专利名称：新的豆豉溶栓酶、其制造方法和产生此溶栓酶的微生物的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种新的豆豉溶栓酶及其生产方法和产生此溶栓酶的微生物。
背景技术：
血栓栓塞性疾病是当前危害人类健康，导致死亡率最高的原因之一，如心肌梗塞、脑血管血栓形成、深静脉血栓形成、脑栓塞、肺栓塞等。此外，血栓形成是许多疾病发病机制中涉及的一种重要病理过程，如肾小球肾炎、糖尿病小血管病变、严重烧伤中局部病变的恶化、视网膜静脉血栓形成等。全世界有血栓栓塞性病人约1500万，所需的溶栓剂的潜在市场约20亿美元。仅我国每年患急性心肌梗塞和脑血栓的约有300万人。因此世界各国都致力于这方面药物的研究开发。
治疗血栓栓塞性疾病的手段目前主要有三种第一，外科手术，即用物理方法清除血栓或切除栓塞部位的血管而用塑料管取代等，如心肌梗塞。这种方法要求的条件复杂，费用高，且手术后易再栓塞；第二，保守疗法，即让患者长期服用抗凝剂，减低凝血倾向，这种方法通常与其他方法结合作为辅助治疗；第三，溶栓疗法，即注射溶栓剂使血管再通，这种方法越早期使用越有效，它与保守疗法相比，治疗后两周内死亡率较低，而费用比外科手术少，更适合于我国国情。
在现行临床所用的溶栓剂中主要是链激酶和尿激酶，但这两种药物都有其局限性。链激酶由于人体内易产生链激酶抗体，因此存在拮抗作用，其用量很不好掌握，并有明显的副作用。虽然尿激酶无明显的抗原性，但因尿激酶很不稳定，其活性很难控制，容易引起大出血，或者因失活而起不到溶解血栓的作用，给急救工作造成很大麻烦。
日本专利(JP61162184)、(JP1180834)和(JP5336917)涉及一种新型的溶栓剂——纳豆激酶(Nattokianse，NK)。它是从日本的传统食品纳豆(Natto)中发现的，能显著地溶解体内血栓，作用时间长，明显缩短优球蛋白溶解时间，静脉注射内皮细胞产生纤溶酶原激活剂，而且口服效果也很好。但野生型纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)的纳豆激酶的产量不高，由此得到的纳豆激酶的生产方法亦不够理想。
豆豉是我国的传统发酵食品，具有开胃增食，消积化滞，驱风散寒以及预防心血管疾病等功效。我国学者近几年相继发现了豆豉中也存在一种溶栓酶，并进行了深入的研究。中国专利(申请号CN-97106442.3和申请号CN00107589.6)涉及到纳豆激酶的生产方法，即采用纳豆芽孢杆菌在大豆、无机盐等的固体或液体培养基经发酵，产生并提取和纯化工艺等生产纳豆激酶。中国专利(申请号CN-99119166.8、CN-99125780.4和CN-00112980.5)则采用基因工程技术，通过PCR反应扩增出纳豆激酶的基因，然后在一定的载体和相应的宿主菌中进行表达。但是这些专利运用的微生物菌株与日本纳豆激酶一样均是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)或纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)。
本发明的目的是提供一种新的豆豉溶栓酶、制造这种溶栓酶的方法和产生这种溶栓酶的微生物。本发明涉及的微生物是从中国传统食品豆豉中筛选的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)，该菌株产生的溶栓酶的特性及其所产的溶栓酶在相关文献和专利中未见报道。
发明内容
发明人发现由芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌株UN-20-N-38产生的豆豉溶栓酶(Douchi Fibrinolytic Enzyme，DFE)是一种弱碱性蛋白酶。仅使用此酶进行的体外溶栓实验表明，该酶具有非常好的溶栓效果。因此，本发明提供了这种新的溶栓酶、它的生产方法和酶学性质，及其产生这种溶栓酶的微生物。
产生酶的微生物产生本发明酶的微生物是芽孢杆菌属的一种与解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)在细菌学上密切相关的菌株UN-20-N-38。
