专利名称：用于生产现成可用的加载抗原或未加载抗原的冷藏成熟树突细胞的方法
技术领域：
本发明涉及用于制备现成可用的冷藏成熟树突细胞的方法，尤其是用于制备含有这类树突细胞的疫苗的方法，其中在合适的成熟刺激物存在下培养未成熟树突细胞，并且将如此获得的成熟树突细胞冷冻。在冷冻之前或之后，可以给所述树突细胞加载抗原。本发明也涉及用按照本发明的方法获得的疫苗，还涉及含有加载抗原的冷冻成熟树突细胞的组合物。
背景技术：
树突细胞(在下文简称为“DC”)是抗原呈递细胞，通过与淋巴细胞相互作用而影响免疫系统。大多数DC表现出免疫刺激活性。这些典型的DC在体内可以以不同方式诱导辅助性T细胞和杀伤性T细胞的形成(“天然佐剂”)。特别是，在外周组织中存在的未成熟DC具有结合抗原并且由其制备免疫原性MHC肽复合体(“抗原加工模式”)的能力。当成熟诱导刺激物例如炎性细胞因子作用时，这些未成熟DC发育为通过增加粘着分子和共同刺激分子的形成的有效T细胞刺激物(“T细胞刺激模式”)。同时，所述细胞迁移到二级淋巴器官，以选择并刺激罕见的抗原特异性T细胞。可以表明，从组织或血液分离出并且在体外加载抗原的DC在作为成熟DC注射回体内之后具有免疫原性。最近，已经表明DC在健康人和癌症患者体内都可以诱导CD4+T细胞免疫和CD8+T细胞免疫。在有免疫能力的健康受治疗者中，一次加强注射成熟DC，可以不仅增强CD8+T细胞应答的频率，而且也增强其官能亲和力。由于这些原因，DC(尤其是成熟DC)是目前极具前景的诱导人类抗肿瘤和抗感染的有效T细胞应答的佐剂。
DC应用于免疫治疗的一个先决条件是开发允许从增殖性CD34+前体细胞或从非增殖性或很少增殖的CD14+单核细胞前体细胞产生大量培养DC的技术。衍生于单核细胞的DC目前是常用的，因为它们容易制备，无需用任何细胞因子预处理供体，并且所得的DC群体相当均一并且已被很好地表征。例如，可以在(GM-CSF+IL-4)中培养通常6-7天的培养期间，在无胎牛血清(FCS)的情况下，可以从贴壁单核细胞制备未成熟DC，然后通常让其成熟1-3天，用自体单核细胞条件培养基诱导所述成熟。已经证明为树突细胞或其前体细胞提供有效的冷藏是极其困难的，除非在FCS存在下(Taylor等(1990)Cryobiology 27，269；Makino等(1997)Scand.J.Immunol.45，618)。然而，由于在疫苗接种时必须不能存在FCS，所以仍必需从新鲜血液、新鲜的白细胞提取(leucapheresate)产物或者从新鲜白细胞提取产物的冷冻PBMC(“外周血单核细胞”)等份样品新鲜制备DC，以供每次DC疫苗接种用(Thumer等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。冷冻PBMC也有在解冻后所述细胞必须首先培养数天以便分化为DC的缺点。Lewalle等(2000)J.Immunol.Methods 240，69-78公开了一种冷冻未成熟DC的方法，但仅获得收率不好的存活细胞(第71页，左栏顶部)。在WO 99/46984中也公开了借助GM-CSF和IL-4冷冻从单核细胞制备的未成熟树突细胞。
因此，本发明的一个目的是提供一种含有成熟DC的组合物，例如疫苗，所述DC可以贮存延长的时间，而活性没有相当大的损失，并且可以在需要时在短时间内给予。
按照本发明使用的DC最好来源于用所述疫苗治疗的同一患者(自体的)。另一方面，所述DC也可以来源于其它患者(异体的)，例如来源于正常志愿者的白细胞提取物，如例如Thumer等(1999)J.Immunol.Methods 283，1-15中所述。
出乎意料的是，已经发现仅通过在具有特定成熟刺激物的合适“成熟混合剂”存在下培养获得的完全成熟的DC(在下文也简称为“天然DC”)，在无FCS下冷冻和解冻后以高百分比存活，并且具有与新鲜制备的成熟DC相当的免疫刺激活性。在用所述成熟混合剂培养期间，未成熟DC分化为成熟DC。一种特别优选的成熟混合剂含有白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、前列腺素E2(PGE2)和“肿瘤坏死因子α”(TNFα)。
因此，本发明涉及(1)一种制备现成可用的冷藏成熟树突细胞的方法，所述方法包括(a)提供未成熟的树突细胞(DC)；(b)在含有成熟混合剂的培养基中培养所述未成熟DC以获得成熟DC，其中所述成熟混合剂具有一种或多种成熟刺激物；(c)在不含任何异种血清的冷冻介质中冷冻所述成熟DC；(2)一种上述(1)中限定的适用于从冷藏成熟DC制备疫苗的方法；(3)冷冻的加载抗原的成熟树突细胞，尤其是可用方法(1)获得那些树突细胞；(4)一种疫苗，所述疫苗包含(3)中限定的树突细胞；和(5)一种发现冷冻DC的有利条件的方法，所述方法包括下述步骤(a)提供未成熟DC；(b)在不同成熟刺激物存在下用所述未成熟DC进行不同的培养；(c)然后在有或无细胞因子的培养基中培养所述DC，优选在无细胞因子的情况下进行培养；(d)在有或无细胞因子的所述培养基中培养至少1天后，测定活细胞的比率；且(e)确立给出最高存活率的成熟刺激物。
在本发明的方法(1)和(2)中，首先培养未成熟DC，在所述培养基中加入具有一种或多种成熟刺激物的合适成熟混合剂。合适的成熟刺激物包括IL-1例如IL-1β等、IL-6、TNF-α、前列腺素例如PGE2等、IFN-α、脂多糖和其它细菌细胞产物例如MPL(单磷酰脂质A)、脂磷壁酸质等、磷酸胆碱、钙离子载体、佛波醇酯例如PMA、热激蛋白、核苷酸例如ATP等、脂肽、Toll样受体的人工配体、双链RNA例如poly-IC等、免疫刺激性DNA序列、CD40配体等。按照本发明，尤其优选所述培养基或成熟混合剂含有IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα，或者所述成熟混合剂是单核细胞条件培养基(MCM)或补充PGE2的MCM。在方法(1)和(2)的一个优选实施方案中，可以在所述培养步骤期间或之后给所述DC加载抗原。在成熟和任选地加载抗原后，将所述DC在不含任何异种血清例如FCS的冷冻介质中冷冻。在本申请含义内的“异种血清”是一种不是来源于人类的血清。然而，按照本发明，有可能使用自体血清或血浆(它来源于与所述DC相同的人)和异体血清或血浆(它来源于与所述DC不同的人)。
本申请含义内的未成熟DC是与所述成熟DC相比仅表达少量I类和II类MHC分子以及粘着或共同刺激分子(例如特别是CVD86、CD80、CD40)、在合适成熟刺激物下将分化为成熟DC的CD83(和/或p55/fascin和/或DC-LAMP)阴性(或仅弱阳性和/或至一定的低百分比)白细胞。
本申请含义内的成熟DC是在成熟刺激物作用下已经从未成熟DC发育的、表现出CD83(和/或p55/fascin和/或DC-LAMP)以及II类和I类MHC分子和粘着或共同刺激分子(尤其是CD86、CD80、CD40)的表达增强的白细胞。此外，成熟DC与未成熟DC相比表现出T细胞刺激能力明显增强(例如与未成熟DC相反，它们甚至在DC∶T之比为大约≤1∶100的同种异体MLR中也表现出明显刺激活性；另外，本申请含义内的成熟DC的一个特征是这样一种事实这些DC是稳定的，即即使在无细胞因子的情况下培养1-2天或更长时间，这些DC也将保持其成熟表型和强T细胞刺激能力的特性。相反，尚未完全成熟的DC不稳定，将分化为未成熟DC，即例如分化为贴壁巨噬细胞。
所述未成熟DC可以由各种已知来源提供。未成熟DC的前体细胞通常是非增殖性CD14阳性单核细胞(PBMC；单核细胞)或增殖性CD34阳性细胞。例如，PBMC可以从白细胞提取产物中分离。正如已描述的，PBMC可以分化为未成熟DC(Thurner等(1999)J.Exp.Med.190，1669)。因此，可以在IL-4(或IL-13；Romani等(1996)J.Immunol.Methods 196，137-151)和GM-CSF(“粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子”)存在下，培养所述PBMC。从CD14阳性细胞，通过在GM-CSF和IFNα存在下培养，也可以制备未成熟DC(Santini等(2000)J.Exp.Med.191，1777-1788)。从CD34阳性单核细胞，通过在GM-CSF、SCF(“干细胞生长因子”)和TNFα存在下培养，可以获得未成熟DC。也可以直接从新鲜血液中获得未成熟树突细胞，例如在Nestle等(1998)Nat.Med.4,328中所述。预先生成的CD11c+和CD11c-DC(O-Doherty等(1994)Immunology 82，487-493)和M-DC8-DC(Schakel等(1999)Pathobiology67，287-290)也存在于血液中。这些DC也可以从血液中分离，可以进一步用于按照本发明的方法中。
