专利名称：脂肪组织来源的基质细胞的内分泌胰腺分化及其应用的制作方法
技术领域：
本发明提供了分离的脂肪组织来源的基质细胞，其被诱导表达至少一种胰腺细胞的特征。也提供了用于治疗胰腺内分泌疾病的方法。
背景技术：
胰岛的内分泌细胞团包括四种细胞类型，它们是根据主要调控的分泌产物分类的。这些细胞包括产生胰高血糖素的α细胞、产生胰岛素的β细胞、产生胰多肽的γ细胞以及产生生长抑素的δ细胞(Henquin，2000，Diabetes 49，1751-1760；Slack，1995，Development 121，1569-1580)。在发育期间，这些不同的细胞群被认为起源于与胰管上皮相关的共同的干细胞前体(Rao等，1989，Am.J.Pathol.134，1069-1086；Rosenberg和Vinik，1992，Adv.Exp.Med.Biol.32195-104；Swenne，1992，Diabetologia 35，193-201；Hellerstrom，1984，Diabetologia 26，393-400；Gu和Sarvetnick，1993，Development 118，33-46)。该前体细胞通过一系列逐步的分化途径，获得各种细胞群的特征。早期观察显示α细胞是胰岛第一个可检测的群体，然后依次为β细胞、δ细胞和γ细胞(Slack，1995，Development 121，1569-1580)。胰岛沿着导管上皮作为由α细胞或γ细胞围绕的β细胞以及交错突的δ细胞的团块而形成。然后未成熟的胰岛迁往周围的腺泡组织并发生血管化(Slack，1995，Development 121，1569-1580)。
胰岛细胞的主要功能是生理性营养稳态。例如，正常行使功能的β细胞合成并分泌胰岛素以维持血糖水平。这通过与胰岛素控释分泌途径相连的内源葡萄糖传感器完成。在这种刺激-分泌偶联的范例中，升高的血浆葡萄糖(如餐后)改变β细胞代谢，通过关闭ATP-敏感的K+通道导致膜电位的改变。这种去极化事件打开电压-敏感的Ca2+通道，而Ca2+的流入引发胰岛素的受控释放(Henquin，2000，Diabetes 49，1751-1760)。然后血浆胰岛素发挥作用刺激葡萄糖摄入骨骼肌和脂肪组织，并抑制肝葡萄糖产生，总结果是降低血浆葡萄糖(Cheatham和Kahn，1995，Endocr.Rev.16，117-142)。
I.胰岛素1型(胰岛素依赖型)糖尿病是与内分泌胰腺功能丧失相关的严重疾病。在多数情况下，这通过自身免疫攻击胰岛发生。目前1型糖尿病的疗法需要每日单次至多次的胰岛素注射。在绝大多数情况下，这种方案不足以维持对血糖水平的充分控制，导致众多的糖尿病晚期并发症，这极大地增加了患病个体的发病率和死亡率。每日胰岛素注射的替代疗法是通过胰腺或胰岛移植治愈糖尿病(Serup等，2001，BMJ 322，29-32；Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415)。研究显示虽然移植完整胰腺组织为有效的治疗，该操作遭遇到3个主要障碍1)供体材料不足；2)需要较大的手术操作以及3)需要具有短期获益的长期的免疫抑制疗法。同样，胰岛移植只在某种程度上有效。该操作包括从供体胰腺分离胰岛并注射到门静脉中。而且，该操作涉及多次注射，需要数次住院治疗(Serup等，2001，BMJ 322，29-32；Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415)。另外，这些患者还必须经历强化的免疫抑制疗法。此外，如在胰腺组织移植中那样，分离胰岛的操作也受到极为有限的供体群的影响。利用异种移植的猪胰岛的研究正在进行中，不过，利用该途径的免疫排斥依然是一个显著的障碍(Serup等，2001，BMJ 322，29-32；Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415)。
