用于加速创伤修复及防治并发症的方法

专利名称：用于加速创伤修复及防治并发症的方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种应用携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒pUDKH加速器官或组织创伤的修复及防治并发症的方法。
肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)最初被认为是一种肝细胞有丝分裂原，后来发现其对多种组织细胞的分裂、扩散和形态发生起重要的调节作用。尤其在肝脏的发育和再生中，HGF起着至关重要的作用，HGF可治疗重症肝炎、急性肝炎，防治肝纤维化、肝硬化和肝癌。HGF对肾脏疾患也有非常重要的治疗作用，可防治肾纤维化、急慢性肾功能不全等。研究表明在生理状况下HGF可促进肺上皮细胞的发生、支气管系统的管腔形成及肺支气管上皮细胞的增生，从而为HGF治疗肺纤维化、肺炎等疾患奠定了基础。HGF以其促进血管内皮细胞增生的作用使其极有可能用于临床治疗血管外伤和外周血管病、防止冠状动脉血管术后狭窄、防治动脉硬化，并可以其抗纤维化作用而用于治疗心肌炎和心肌梗死。HGF还可促进神经的发生、生存和再生，对神经有营养作用，可用于预防和治疗神经损伤。另外，HGF对消化性溃疡、骨关节软骨疾病等均具有一定的防治作用。由此可见，HGF是一生物活性极为广泛的细胞因子，HGF将以其多种药理作用渗透于临床治疗的各个领域(1)。
创伤、烧伤包括手术切口的愈合仍然是临床存在的一大难题，尤其是糖尿病人的创伤愈合、局部放疗伤口的愈合、大面积烧伤或褥疮等难愈合伤口的愈合，给患者造成巨大痛苦，也给医疗工作带来巨大负担，目前还没有非常有效的方法来促进这些伤口的快速愈合。HGF在理论上可从多方面促进伤口的有效、高质量愈合。首先，HGF可刺激血管内皮细胞的迁移、增殖，形成新生血管，促进局部血液循环从而加速愈合；HGF可刺激皮肤角质细胞运动、增殖，促使伤口的再表皮化；HGF可显著抑制TGF-β的产生，而TGF-β是迄今了解最多、与瘢痕形成最密切的细胞因子，HGF由于对抗TGF-β的产生而可减少瘢痕的形成；另外HGF可增强胶原酶的活性，促使多余形成的胶原有效地降解(3，4)。
以往的研究表明，骨折的愈合是一个极其复杂的过程，是在全身和局部因素的作用下，由多种组织和因子参与的修复过程。在骨组织内的细胞与细胞之间，细胞和细胞外基质之间进行相互的作用和调节，从而完成骨的修复与重建。骨折是外科临床的常见病和多发病，骨折的延迟愈合或骨不连接严重影响患者的机体功能、心理健康和正常的社会活动。近年来，骨愈合中的再血管化受到越来越密切的关注，骨折后骨断端的血管发生了广泛性断裂，不能直接参与骨的修复过程，它必须被疏通，血管再生可促进骨再生，新生血管跨越骨折区后便有新的骨组织形成，在骨折愈合中软骨性骨痂的矿化也依赖于血管再生。因此，寻找一种在骨折愈合过程中能够促进血管再生的细胞因子，并应用于骨折局部，将会促进骨折的愈合，缩短骨愈合的时间。而HGF已证明可明显促进新生血管的形成，而且HGF是成骨细胞与破骨细胞的偶联因子，成骨细胞与破骨细胞均有HGF受体，HGF均能刺激二者的增殖，同时HGF可增加破骨细胞迁移，破骨细胞自身分泌有活性的HGF，因此认为HGF对骨重塑有重要作用(5，6)在HGF蛋白制剂给药中，因HGF在体内半衰期较短，因而需要大剂量、反复给药才能维持局部较高的药物浓度；然而，因局部或体内的酶解作用，即使重复应用也往往难以达到有效浓度。因而，应用蛋白制剂花费较高，且因纯化工艺不成熟，易产生不良作用从而给临床治疗带来副作用。近年来兴起的一种新的治疗模式——基因治疗的方法，有可能克服上述缺点。