所述培养基中各种成熟刺激物的优选浓度在0.1ng/ml至100μg/ml、优选1ng/ml至10μg/ml的范围。对于本发明的特别优选的成熟混合剂而言，成熟刺激物的浓度为0.1-100ng/ml IL-1β、0.1-100ng/mlIL-6、0.1-10μg/ml PGE2和0.1-100ng/ml TNFα(最优选这些特定成熟刺激物的浓度为大约10ng/ml IL-1β、10 ng/ml IL-6、1μg/ml PGE2和10ng/ml TNFα)。所述的浓度是所述物质在培养所述DC的细胞培养基中的终浓度。在上述活性物质存在下使所述DC成熟的一种可能是在单核细胞条件培养基(MCM)存在下培养所述未成熟DC。MCM含有IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα。它可以通过在无细胞因子的培养基中培养PBMC而获得，如例如在Romani等(1996)J.Immunol.Methods 196，137中所述。当用MCM使所述DC成熟时，所述培养基含有1-100％、优选5-25％的MCM。在本发明的另一实施方案中，所述DC的成熟通过添加MCM和限定量的PGE2来实现。换句话说，已经发现，MCM以最佳的可能方式使DC成熟的能力的变化可以通过添加PGE2(最好在上述浓度范围内)来抵消。然而，按照本发明，最好通过添加已确定的最适量的活性物质IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα来使所述DC成熟。这意味着用所述各种活性物质的纯化制剂制备所述成熟组合物。从而与用MCM或MCM+PGE2成熟相比，获得更好的结果。IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα是可得到的，为GMP(“良好生产操作规程”)级。通常，通过在所述物质存在下培养至少1小时、优选2小时、更优选至少6小时，实现所述成熟。按照本发明，特别优选成熟时间为6-96小时，优选18-36小时(当使用白细胞提取物用作原料时)或36-60小时(当用新鲜血液或血沉棕黄层作为原料时)。
按照本发明，在上述成熟步骤期间和/或之后，给所述DC加载至少一种抗原或抗原-抗体复合体。按照本发明，可以在冷冻期间或者之后，完成所述抗原加载。如果在冷冻之后实现加载，则仅在解冻之后给所述DC加载抗原。然而，优选在将所述DC冷冻之前加载抗原。其优点是，所述DC在解冻后立即可用。
本申请含义内的抗原是蛋白质、蛋白质片段、肽和由其衍生的分子(例如糖基化化合物或具有其它化学修饰的化合物)，但也可以是编码它们的核酸、病毒、完整的原核或真核细胞或其片段或凋亡的细胞。“加载抗原”是指使所述DC细胞表面的MHC分子“呈递”肽、即肽与所述MHC分子形成复合体的过程。虽然有可能通过特定的肽直接加载所述MHC分子，但是必须首先加工蛋白质(或蛋白质片段)，即首先由所述细胞摄取蛋白质(或蛋白质片段)。在胞内切割所述蛋白质并给MHC加载肽后，MHCII-肽复合体呈递到细胞表面。合适的抗原主要包括蛋白质或蛋白质片段。所述蛋白质可以是天然来源的，或者是重组制备的。由于成熟和加载蛋白质抗原，包含加入的所述抗原的肽片段的MHCII-肽复合体将在细胞表面上形成。培养基中所述蛋白质抗原的浓度通常为0.1-100μg/ml，优选为1-50μg/ml、最优选为1-10μg/ml。
如果用蛋白质(即具有超过50个氨基酸残基的多肽)作为抗原，则所述加载最好在所述DC成熟期间进行。这使得由MHCII分子特别有效地呈递所述抗原片段。所述蛋白质(片段)不必在整个成熟期期间存在，但在成熟期的至少部分时间内存在，所述成熟组合物和所述蛋白质(片段)应该同时存在。蛋白质抗原的实例包括通常用作阳性对照抗原的KLH(匙孔血蓝蛋白)。MAGE-3蛋白质为肿瘤抗原的实例，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或HIV-1 gp-160蛋白质是适用于病毒性疾病治疗的蛋白质的实例。
当所述加载用“短多肽”或蛋白质片段(例如具有至多50个氨基酸残基、准确嵌入所述DC表面的MHC分子中的短多肽)进行时，除上述在成熟期间加载之外，也有可能在成熟后、即在冷冻之前或再解冻之后进行加载。在这种成熟后加载时，将所述短多肽加入到经洗涤的DC中。
加载抗原的另一种可能是在培养基中添加凋亡的或裂解的细胞。然后所添加的细胞被所述DC吞噬。这种方法的优点是，除MHCII类分子外，也可以有效地加载I类分子。例如，已经表明，甚至在加入蛋白质(尤其是具有颗粒性质的蛋白质)时，呈递也发生于MHC I类分子上。例如，不在Mage-3肿瘤蛋白或肽存在下培养所述DC，而是可以将含有Mage-3的细胞片段(或坏死的或凋亡的肿瘤细胞)加入到所述DC。
通过使DC例如与肿瘤细胞融合，也可以给DC加载抗原。这种融合可以用聚乙二醇或电穿孔来实现。
在本发明的另一实施方案中，通过转染或病毒感染，给所述DC加载抗原。从而将编码抗原的核酸导入到所述DC中或诱导其表达。例如，可以以合适的方式进行DNA或RNA转染或者用腺病毒感染。因此，加载MHC I类分子也是可能的。例如，也可以转染从肿瘤细胞制备的RNA。关于转染，可以使用常用的方法，例如电穿孔。
如上所述，可以在成熟期期间或成熟期之后加入特定的抗原肽(即“短多肽”)，以便直接加载I类或II类MHC分子。可以在加入所述成熟组合物之前将所述肽抗原加入至所述细胞，但最好是同时或者在此后加入所述肽抗原。所述抗原加载优选进行至少10分钟，更优选进行1-24小时，最优选进行3-12小时。
所述肽(即“短多肽”)通常具有至少8个氨基酸。这类肽最好具有8-12个氨基酸(MHCI)或8-25个氨基酸(MHCII)。在培养基中用于加载的所述肽的浓度通常为0.01-1000μM，优选为0.1-100μM，最优选为1-20μM。
可以由MHC分子呈递的所有肽都可以认为是可以使用的肽。优选来源于得自病原体的蛋白质的肽。这些肽也可以是表现出天然存在的氨基酸序列变异的肽。这类变异通常是一个或两个氨基酸取代。肽抗原的实例是氨基酸序列为GILGFVFTL(SEQ ID NO1)的流感病毒基质肽(IMP)、或者序列为ELAGIGILTV(SEQ ID NO2)的Melan-A类似肽。其它可能的肽的实例示于图26中。
除“肽/蛋白质脉冲”之外，也可以进行“肽/蛋白质转载(transloading)”，来给DC加载抗原。
如上所述，也可以给所述DC加载抗原-抗体复合体。用于此目的的合适抗原包括所有上述抗原。按照本发明的“抗原-抗体复合体”是这类抗原与合适抗体的复合体，例如抗原-IgG或抗原-IgE复合体。在Reynault，A.等，J.Exp.Med.189(2)371-80(1999)中描述了给DC加载这类抗原，该文献通过引用结合到本文中。
在成熟和任选的给所述DC加载抗原后，可以在冷冻介质中冷冻所述成熟DC。除所述血清组分外，冷冻介质还可以含有一种或多种低温防护剂(例如0.1-35％(v/v)，优选5-25％)。合适的低温防护剂最好包括以下化合物DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、氯化胆碱、氨基酸、甲醇、乙酰胺、甘油一乙酸酯、无机盐等。优选的低温防护剂是DMSO，它优选以5-25％(v/v)、更优选10-20％(v/v)、最优选约10％DMSO的浓度包含于冷冻介质中。所述冷冻介质可以含有非异种血清组分，优选浓度为2-90％(w/v)，优选5-80％(w/v)，其中特别优选人血清白蛋白，优选浓度为10-30％(w/v)。然而，更优选冷冻介质含有自体血清或血浆来代替人血清白蛋白。它也可以含有人异体血清或混合血清。此外，冷冻介质也可以含有作为添加剂的一种或多种衍生于糖类的多元醇化合物，尤其是选自葡萄糖、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、赤藓醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨醇、肌醇、D-乳糖等的多元醇化合物，浓度优选为2-30％、更优选5-10％、最优选约5％(w/v)。最优选的冷冻介质是含有约10％DMSO和约5％葡萄糖的纯自体血清。通常，在冷冻之前将所述细胞离心以将其浓缩，然后溶解于冷冻介质中。
