aagaataacg 1440caatcgtcat gtacacatta acggtgctgg agacgtgcgt gaagaactgt ggccataatt 1500tccacgtgct cgtatgttcc aaggactttg tgcaggattt ggtgaagttg atcggctcga 1560agttcgatac gcctcagatt attcacgagc gtgtattgtc acttattcag gcttgggcag 1620atgcattccg caatcaacca gatcttcagg gagtcgtaca ggtctatgaa gaacttgtta 1680gtaagggggt tacattccct gcaactgatc tagacgctat ggcacctata ctaacaccaa 1740aacaaacagt cttcactgag ccaaaggcat caacggctgt tccttcgcag tcaggtggag 1800gacctagtta cgaggtggtc agccaaccag atggtccaat ttact 1845<210>10<211>43<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述来自克隆载体的合成序列<400>10ctgcagtcac cgtccttgac acaagcttga tatcgaattc acc43<210>11<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述来自克隆载体的合成序列<400>11ataagtcgag acgtataaag aagccaaggc aacgtaagcg agaattcctg cagcccggg 59
权利要求
1.一种制备嗜中性粒细胞抑制因子的方法，其特征在于，该方法包括步骤在无动物成分的培养基中培养表达嗜中性粒细胞抑制因子的细胞系，以得到生产培养物，所述培养基选自接种生长培养基、生产生长培养基和营养物进料。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嗜中性粒细胞抑制因子是SEQID NO3的蛋白质。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质是糖基化的，具有约38.3-64.1kDa的相对分子量。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质约5-25％-唾液酸化；约10-30％二唾液酸化；约15-35％三唾液酸化；约15-45％四唾液酸化；和约1-20％无唾液酸化。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无动物成分生产生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)次黄嘌呤钠/胸腺嘧啶溶液；和(iii)酵母提取物。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无动物成分生产生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)约5-20ml/l(i)的10mM次黄嘌呤钠/1.6M胸腺嘧啶溶液；和(iii)约0.5-5.0g/升(i)的酵母提取物。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无动物成分生产生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)10.0ml/l(i)的10mM次黄嘌呤钠/1.6M胸腺嘧啶溶液；和(iii)1.5g/升(i)的酵母提取物。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括步骤(a)提供接种物，所述接种物是通过在无动物成分的接种生长培养基中培养表达嗜中性粒细胞抑制因子的细胞系；和(b)将所述接种物转移到含无动物成分的生产生长培养基的容器中。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述接种生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)次黄嘌呤钠/胸腺嘧啶溶液；(iii)氨基酸溶液，含有选自L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-甲硫氨酸的氨基酸；(iv)可任选的，L-甲硫氨酸磺亚胺溶液；和(v)L-半胱氨酸溶液。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述接种生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)约5-20ml/L(i)的10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸腺嘧啶溶液；(iii)约5-30ml/l(i)的氨基酸溶液，含有3.0g/l的L-天冬氨酸、2.5g/l的L-谷氨酸、10.0g/l的L-天冬酰胺、1.25g/l的L-脯氨酸、3.0g/l的L-丝氨酸和1.5g/l的L-甲硫氨酸；(iv)约0-75μmol/l(i)的L-甲硫氨酸磺亚胺溶液；和(v)约10-40mg/l(i)的L-半胱氨酸。
11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述接种生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)10.0ml/L(i)的10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸腺嘧啶溶液；(iii)20.0ml/l(i)的氨基酸溶液，含有3.0g/l的L-天冬氨酸、2.5g/l的L-谷氨酸、10.0g/l的L-天冬酰胺、1.25g/l的L-脯氨酸、3.0g/l的L-丝氨酸和1.5g/l的L-甲硫氨酸；(iv)可任选的1.0ml/l(i)的25mM L-甲硫氨酸磺亚胺溶液；和(v)25.0mg/l(i)的L-半胱氨酸溶液。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，该方法还包括步骤(c)用至少一种营养物进料供给生产培养物。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)包括第一营养物进料和第二营养物进料。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一营养物进料是含有约100-500g/l葡萄糖的水溶液的营养物进料。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一营养物进料是含有约200g/l葡萄糖的水溶液的营养物进料。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一营养物进料以每天每升生长培养基约0.0-0.6克葡萄糖的速率加入。
17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第二营养物进料含有(i)CHO-III-PFM(5X)溶液，含有1X L-半胱氨酸、3X L-酪氨酸，不含葡萄糖、次黄嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠或氯化钠；(ii)每升溶液(i)25-100ml 10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液；和(iii)每升溶液(i)5-20g酵母提取物。