综上所述，上文的数据表明了对可供选择的细胞治疗途径的需求。沿着这些主线，已经利用鼠源和人源的胰管干细胞及胚胎干细胞通过控制诱导其沿内分泌胰腺途径的分化来产生胰岛样细胞系(Assady等，2001，Diabetes 50，1691-1697；Serup等，2001，BMJ 322，29-32；Lumelsky等，2001，Science 292，1389-1394；Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415)。被诱导分化为产生胰岛激素的细胞的鼠源干细胞已经被成功地用来重建糖尿病小鼠模型(Serup等，2001，BMJ322，29-32；Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415)。再次地，这些途径的障碍包括免疫排斥以及极为有限的用于人类的前体细胞系来源。
人胚胎干细胞(HES)已被成功地分化为产胰岛素的细胞(Assady等，2001，Diabetes 50，1691-1697)。多能未分化HES细胞的应用潜在地代表了用于疾病如糖尿病的分化胰腺β细胞的来源。不过，这些方法有许多缺点。首先是HES细胞本身的来源问题。尽管围绕HES细胞领域研发的迫切需求近来已公诸于众，但仍存在政治和伦理争议。因此，合适HES细胞的可获得性得不到保证。利用HES细胞产生分化的胰岛细胞的第二缺陷是证明培养的未分化细胞的葡萄糖反应性的不可预知性。确实，Assady及其同事(Diabetes 50，1691-1697)提示由HES细胞分化的细胞不显示葡萄糖应答。不应答可以归结于培养物中生长的细胞群的异质性的差异、使胰岛素应答标准化为参数诸如蛋白或DNA含量的困难或长期暴露于培养物中高葡萄糖水平。因此为了利用分化的β细胞，有必要证明该分化的细胞具有胰岛素的刺激-分泌偶联。HES细胞疗法还具有发生畸胎瘤的潜在高风险。
胰腺本身是胰岛先祖细胞的来源。佛罗里达大学研究基金会的WO01/23528公开了体外生长的胰岛先祖细胞移植到哺乳动物中用于体内糖尿病治疗的用途。
胰管来源的干细胞或分离的胚胎干细胞沿内分泌胰腺细胞系的分化特征在于表达特异性的标记酶和转录因子。令人感兴趣的是，在胚胎发育期间，胰岛和神经细胞享有许多共同的标记，包括神经特异性烯醇化酶、突触泡蛋白、儿茶酚合成酶、酪氨酸羟化酶、巢蛋白以及转录因子HNF3β、Isl-1、Brain-4 Pax-6、Pax-4、Beta2/NeuroD、胰腺和十二指肠同源框基因1(PDX-1)、Nkx6.2、Nkx2.2以及neurogenin-3(Ngn-3)(Ramiya等，2000，Nat.Med.6，278-282；Schwitzgebel等，2000，Development 127，3533-3542；Fernandes等，1997，Endocrinology 138，1750-1762；Zulewski等，2001，Diabetes 50，521-533；Gradwohl等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97，1607-1611)。更成熟胰岛细胞的功能标记是胰高血糖素、生长抑素、胰岛素、葡萄糖转运蛋白2(Glut2)以及胰多肽的表达。
II.胰高血糖素胰高血糖素是胰岛α细胞中释放的29个氨基酸的肽激素。产生胰高血糖素的α细胞代表了在发育的内分泌胰腺中最早可检测的胰岛细胞群之一。胰高血糖素原的组织特异性释放受激素原转化酶(PC)细胞特异性表达的调控。PC2在加工胰岛胰高血糖素原中的重要作用由PC2基因敲除小鼠的研究揭示。该小鼠具有轻微的低血糖症、升高的胰岛素原，并在胰高血糖素原向成熟胰腺胰高血糖素的加工中表现出较大的缺陷，并且鼠胰岛α细胞从非典型的分泌颗粒分泌胰高血糖素原(J Biol Chem.1998年2月6日，273(6)3431-7；J Biol Chem.2001年7月20日，276(29)27197-202)。
胰高血糖素的关键生物学作用集中于通过增强肝中葡萄糖的合成和动员而调节葡萄糖稳态。胰高血糖素受体也表达在人胰岛β细胞上，并有助于调节葡萄糖刺激的胰岛素分泌(Diabetologia，2000年8月；43(8)1012-9)。
