4-(苯基-哌啶-4-基亚基-甲基)-苯甲酰胺衍生物及其在治疗疼痛、焦虑或胃肠疾病中的用途的制作方法

专利名称：4-(苯基-哌啶-4-基亚基-甲基)-苯甲酰胺衍生物及其在治疗疼痛、焦虑或胃肠疾病中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的化合物、其制备方法、用途以及含有该新化合物的药物组合物。该新化合物适用于治疗、特别是疼痛、焦虑和功能性胃肠疾病。
背景技术：
已经确定，δ受体在许多身体功能例如循环和疼痛系统中起着作用。因此发现，δ受体的配体可能可以用作止痛剂和/或抗高血压药剂。δ受体的配体还显示出具有免疫调节活性。
目前已经确定了至少三种不同的类阿片(opioid)受体(μ、δ和κ)，并且所有这三种受体在许多物种、包括人的中枢和外周神经系统中均清晰可见。当一种或多种这些受体被活化时，在各种动物模型中均观察到痛觉缺失。
少数例外的是，目前可供选择的阿片类δ配体是天然肽类的，并且不适用于全身给药。非肽δ-激动剂的一个实例是SNC80(Bilsky E.J.等，Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，273(1)，pp.359-366(1995))。无论如何，仍然需要选择性的δ-激动剂，这些激动剂不仅仅具有改善的选择性，而且具有改善的副作用特性。
因此，本发明的问题是发现比现有的μ兴激动剂具有改善的止痛作用、同时具有改善的副作用特性以及具有改善的系统功效的新的止痛剂。
已经确定存在于现有技术中的止痛剂有许多缺点，即它们的药物动力学差，并且当全身给药时不能止痛。此外，已经证明，当系统给药时，现有技术中所述的优选的δ激动剂化合物显示出显著的惊厥作用。
我们现在发现某些化合物具有出人意料的改善的性质，即改善的δ-激动剂功效、体内功效、药物动力学、生物利用度、体外稳定性和/或低毒性。
发明概述本发明的新化合物由式I所定义 其中R1选自下列基团之一(i)苯基； (ii)吡啶基； (iii)噻吩基； (iv)呋喃基 (v)咪唑基
(vi)三唑基 (vii)吡咯基 (viii)噻唑基 (ix)吡啶基-N-氧化物 其中每个R1苯基环和R1杂芳环任选地和独立地被1、2或3个独立选自直链或支链C1-C6烷基、NO2、CF3、C1-C6烷氧基、氯、氟、溴和碘的取代基进一步取代。苯基环或杂芳环上的取代基可以出现在所述环系上的任何位置；本发明的另一具体实施方式
是图I的化合物，其中R1如上所定义，并且每个R1苯基环和R1杂芳环可以进一步独立地被甲基取代。
本发明的另一具体实施方式
是图I的化合物，其中R1是苯基、吡咯基、吡啶基、噻吩基或呋喃基，它们任选地在R1苯基或R1杂芳环上带有1或2个优选的取代基。
本发明的另一具体实施方式
是图I的化合物，其中R1是苯基、吡咯基或吡啶基，它们任选地在R1苯基或R1杂芳环上带有1或2个优选的取代基。
本发明的另一具体实施方式
是图I的化合物，其中R1是噻吩基或呋喃基，它们任选地在R1杂芳环上带有1或2个优选的取代基。
本发明还包括式I化合物的盐和旋光对映体，包括旋光对映体的盐。
当R1苯基环和R1杂芳环被取代时，优选的取代基选自CF3、甲基、碘、溴、氟和氯中的任何一个。
在反应方案1中的反应步骤g，参见下文，使用钯催化剂例如Pd(PPh3)4、在碱例如碳酸钠存在下，通过通式II的中间体化合物与3-氨基苯基硼酸(boronic acid)反应进行 其中PG是尿烷或尿烷保护基如Boc和CBZ或苄基或取代的苄基保护基例如2，4-二甲氧基苄基，得到通式III化合物
然后在标准条件下将其脱保护，并在还原条件下使用通式R1-CHO化合物将其烷基化，得到通式I化合物。
本发明的新化合物适用于治疗、特别是治疗各种疼痛如慢性痛、神经性疼痛、急性痛、癌痛、风湿性关节炎引起的疼痛、偏头痛、内脏性痛等。当然，该列举不是穷举。
本发明化合物适于用作免疫调节剂，特别是用于自身免疫疾病如关节炎，用于皮肤移植、器官移植和类似的外科手术需要，用于胶原病、各种变应性疾病，用作抗肿瘤剂和抗病毒剂。
本发明适用于如下的疾病状态，其中在范例中存在或者涉及类阿片受体的变性或机能障碍。可以包括在诊断技术和成象应用例如正电子发射断层照相(PET)中使用同位素标记的本发明化合物。