冷冻介质中细胞的优选浓度为1-100×106细胞/ml，最优选的浓度范围为约5×106细胞/ml至20×106细胞/ml。
也已经发现，通过在冷冻之前或解冻之后使所述DC与抗凋亡分子接触，提高了DC存活率。因此，在按照本发明方法的一个优选实施方案中，在冷冻之前或解冻之后，使所述DC与一种能够抑制细胞凋亡的分子接触。优选的抗凋亡分子包括CD40配体(CD40L)(Morris等(1999)J.Biol.Chem.274，418)、TRANCE(Wong等(1997)J.Exp.Med.186，2075)或RANKL(Anderson等(1997)Nature 390，175)。最好是，将至少一种所述分子在所述DC冷冻之前或解冻之后加入到培养基中达至少10分钟，优选至少1小时，更优选至少4小时。在培养基中的优选浓度是1ng/ml至5μg/ml(RANKL/TRANCE)和1ng/ml至1μg/ml(CD40L)。特别优选的浓度为0.5-1μg/ml(RANKL/TRANCE)和0.1-0.5μg/ml(CD40L)。
在所述方法的一个优选实施方案中，在免疫抑制性白介素-10(IL-10)或其它免疫/成熟调节剂例如维生素D3及其衍生物、富马酸及其衍生物例如酯等、霉酚酸mofetil等存在下，进一步培养所述DC。如此处理的细胞不用于刺激免疫系统，而是诱导对特定抗原的耐受。所述介质中这些调节剂和IL-10的浓度为1-1000ng/ml，优选10-100ng/ml。
按照实施方案(4)，本发明也涉及可按照本发明的方法获得的疫苗。除所述加载抗原的成熟DC外，按照本发明的疫苗还可以含有药学上可接受的佐剂。在将按照本发明的疫苗解冻后，可以加入药学上可接受的并且有利于给药的各种物质。
按照实施方案(3)，本发明也涉及冷冻的加载抗原的成熟树突细胞。按照本发明的这些细胞可以是药用组合物的一部分，所述药用组合物除含有所述细胞外，还含有适用于给予人类的有用的添加剂。
本发明首次提供了含有加载抗原的成熟DC并且可以冷冻的疫苗。本发明的主要优点是所述DC在解冻后的存活率非常高。在所述冷冻DC解冻后，基于冷冻DC的数目，通常获得高于75％、优选高于85％的存活DC。先前在未加入FCS的情况下，未曾达到解冻DC的这样高存活率。然而，这是达到有效免疫刺激的一个重要先决条件。将加载抗原的成熟DC冷冻的一个显著的优点是可以制备并冷冻多个等份的疫苗。因此，所述疫苗在需要可立即获得，并且可以无需漫长的培养步骤而在非常短的时间内应用。通过仅在冷冻和再解冻后给成熟DC加载抗原，有可能根据相应的环境，对所述DC进行可变的加载。例如，当发生疫苗接种所用的肽之一过度刺激或对所述肽之一产生变态反应时，可以在加载中去除这种肽。
令人惊讶的是，已经发现，为了发现冷冻DC的合适方法，改变立即冷冻参数例如冷冻介质和冷却速率和在解冻后立即测定存活率是不够的。这种立即存活率不一定对应于在无细胞因子的情况下培养数天的新鲜制备DC的存活率。
而是，在冷冻之前所用的成熟方法或成熟刺激物也对所述细胞存活率起重要作用。因此，本发明也基于这样的一种认识按照本发明的成熟刺激物不仅导致DC完全成熟，而且产生可以比通过其它刺激物成熟的DC存活率更佳的DC。迄今为止，由所述冷冻来看，根本未考虑过所述成熟刺激物。
也已经发现，使冷冻DC的方法优选的良好方法是借助不同的成熟刺激物使DC成熟，然后测试在不加入任何细胞因子的情况下在完全培养基中培养后的存活率作为示值读数。使用诱导最具活力的DC的成熟刺激物来制备DC制剂，然后将所述制剂冷冻。
因此，本发明的另一方面是发现冷冻DC的有利条件的方法，其中提供未成熟DC，并且在各种成熟刺激物存在下培养所述细胞，随后在有或无细胞因子(最好是无细胞因子)的培养基中培养所述细胞，在有或无细胞因子的培养基中培养至少1天后测定存活细胞的比率，最后确定给出最高DC存活率的成熟刺激物。然后用这种成熟刺激物制备DC，并将所述DC冷冻。最好仅在无细胞因子的培养基中培养至少2天、最优选在培养至少3天后，测定活细胞数目。
附图描述
图1显示了冷冻容器中的细胞浓度对解冻后DC收率的影响。从健康成人的白细胞提取产物制备成熟DC，其中首先通过在GM-CSF+IL-4中培养6天，将贴壁单核细胞转变为未成熟DC，然后用由TNFα+IL-1β+IL-6+PGE2组成的四组分混合剂(参见实施例1)培养1天使其成熟。将成熟(第7天)DC以-1℃/min的冷冻速率，在纯自体血清+10％DMSO+5％葡萄糖中以不同的细胞密度(DC数目/ml)冷冻。在使所述成熟DC解冻后，立即(＝d7)和在培养数天(1天后＝d8，2天后＝d9等)后，测定活DC的收率(以冷冻DC数目的百分率表示)。后一种测定在完全培养基中但在不加入GM-CSF或IL-4的情况下进行，因为这种硬“洗出试验”是一种已经建立的确定DC是否实际完全成熟和稳定的方法。以10×106成熟DC/ml冷冻，得到最佳结果(第7天时p＜0.05，在所有其它天时p＜0.01；n＝3)。
图2显示了各种冷冻介质对再解冻后DC收率的影响。如图1的图解说明中所述制备DC，将等分样品以10×106DC/ml的浓度在HSA+10％DMSO、自体血清+10％DMSO以及自体血清+10％DMSO+5％葡萄糖(终浓度)中冷冻。如关于图1所述的方法测定冷冻和再解冻后的DC收率。在自体血清+10％DMSO+5％葡萄糖中冷冻，得到最佳结果(第8天时p＜0.05；n＝4)。
图3显示了与“洗出试验”中冷冻和再解冻的DC相比的新鲜DC的存活率。如关于图1所述方法制备成熟d7 DC，然后新鲜制备所述DC以及冷冻(-1℃/min)，在纯自体血清+10％DMSO+5％葡萄糖中，细胞密度为10×106DC/ml)并且在液氮气相中贮存3小时以上后再解冻。如在图1中所述，DC在无细胞因子的培养基中(“洗出试验”)培养数天。活DC的收率以第7天时占接种到各孔中的DC总数的百分比表示。在新鲜制备的DC和冷冻/解冻DC之间没有统计学显著差异(n＝4)。
图4表明，所述冷冻和再解冻没有改变成熟DC的特征性形态。如图1中所述制备的成熟d7 DC或者立即再进一步培养2天，或者在冷冻、在也到液氮气相中贮存至少3小时然后再解冻后进一步培养。甚至在无细胞因子(“洗出试验”)的情况下进一步培养48小时后，未冷冻DC(左图)和冷冻/再解冻DC(右图)都保持稳定的非贴壁细胞。
图5表明，所述冷冻和再解冻没有改变成熟DC的特征性表型。通过FACS分析，分析如关于图1所述的方法新鲜制备的成熟d7 DC的表型(新鲜DC，第7天)。将等分样品冷冻，在液氮气相中贮存至少3小时，再解冻，随后立即(冷冻/再解冻d7 DC)或者在无细胞因子(“洗出试验”)的情况下再培养3天后(冷冻/再解冻d10 DC)，测定其表型。甚至在除去细胞因子和再培养3天后，冷冻/再解冻成熟d7 DC仍保持成熟DC的特征性表型(CD14-，CD83均一的++)。
图6表明，所述冷冻和再解冻没有改变成熟DC在初次同种异体MLR(“混合白细胞反应”)中的刺激能力。如关于图1所述方法制备成熟d7 DC，新鲜制备的未冷冻DC的同种刺激功效与等份的已经经过冷冻和再解冻(在液氮中贮存3小时后)的这些DC的同种刺激功效相当。
图7表明，所述冷冻和再解冻没有改变成熟DC诱导强IMP特异性CTL应答的能力。给新鲜制备的或冷冻/再解冻的HLA-A2.1+成熟d7 DC加载流感病毒基质肽(＝IMP)GILGFVFTL(SEQ ID NO1)或者不经超声处理，然后不添加任何细胞因子用自体CD8+T细胞(T∶DC之比＝10∶1)培养。另外，纯化CD8+T细胞在无DC±加入IMP的情况下培养。7天后，收获所述T细胞，用标准51Cr释放测定，检查其细胞学活性。经过或未经10μg/ml IMP脉冲处理的T2细胞用作靶细胞。
图8表明，所述冷冻和再解冻没有改变成熟DC诱导强IMP特异性CD8+T细胞应答(HLA-A2.1/肽四聚体分析)的能力。给新鲜制备的或冷冻/再解冻的HLA-A2.1+成熟d7 DC加载IMP(就冷冻/再解冻细胞而言，在冷冻之前或解冻之后)，或者所述细胞不经超声处理而在不添加任何细胞因子的情况下与自体PBMC的非贴壁部分(PBMC∶DC之比＝30∶1)共同培养7天后，收获所述细胞，用HLA-A2.1/IMP四聚体(X轴)和抗CD8(Y轴)双染色。对于新鲜DC和冷冻DC而言，IMP-肽特异性CD8+T细胞的扩充(在该图中以四聚体结合CD8+T细胞的百分比表示)相当。在冷冻之前或解冻之后给DC加载没有产生差异。