细菌学特性与本发明相关的芽孢杆菌属菌株UN-20-N-38具有下列的细菌学特性(a)形式芽孢杆菌(b)革兰氏染色阳性(c)孢子的产生阳性(d)孢子的形状椭园(e)移动性阳性(f)对氧的反应需氧菌(g)过氧化氢酶的产生阳性(h)在厌氧条件下的生长阴性(i)伏一普二氏反应(VP)反应阳性(j)酸的产生葡萄糖阳性阿拉伯糖阳性甘露糖醇阳性蔗糖阳性木糖阳性乳糖阳性(k)耐盐性10％NaCl(l)明胶的液化作用阳性(m)淀粉的降解阳性(n)抗溶菌酶(0.001％)阳性(o)柠檬酸盐、丙酸盐的利用阳性(p)50℃的生长阴性根据Bergey的系统细菌学手册(Vol.2，William和Wilkins，1986)，初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌，定名UN-20-N-38。并且用美国Biolog微生物鉴定仪鉴定得到相同的结果。
此外，属于所说菌株UN-20-N-38的溶栓酶生产力改进突变体(通过自发或者诱导突变而得)可以作为产生本发明溶栓酶的细菌。为了制备这些突变体，可以使用常规的方法，例如由紫外线照射或者诱变剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)对原始菌株诱导突变后，将培养物接种到含有纤维蛋白的琼脂培养基中。从在菌落周围形成较大清晰环带的菌落中选择具有极好生产力的突变体；配合通过摇瓶实验测定纤溶活性，以及体外溶栓实验等，得到产生本发明溶栓酶的微生物菌株。
产生溶栓酶的方法任何能够使产生本发明溶栓酶的微生物生长并产生所说的溶栓酶的培养基都可以用于生产本发明的溶栓酶。
例如，可以使用木糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、糊精作为碳源，使用无机的氮化合物(如硝酸钠、硝酸钾、磷酸氢二铵等)或有机氮化合物(如纤维蛋白、蛋白胨、玉米浸液、黄豆粉等)作为氮源，此外还要加入矿物质，如磷酸盐、钾盐、镁盐和钙盐。培养基的初始pH值为7.0-8.0。在本发明中，将培养物在需氧的条件下培养，培养温度为37℃，培养时间为60h到72h，即可得到最大产量的酶。
可以按照常规的分离和纯化方法对通过以上过程获得的培养物进行纯化。通过盐析沉淀蛋白质、喷雾干燥方法、冻干法等，将可溶性盐加入到所得的上清液或滤液(所说的上清液和滤液是通过离心或者过滤菌体细胞和培养基的固体剩余物而得到的)中，即可获得了本发明的溶栓酶。而且可以结合使用其它的纯化方法(如离子交换层析和凝胶过滤层析)来进一步纯化所说的酶。发明人把通过上述方式所获得的本发明的溶栓酶命名为(DouchiFibrinolytic Enzyme，DFE)。通过下述方法测定溶栓酶的活性并测试它的体外溶栓效果。
1、纤溶活力的测定16.2mL 1％的琼脂糖凝胶液于55℃时加入16.2mL 0.3％的纤维蛋白原溶液及1.3mL凝血酶(1BP/mL)，混匀倒入平板中，静置冷却。在平板上打孔点样，于37℃保温18h，测定水解圈的大小，计算其面积。以尿激酶作标准曲线。
2、体外溶栓的测试加抗凝剂的新鲜人血经3000rpm离心15min，所得的血浆作为贫凝血酶的血浆样品。在冰浴中混合250μL血浆和750μL TNTC缓冲液(20mmol/L Tris.HCl，0.16mol/LNaCl，0.01％Tween-80，30mmol/L CaCl2，pH7.4)，迅速混匀后用注射器加入到Ep管底部，每管100μL。将小试管于37℃保温30min，凝块形成后，编号称重，小心加入100μL待测样品，封口并于37℃保温12h，吸净管中溶液，称重，两次重量之差即为血凝块溶解得量。
豆豉溶栓酶的特性本发明所获得的溶栓酶的物理和化学特性如下1.酰胺水解酶活性利用几种人工合成的底物测定了DFE水解酰胺键活性的高低，结果见表1。DFE的最适底物是Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，它是枯草杆菌蛋白酶或胰凝乳蛋白酶的最适底物。DFE水解Lys羧基端形成的肽键比Arg羧基端形成的肽键更容易一些，而对Bz-Val-Gly-Arg-NA和CBz-Gly-Pro-Arg-NA.水解能力很弱。因此，DFE可以被认为是类似于枯草杆菌蛋白酶的一种蛋白酶，这与纳豆杆菌产生的纳豆激酶，枯草杆菌IMR-NK1和芽孢杆菌CK11-4产生的纤溶酶类似。