本发明化合物适用于治疗腹泻、抑郁、焦虑和与压力有关的疾病例如外伤后应激症、恐慌症、广泛性焦虑症、社交恐怖症和强制性障碍；小便失禁、各种精神疾病、咳嗽、肺水肿、各种胃肠疾病例如便秘、功能性胃肠疾病如肠道易激综合征和功能性消化不良、帕金森氏病和其他运动障碍、外伤性脑损伤、中风、心肌梗塞后的心保护、脊髓损伤和药物成瘾包括酒精、尼古丁、阿片样物质和其他药物滥用，以及用于治疗交感神经系统疾病例如高血压。
本发明化合物适于用作止痛剂以用于全身性麻醉和监护麻醉护理。经常采用具有不同性质的试剂的组合以达到保持麻醉状态所需的平衡效果(例如记忆缺失、痛觉缺失、肌肉松弛和镇静)。在该组合中包括吸入麻醉剂、安眠药、抗焦虑药、神经肌肉阻滞剂和阿片样物质。
上述式I中的任何化合物在制备治疗上述任何疾病的药物中的用途也包括在本发明范围内。
本发明另一方面是患上述任何疾病患者的治疗方法，该方法是将有效量的上述式I化合物对需要该治疗的患者给药。
本发明另一方面是通式II和III的中间体，
其中PG是氨基甲酸酯保护基例如Boc或CBZ，或者苄基或取代的苄基保护基如2，4-二甲氧基苄基。
制备方法实施例下面将通过反应方案和实施例详细描述本发明，这些反应方案和实施例不应解释为对本发明的限制。
反应方案1合成溴乙烯中间体6。
中间体24-(二甲氧基-磷酰基甲基)-苯甲酸甲酯。
在氮气氛下，将原料1(11.2g，49mmol)与亚磷酸三甲酯(25mL)的混合物回流5小时。与甲苯共蒸馏除去过量的亚磷酸三甲酯，得到定量产率的化合物21HNM NMR(CDCl3)δ3.20(d，2H，J＝22Hz，CH2)，3.68(d，3H 10.8Hz，OCH3)，3.78(d，3H，11.2Hz，OCH3)，3.91(s，3H，OCH3)，7.38(m，2H，Ar-H)，8.00(d，2H，J＝8Hz，Ar-H)。
中间体34-(t-甲氧羰基-亚苄基)-哌啶-1-甲酸叔丁酯。
在-78℃，向化合物2在无水THF中的溶液(200mL)中滴加二异丙基氨基锂(32.7mL 1.5M，在己烷中，49mmol)。然后将反应混合物温热至室温，加入N-叔丁氧羰基-4-哌啶酮(9.76g，49mmol，在100mL无水THF中)。12小时后，反应混合物用水(300mL)终止反应，用乙酸乙酯萃取(3×300mL)。合并的有机相用MgSO4干燥并蒸发，得到粗产物，该产物经闪式色谱纯化，得到化合物3，为白色固体(5.64g，35％)IR(NaCl)3424，2974，2855，1718，1688，1606，1427，1362，1276cm-1；1H NMR(CDCl3)δ1.44(s，9H)，2.31(t，J＝5.5Hz，2H)，2.42(t，J＝5.5Hz，2H)，3.37(t，J＝5.5Hz，2H)，3.48(t，J＝5.5Hz，2H)，3.87(s，3H，OCH3)，6.33(s，1H，CH)，7.20(d J＝6.7Hz，2H，Ar-H)，7.94(d，J，＝6.7Hz，2H，Ar-H)；13C NMR(CDCl3)δ28.3，29.2，36.19，51.9，123.7，127.8，128.7，129.4，140.5，142.1，154.6，166.8。
中间体4(4-甲氧羰基-苯基)-甲基]-哌啶-1-甲酸叔丁酯。
在0℃，向化合物3(5.2g，16mmol)和K2CO3(1.0g)在无水二氯甲烷(200mL)中的混合物中加入溴(2.9g，18mmol)在30mL CH2Cl2中的混合物。在室温保持1.5小时，滤出K2CO3后，将该溶液浓缩。然后将残余物溶解在乙酸乙酯(200mL)中，用水(200mL)、0.5M HCl(200mL)和盐水(200mL)洗涤，用MgSO4干燥。除去溶剂，得到粗产物，粗产物从甲醇中重结晶，得到化合物4，为白色固体(6.07g，78％)IR(NaCl)3425，2969，1725，1669，1426，1365，1279，1243cm-1；1H NMR(CDCl3)δ1.28(s，9H)，1.75(m，1H)，1.90(m，1H)，2.1(m，2H)，3.08(br，2H)，3.90(s，3H，OCH3)，4.08(br，3H)，7.57(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H)7.98(d，J＝8.4Hz，2H，Ar-H)；13C NMR(CDCl3)δ28.3，36.6，38.3，40.3，52.1，63.2，72.9，129.0，130.3，130.4，141.9，154.4，166.3。
中间体54-[溴-4-羧基苯基)-亚甲基]-哌啶-1-甲酸叔丁酯。