图9表明，与CD40L接触进一步提高了解冻DC的存活率。如关于图1所述方法制备成熟d7-DC。在解冻后，加入可溶性初级(primary)CD40L(100ng/ml)达4小时，然后洗涤DC，并且如图3的图解说明中所述在无细胞因子(“洗出试验”)的培养基中培养数天。立即(＝d7)和在培养数天(1天后＝d8，2天后＝d9等)后，测定活DC的收率(以冷冻DC的百分率表示)。用CD40L处理DC，得到提高的存活率，尤其是在进一步培养2天之后(第10天和第11天p＜0.01；n＝5)。
图10表明，可以在冷冻之前给DC成功地加载蛋白质抗原。通过的第6天加入模型抗原破伤风类毒素(TT)(10μg/ml)，在未成熟期中对DC进行脉冲处理。然后在第7天收获成熟DC，并如图3的图解说明中所述将其冷冻。TT脉冲处理的冷冻DC同新鲜制备的TT脉冲处理的成熟DC一样，具有刺激性。
图11表明，可以在冷冻之前给DC成功地加载蛋白质抗原。或者在冷冻之前或解冻之后，给冷冻/解冻(参见图3)的HLA-A2.1+成熟d7DC加载melan-A类似肽ELAGIGILTV(SEQ ID NO2)，或者所述细胞不经超声处理而在不添加任何细胞因子的情况下与自体PBMC的非贴壁部分(PBMC∶DC之比＝20∶1)共同培养7天后，收获所述细胞，用HLA-A2.1/Melan-A四聚体(X轴)和抗CD8(Y轴)双染色。对于在冷冻之前或者在解冻之后已经加载的冷冻DC而言，Melan-A-肽特异性CD8+T细胞的扩充(在该图中以四聚体结合CD8+T细胞的百分比表示)相当。也参见图8。
图12显示了实施例6中所述的在接种疫苗的患者体内诱导针对KLH的辅助细胞1型应答。
图13-15显示了实施例7的结果。
图16显示了实施例8实验建立的图解说明。在图17和18中总结了实施例8的结果。
图17A显示了加载肿瘤细胞裂解液或坏死肿瘤细胞并且随后冷藏后的DC总数。
图17B显示了加载肿瘤细胞裂解液或坏死肿瘤细胞并且随后冷藏后的DC的同种刺激功效。
图17C显示了肿瘤加载和冷藏后FACS分析的结果。
图18A显示了加载凋亡肿瘤细胞并且随后冷藏后的DC总数测定结果。
图18B显示了加载凋亡MEL 526黑素瘤细胞并且随后冷藏后的DC的同种刺激功效。
图18C显示了在冷藏之前和之后Mage-1肽脉冲处理的DC上MAGE-1/HLA-A1 Ag表达的FACS分析结果。
图18D显示了以不同方式加载的DC上在冷藏之前和之后MAGE-1/HLA-A1复合体表达(通过抗MAGE-1/HLA-A1复合体的抗体检测)的比较。
图19显示了实施例9实验建立的图解说明，其中比较了冷藏或未冷藏的腺病毒感染的树突细胞。在图20-23中总结了实施例9的结果。
图20显示了冷藏后腺病毒感染的树突细胞的回收率。腺病毒-GFP感染的DC在冷冻和再解冻后的回收率与经模拟处理(未转染的)DC的回收率相当。
图21冷藏后腺病毒感染的树突细胞的CD4 T细胞刺激活性。可以看出，冷藏没有改变腺病毒感染的DC的同种刺激活性。
图22A和22B表明，在冷藏或未冷藏的腺病毒感染的DC中观察到相似的表型。
图23A和23B显示了冷藏或未冷藏的腺病毒感染的DC的表型。
图24图示了与冷藏或未冷藏的RNA电穿孔DC相比的实施例10的实验过程。结果总结于图25-27中。
图25表明，EGFP-RNA电穿孔DC冷藏后的回收率与对照实验中的回收率相似。
图26表明，冷藏没有改变EGFP-RNA转染DC的同种刺激能力。
图27表明，RNA转染的DC的表型与对照实验中的所述表型相似。
图28显示了可以用于本发明方法中的MHCI类和II类限制的黑素瘤和流感病毒肽。缩写AS＝氨基酸，NT＝核苷酸，NP＝核蛋白，ana*＝类似肽a频率最高的DR4亚型，大约80％b频率最高的DR4亚型，大约80％c迄今为止，已经描述了30种不同的HLA DR13等位基因。显示了DRB1*1301和DRB1*1302的限制，DRB1*1301和DRB1*1302结合在一起占DR13等位基因的80％。有可能其它DR13等位基因也呈递所述肽。d所述表位由这第二种HLA DP4等位基因的呈递不如等位基因DPB1*0401有效。
以下实施例用来进一步说明本发明，但对本发明并没有任何的限制。实施例1测定新鲜制备的未成熟DC和用不同成熟刺激物成熟的DC的存活率。
测试以下不同的成熟刺激物-单核细胞条件培养基，如已描述的制备和使用(Thumer等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)；-10ng/ml TNFα；-10ng/ml TNFα+1μg/ml PGE2；-10ng/ml TNFα+10ng/ml IL-1β+100U/ml IL-6+1μg/ml PGE2(“成熟混合剂”)；-至多1.0μg/ml马流产沙门氏菌(Salmonella abortus equi)的LPS；-双链RNA(poly-IC，20μg/ml)；-50-1000ng/ml CD40L。
从PBMC制备单核细胞衍生DC作为完全培养基，使用具有20μg/ml庆大霉素、2mM谷氨酰胺和1％热失活(56℃，30分钟)的人自体血浆的RPMI 1640。按照已描述的方法，从健康细胞提取供体制备白细胞提取产物，作为单核细胞分离产物(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。然后在淋巴细胞制备(lymphoprep)时，通过离心分离外周血单核细胞(PBMC)，按照已描述的方法，从所述PBMC的粘附塑料的部分制备DC(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。为此，通过在具有重组人GM-CSF(800U/ml)和IL-4(500U/ml)的完全培养基中培养，获得未成熟DC。第6天，向所述DC中加入上述不同的成熟刺激物，第7天，收获成熟DC，在无细胞因子的情况下再进一步培养2天。培养2天后的存活率(以接种的DC的百分比)为未成熟DC为38.25％；(IL-1β+IL-6+PGE2+TNFα)成熟的DC为76.2％；TNFα成熟的DC为13.5％；(TNFα+PGF2)成熟的DC为37.0％；(poly-IC)成熟的DC为31.8％；和CD40L成熟的DC为49.6％(在500ng/ml下)。
所述差异是统计学上显著性差异。实施例2成熟(第7天)DC如下冷冻将DC以不同的浓度(5、20、40、60和100×106/ml)重悬于冷冻容器内的或者纯自体血清或者20％人血清白蛋白(HSA；由补充200g人血浆蛋白与至少95％白蛋白的1000ml电解质溶液构成；DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg，Baden-Baden，Germany)中。将所形成的DC悬浮液与下文所述的不同冷冻溶液以1∶1混合，然后立即转移到1.0ml或1.8ml冷冻容器中。此后，立即将容器在“低温冷冻容器(Cryo Freezing Container)”(Nalgene Cryo1℃Freezing Container，冷却速率-1℃/ml)冷却至-80℃，最后转移到液氮气相中，在此将其保持至多数月。a)冷冻介质-HSA+DMSO±葡萄糖[由20％HSA溶液(参见上文)+10、15、20和25％(v/v)DMSO±葡萄糖(Glukosteril 40％TM，Fresenius，Germany，有效成分葡萄糖一水合物)构成，以2％、4％、6％、10％、20％或30％(v/v)加入]；-血清+DMSO±葡萄糖[由纯自体血清+20％(v/v)DMSO±葡萄糖构成，以2％、4％、6％、10％、20％或30％加入]；-红细胞冷冻液(Erythrocyte Freezing SolutionTM)[Erythrocyte
Freezing SolutionTM(Fresenius，Dreieich，Germany)，由38％甘油、2.9％山梨醇和0.63％氯化钠的无菌水溶液构成]；-细胞加工液(Cell Processing SolutionTM)+DMSO(Fresenius，Dreieich，Germany，由6％羟乙基淀粉在0.9％氯化钠中的溶液构成，通常用于红细胞的沉降)+10％或15％(v/v)DMSO。b)解冻条件对于使冷冻成熟(第7天)DC解冻，检查以下四种方法1.使DC在56℃水浴中解冻，然后不经洗涤，于37℃和5％CO2下，在Teflon培养皿(Rotilabo boxes，Roth，Karlsruhe，Germany)内的10-20ml冰冷的完全培养基(补充800 U/ml GM-CSF和500 U/ml IL-4)中孵育2小时，然后收获DC，并且以150×g于22℃离心10分钟。随后，对所述细胞计数，再次接种到Teflon培养皿上的具有GM-CSF和IL-4的完全培养基中(细胞密度1×106/ml)，培养过夜。第二天，收获细胞以供进一步使用。