表1 豆豉溶栓酶对几种人工合成底物的水解底物 水解活性Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA 0.687H-D-Val-Leu-Lys-pNA 0.326Bz-Val-Gly-Arg-NA 0.029CBz-Gly-Pro-Arg-NA 0.015BANA0BTEE0.0112、最适pH值用不同pH值的缓冲液稀释酶液，37℃下测定酶活性，结果如附图1所示。在pH6.0-9.0的范围内，酶活随pH升高而升高，随后便随pH升高而下降。因此最适pH值为8.0(见附图1)。
3、最适反应温度以Tris-HCl缓冲液(pH9.0)稀释酶液，在不同反应温度下测定酶活。结果表明，该酶的最适反应温度为48℃，超过52℃酶活迅速降低(见附图2)。
4、抑制剂的影响使用了7种不同的抑制剂，测定了它们对该溶栓酶的影响。以未加入抑制剂的样品酶活作为100％，加入抑制剂后的样品的酶活进行换算后为剩余相对酶活，结果示于表2。
表2不同抑制剂对豆豉溶栓酶活性的影响抑制剂 浓度 剩余酶活(％)None0 100PMSF0.1mmol/L 0Benzamidine HCl 0.8mg/mL 43Leupeptin 0.25mg/mL 76.5Pepstatin A 0.25mg/mL 84.2Aproptin1000IU/mL 100EGTA10mmol/L 100EDTA10mmol/L 100结果表明，特异性抑制丝氨酸蛋白酶的抑制剂PMSF能完全抑制该溶栓酶的活性，表明该溶栓酶为一种丝氨酸蛋白酶。EDTA，EGTA和aproptin对该酶不抑制，表明该溶栓酶的活性不需要金属离子的参与。
5、分子量和等电点的测定将纯化得到的蛋白进行SDS-PAGE(12％胶浓度)，无论有无还原剂β-巯基乙醇，DFE均呈现一条带(见附图3)，说明DFE为单链蛋白质，分子量为28kD。等电聚焦电泳(见附图4)显示，DFE的等电点约为8.0。
6、温度对豆豉溶栓酶的纤溶活性的影响将酶液分别置于40℃，50℃，60℃，70℃的水浴中保温不同时间，然后检测纤溶活性。结果见附图5所示。豆豉溶栓酶在40℃保温60min后，活力几乎没有丧失。在50℃，60℃保温60min后，分别保留76％，10％的活性；在70℃保温10min，完全丧失活性。该酶在37℃，pH6-10的缓冲液中存放1h，其酶活基本稳定，而且反复冻融几乎不影响酶活性。
7、溶解纤维蛋白的作用方式将纤维蛋白平板于85℃烘箱内放置30min制成加热平板，其中的血纤维蛋白溶酶原因加热而失活。将样品分别点在纤维蛋白平板和加热平板上测定酶活，结果表明，在两块平板上的水解圈没有显著的差异，这说明豆豉溶栓酶溶解纤维蛋白的作用方式为直接溶解纤维蛋白，不能激活纤溶酶原形成纤溶酶。
图1、豆豉溶栓酶(DFE)的最适反应pH值；
图2、豆豉溶栓酶(DFE)最适反应温度；图3、豆豉溶栓酶(DFE)的SDS-PAGE图；图4、豆豉溶栓酶(DFE)的等点聚焦电泳图；图5、温度对豆豉溶栓酶(DFE)的纤溶活性的影响。
具体实施例方式
实施例1、解淀粉芽孢杆菌UN-20-N-38的培养将菌株UN-20-N-38在含有纤维蛋白2.0％，蛋白胨0.5％，糊精2.0％，酵母膏0.15％，K2HPO4 0.4％，NaH2PO4 0.04％，CaCO30.5％的培养基中，于32℃摇瓶培养72h，将培养液10000rpm离心10min后取上清液。上清液的酶活为820U/mL。
实施例2、豆豉溶栓酶(DFE)的纯化将在实施例1中获得的培养物10000rpm离心10min后，取上清液，用30-65％饱和度的硫酸铵将此溶液进行分段盐析。将获得的沉淀溶解于20mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.8)，并用此缓冲液透析。然后在pH7.8下，将此溶液加入到CM-Sepharose Fast Flow柱(Pharmacia公司)中，使用含0.02mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.8)洗脱。将酶活峰于10mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.4)中充分透析后，再上DEAE-Sepharose Fast Flow(Pharmacia公司)柱，使用含0.01mol/L NaCl的10mmol/LTris-HCl缓冲液(pH8.4)洗脱。将酶活峰中加入硫酸铵至终浓度为1mol/L，上Phenyl Sepharose 6 Fast Flow柱，洗脱出的活性峰透析后冻干。溶解后上Sepheadex G-50柱(Pharmacia公司)中，使用含0.15mol/LNaCl的20mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.8)洗脱，收集酶活峰。对此组分进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，表明此酶为一条单一的带。利用此法所获得的豆豉溶栓酶纯度提高11.5倍，回收率达到2.8％(表4)。