胰高血糖素通常作为反向调节激素起作用，对抗胰岛素的作用，并维持血糖水平，尤其是在低血糖症患者中。在糖尿病患者中，过量的胰高血糖素分泌在与糖尿病相关的代谢紊乱如高血糖症中起着主要作用。具有反复的低血糖症的糖尿病患者的主要问题在于形成了缺陷的反向调控应答，其包括降低或缺失的对低血糖的胰高血糖素应答。因此理解如何以及为什么自主神经系统和胰岛α细胞发生胰高血糖素分泌缺陷导致低血糖不敏感，是糖尿病研究中的重大挑战。
给予胰高血糖素在药理学上导致血糖的迅速升高，因此可注射胰高血糖素被用作为处于重大低血糖症风险中的糖尿病患者的药理学治疗。糖尿病长期以来被视为一种双激素紊乱，其中胰高血糖素过量显著地促成了高血糖症的形成。Shah及其同事(Am.J.Physiol 1999 277E283-E290)调查了在膳食糖负荷之后人类受试者中周围胰岛素浓度对形成胰高血糖素介导的高血糖症的重要性。作者发现在存在相对胰岛素不足时，胰高血糖素过量明显促成受损的葡萄糖产生抑制和高血糖症。因此胰高血糖素分泌或胰高血糖素作用的抑制剂可能用于治疗具有胰岛素不足和/或胰高血糖素过量的糖尿病。2型糖尿病患者的研究表明缺乏胰高血糖素抑制部分地通过加速的糖原分解促成餐后的高血糖。在口服葡萄糖耐量试验(OGTT)期间在存在或不存在生长抑素诱导的胰高血糖素抑制时的血糖分析显示在具有较高胰高血糖素水平的受试者中葡萄糖的显著增加(参见J Clin Endocrinol Metab.2000年11月；85(11)4053-9)。
已有许多研究证明胰高血糖素在细胞制备物及在体内都促进脂肪降解(称为脂解作用)。因而，胰高血糖素可能促进人类脂肪组织的脂解作用。不过，过去的研究是矛盾的，其中有些报道证实胰高血糖素在人类脂肪细胞脂解作用中的作用。人类胰高血糖素和血管活性肠肽(VIP)在体外刺激游离脂肪酸从人类脂肪组织中释放，而其它实验在分离的人类脂肪细胞中未能证明胰高血糖素对脂解作用的明显效果(Int.J.Obes.1985；9(1)25-7)。胰高血糖素撤退或者体内生理性高胰高血糖素血症在正常或糖尿病人类受试者中不引起软脂酸流量(脂解指数)的显著变化(J Clin Endocrinol Metab.1991年2月；72(2)308-15)。最近报道了相似的阴性发现，其中7个健康男性受试者在腹壁上植入留置微透析导管，并检测胰高血糖素灌输对间质甘油、血浆甘油以及FFA的作用。在有或无外源葡萄糖的全身胰高血糖素灌输中未检测到对甘油或游离脂肪酸的作用(J Clin Endocrinol Metab.2001年5月1日；86(5)2085-2089)。对在腹部脂肪组织中植入了留置微透析导管的正常男性受试者的脂解研究中得到了相似的阴性结果(J Clin EndocrinolMetab.2001年5月；86(5)2085-9)。因此，现有的数据不支持胰高血糖素对脂解的重要生理学作用。
当在药理学上给予人类受试者时，胰高血糖素对胃肠道(食道、胃以及小肠和大肠)具有抗运动性效果(Dig Dis Sci.1979年7月；24(7)501-8；Gut.1975年12月；16(12)973-8；N Engl J Med.1999年11月11日；341(20)1496-503)。胰高血糖素也可以松弛胆囊和输尿管中的平滑肌，导致在胆囊和肾脏的放射学研究中的偶尔应用。
III.生长抑素生长抑素是胰腺δ细胞产生的内源肽，它在体内行使多种重要功能。生长抑素是高度柔性的环肽，具有非常短的生物学半衰期。生长抑素最初发现作为下丘脑-垂体系统的经典内分泌激素起作用，从那以后被证明另外作为对广泛种类的细胞类型的旁分泌和自分泌信号传导因子起作用。目前公认的受生长抑素影响的众多生理学过程包括激素和肽因子分泌、神经传递、细胞增殖、平滑肌收缩、营养吸收和炎症。受生长抑素调节的激素和肽包括生长激素(GH)、促甲状腺激素(TSH)、催乳素(PRL)、胰岛素和P物质(SP)。