2.如1中所述，在Teflon培养皿上于37℃和5％CO2下2小时的静息期后，使冷冻成熟(第7天)DC解冻，收获细胞(以150×g，22℃下离心10分钟)以供进一步使用。
3.如1中所述，在组织培养皿(Falcon Becton Dickinson Labware，New Jersey，USA)上于37℃和5％CO2下2小时的静息期后，使冷冻成熟(第7天)DC解冻，收获细胞(以150×g，22℃下离心10分钟)以供进一步使用。
4.使冷冻成熟(第7天)DC在56℃水浴中解冻，然后加入到10ml冰冷的“Hank氏平衡盐溶液”(Bio Whitaker)中，立即于4℃以133g离心12分钟。随后，收获细胞以供进一步使用。c DC存活率的确立通过在未添加GM-CSF和IL-4的完全培养基中培养至少4天以上(＝“洗出试验”)，检查冷冻和再解冻DC的存活率，将其与按照已描述的方法(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)从未冷冻或冷冻的等份PBMC中新鲜制备的DC的存活率相比。用细胞计数器(CassyCell Counter and Analyser System，Model TT，Scharfe System，Reutlingen，Germany；该系统使用“脉冲面积分析”并且允许测定细胞计数、细胞大小和体积以及是否存在活细胞)，并且也通过标准锥虫蓝染色作为对照，测定活DC的相应量。
首先，检查DC浓度的影响，其中以10×106成熟DC/ml冷冻，得到最佳结果。结果示于图1中。
其次，检查DMSO浓度(5-12.5％v/v终浓度)的影响。DMSO浓度的变化对解冻DC的存活率没有显著性影响。
下一步，检查HSA或纯自体血清是否得到更好的存活率，以及添加葡萄糖(终浓度1％、2％、3％、5％、10％和15％v/v)是否提高存活率。结果示于图2中。如果HSA被自体血清所替代，则数天后DC的存活率可再现地提高。以5％(v/v)的终浓度加入葡萄糖，进一步改善了所述结果。
也检查了各种市售的冷冻介质例如Erythrocyte FreezingSolutionTM或Cell Processing Solutin Freseniu)。然而，与已经测试的所述冷冻介质相比，这些冷冻介质得到结果较差。
此外，检查了在b)下所述的各种解冻条件，以将在解冻后所述细胞经历的逆境减至最小。所测试的四种方法中没有一种显示出明显优于其它方法。
成熟(第7天)DC如实施例1中所述方法制备，并且在以下条件下冷冻冷却速率1℃/min，在纯自体血清+10％DMSO+5％葡萄糖中，细胞密度10×106/ml。在液氮气相中贮存至少3小时后，将细胞解冻。解冻后，直接测定活DC的百分比(＝D7)。接种等份的DC，如实施例1c)中所述，在无细胞因子的培养基(“洗出试验”)中培养至多4天后，测定存活率(n＝20)。结果示于下表中。
在解冻(第7天)和在“洗出试验”(第8-11天)后冷冻/解冻DC的收率。
实施例3在存活率和T细胞刺激活性方面，最佳成熟和冷冻的DC等同于新鲜制备的DC。
a)首先，检查冷冻和再解冻DC的存活率是否与从同一供体新鲜制备的DC的存活率相当。因此，如实施例2)中所述使用“洗出试验”。结果示于图3中。发现在解冻的DC和从同一供体新鲜制备的DC之间没有差异。
此外，解冻DC的形态和表型可与新鲜制备的DC相比。用倒置显微镜(Leika DM IRB，Leika Mikroskopie und Systeme GmbH，Wetzler，Germany)检查细胞的形态，并通过照相术记录。用一系列单克隆抗体检查并且在FACScan设备(Becton Dickinson，New Jersey，USA)上，如已描述的方法(Thumer等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)检查细胞群体的表型。死细胞由于其散射光的特性而被分选出。结果示于图4和图5中。冷冻和再解冻DC在数天内保持其特征性形态特性及其表型。
b)然后，也检查再解冻DC是否也保持其功能特性。
1.因此，检查再解冻DC是否可以与新鲜制备的未冷冻成熟DC一样有效地诱导初次同种异体MLR。该试验如已描述的方法进行(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。以直至2×105同种异体T细胞/孔的分级剂量，将DC加入到平底96孔板中，在RPMI 1640(补充庆大霉素、谷氨酰胺和5％同种异体热失活人血清(混合血清))中共同培养4-5天，通过在共同培养的最后12-16小时内加入3H-胸苷(4μCi终浓度/ml)，测定增殖。结果示于图6中。冷冻和再解冻DC与新鲜制备的成熟DC一样有效地诱导初级同种异体MLR。
2.也检查冷冻和再解冻DC可以有多有效地诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。为此，测量了IMP脉冲处理的成熟DC对IMP(流感病毒基质肽)特异性CTL的诱导。这种方法当在无T细胞辅助和外源IL-2的情况下进行时，对于成熟DC是特异性的。通过刺激纯化CD8+T细胞(按照供应商的说明，用磁性细胞分选/MACS和CD8微珠，从PBMC中分离的，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany)，或者在具有DC的非贴壁PBMC部分(从来自HLA-A2.1+供体的自体PBMC制备)的其它实验中，实现流感病毒基质A2.1肽(IMP)或Melan-AA2.1肽特异性的CD8+T细胞的诱导，其中所述具有DC的非贴壁PBMC部分在不加入细胞因子的情况下，用HLA-A2.1限制的IMP(GILGFVFTL[SEQ ID NO1]，10μM，于37℃1小时，以1×106DC/ml的完全培养基)脉冲处理或者用Melan-A类似肽(ELAGIGILTV[SEQ IDNO2]，10μM)以1∶10或1∶30的DC/T比脉冲处理7天，或者未经所述脉冲处理。通过标准裂解测定(Bhardwaj等(1994)J.Clin.Invest.94，797)，或者通过于37℃四聚体染色(Whelan等(1999)J.Immunol.163，4342)，对CTL定量。以不同效应细胞/靶细胞比进行的标准4小时51Cr释放测定的靶细胞，是IMP脉冲处理(10μg/ml，37℃，1小时)的T2A1细胞、未经脉冲处理的T2A1细胞和K562靶细胞(所有细胞都用51Cr标记)。所有实验以80倍过量的K562细胞进行，以便阻断自然杀伤细胞活性。用公式(特异性释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)×100，计算特异性裂解(％)。制备可溶性IMP和Melan A/HLA A2.1四聚体，如已描述的方法(Whelan等，1999)采用流式细胞术，于37℃分析T细胞的生成。将1μl四聚体(0.5-1mg/ml)加入到约60μl(在离心和倾注上清液后在容器中剩下的体积)培养基中的2×106细胞中于37℃达15分钟，所述培养基由补充庆大霉素、谷氨酰胺和5％同种异体热失活人血清(混合血清)的RPMI 1640构成。随后，不经洗涤，将细胞冷却，并在冰上与抗人CD8的三重染色单克隆抗体(Caltag Laboratories，Burlingame，California)一起孵育15分钟。在3个洗涤步骤之后，在FACScan设备(Becton Dickinson)上分析细胞。
结果示于图7和图8中。
DC的冷冻和解冻并不改变成熟DC诱导强IMP特异性CTL反应的能力。此外，所述冷冻和解冻也没有改变成熟DC诱导强IMP特异性CD8+T细胞应答的能力，如HLA-A2.1/肽四聚体分析所示。
这些实验表明，在冷冻和解冻后，获得与新鲜制备的DC绝对等同的活DC。实施例4为了达到提高的冷冻和再解冻DC的存活率，将以下不同的抗凋亡刺激物以不同的浓度和在不同时间加入到所述DC中1.重组鼠或人三聚体TRANCE(Wong等(1997)J.Exp.Med.