基因治疗所用的基因导入系统，大致可分为非病毒载体和病毒载体两类。非病毒载体方法包括裸露DNA、脂质体、基因枪等。这些方法中尤以裸露DNA直接应用为优选方法。
在目前的临床基因治疗中，为尽可能减少副反应，尤其是减少基因突变的潜在危险，基因直接以裸露DNA的形式转移已越来越受到青睐。该方法有以下优点质粒可以携带较长的外源基因，最长可达48kb；DNA不与宿主细胞染色体整合，不引起基因突变，且表达时间相对短暂；质粒构建简单，纯化产品质量过关时又不具有感染性和免疫原性，不易引起免疫应答，可重复注射；在分裂及未分裂细胞中均能表达。缺点是转染效率较低，但HGF基因含一分泌信号肽，可通过旁分泌发挥较强的生物效应；而且对某些特定的疾病裸露DNA的低而短暂的表达却是一大优点，在达到治疗效果的同时更为安全，更适合于临床应用。
病毒载体可以是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、小病毒或其它病毒。在这些病毒中，腺病毒优先用于基因转移。
综上所述，如何加速组织或器官创伤的修复及防治并发症目前仍是医学中的一大难题。而HGF这一对多器官具有营养、修复功能的多功能细胞因子却尚未应用于临床，为此，我们构建了人HGF基因的表达质粒pUDKH，局部涂抹或注射后，证实其具有加速组织器官损伤修复及防治并发症的功效，从而构成一种新的给药系统和防治方法，显示出潜在的临床应用价值。而且我们所构建的pUDKH较以往构建的pcDNA3-HGF发酵后质粒的得率高，转染效率高和HGF表达高。
从我们的实验结果表明，pUDKH可明显加快伤口愈合的速度，防治组织纤维化，抑制病理性瘢痕的形成。我们的结果已证明应用质粒作为载体介导HGF基因可有效促进兔耳皮肤伤口的快速愈合并促进毛囊再生，促进皮脂腺再生，促进毛发及皮脂腺的再生，但哺乳动物中只有人的皮肤附器中有汗腺，因此推测pUDKH用于人的大面积烧伤的治疗中可能也会促进汗腺的再生。
我们利用HGF促进新生血管形成、定向促进创伤愈合等生物学功能，通过基因转染技术，将pUDKH转入到骨折局部组织细胞，使成骨细胞、肌细胞等多种细胞大量分泌活性HGF，促进血管的增生和创伤的修复，从而加速骨折的愈合。临床上由于创伤、肿瘤术后和先天性骨畸形造成的骨缺损后进行自体骨移植的病人相当多，而骨折愈合与自体骨移植修复的机理相同，所以本项目不仅为HGF基因治疗骨折提供重要的科学依据，而且对临床上促进骨折愈合以及骨缺损的修复，也具有极其重要的意义。我们以新西兰兔颌面部骨缺损为例，证明pUDKH可促进颌面部骨损伤的愈合，缩短骨愈合的时间，防止与周围组织的粘连。
我们的实验观察的结果还表明，因犬股动脉被结扎而使血运严重受到干扰的患肢中，不但骨骼肌因缺血而发生了明显的退行变，出现肌肉萎缩、横纹不清晰，肌纤维变细、断裂，肌束内有脂肪细胞浸润等；而且股神经也发生了显著的病变，累及轴突、髓鞘和施旺氏细胞。而经pUDKH处理犬肢体的肌肉和神经均得到了明显的恢复，有的甚至已经达到了正常犬的图像。
我们的实验观察的结果还表明，pUDKH对新西兰兔膀胱粘膜及平滑肌的损伤有促愈合作用，并可防止愈合后疤痕的过度形成。
另外，我们应用E1、E3缺失的重组腺病毒介导HGF基因(Ad-HGF)进行创伤的修复研究，结果表明Ad-HGF同样具有加速创伤修复及预防并发症的功效。
本发明的目的在于提供一种用于加速创伤修复及防治并发症的方法，该方法是利用携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒pUDKH的注射液或喷涂液加速组织器官损伤修复及防治并发症的发生。
本发明的具体实施方案如下1.从人胎盘cDNA文库中克隆人肝细胞生长因子基因。
2.将人肝细胞生长因子编码区cDNA插入到自行构建的载体pUDK上，获得携带人肝细胞生长因子基因表达盒的质粒pUDKH。
3.质粒pUDKH的制备、纯化及质量控制。