将化合物4(5.4g 11mol)在甲醇(300mL)和2.0M NaOH(100mL)中的溶液在40℃加热3小时。过量收集固体，并真空干燥过夜。将干燥的盐溶解在40％乙腈/水中，并用浓盐酸调节至pH2。过滤分离出产物5(3.8g，87％)，为白色粉末1H NMR(CDCl3)δ1.45(s，9H，tBu)，2.22(dd，J＝5.5Hz，6.1Hz，2H)，2.64(dd，J＝5.5Hz，6.1Hz，2H)，3.34(dd，J＝5.5Hz，6.1Hz，2H)，3.54(dd，J＝5.5Hz，6.1Hz，2H)，7.35(d，J＝6.7Hz，2H，Ar-H)，8.08(d，J＝6.7Hz，2H，Ar-H)；13C NMR(CDCl3)δ28.3，31.5，34.2，44.0，115.3，12 8.7，129.4，130.2，137.7，145.2，154.6，170.3。
中间体64-[溴-(4-二异丙基氨基甲酰基-苯基)-亚甲基]-哌啶-1-甲酸叔丁酯。
在室温，向酸(5)(50.27g，0.127mol，1.0当量)在乙酸乙酯(350ml)中的轻悬浮液中加入二异丙胺(71.10ml，0.510mol，4.0当量)和2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TBTU，44.90g，0.140mol，1.1当量)。搅拌所得淡白色悬浮液两天后，加入水(200ml)终止反应，并分离两相。水相用二氯甲烷(100ml)反萃取两次。合并的有机相用1M HCl溶液(150ml)和盐水(100ml)洗涤，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到淡黄色油。粗产物在叔丁基甲基醚(300ml)中重结晶。滤液经闪式色谱纯化，用在己烷中的30％乙酸乙酯洗脱，并从(10∶90)乙酸乙酯∶己烷混合物中重结晶。合并白色固体产物(47.28g，产率78％)。
反应方案2实施例1和中间体9的合成途径
中间体7N，N-二异丙基-4-(3-氨基苯基-哌啶-4-基亚基-甲基)-苯甲酰胺。
在室温，向溴乙烯6(9.09g，18.96mmol，1.0当量)在甲苯(100ml)中的溶液中加入2-氨基硼酸(3.12g，22.75mmol，1.2当量)，然后加入乙醇(20ml)和碳酸钠(2M水溶液，23.7ml，47.4mmol，2.5当量)。用氮气吹扫15分钟后，向该混合物中加入四(三苯基膦)钯(0)(1.58g，1.37mmol，0.072当量)，然后升温至90℃。搅拌过夜后，使反应物冷却至室温，分离各相。有机相用水(50ml)、然后用盐水(50ml)洗涤两次。水相用二氯甲烷(80ml)反萃取。后一有机相用水(50ml)、然后用盐水(50ml)洗涤两次。合并有机相，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物经闪式色谱纯化，用在己烷中的50％乙酸乙酯洗脱(6.06g，65％)。
中间体94-[1-(3-氨基-苯基)-1-哌啶-4-基亚基-甲基]-N，N-二异丙基-苯甲酰胺。
在室温，向氨基甲酸酯7(5.20g，10.6mmol，1.0当量)在二氯甲烷(100ml)中的溶液中加入三氟乙酸(TFA)(8.15ml，105.8mmol，10.0当量)。搅拌3小时后，加入2M氢氧化钠水溶液(100ml)终止反应。分离各相。有机相用2M氢氧化钠水溶液(50ml)洗涤两次，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到3.81g所需化合物(92％)。
一等分脱保护的胺(450mg，1.15mmol)经反相制备HPLC纯化(梯度在A中的10％-5 0％B，A0.1％TFA水溶液；B0.1％TFA的乙腈溶液)。减压浓度馏分并用2M氢氧化钠水溶液中和至pH＝10。该混合物用乙酸乙酯(20ml)萃取两次。合并有机相，用硫酸钠干燥，过滤。向该混合物中加入在乙醚中的1M HCl溶液(4ml，约3.5当量)。然后减压浓缩所得混合物。白色固体与乙醚一起研制，并减压浓缩，得到336.7mg产物。
1H NMR(δ，ppm)(400MHz，CD3OD)7.51(t，J＝8.4Hz，1H，Ar-H)；7.20-7.38(m，7H，Ar-H)；3.81(br s，1H，NCH)；3.61(br s，1H，NCH)；3.26(m，4H，NCH2)；2.59(m，4H，NCH2)；1.48(br s，6H，CH3)；1.13(br s，6H，CH3)元素分析实测值C，57.88；H，7.08；N，7.54。C25H33N3O x 3.5HCl的计算值C，57.84；H，7.09；N，8.09％。