186，2075)，以100、200、500ng/ml加入；2.RANKL(Anderson等(1997)Nature 390，175)，以10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和1μg/ml加入；3.可溶性三聚体CD40L(Morris等(1999)J.Biol.Chem.274，418)，以50、100和500ng/ml加入。
所述DC于37℃经过所述不同的抗凋亡刺激物在冷冻前培养的最后12-16小时过夜处理、在冷冻前处理4小时(细胞密度1×106，在具有GM-CSF和IL-4的完全培养基中)、以及在解冻后处理4小时(细胞密度1×106，在具有GM-CSF和IL-4的完全培养基中)。
将解冻DC短暂暴露于所述抗凋亡刺激物，与在冷冻前处理DC一样有效，达到提高的存活率，然而通常在“洗出试验”中仅在3天后可见。然而，CD40L(图9)和TRANCE/RANKL(结果未显示)得到相似的结果。结果表明，加入CD40L或TRANCE/RANKL将DC的存活率提高至超过第3天。实施例5为了检查是否可以在冷冻前成功地给DC加载抗原，给DC加载破伤风类毒素(TT)(作为蛋白质抗原的例子)或IMP(作为模型肽)。对于用TT脉冲处理，从得自白细胞提取产物的新鲜的或冷冻的等份PBMC制备DC(参见上文)。在第5天将10μg/ml TT加入所述未成熟细胞中。第7天收获成熟DC，所述DC或者不冷冻，或者在冷冻和解冻后(4小时后)，检查其在PBMC中诱导TT特异性增殖反应的能力。因此，将分级剂量的未经脉冲处理和TT脉冲处理的DC加入到PBMC中(10×104/孔)，在第5天，按照已描述的方法用3H-胸苷脉冲处理(Thurner等(1999)J.Immunol.Methods 223，1)。对于加载IMP，或者在冷冻之前，或者在解冻之后，DC用10μM肽脉冲处理(1小时，37℃，1×106DC/ml完全培养基)。如上所述测试成功呈递IMP的能力。
冷冻的TT脉冲处理DC具有与新鲜制备的TT脉冲处理DC相同的刺激特性(图10)。两种DC都在冷冻前加载了IMP或Melan A，在解冻后加载的那些DC同样好地刺激IMP特异性CTL或Melan-A特异性CTL(图8和图11)。这些结果表明，有可能制备已经加载抗原并且在解冻后可以立即使用的等份冷冻成熟DC。实施例6对IV期黑素瘤患者，用按照本文所示方法制备和加载抗原的加载肽和加载蛋白质的DC进行疫苗接种。图12表明在所有接种的患者体内都诱导了抗KLH的辅助细胞1型应答。每位患者都接受一次4×106成熟DC和本申请中所述的成熟组合物(例如图1和图3)的皮下给药，所述成熟DC是用GM-CSF和白介素-4从白细胞提取产物制备的。为此，同时加入10μg/ml的浓度的对照抗原KLH和所述成熟组合物，然后分成多份冷冻所述DC。在接种前和所述4×106DC的一次给药后14天，取血，通过标准Elispot测定进行检查(加入10μg/ml KLH至500,000 PBMC中，并测量产生干扰素-γ或IL-4的细胞数；未加入KLH的背景几乎为0)。发现在接种之前，在KLH呈递时，没有产生干扰素-γ或白介素-4，而在一次接种加载KLH的DC后14天，在所有患者体内都诱导了产生干扰素-γ、但不产生白介素-4或仅产生极少量的T细胞(在对照实验中，通过从PBMC取出CD4细胞表明，所述反应性细胞是CD4阳性辅助性T细胞)。实施例7来自实施例6研究的一位患者接受了数次DC接种，其中4×106的每种再解冻DC加载了在图13、14或1 5中所述的肽(即分别为每4×106DC仅一种肽)，并且经皮下注射。分别在第一次接种之前和各个后续接种后14天、以及在下一次接种的临接种前，取血，并且如Thurner等(1999)J.Exp.Med.190，1669-1678的材料和方法中所述的方法进行标准Elispot测定。用于接种的DC如图8和图11的图面说明中以及实施例5中所述的方法制备，并且仅在解冻后加载相应的肽。正如从图13-15中可以看出的，诱导了针对几种I类肽(图13和图14)和II肽(图15)的免疫。从表I可以看出所使用肽的特征。注意到，所述特定患者的HLA型为HLA-A2.1+和HLA-A3+以及HLA-DR 13+、HLA-DP4+(但为DR4-)。图13表明在一次接种后，诱导了针对流感病毒肽NP-A3和IMP-A2的免疫(#2是指取血并且在给予第二次疫苗接种之前不久进行Elispot测量)，并且显示了在另一次接种后免疫增强，但对于未用于接种的EBV-A2和IV-9-A2肽没有变化。图14表明诱导了针对4种I类限制的肿瘤肽、明显且明确针对Melan A-A2.1肽的免疫。图15表明诱导了针对两种II类限制的肿瘤肽(Mage 3-DR13和Mage 3-DP4)的免疫，但没有诱导针对酪氨酸酶-DR4和GP 100 DR4(这是阴性对照，因为所述患者是DR4阴性的，因此所述DC不能加载这些肽)的免疫。实施例8在用肿瘤细胞制剂(肿瘤细胞裂解液、坏死或凋亡的肿瘤细胞)进行抗原加载后树突细胞的冷藏可以从白细胞提取法中，大量产生树突细胞(DC)。已经开发了允许分次使用这些细胞来接种的冷藏成熟DC的方法。迄今为止，成熟DC在使用前加载对应于肿瘤相关抗原(TAA)的免疫优势序列的肽。在此处所述实验中(参见图16)，检查加载了不同肿瘤细胞制剂并且随后成熟的未成熟DC是否也可以冷藏。
肿瘤细胞制剂为了制备肿瘤细胞制剂，使用Me1526黑素瘤细胞系。Me1526细胞用RPMI洗涤，通过重复于57℃加热和随后在液氮中冷却来处理。然后，借助超声装置破碎所述细胞材料。由于加热/冷冻循环诱导坏死，所以含有所有细胞组分的这种肿瘤细胞制剂在下文中被称为坏死细胞材料。为了获得裂解液，我们在这些步骤之后进行了超离心，以除去细胞组分，并且在Centricon离心管中进行所述蛋白质的纯化。根据Bradford分析的结果，我们使用具有较高活性的蛋白质部分，即≥10kDa的蛋白质部分。凋亡肿瘤细胞用宽范围的UVB辐射装置诱导，并且用AnnexinV试验证实。
DC的产生按照实验性免疫治疗中所用的技术，从白细胞提取法产生DC。将PBMC接种到Nunc Cell Factories中，用补充1000 IU/mlGM-CSF和500 IU/ml IL-4的RPMI(1％自体热失活血浆)培养。第5天，使用未成熟的DC，然后用所述的肿瘤细胞制剂以1∶1的浓度加载4小时。
加载在5ml聚丙烯反应容器中于37℃和5％CO2下进行加载。加载后，将所述DC接种到12ml组织培养皿中，用由TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2构成的成熟混合剂培养24小时。
冷冻/解冻按照已描述的方法(Feuerstein B.等，J.Immunol.Methods 24515-29(2000))，将一半相应加载的DC分别在1.8ml Nunc冷冻小瓶中于-80℃冷藏3小时。此后，按照所述已描述的方法将所述细胞再次解冻，并且于37℃和5％CO2下在RPMI培养基中培养1小时。随后，分析DC的该部分以及未冷冻的部分，并用于其它实验中。
所述的实验建立在图16中以流程表显示。
细胞计数和活力在进行所述加载和冷藏后，用锥虫蓝和显微镜，确定所述DC的总细胞计数和活力。最初，使用5×105DC。我们发现与未冷藏细胞相比相当的细胞计数以及加载且冷藏的DC的活力没有差异(图17A、18A)。可以观察到，加载使细胞计数减少，但冷藏没有使细胞计数降低，尤其是使用坏死细胞时。
功能性为了测试功能能力，进行混合白细胞反应试验(MLR)。在同种异体MLR中使用加载DC(与同种异体白细胞一起孵育4天)，然后用放射性胸苷(3H-胸苷)脉冲处理13小时。对于冷藏和未冷藏加载DC而言，获得了相当的同种刺激功效(图17B、18B)。
表型为了评价与抗原呈递相关的表面分子的表达和所述DC的功能条件，用相应的抗体进行FACS分析。对于不同加载方法和在冷藏后，都发现了相当的表面表达模式(图17C)。
直接抗原检测为了直接检测肿瘤抗原，使用识别HLA-A1环境(即Mage-1肽和HLA-A1分子的复合体)中的MAGE-1的抗体。不同加载的DC用该抗体染色，并且在FACS中分析。当使用加载肽(20μgMAGE-1肽3小时/ml)的DC时，发现在冷藏后，可以检测到一定百分比的MAGE-1/A1抗原，所述百分比与未冷藏时检测的百分比相当(图18C)。根据这一实验可以断定，所述冷藏并不导致抗原的损失。
在另一实验中，用MAGE-1/A1抗体测定不同加载方法的效力。用所述肿瘤细胞制剂(所用的黑素瘤细胞系表达Mage-1抗原)，可以达到显著的加载，达到所述肽脉冲处理的大约20％的抗原密度(图18D)。可以以相当的量检测到冷藏前后MAGE-1/HLA-A1复合体的表达(相对于未加载DC的背景计算为阳性)。