表4 解淀粉芽孢杆菌豆豉溶栓酶的分离纯化总活力总蛋白 比活 纯化倍数回收率步骤(U) (mg)(U/mg) (x-fold)(％)发酵上清液899470 2210407 1 10030～60％硫酸铵分段盐析811322 715 11352.890.2CM阳离子交换层析 318412 153 20815.135.4DEAE阴离子交换层析142116 44 32307.915.8疏水层析 8005321 38129.48.9Sephadex G-50凝胶过滤 251855.4 466411.5 2.8实施例3、豆豉溶栓酶(DFE)的体外溶栓实验将在实施例2中获得的豆豉溶栓酶纯品测定体外溶栓效果。加抗凝剂的新鲜人血经3000rpm离心15min，所得得血浆作为贫凝血酶的血浆样品。在冰浴中混合250μL血浆和750μL TNTC缓冲液(20mmol/L Tris.HCl，0.16mol/L NaCl，0.01％TweeN-80，30mmol/LCaCl2，pH7.4)，迅速混匀后加入到Ep管底部，每管100μL。将小试管于37℃保温60min，凝块形成后，编号称重，小心加入100μL待测样品，封口并于37℃保温12h，吸净管中溶液，称重，两次重量之差即为血凝块溶解得量。
权利要求
1.一种溶栓酶，其特征是满足下列(a)-(e)所规定的至少一个条件(a)室温下，在10mmol/L的EDTA作用下，剩余活力达100％；(b)室温下，在10mmol/L的EGTA作用下，剩余活力达100％；(c)室温下，在1000IU/mL的Aproptin作用下，剩余酶活达100％；(d)室温下，在0.1mmol/L的PMSF作用下，剩余活力达0；(e)室温下，在0.8mg/mL的盐酸苯甲醚作用下，剩余活力达43％；
2.按照权利要求1的溶栓酶，其特征是所说的溶栓酶具有下列特性(1)作用此溶栓酶能水解蛋白质和肽；(2)最适pH48℃下在pH9.0时酶活最高；(3)稳定pH范围37℃下在pH6.0-pH10.0范围内酶活稳定；(4)最适温度该酶的最适反应温度为48℃；(5)分子量通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测得的该酶的分子量为28,000道尔顿。
3.按照权利要求1或权利要求2的溶栓酶，其特征是所说的溶栓酶是由属于芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物产生的。
4.按照权利要求3的溶栓酶，其特征是所说的产生溶栓酶的微生物是解淀粉芽孢杆菌UN-20-N-38(保藏号CGMCC NO.0625)。
5.一种生产溶栓酶的方法，其特征是从产生权利要求1-4所说的溶栓酶产生菌解淀粉芽孢杆菌UN-20-N-38(保藏号CGMCC NO.0625)或其变种培养物中获得所说的蛋白酶。
6.按照权利要求5的方法，其特征是所说的微生物是解淀粉芽孢杆菌UN-20-N-38(保藏号CGMCC NO.0625)。
7.一种产生溶栓酶的微生物，其特征是它是解淀粉芽孢杆菌UN-20-N-38(保藏号CGMCCNO.0625)和它的突变体。
8.溶栓剂，其特征是其中包括权利要求1-4所规定的溶栓酶。
9.一种溶栓剂，其特征是其中包括权利要求1-4所规定的溶栓酶。
全文摘要
本发明涉及一种新的芽孢杆菌属未知菌株(保藏号CGMCC NO.0625)，通过培养所说的菌株或其突变体所获得的、具有下列特性的溶栓酶、此溶栓酶的产生方法。该酶能水解蛋白质和肽；在48℃下，在pH9.0时的酶活最高；在37℃下，pH6.0－pH10.0范围内酶活力稳定；最适反应温度48℃；分子量为28,000道尔顿。本发明的溶栓酶可以特异水解纤维蛋白，高效溶解血栓。本发明的豆豉溶栓酶经处理后可制成溶血栓类药品和预防心血管疾病的保健食品。
文档编号A61K38/43GK1473931SQ02133580
公开日2004年2月11日 申请日期2002年8月5日 优先权日2002年8月5日
发明者张义正, 彭勇, 李珉, 王海燕, 童英 申请人:四川大学