实施例1N，N-二异丙基-4-(3-氨基苯基-N-苄基-哌啶-4-基亚基-甲基)-苯甲酰胺。
(i)制备N，N-二异丙基-4-(溴-N-苄基-哌啶-4-基亚基-甲基)-苯甲酰胺(化合物10)在室温，用在二氯甲烷(25mL)中的TFA(25mL)处理如上制备的化合物6(2.26g，5.0mmoL)。2小时后，浓缩反应混合物，得到残余物(化合物8)，将其溶解在乙腈(20mL)中，并在室温与苄基溴(5.0mmol)反应2小时。浓缩反应混合物，然后溶解在乙酸乙酯(100mL)中。有机溶液用1N NH4OH和盐水洗涤，用硫酸镁干燥。除去溶剂，得到粗产物，经闪式色谱纯化，得到化合物8。
在0℃，向胺(8)(4.76g，13.6mmol)在二氯甲烷(120mL)中的的溶液中加入三乙胺(5.7mL，41.0mmol)和苄基溴(1.8mL，15.1mmol)。使反应物逐渐温热至室温，24小时后，反应物用水(1×100mL)洗涤，用硫酸镁干燥有机层，过滤并浓缩。残余物经闪式色谱纯化，用在己烷中的50％-60％乙酸乙酯洗脱，得到3.80g(产率64％)产物。
(ii)N，N-二异丙基-4-(3-氨基苯基-N-苄基-哌啶-4-基亚基-甲基)-苯甲酰胺(实施例1)向装有8.5g溴乙烯(10)的烧瓶中加入二甲苯(120mL)、乙醇(80mL)和3-氨基苯基硼酸(3.96g，1.5eq)。使该溶液脱气30分钟，然后经套管加入碳酸钠水溶液(29.0mL，2N，3.0eq，脱气30分钟)。然后加入四三苯基膦钯(1.67g，0.075eq)。将反应混合物脱气10分钟，然后在80℃搅拌过夜。将反应物冷却，用水稀释，经硅藻土垫过滤。除去有机物，水层用乙醚萃取(2×100mL)。合并的有机提取物用无水硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残余物经闪式色谱纯化，用2％MeOH/CH2Cl2至4％MeOH/CH2Cl2洗脱。
实施例1(另一制备方法)N，N-二异丙基-4-(3-氨基苯基-N-苄基-哌啶-4-基亚基-甲基)-苯甲酰胺。
在室温，向胺9(375mg，0.96mmol，1.0当量)在四氢呋喃(20ml)中的溶液中加入苯甲醛(117μl，1.15mmol，1.2当量)。搅拌10分钟后，向溶液中加入三乙酰氧基硼氢化钠(265mg，1.25mmol，1.3当量)。搅拌过夜后，反应混合物用二氯甲烷(10ml)和2M氢氧化钠水溶液(15ml)稀释。分离各相，有机相用盐水(15ml)洗涤。前一水相用二氯甲烷反萃取三次(15ml)。合并有机相，用硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗产物经反相制备HPLC纯化(梯度在A中的10％-50％B，A0.1％TFA水溶液；B0.1％TFA的乙腈溶液)。减压浓缩馏分，并用2M氢氧化钠水溶液中和至pH＝11。该混合物然后用乙酸乙酯萃取两次(30ml)。合并有机相，用硫酸钠干燥，过滤。向该混合物中加入在乙醚中的1M HCl溶液(4ml，约3.5当量)。然后减压浓缩所得混合物。白色固体用乙醚研制并减压浓缩，得到294mg产物(产率53％)。
1H NMR(δ，ppm)(400MHz，DMSO)7.56(s，2H，Ar-H)；7.41(m，4H，Ar-H)；7.22(d，J＝7.4Hz，2H，Ar-H)；7.08-7.15(m，4H，Ar-H)；6.96(s，1H，Ar-H)；4.26(s，2H，NCH2Ar)；4.00(br s，2H，NH2)；3.60(br s，2H，NCH)；3.32(br s，2H，CH2)；3.00(brs，2H，CH2)；257(m，4H，NCH2)；1.31(br s，6H，CH3)；1.06(br s，6H，CH3)元素分析实测值C，64.33；H，7.10；N，6.40。C32H39N3O x 3.2HCl的计算值C，64.23；H，7.11；N，7.02％。
按照下列一般合成方法制备了附加的实施例2-13。上面对实施例1所述的方法是典型的。
向化合物7在无水四氢呋喃(THF)中的溶液中加入醛(1-1.5eq)，然后加入三乙酰氧基硼氢化钠(1-1.6eq)。在室温和氮气氛下搅拌反应物延长的时间(6-48小时)以确保反应完全。然后对反应混合物进行标准的后处理和标准的纯化。THF的量不是关键的。优选的用量是每克胺约30mL。