4.观察到该重组质粒可加速皮肤创面愈合，并预防疤痕形成。
5.观察到该重组质粒可加速皮肤毛囊、毛发、皮脂腺的生长。
6.观察到重组质粒对神经损伤有加速修复作用。
7.观察到重组质粒对肌肉损伤有加速修复作用。
8.观察到重组质粒对骨损伤有加速修复作用。
9.观察到重组质粒可加速膀胱粘膜和平滑肌损伤修复，并预防粘连。
本发明提供一种加速组织器官损伤修复及防治并发症的方法，该方法是利用携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒pUDKH。该重组质粒可以以液体形式被配制成注射液、涂抹液等用于加速组织器官损伤修复及防治并发症。
应用本发明提供的方法，用携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒pUDKH防治纤维性疾病是从纤维形成机制入手，向患者体内导入人肝细胞生长因子基因，通过抑制TGFβ的产生和增强基质降解酶如胶原酶的活性，来降低组织中TGFβ的水平和降解胶原纤维，达到防治纤维性疾病的目的。因此应用本发明提供的方法应用重组质粒防治纤维性疾病比以往的防治手段更具有科学性，疗效更明确，更彻底，而且能够逆转纤维化过程。若本发明得以应用，将为目前尚无有效防治手段的纤维性疾病的临床治疗提供一种有效的防治手段。
应用本发明提供的方法，用携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒pUDKH加速组织器官损伤修复是从在损伤局部促进血管新生、促进细胞增生、迁移入手，向损伤部位导入人肝细胞生长因子基因，通过在局部促进血管形成、促进组织再生达到加快组织修复的目的。因人肝细胞生长因子是一多功能营养修复因子，可从多方面促进组织器官高质量修复，这种疗法较以往的防治手段更具有科学性，疗效更明确。
参考文献1.刘克辛.《肝细胞增殖因子(HGF)分子医学研究最新进展》，天津科学技术出版社.2001，1-1402.Matsumoto K，Hashimoto K，Yushikawa K，et al.Markedstimulation of growthh and motility of human keratinocytesby hepatocyte growth factor.Exp Cell Res，1992；196114-1203.Ueki T，Kaneda Y，Tsutsui H，et al.Hepatocyte growth factorgene therapy of liver cirrhosis in rats.Nature Med，1999，52264.Zambonin G，Camerino C，Creco G，et al.Hydroxyapatitecoated with hpatocyte growth factor(HGF)stimulates humanosteoblasts in vitro.Br J Bone Joint Surg 2000，82(13)4575.Grano M，Galimi F，Zambonin G et al.Hepatocyte gtowthfactor is a coupling factor for osteoclasts and osteoblastsin vitro.Proc Natl Acad Sci USA，1996；937644实施例一、重组质粒的构建、扩增及纯化1.重组质粒的构建(1)人肝细胞生长因子cDNA的克隆及序列测定按文献报道的人肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)cDNA序列设计引物，并在正向引物中引入BamHI酶切位点，反向引物中引入SalI酶切位点。