18.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第二营养物进料含有(i)CHO-III-PFM(5X)溶液，含1X L-半胱氨酸，3X L-酪氨酸，不含葡萄糖、次黄嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠、氯化钠；(ii)每升溶液(i)50ml 10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液；和(iii)每升溶液(i)7.5g酵母提取物。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，第二营养物进料以每天每升约25ml的速率连续加到反应器中。
20.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述营养物进料含有约100-500g/L葡萄糖，所述第二营养物进料含有(1)CHO-III-PFM(5x)溶液，(2)每升(1)约25-100ml的10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸腺嘧啶溶液；和(3)每升(1)约5-5g酵母提取物。
21.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述营养物进料是含有约100-500g/l葡萄糖的水溶液的营养物进料。
22.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述第一营养物进料是含有约200g/l葡萄糖的水溶液的营养物进料。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述营养物进料以每天每升生长培养基约0.0-0.6克葡萄糖的速率加入。
24.用权利要求1所述的方法制备的嗜中性粒细胞抑制因子。
25.一种无动物成分生产生长培养基，其特征在于，该培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)次黄嘌呤钠/胸腺嘧啶溶液；和(iii)酵母提取物。
26.如权利要求25所述的培养基，其特征在于，所述培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)约5-20ml/l(i)的10mM次黄嘌呤钠/1.6M胸腺嘧啶溶液；和(iii)约0.5-5.0g/升(i)的酵母提取物。
27.如权利要求25所述的培养基，其特征在于，所述培养基含有；(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)10.0ml/l(i)的10mM次黄嘌呤钠/1.6M胸腺嘧啶溶液；和(iii)1.5g/升(i)的酵母提取物。
28.一种制备重组蛋白质的方法，其特征在于，该方法包括在权利要求25所述的无动物成分生长培养基中培养表达外源重组蛋白质的哺乳动物细胞。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞是被含有重组蛋白DNA编码区的谷氨酰胺合成酶质粒载体转染的中国仓鼠卵巢细胞。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述载体是选自pEE14和pEE14.1的谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺亚胺共扩增载体。
31.一种接种生长培养基，其特征在于，该培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)次黄嘌呤钠/胸腺嘧啶溶液；(iii)氨基酸溶液，含有选自L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-丝氨酸和L-甲硫氨酸的氨基酸；(iv)可任选的，L-甲硫氨酸磺亚胺溶液；和(v)L-半胱氨酸溶液。
32.如权利要求31所述的接种生长培养基，其特征在于，该培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)约5-20ml/L(i)的10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸腺嘧啶溶液；(iii)约5-30ml/l(i)的氨基酸溶液，含有约3.0g/l的L-天冬氨酸、约2.5g/l的L-谷氨酸、约10.0g/l的L-天冬酰胺、约1.25g/l的L-脯氨酸、约3.0g/l的L-丝氨酸和约1.5g/l的L-甲硫氨酸；(iv)约0-75μmol/l(i)的L-甲硫氨酸磺亚胺；和(v)约10-40mg/l(i)的L-半胱氨酸溶液。
33.如权利要求32所述的接种生长培养基，其特征在于，所述接种生长培养基含有(i)CHO-III-PFM/葡萄糖溶液；(ii)10.0ml/L(i)的10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸腺嘧啶溶液；(iii)20.0ml/l(i)的氨基酸溶液，含有3.0g/l的L-天冬天氨酸、2.5g/l的L-谷氨酸、10.0g/l的L-天冬酰胺、1.25g/l的L-脯氨酸、3.0g/l的L-丝氨酸和1.5g/l的L-甲硫氨酸；(iv)可任选的1.0ml/l(i)的25mM L-甲硫氨酸磺亚胺溶液；和(v)25.0mg/l(i)的L-半胱氨酸溶液。
34.一种营养物进料，其特征在于，该进料含有(i)CHO-III-PFM(5x)溶液，含有1x L-半胱氨酸、3X L-酪氨酸，不含葡萄糖、次黄嘌呤、胸苷、L-谷氨酰胺、碳酸氢钠或氯化钠；(ii)每升溶液(i)25-111ml 10mM次黄嘌呤钠/1.6mM胸苷溶液；和(iii)每升溶液(i)5-20g酵母提取物。
35.细胞系PFG-01ATCC PTA-2503。
36.一种制备嗜中性粒细胞抑制因子的方法，其特征在于，该方法包括在促进嗜中性粒细胞抑制因子表达的条件下培养权利要求35所述的细胞系，并回收嗜中性粒细胞抑制因子。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述嗜中性粒细胞抑制因子含有SEQ ID NO3的氨基酸序列。
38.通过培养细胞系PFG01ATCC PTA-2503制备的嗜中性粒细胞抑制因子。
39.用权利要求36或37所述的方法制备的嗜中性粒细胞抑制因子。
40.如权利要求1-23任一所述的方法，其特征在于，所述细胞系是PFG01ATCCPTA-2503。
41.用权利要求1-23任一所述的方法制备的嗜中性粒细胞抑制因子。
42.一种分离的嗜中性粒细胞抑制因子，其特征在于，该抑制因子具有嗜中性粒细胞抑制活性，具有由细胞系PFG01ATCC PTA-2503产生的SEQ ID NO3的氨基酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种制备嗜中性粒细胞抑制因子(NIF)的方法，它包括在无动物成分的生长培养基中培养表达NIF的哺乳动物细胞。本发明可用于大规模制备NIF。本发明还涉及制备重组蛋白质的方法，它包括在无动物成分的生长培养基中培养表达外源重组蛋白质的哺乳动物细胞。
文档编号A61K38/00GK1531592SQ01816825
公开日2004年9月22日 申请日期2001年8月15日 优先权日2000年8月23日
发明者S·B·普卢希尔, R·W·吉尔达特, L·何, M·A·科勒尔, C·A·奥基迪, S·J·皮亚, M·M·朱, S·J·霍赖利, M·莫伊尔, S B 普卢希尔, 吉尔达特, 奥基迪, 朱, 炼, 皮亚, 科勒尔, 霍赖利 申请人:菲塞产品股份有限公司, 科尔凡斯国际股份有限公司