合成实施例的分析数据示于下表1中。
表1合成实施例的分析数据。



药物组合物本发明新化合物可口服给药、舌下给药、肌内给药、皮下给药、局部给药、鼻内给药、腹膜内给药、胸内给药、静脉内给药、硬膜外给药、鞘内给药、脑室内给药和通过注射到关节内来给药。
优选的给药途径是口服给药、静脉内给药或肌内给药。
剂量将取决于给药途径、疾病严重程度、患者年龄和体重，以及临床医师在决定最适于特定患者的个体治疗方案和剂量水平时通常所考虑的其它因素。
为了用本发明化合物制备药物组合物，惰性可药用载体可以是固体或液体。固体形式的制剂包括粉剂、片剂、可分散粒剂、胶囊、扁囊剂和栓剂。
固体载体可以是一种或多种还起稀释剂、矫味剂、助溶剂、润滑剂、悬浮剂、粘合剂或片剂崩解剂作用的物质；其也可以是包囊材料。
在粉剂中，载体是细分散的固体，其与细分散的活性组分形成混合物。在片剂中，活性组分与具有所需粘合性质的载体以适当比例混和，并压制成所需形状和大小。
为了制备栓剂组合物，首先将低熔点蜡例如脂肪酸甘油酯与可可脂的混合物熔化，然后通过例如搅拌将活性组分分散在该熔化物中。将熔化的均匀混合物倒入具有适宜大小的模子中，让其冷却和固化。合适的载体有碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、乳糖、糖、果胶、糊精、淀粉、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。
盐包括但不限于可药用盐。在本发明范围内的可药用盐的实例包括乙酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、氢溴化物、乙酸钙盐、樟脑磺酸盐、碳酸盐、氯化物、柠檬酸盐、二盐酸盐、乙二胺四乙酸盐、乙二磺酸盐、丙酸酯十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐(glucaptate)、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酰基对氨基苯胂酸盐、己雷琐酚盐、哈胺盐、氢溴酸盐、盐酸盐、羟萘甲酸盐、羟乙磺酸盐、乳酸盐、乳糖酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基硫酸盐、粘酸盐、萘磺酸盐、硝酸盐、扑酸盐(双羟萘酸盐)、泛酸盐、磷酸盐/二磷酸盐、聚半乳糖醛酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、碱式乙酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、鞣酸盐、酒石酸盐、茶氯酸盐、triethiodide和苄星盐。在本发明范围内的非可药用盐的实例包括氢碘酸盐、高氯酸盐和四氟硼酸盐。由于具有有利的物理和/或化学性质例如结晶性，可药用盐也可能是有用的。
优选的可药用盐是盐酸盐、硫酸盐和酒石酸氢盐。盐酸盐和硫酸盐是特别优选的。
术语组合物意欲包括这样的制剂，即活性组分与包囊材料的制剂，其中包囊材料作为载体提供胶囊，活性组分(具有或不具有其它载体)在胶囊中被载体包围，由此载体与活性组分有关联。类似地，也包括扁囊剂。
片剂、粉剂、扁囊剂和胶囊可用作适于口服给药的固体剂型。
液体形式的组合物包括溶液、悬浮液和乳剂。对于适于非胃肠道给药的液体制剂，可提及的实例有活性组分的无菌水或水-丙二醇溶液。液体组合物还可以在含水丙二醇溶液中配制成溶液。
口服给药的水溶液可通过将活性组分溶解在水中，并按照需要加入合适的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂来制得。水悬浮液可通过将细分的活性组分与粘性材料例如天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和药物制剂领域已知的其它悬浮剂一起分散在水中来制得。
药物组合物优选呈单位剂型的形式。在单位剂型中，组合物被分成含有适当量活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，含有不连续量的制剂的包装，例如包装的片剂、胶囊和在小瓶或安瓿中的粉剂。单位剂型还可以是胶囊、扁囊剂或片剂自身，或者其可以是适当数目的任何这些包装的形式。