正向引物的寡核苷酸序列为5′-ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc-3′，反向引物的寡核苷酸序列为5′-tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt-3′，从人胎盘cDNA文库克隆人肝细胞生长因子基因。PCR参数为94℃ 60sec，55℃60sec，72℃ 90sec，循环数为30，72℃延伸7min。PCR产物克隆至pBluescript SK(pSK)载体的BamHI和SalI酶切位点中，命名为pSK-HGF。用XhoI酶切pSK-HGF，琼脂糖凝胶电泳分离后，分别回收大小约3.5kb、1.1kb、0.6kb的DNA片段，将3.5kb片段用T4DNA连接酶自连得到pSK-HGF1，再将1.1kb和0.6kb片段分别插入pSK载体的XhoI酶切位点中，分别命名为pSK-HGF2和pSK-HGF3。全部克隆过程见

图1-1。测序反应策略是pSK-HGF1用T3引物作一反应；pSK-HGF2用T3和T7引物分别作一反应；pSK-HGF3用T7引物作一反应。用Sanger双脱氧终止法测定人HGF cDNA序列。
(2)pUDK的构建将pUC18克隆载体用Pvu II酶切，琼脂糖凝胶电泳分离后，回收大小约2.3kb的DNA片段。用NruI和PvuII双酶切pcDNA3，回收约1kb的DNA片段，该片段含有CMV启动子，多克隆位点和生长激素终止子。将这两个片段用T4 DNA连接酶连接得质粒pUD(约3.3kb)。用AvaII和SspI双酶切pUD，回收约2.7kb的DNA片段，另用AvrII酶切pEGFP-N1，回收约1.1kb的DNA片段，该片段含有完整的卡那霉素基因；连接两个回收DNA片段得质粒pUDK(约3.8kb)。构建示意图见图1。
(3)携带人肝细胞生长因子基因的质粒pUDKH的构建用BamHI和ApaI双酶切pSK-HGF，回收大小约2.2kb的DNA片段，将其克隆至pUDK载体的多克隆位点(BamHI和ApaI两个酶切位点中)，获得携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒载体，命名为pUDKH。构建示意图见图1。
(4)携带人肝细胞生长因子基因的质粒pUDKH的制备制备流程包括发酵、离心收集细胞、碱变性裂解、分离纯化、质量检测。
(5)质粒pUDKH与pcDNA3-HGF的比较将质粒pUDKH与pcDNA3-HGF在同一条件下发酵，发酵8小时时菌体的OD600值分别为1.6382和1.4308，经42℃热激活1.5小时，其菌体的OD600值分别为1.6461和1.5167；质粒pUDKH与pcDNA3-HGF的得率分别为69.05μg/ml和38.12μg/ml，经42℃热激活1.5小时，其得率分别为78.83μg/ml和59.33μg/ml。将质粒pUDKH与pcDNA3-HGF在同一条件下转染293细胞，用ELISA方法检测上清中HGF的表达，结果表明在293细胞中的表达pUDKH高于pcDNA3-HGF。二.重组质粒介导人肝细胞生长因子基因(pUDKH)加速皮肤创面愈合、预防疤痕过度形成的作用1.动物模型新西兰雌性大白兔，体重2.5-3.5kg。耳腹侧无大血管处剃毛消毒后，用一环钻以显微外科方法切除全层皮肤直至软骨表面，圆形切口的直径0.6cm，每侧4-6个。