结论也可以表明，本发明的方法不仅允许有效地冷藏未加载DC或加载肽或蛋白质的DC(如实施例1-7所示)，而且也允许同样有效地冷藏加载(肿瘤)细胞制剂(简单的坏死肿瘤细胞、从肿瘤细胞制备的裂解液、或者凋亡肿瘤细胞)的DC。“有效地”是指在冷冻时，i)解冻后与未冷冻DC相比，细胞的损失≤25％，ii)解冻DC具有与未冷冻DC相当的T细胞刺激能力(在同种异体MLR中测试)，和iii)抗原和T细胞受体的配体(即特异性MHC肽复合体)的表面表达在所述冷冻和解冻过程后得以保留(在一种模型中，通过借助特异性识别特定肽/MHC复合体即MAGE-1/HLA-A1复合体的单克隆抗体直接检测所述复合体所示的)。实施例9在借助腺病毒转染加载抗原后冷藏树突细胞可以采用按照本发明的方法，以这样的方式冷冻用腺病毒转染的树突细胞，使得树突细胞的特性与未转染树突细胞的特性不相上下。为此，成熟DC用含有编码绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA的腺病毒载体(AD5)，以500的感染复数(MO)感染2小时。洗涤2次后，将细胞以10×106DC/ml的浓度在HSA和10％DMSO的5％葡萄糖(终浓度)溶液中冷冻并贮存4小时。解冻后，通过锥虫蓝排除测定细胞活力。活细胞的回收率以冷冻DC的百分比示于图20中。
此外，可以表明，腺病毒感染的DC的同种刺激或性未因冷藏而改变。因此，用adeno-GFP以500的MOI感染成熟DC，并且如上所述进行冷藏。在再解冻并且培养24小时或72小时后，所述树突细胞与同种异体CD4+T细胞(2×105/孔)在图21所述的条件下共同培养。4天后，所述细胞用[3H]-胸苷脉冲处理16小时，然后测定掺入的放射性。在图21中，显示了三次计数的平均值与对应的标准偏差。单独的T细胞或单独的DC的所述数值总是低于1000/min。
此外，如上所述将成熟DC与adeno-GFP以500的MOI一起冷藏。在再解冻和所述的培养时间后，所述细胞用CD83、CD25、CD86、CD80特异性抗体、然后用PE缀合的山羊/小鼠IG(Fab’)2片段复染。结果示于图22A中。在使用HLA 1类、HLA-DR和CD40特异性抗体的一个类似的实验中，获得示于图22B中的结果。实施例10在借助RNA转染加载抗原后冷藏树突细胞可以采用按照本发明的方法，以这样的方式冷冻用RNA转染的树突细胞，使得树突细胞的特性与未转染树突细胞的特性不相上下。所述DC在未成熟期可以用RNA转染，然后使其成熟，以成熟DC冷冻(未显示)。最好是用RNA转染已经成熟的DC，然后冷藏。结果总结于图25-27中。
因此，成熟的树突细胞用RPMI洗涤2次，在Optimix试剂盒(EQUIBIO，Maidstone Kent，UK)的洗涤溶液中洗涤1次。使DC在Opttimix培养基中的终浓度为40×106DC/ml。然后将0.1ml细胞悬浮液与40μg体外转录的EGFp RNA在1.5ml反应容器中混合。于室温孵育最多3分钟后，将细胞悬浮液转移到一个0.4cm间距的电穿孔比色杯中，用Gene PulserII(Biorad，Munich，Germany)以260V的电压和150μF电容脉冲处理。对照DC未加RNA而进行脉冲处理。将细胞以10×106DC/ml的浓度在HSA(与10％DMSO和5％葡萄糖(终浓度))中冷冻并贮存4小时。解冻后，通过锥虫蓝排除测定细胞活力。活细胞的回收率以冷冻DC的百分比示于图25中。
在EGFP RNA存在下电穿孔处理成熟DC，并且如上所述进行冷藏。在再解冻并且培养48小时后，所述树突细胞与同种异体CD4+T细胞(2×105/孔)在图26所述的条件下共同培养。4天后，所述细胞用[3H]-胸苷脉冲处理16小时，然后测定掺入的放射性。在图26中，显示了三次重复测定的平均值(与标准偏差)。单独的T细胞或单独的DC的所述数值总是低于1000/min。
RNA电穿孔处理的DC的冷藏，并不改变DC表型标记。因此，在有或无EGFP RNA时电穿孔处理成熟DC并如上所述冷藏。在再解冻并且培养48小时后，用图27中所述的小鼠单克隆抗体和PE缀合的抗小鼠IG(Fab’)2片段复染，然后进行FACS分析。图27中的右下图涉及EGFP阳性DC，而右上图涉及EGFP/DC标记双阳性DC。
序列表<110>Schuler，Gerold<120>用于生产现成可用的加载抗原或未加载抗原的冷藏成熟树突细胞的方法<130>010589wo/JH/ml<140><141><160>27<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>1Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu1 5<210>2<211>10<212>PRT<213>人工序列<220><223>Mart1/MelanA类似肽(AA 26-35)<400>2Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val1 5 10<210>3<211>10<212>PRT<213>流感病毒<400>3Lys Leu Gly Glu Phe Tyr Asn Gln Met Met1 5 10<210>4<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>4Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val1 5<210>5<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述gp100类似肽，AA 209-217<400>5Ile Met Asp Gln Val Pro Phe Ser Val1 5<210>6<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>6Tyr Met Asp Gly Thr Met Ser Gln Val1 5<210>7<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>7Val Leu Pro Asp Val Phe Ile Arg Cys Val1 5 10<210>8<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>8Gly Leu Tyr Asp Gly Met Glu His Leu1 5<210>9<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>9Gly Val Tyr Asp Gly Arg Glu His Thr Val1 5 10<210>10<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>10Cys Thr Glu Leu Lys Leu Ser Asp Tyr1 5<210>11<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>11Val Ser Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr1 5<210>12<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>12Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr1 5<210>13<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>13Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr1 5<210>14<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述酪氨酸酶类似肽，AA 243-251<400>14Lys Ser Asp Ile Cys Thr Asp Glu Tyr1 5<210>15<211>9<212>PRT<213>流感病毒<400>15Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys1 5<210>16<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>16Ser Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys1 5<210>17<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>17Leu Ile Tyr