生物评价体外模型细胞培养物A.在装有不含钙的DMEM、10％FBS、5％BCS、0.1％Pluronic F-68和600μg/ml新霉素的摇瓶内，让表达克隆的人μ、δ和κ受体和新霉素抗性的人293 S细胞在悬浮液中于37℃和5％CO2下生长。
B.称重小鼠和大鼠脑，在冰冷的PBS(含有2.5mM EDTA，pH7.4)中洗涤。在冰冷的裂解缓冲液(50mM Tris，pH7.0，2.5mM EDTA，在临用前加入苯甲磺酰氟(0.5M在DMSO∶乙醇中的贮备液)至终浓度为0.5mM)中，用polytron将脑匀化15秒(小鼠)或30秒(大鼠)。
膜制备将细胞离心，重新悬浮在裂解缓冲液(50mM Tris，pH7.0，2.5mMEDTA，在临用前加入PMSF(0.1M在乙醇中的贮备液)至终浓度为0.1mM)中，在冰上培养15分钟，然后用polytron匀化30秒。将悬浮液在4℃以1000g(最大)离心10分钟。把上清液在冰上保存，将离心沉淀重新悬浮，并如上所述离心。将两次离心所获得的上清液合并，并以46,000g(最大)离心30分钟。将离心沉淀重新悬浮在冷的Tris缓冲液(50mM Tris/Cl，pH7.0)中，并再次离心。将最后的离心沉淀重新悬浮在膜缓冲液(50mM Tris，0.32M蔗糖，pH7.0)中。将在聚丙烯管中的等份试样(1ml)在干冰/乙醇中冷冻，在-70℃贮藏直至使用。通过用SDS改进的Lowry分析测定蛋白浓度。
结合测定将膜在37℃融化，在冰上冷却，经过25规格的针头3次，稀释到结合缓冲液(50mM Tris，3mM MgCl2，1mg/ml BSA(Sigma A-7888)，pH7.4，经由0.22μm滤器过滤后在4℃贮藏，并且向其中新加入了5μg/ml抑肽酶，10μM苯丁抑制素，10μM diprotin A，没有DTT)中。将100μl等份试样加到含有100μl适当放射配体和100μl不同浓度测试化合物的冰冷的12×75mm聚丙烯管中。分别不在和在10μM纳洛酮存在下测定总的(TB)和非特异性(NS)结合。将所述管涡旋，在25℃培养60-75分钟，然后将内容物迅速真空过滤，并用约12ml/管冰冷的洗涤缓冲液(50mM Tris，pH7.0，3mM MgCl2)经由在0.1％聚乙烯亚胺中预浸泡至少2小时的GF/B滤器(Whatman)洗涤。将滤器在含有6-7ml闪烁液体的小瓶中浸泡至少12小时后，用β计数器测定保留在滤器上的放射性(dpm)。如果测定是在96-孔平板上进行，过滤是在96孔PEI浸泡的单滤器上进行的，将其用3×1ml洗涤缓冲液洗涤，并在烘箱中于55℃干燥2小时。加入50μl MS-20闪烁液体/孔后，将滤器平板在TopCount(Packard)中计数。
功能测定通过测定化合物受体复合物激活GTP与受体所偶联的G-蛋白结合的程度来测定化合物的激动活性。在GTP结合测定中，将GTP[γ]35S与测试化合物和膜混和，其中所述膜得自表达克隆的人阿片样物质受体的HEK-293S细胞或得自匀化的大鼠和小鼠脑。激动剂次级这些膜中的GTP[γ]35S结合。从剂量-反应曲线中确定EC50和Emax值。用δ拮抗剂纳曲吲哚将剂量-反应曲线右移，以证实激动活性是经由δ受体介导的。
关于大鼠脑GTP的操作将大鼠脑膜在37℃融化，经过25-规格的钝头针头3次，在GTPγS结合液(50mM Hepes，20mM NaOH，100mM NaCl，1mM EDTA，5mMMgCl2，pH7.4，新加入1mM DTT，0.1％BSA)中稀释。最后将120μlGDP加到膜稀释液中。从有10个点的剂量-反应曲线确定EC50和Emax值，所述剂量-反应曲线是在300μl中用适当量的膜蛋白(20μg/孔)和100000-130000dpm的GTPγ35S/孔(0.11-0.14μM)制作的。不在或在3μM SNC-80存在下确定基础和最大刺激的结合。
数据分析特异性结合(SB)计算为TB-NS，在不同测试化合物存在下的SB以对照SB的百分比表示。在特异性结合的放射配体置换中，关于配体的IC50值和Hill系数(nH)是用logit图或曲线拟合程序例如Ligand，GraphPad Prism，SigmaPlot或ReceptorFit计算的。Ki值是用Cheng-Prussoff公式计算的。在至少3条置换曲线中报告关于测试的配体的IC50、Ki和nH的平均值±S.E.M.值。本发明化合物的生物活性如表2所示。
表2生物数据