2.基因转移于切除皮肤的同时将不同剂量的质粒pUDKH涂抹于创口表面，每个创口各涂10μg，8μg，4μg，2μg，0μg，只涂一次。每个剂量组2只兔子，共20个创口。涂抹后动态观察创口愈合速度，分别在第8天、第12天用游标卡尺测量每个创口未愈合横径、纵径，计算未愈合创面的面积。涂抹后第30天，用游标卡尺测量每个创口愈合后皮肤全层厚及其临近无创伤处皮肤全层厚，计算肥大指数(Hypertrophic Index，HI)(HI＝愈合皮肤全层厚/临近皮肤全层厚)。同时将愈合创面及其临近无创伤处皮肤全层(耳的腹、背两侧)一并切下，经10％福尔马林固定，做常规石蜡切片，行H.E.染色。光学显微镜下依据记分的标准示意图对每个标本纤维组织的量进行半定量评估，分为4个等级(+，++，+++，++++)，同时观察再表皮化及软骨的再生程度。
3.疗效评价实验结果表明，在涂抹后第8天愈合速度已有明显差别，涂10μg和8μg组均较涂4μg、2μg组和对照组愈合快，统计学上有显著性差异(p＜0.01)；而4μg、2μg组和对照组比较虽然创口面积缩小但无统计学意义(p＞0.05)。至涂抹后第30天，将创面与邻近无创伤处皮肤一并切下，10％福尔马林固定后做石蜡切片，行H.E.染色。光学显微镜观察表明，涂pUDKH组织切片表皮角化轻，真皮层厚度薄，纤维组织量少；而对照组纤维组织多，真皮层厚。创口中纤维组织半定量评估结果表明，涂10μg和8μg组与涂4μg、2μg组和对照组间有显著性差异(p＜0.01)，而涂4μg、2μg组和对照组无显著差异。同时计算每个瘢的肥大指数，作为愈合质量的一个指标，肥大指数与瘢痕的大小呈正比。结果显示涂抹pUDKH的各组均较对照组肥大指数小，即瘢痕的形成小，外观较平坦，但仅涂10μg，8μg组与对照组比较有显著性差异(p＜0.01)。
另外，在涂10μg，8μg组的一些愈合皮肤上可见丛状新毛的生长，光学显微镜下可见毛囊的增多及毛囊细胞的分裂相以及皮脂腺，而对照组与小剂量组未见此现象，表明涂抹一定剂量的pUDKH可促进皮肤附属器生长。三.pUDKH对犬下肢缺血模型中神经、肌肉的修复作用1.方法杂种犬(雌、雄两性，体重12-15kg)在静脉内注射戊巴比妥麻醉下，于左后肢腹股沟处在股动脉由髂外动脉分支处的起始端进行全或半(使管腔缩小至7mm)结扎，造成肢体缺血模型。这些模型犬被随机分为对照组和pUDKH处理组。结扎股动脉后即刻在大腿内侧的内收长肌和外侧的股直肌肌组织内各分5个点，每个点各注射0.6毫升的裸露空白质粒pUDK或不同剂量(全结扎犬0.15，0.3，和0.6mg/kg；半结扎犬0.075，0.15，和0.3mg/kg)携带HGH基因的裸露质粒pUDKH。到手术后满3个月时，从结扎的后肢采取肌肉和股神经组织标本。这些标本经常规组织病理学制片技术做成切片，光学显微镜下观察结果。
2.结果(1)对照犬在纵切面上只有极少数神经纤维的一些短的节段中仍可隐约见到其中央被染成浅灰蓝色的轴突，而其余绝大多数的神经纤维则已看不到轴突或虽有但已变细、深染并呈不规则的弯曲形；施旺氏细胞核的数量大为减少，能看到的核均已失去泡沫状的结构，形状亦变为两端尖、比正常核稍粗或稍细有些弯曲的梭形，染色深浅不一；更为突出的是几乎所有的神经纤维中都出现了许多大而形状不规则的空泡互相排列成串(髓鞘基质受到损伤后发生了降解，又在常规制片过程中被溶解所形成的)，而正常时所见到的细小空泡只偶在个别神经纤维的节段仍可见到，在其余部位则均已消失，细小空泡之间的神经角质(neurokerating)的隔板已大多消失。在横切面上见到绝大部分神经纤维的轴突均已失去浅灰兰色的色调而变为深染、细而形状不规则；轴突外周的放射状隔板已大部分或完全消失，而为大而完整或不完整环行的空白区所替代；所切到的施旺氏细胞核亦呈圆缩状态。该侧肢体的横纹肌观察到有肌纤维变性、横纹不清晰，肌纤维及细胞核变细、断裂、染色淡，肌束内水肿以及出现脂肪。