Arg Arg Arg Leu Met Lys1 5<210>18<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>18Ala Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe1 5<210>19<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>19Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile1 5<210>20<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>20Val Tyr Phe Phe Leu Pro Asp His Leu1 5<210>21<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile1 5<210>22<211>9<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe1 5<210>23<211>10<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>23Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr1 5 10<210>24<211>13<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述酪氨酸酶类似肽，AA 450-462<400>24Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Val Pro Asp Ser Phe Gln Asp1 5 10<210>25<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>25Trp Asn Arg Gln Leu Tyr Pro Glu Trp Thr Glu Ala Gln Arg Leu Asp1 5 10 15<210>26<211>14<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>26Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu1 5 10<210>27<211>16<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>27Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr1 5 10 1权利要求
1.一种制备现成可用的冷藏成熟树突细胞的方法，所述方法包括(a)提供未成熟的树突细胞(DC)；(b)在含有成熟混合剂的培养基中培养所述未成熟DC以获得成熟DC，其中所述成熟混合剂具有一种或多种成熟刺激物；(c)在不含任何异种血清的冷冻介质中冷冻所述成熟DC。
2.权利要求1的方法，其中在所述冷冻之前或在将所述冷冻DC再解冻之后，给所述DC加载抗原或抗原-抗体复合体。
3.权利要求1或2的方法，其中(i)所述未成熟DC从CD14+单核细胞或者从CD34+细胞制备；和/或(ii)所述未成熟DC直接从血液中分离；和/或(iii)所述未成熟DC或其前体细胞通过白细胞提取法获得；和/或(iv)所述未成熟DC或其前体细胞从新鲜血液或骨髓获得。
4.权利要求1-3中一项或多项的方法，其中所述成熟刺激物选自IL-1例如IL-1β、IL-6、TNF-α、前列腺素例如PGE2、IFN-α、脂多糖和其它细菌细胞产物例如MPL(单磷酰脂质A)和脂磷壁酸质、磷酸胆碱、钙离子载体、佛波醇酯例如PMA、热激蛋白、核苷酸例如ATP、脂肽、Toll样受体的人工配体、双链RNA例如poly-IC、免疫刺激性DNA序列、CD40配体等，所述培养基或所述成熟混合剂尤其含有IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα，或者所述成熟混合剂是单核细胞条件培养基(MCM)或补充PGE2的MCM。
5.权利要求4的方法，其中所述未成熟DC在存在0.1-100ng/mlIL-1β、0.1-100ng/ml IL-6、0.1-10μg/ml PGE2和0.1-100ng/ml TNF-α的情况下培养。
6.权利要求4或5的方法，其特征在于，加入到所述DC中以使其成熟的所述活性物质IL-1β、IL-6、PGE2和TNFα得自所述各种活性物质的纯化制剂。
7.权利要求1-6中一项或多项的方法，其中(i)所述成熟进行至少1小时，最好进行至少6小时；和/或(ii)在所述成熟期间，更换所述培养基中的所述成熟混合剂，和/或将额外的成熟刺激物加入到所述培养基中；和/或(iii)向所述培养基中加入免疫/成熟调节剂，尤其是选自IL-10、富马酸及其酯、霉酚酸mofetil和维生素D3的免疫/成熟调节剂。
8.任一前述权利要求的方法，其中所述冷冻介质含有(i)5-25％(v/v)的一种或多种低温防护剂，尤其是选自DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、白蛋白、氯化胆碱、氨基酸、甲醇、乙酰胺、甘油一乙酸酯和无机盐的低温防护剂，更优选DMSO；和/或(ii)2-30％(w/v)的一种或多种多元醇化合物，尤其是选自葡萄糖、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、赤藓醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨醇、肌醇和D-乳糖的多元醇化合物，更优选葡萄糖；和/或(iii)2-90％(w/v)的非异种血清组分，尤其是自体血清或血浆或者同种异体血清或血浆，更优选人血清白蛋白、自体血清、同种异体人血清或混合血清。
9.任一前述权利要求的方法，其特征在于，所述细胞以5×106至100×106细胞/ml的浓度冷冻。
10.权利要求2-9中一项或多项的方法，其中在冷冻之前给所述DC加载抗原或抗原-抗体复合体。
11.权利要求2-10中一项或多项的方法，其中给所述DC加载的所述抗原是一种蛋白质或具有至少8个氨基酸的其片段，将所述蛋白质或片段加入到所述培养基中，尤其是以0.01-1000μM的浓度加入，最好同时在所述培养基中含有IL-1β、IL-6、PGE2和TNF-α。
12.权利要求2-10中一项的方法，其中给所述DC加载编码所述抗原的DNA分子或RNA分子。
13.权利要求2-10中一项或多项的方法，其中蛋白质片段、细胞或细胞碎片或核酸序列用作所述抗原-抗体复合体中的所述抗原，并且所述抗体是IgG或IgE类之一。
14.权利要求1-13中一项或多项的方法，其中所述DC在冷冻之前或者在再解冻之后，接触能够抑制细胞凋亡的分子，其中所述能够抑制细胞凋亡的分子最好选自CD40配体、TRANCE和RANKL。
15.权利要求1-14中一项或多项的方法，其中超过所述冷冻DC数目的75％、最好超过85％的所述DC在所述DC的所述冷冻和再解冻之后存活。
16.权利要求1-15中一项或多项的方法，其中所述方法适用于从成熟冷藏DC制备疫苗。
17.一种发现冷冻DC的有利条件的方法，所述方法包括下述步骤(a)提供未成熟DC；(b)在不同成熟刺激物存在下用所述未成熟DC进行不同的培养；(c)然后在有或无细胞因子的培养基中培养所述DC，优选在无细胞因子的情况下进行培养；(d)在有或无细胞因子的所述培养基中培养至少1天后，测定活细胞的比率；且(e)确立给出最高存活率的成熟刺激物。
18.权利要求17的方法，其中在有或无细胞因子的所述培养基中培养至少2天、优选至少3天后，测定所述活细胞的比率。
19.冷冻的加载抗原的成熟树突细胞。
20.权利要求19的细胞，所述细胞可采用权利要求1-16中一项或多项的方法获得。
21.一种疫苗，所述疫苗包含权利要求19或20的树突细胞。
全文摘要
本发明涉及用于生产现成可用的、加载抗原或未加载抗原的冷藏成熟树突细胞的方法，尤其是用于生产含有所述树突细胞的疫苗的方法，其中在合适的成熟刺激物存在下培养未成熟的树突细胞，并且将如此获得的成熟树突细胞冷冻。可以在冷冻之前给所述树突细胞加载抗原。本发明也涉及可以按照本发明的方法获得的疫苗，还涉及含有加载抗原的冷冻成熟树突细胞的组合物。
文档编号A61K39/00GK1471575SQ01817741
公开日2004年1月28日 申请日期2001年8月24日 优先权日2000年8月24日
发明者杰罗尔德·许勒, B·许勒图尔纳, 杰罗尔德 许勒, 胀级 申请人:杰罗尔德·许勒, 杰罗尔德 许勒