受体饱和实验放射配体Kδ值是通过用合适的放射配体在细胞膜上进行结合测定来进行的，其中放射配体的浓度是所估计的Kδ值的0.2至5倍(如果所需放射配体的量是可行的，最高达10倍)。特异性放射配体结合是用μmol/mg膜蛋白表示。各个实验的Kδ和Bmax值是通过依据以点模型，将特异性结合的(B)对nM游离(F)放射配体非线性拟合而获得的。
使用Von Frey试验测定机械异常性疼痛使用Chaplan等人(1994)描述的方法，在早晨8点至下午4点之间进行测试。将大鼠放置在有机玻璃笼子中的金属丝网状地板上，该金属丝网状底面可以让大鼠的爪子穿过，让它们熟悉环境10-15分钟。测试区域是左后爪的中部足底。让爪子与一系列δVon Frey细丝接触，这些细丝具有对数增加的刚度(0.41、0.69、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51和15.14克；Stoelting，III，USA)。用足以引起轻微的对着爪子弯曲的力将Von Frey细丝从网状地板垂直施加到足底表面上，并保持大约6至8秒。如果爪子迅速缩回，则记录为正反应。在除去细丝时立即退缩也视为正反应。步行移动视为模糊反应，在这种情况下，重复刺激。
试验方案对于FCA治疗组，在手术后第1天测试动物。使用Dixon的上下法(1980)测定50％缩回阈值。用在系列细丝中间的2.04g的细丝开始测试。无论是增加还是减少，刺激总是以连续途径给予。当爪子对于开始选择的细丝没有缩回反应时，则给予更强的刺激；在有爪子缩回反应时，下一次给予更弱的刺激。通过该方法的最佳阈值计算需要在紧挨着50％阈值的邻近区域中的6个反应，并且当发生第一次反应改变，例如阈值第一次交叉时，计数这6个反应。当阈值落在刺激范围的外面时，分别赋予15.14(正常敏感性)或0.41(最大异常性疼痛)的值。使用惯例将所得正反应和负反应模式制成表，X＝没有缩回反应；0＝缩回反应，并且使用下述公式以内插值替换法获得50％缩回阈值50％g阈值＝10(Xf+Kδ)/10,000其中Xf＝所用的最后一个Von Frey细丝的值(对数单位)；k＝关于正/负反应模式的表格值(参见Chaplan等人(1994))；且δ＝刺激之间的平均差值(对数单位)。在这里，δ＝0.224。
依据Chaplan等人(1994)，将Von Frey阈值转化成最大可能效果的百分比(％MPE)。使用下述公式计算％MPE 给药测试化合物在von Frey测试之前，给大鼠注射(皮下、腹膜内、静脉内注射或口服)测试物，测试化合物给药与von Frey测试之间的时间长短根据测试化合物的性质来改变。
扭曲试验当腹膜内施用到小鼠中时，乙酸会引起腹部收缩。之后小鼠会以典型模式伸展它们的身体。当施用镇痛药物时，就很少能观测到所述动作，并且选择该药物作为可能的良好候选对象。
只有当出现下列要素时，才考虑是完全和典型的扭曲反射动物不处于运动中；后背下部轻微凹陷；可观察到两个爪子的足底面。在该测定中，以1至100μmol/kg给药后，本发明化合物表现出对扭曲反应的显著抑制。
(i)溶液制备乙酸(AcOH)将120μL乙酸加到19.88ml蒸馏水中以获得终体积为20ml，终浓度为0.6％的AcOH溶液。然后将该溶液混和(涡旋)，并准备注射。
化合物(药物)制备各种化合物，并依据标准操作溶解在最合适的载体中。
(ii)溶液给药在测试之前20、30或40分钟(依据化合物类别及其特征)，将化合物(药物)以10ml/kg(指小鼠平均体重)的剂量口服给药、腹膜内给药(i.p.)、皮下给药(s.c.)或静脉内给药(i.v.)。当化合物中央给药时心室内(i.c.v.)或鞘内(i.t.)给药，给予1L的体积。
AcOH在临测试之前以10ml/kg(指小鼠平均体重)的剂量在两个位点腹膜内给药(i.p.)。
(iii)测试观察动物(小鼠)20分钟，记录反应(扭曲反射)次数，在试验结束时汇总。将小鼠保持在具有接触褥草的独立的“鞋盒”离子中。一般同时观察4只小鼠1只对照小鼠，3只给药治疗的小鼠。
对于焦虑和焦虑样适应症，已经在用大鼠进行的gellerseifter冲突试验中确认了其效力。
对于功能性胃肠障碍适应症，可采用Coutinho SV等人在AmericanJournal of Physiology-Gastrointestinal & Liver Physiology.282(2)G307-16，2002 Feb中描述的测定，使用大鼠来确认其效力。
权利要求