(2)pUDKH处理犬3个月活杀犬的股神经在纵切面上见一少部分神经纤维或一些神经纤维的某些节段上亦有略大的空泡，但其数量远少于对照组，而大部分神经纤维或一些神经纤维的大部分节段均已恢复到正常时所见到的细小空泡的形态及规律性排列的神经角质隔板，在其中央可见到浅灰兰色的轴突。施旺氏细胞核的数量亦多于该对照组，且只有一部分呈深染的梭形。在横切面上只见个别神经纤维在轴突与施旺氏细胞膜之间出现有环形空白区，而绝大多数神经纤维均已恢复到正常的形态，在轴突的外周有呈放射状的神经角质隔板。pUDKH处理犬后肢肌肉组织的改变均没有对照组明显。四.pUDKH对兔膀胱粘膜和平滑肌损伤的修复作用1.方法用24-30周新西兰兔制备单纯膀胱肌肉创伤模型，耻骨上正中小切口暴露膀胱前壁，分离切除膀胱前壁肌层组织，制备膀胱前壁肌层缺损创面3个，面积均为1cm2大小。分别涂覆单纯溶剂(A组)，模型对照组(空白质粒pUDK，B组)和实验组(pUDKH，C组)溶液，只涂一次。术后4天去除耻骨上管，4-7天去尿道置管；进行系列创面愈合速度检查，膀胱造影检查，大体检查和组织学检查，比较肥大指数(Hypertrophic index，HI)。
2.结果术后20只兔均存活至实验结束。术后各组平滑肌缺损创面均缩少，A、B和C组创面面积，7天时分别为44±8mm2，43±9mm2和28±6mm2(p＜0.05，Cvs A and B)，14天时分别为23±7mm2，22±6mm2和4±4mm2(p＜0.01，C vs A and B)。膀胱影像检查和大体检查发现，用溶媒治疗创面和用Ad-GFP治疗创面各有一只形成憩室，其余膀胱均保持正常形态。术后愈合膀胱显示，A、B组显示上皮层正常，粘膜下纤维组织增生加厚而肌层较薄；C组显示了明显的三层结构，包括形态正常的膀胱粘膜上皮衬里覆盖在粘膜下层之上，随之是一层含有各种形状的平滑肌束，与周围的膀胱肌层具有相同的正常的组织学结构。术后30天时，A，B和C组的HI分别为1.76±0.17，1.83±0.18和1.11±0.18(p＜0.05，C vsA and B)。
3.结论实验组兔膀胱创面愈合速度快，大体解剖检查及膀胱造影显示形态正常，对照组创面膀胱平滑肌再生速度慢，再生不完全，粘膜下纤维瘢痕增生，部分粘膜外突形成憩室。提示携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒能够促进膀胱平滑肌创伤愈合，减少瘢痕形成。五.pUDKH对兔下颌骨骨损伤愈合的修复作用1.方法新西兰大耳白兔20只(平均体重3kg)，随机分为5组，每组4只。用3％戊巴比妥钠(30mg/kg体重)经耳缘静脉注射麻醉后，仰卧位。固定四肢与头部，头偏向右侧。左侧颌下区备皮、消毒。在左侧颌下作切口，长约2.5cm，分层切开皮肤、皮下组织和颈阔肌，结扎颌外动脉、面前静脉，沿下颌下缘切至骨面，暴露下颌骨体部中后段，用骨膜剥离器作颊、舌侧骨膜下剥离。然后用金刚磨头在下颌体部作一直径为0.5cm的贯通性骨缺损，不予固定。以0.9％生理盐水彻底冲洗创面，充分止血后，骨缺损区填塞明胶海绵，在明胶海绵内以及缺损区的颊舌侧软组织内局部注射pUDKH。创口分层严密缝合，术后自由进食，连续三天肌肉注射庆大霉素4万u，每日1次，以预防感染。于手术后第2、4、6、8、12周分批处死动物，作骨折区血管造影、抗拉力、抗压力、抗剪切力检查，以及组织学检查，以判断骨折愈合情况。对照组兔20只，分组、处理及观察指标基本同试验组，但局部应用pUDK。
2.结果结果表明pUDKH有加速兔下颌骨骨损伤愈合的修复作用。六.重组腺病毒介导人肝细胞生长因子基因(Ad-HGF)对创伤修复的作用1.动物模型新西兰雌性大白兔，体重2.5-3.5kg。耳腹侧无血管处剃毛消毒后，一环钻以显微外科方法切除全层皮肤直至软骨表面，圆形切口的直径为0.6cm，每侧4-6个。