1.式I化合物及其盐 其中R1选自下列基团之一(i)苯基； (ii)吡啶基； (iii)噻吩基； (iv)呋喃基 (v)咪唑基 (vi)三唑基 (vii)吡咯基 (viii)噻唑基 (ix)吡啶基-N-氧化物 其中每个R1苯基环和R1杂芳环任可以独立地被1、2或3个独立选自直链或支链C1-C6烷基、NO2、CF3、C1-C6烷氧基、氯、氟、溴和碘的取代基进一步取代。
2.权利要求1的化合物，其中每个R1苯基环和R1杂芳环可以进一步独立地被选自甲基、CF3、氯、氟、溴和碘的取代基取代。
3.权利要求1的化合物，其中每个R1苯基环和R1杂芳环可以进一步独立地被甲基取代。
4.权利要求1的化合物，其中R1是苯基、吡咯基、吡啶基、噻吩基或呋喃基。
5.权利要求1的化合物，选自下列任何一个4-[1-(3-氨基-苯基)-1-(1-苄基-哌啶-4-基亚基)-甲基]-N，N-二异丙基苯甲酰胺，4-[1-(3-氨基-苯基)-1-(1-吡啶-2-基甲基-哌啶-4-基亚基)-甲基]-N，N-二异丙基苯甲酰胺，4-[1-(3-氨基-苯基)-1-(1-吡啶-4-基甲基-哌啶-4-基亚基)-甲基]-N，N-二异丙基-苯甲酰胺，4-[1-(3-氨基-苯基)-1-(1-呋喃-2-基甲基-哌啶-4-基亚基)-甲基]-N，N-二异丙基-苯甲酰胺，4-[1-(3-氨基-苯基)-1-(1-呋喃-3-基甲基-哌啶-4-基亚基)-甲基]-N，N-二异丙基-苯甲酰胺，4-(1-(3-氨基-苯基)-1-(1-噻吩-2-基甲基-哌啶-4-基亚基)-甲基]-N，N-二异丙基-苯甲酰胺，4-[1-(3-氨基-苯基)-1-(1-噻吩-3-基甲基-哌啶-4-基亚基)-甲基]-N，N-二异丙基-苯甲酰胺，4-[1-(3-氨基-苯基)-1-(1-噻唑-2-基甲基-哌啶-4-基亚基)-甲基]-N，N-二异丙基-苯甲酰胺，4-{1-(3-氨基-苯基)-1-[1-(1H-咪唑-2-基甲基)-哌啶-4-基亚基]-甲基}-N，N-二异丙基-苯甲酰胺，4-{1-(3-氨基-苯基)-1-[1-(1H-咪唑-4-基甲基)-哌啶-4-基亚基]-甲基}-N，N-二异丙基-苯甲酰胺，4-{1-(3-氨基-苯基)-1-[1-(4-甲氧基-苄基)-哌啶-4-基亚基]-甲基}-N，N-二异丙基-苯甲酰胺，4-{1-(3-氨基-苯基)-1-[1-(4-溴-苄基)-哌啶-4-基亚基]-甲基}-N，N-二异丙基-苯甲酰胺，和4-[1-(3-氨基-苯基)-1-(1-吡咯-2-基甲基-哌啶-4-基亚基)-甲基]-N，N-二异丙基-苯甲酰胺。
6.前述任-权利要求的化合物，其是盐酸盐、二盐酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、二三氟乙酸盐或柠檬酸盐。
7.式I化合物的制备方法，包括使用钯催化剂例如Pd(PPh3)4、在碱例如碳酸钠存在下，将通式II化合物与3-氨基苯基硼酸反应 其中PG是氨基甲酸酯保护基如Boc和CBZ或苄基或取代的苄基保护基例如2，4-二甲氧基苄基，得到通式III化合物 然后在标准条件下将其脱保护，并在还原条件下使用通式R1-CHO化合物将其烷基化，得到通式I化合物。
8.用于治疗的权利要求1的化合物。
9.权利要求1的式I化合物在制备治疗疼痛、焦虑或功能性胃肠疾病药物中的用途。
10.含有权利要求1的式I化合物作为活性成分以及可药用载体的药物组合物。
11.治疗疼痛的方法，该方法是将有效量的权利要求1的式I化合物对需要控制疼痛的患者给药。
12.治疗功能性胃肠疾病的方法，该方法是将有效量的权利要求1的式I化合物对患有所述功能性胃肠疾病的患者给药。
13.治疗焦虑的方法，该方法是将有效量的权利要求1的式I化合物对患有焦虑的患者给药。
14.通式II的化合物 其中PG是氨基甲酸酯保护基例如Boc或CBZ，或者苄基或取代的苄基保护基如2，4-二甲氧基苄基。
15.通式III的化合物 其中PG是氨基甲酸酯保护基例如Boc或CBZ，或者苄基或取代的苄基保护基如2，4-二甲氧基苄基。
全文摘要
本申请公开和要求保护通式I化合物及其盐以及含有该新化合物的药物组合物及其治疗、特别是控制疼痛、焦虑和功能性胃肠疾病应用，其中R
文档编号A61K31/4523GK1509271SQ02810186
公开日2004年6月30日 申请日期2002年5月16日 优先权日2001年5月18日
发明者W·布朗, C·瓦尔波尔, Z·魏, ǘ, W 布朗 申请人:阿斯特拉曾尼卡有限公司