2.效果评价切除皮肤的同时将重组腺病毒涂抹于伤口表面，涂抹8ul(8.6×107pfu/μl)(Ad-HGF组)，；对照组伤口则涂抹同剂量Ad-GFP。术后一月将创面与邻近无创伤处皮肤一并切下，做石蜡切片，行HE染色。结果表明涂抹Ad-HGF组较涂Ad-GFP组创面愈合快，炎性反应轻，疤痕的形成小，；HE染色显示涂Ad-HGF组较涂Ad-GFP表皮角化轻、真皮层厚度小，纤维组织薄。并可观察到毛囊的再生。
权利要求
1.一种用于加速创伤修复及防治并发症的给药系统和治疗方法，其特征在于该方法是利用携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒注射液或喷涂液用于加速创伤修复及防治并发症。
2.一种重组真核表达质粒，其特征在于该重组质粒携带人肝细胞生长因子基因，含有卡那霉素抗性基因序列；肝细胞生长因子基因受巨细胞病毒启动子、牛生长激素基因的聚腺苷酸信号调控。该重组质粒的结构为 pCMV巨细胞病毒启动子； HGF肝细胞生长因子基因；BGHpA牛生长激素基因的聚腺苷酸；Kana卡那霉素抗性基因；ORI复制起点；pUDKH携带人肝细胞生长因子基因重组质粒
3.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是该方法可加速皮肤创伤的修复。
4.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是该方法可加速皮肤附属器的再生修复。
5.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是该方法可防治皮肤瘢痕形成。
6.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是该方法可加速膀胱损伤的修复及防治粘连。
7.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是该方法可加速神经损伤的修复并预防其与周围组织的粘连。
8.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是该方法可加速肌肉损伤的再生修复。
9.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是该方法可加速骨损伤的修复。
10.根据权利要求1和2所述的方法，其特征是该方法可加速其它器官或组织创伤的修复并防治并发症的发生。
全文摘要
本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及一种用于加速组织或器官创伤的修复及防治并发症的方法。将人肝细胞生长因子全长编码区cDNA插入到自行构建的真核表达载体pUDK上，获得一携带人肝细胞生长因子基因的重组质粒，命名为pUDKH，并配制成注射液或喷涂剂。用新西兰兔耳制备皮肤全层创伤模型，经局部一次注射或涂抹注射液或喷涂剂后，观察到创面愈合加速，能预防或减轻瘢痕形成，并促进毛囊及皮脂腺的再生；新西兰兔制备膀胱肌肉创伤模型，经一次局部使用喷涂剂后，观察到本喷涂剂可加速膀胱粘膜和平滑肌创伤的愈合并防止粘连。结扎犬后肢股动脉造成神经和骨骼肌的缺血性损伤模型，经创伤周围给予一次注射液后，观察到本注射液可加速神经和骨骼肌的修复，防止粘连。制备新西兰兔下颌骨骨缺损模型，局部一次应用注射液可促进骨的愈合。据此认为这一应用重组质粒介导人肝细胞生长因子基因的治疗方法在创伤修复及其并发症的基因治疗中具有很好的应用前景。
文档编号A61P17/00GK1453039SQ02116900
公开日2003年11月5日 申请日期2002年4月26日 优先权日2002年4月26日
发明者哈小琴, 吴祖泽, 李元敏, 王新国, 毕建进, 张庆林, 张津辉, 严泉剑, 刘少华, 靳继德 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所, 北京鲁银利华医药科技发展有限公司