生长抑素影响许多重要的生物系统的功能，例如内分泌系统、胃肠道系统、血管系统、以及免疫系统连同中枢神经系统和周围神经系统。在内分泌系统中，生长抑素在生长激素、胰岛素和胰高血糖素分泌的调控中起着重要作用(Koerker等，Science 1974，184，482-484)。生长抑素对胃肠道及血管生物系统的作用导致生长抑素疗法在这些邻域的临床应用。在中枢神经系统(CNS)中，生长抑素似乎是认知功能的一种重要调节剂(Schettini，Pharmacological Research 1991，23，203-215)，并且在大脑的特定区域，似乎起着神经递质的作用，或者作为神经调质调控神经递质例如乙酰胆碱(Gray等，J.ofNeuroscience 1990，10，2687-2698)和多巴胺(Thal等，Brain Research1986，372，205-209)的释放。在周围神经系统(PNS)中，生长抑素与P物质一起存在于含儿茶酚胺的纤维和感觉末梢中(Green等，Neuroscience 1992，50，745-749)，并起着抑制它们释放和介导效果的作用。
象生长抑素本身一样，生长抑素受体被定位到广泛种类的组织和细胞类型中，包括属于内分泌、胃肠道、血管、免疫、CNS和PNS系统的那些组织和细胞。也已在许多人类肿瘤中证明了生长抑素受体的高发生率。神经内分泌肿瘤是一类展现出高密度功能活性生长抑素受体的肿瘤。功能活性神经内分泌肿瘤由于肿瘤细胞激素释放过量而表现出诸如促胃泌素瘤及胰高血糖素瘤综合征的临床症状。此类症状可以通过生长抑素受体活化治疗。
IV.胰多肽已知胰腺γ细胞分泌胰多肽(PP)，它是神经肽Y蛋白家族的成员。对于该肽的确切生理学机制知之甚少。PP已知通过抑制迷走神经刺激抑制胰腺消化酶的分泌而直接在胰腺中发挥作用。PP的这种效果被认为是通过直接作用于迷走神经以及中枢神经系统介导的对背侧迷走神经复合体及弓状核的作用而发生的(Deng等，Brain Res 2001；90218-29)。通过它的迷走神经作用，还认为PP可抑制胰岛素释放。PP还似乎抑制在非胰岛素依赖型糖尿病中所观察到的胰岛细胞肥大。循环水平的PP也对肝脏发挥作用，并导致肝糖产生的下降。因而，给予PP可能在治疗非胰岛素依赖型糖尿病中具有作用。
V.干细胞的非胚胎来源成体细胞已表现出分化能力。例如，最近的研究证明骨髓来源的基质细胞在体外经历神经元分化的特定能力(Woodbury等(2000)JNeuroscience Research 61364；Sanchez-Ramos等(2000)ExpNeurology 164247)。在这些研究中，用抗氧化剂、表皮生长因子(EGF)或脑衍生的神经营养因子(BDNF)处理骨髓基质细胞诱导该细胞经历与神经元分化相一致的形态变化，即，长细胞突延伸终止于生长锥和丝状伪足(Woodbury等，(2000)J Neuroscience Research 61364；Sanchez-Ramos等(2000)Exp Neurology 164247)。另外，这些制剂诱导神经元特异性蛋白的表达，包括巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝M(NF-M)、NeuN以及神经生长因子受体trkA(Woodbury等(2000)J Neuroscience Research 61364；Sanchez-Ramos等(2000)Exp Neurology 164247。
具有分化能力的成人细胞的其它实例描述在下列专利中Osiris的美国专利No.5,486,359涉及能够分化为不止一种结缔组织类型的细胞的分离的人类间充质干细胞均质群体。该专利公开了分离、纯化以及在培养物中，即在体外极大地复制这些细胞的方法。
Case Western和Osiris的美国专利No.5,942,225描述了用于诱导分离的人类间充质干细胞细胞系定向分化为单一特定的间充质细胞系的组合物，它包括人类间充质干细胞以及一种或多种生物活性因子，用以诱导间充质干细胞分化为单一特定的细胞系。
Case Western的美国专利No.5,736,396描述了诱导分离的人类间充质干细胞离体细胞系定向分化的方法，它包括使间充质干细胞与生物活性因子接触，以便藉此诱导其离体分化成单一特定的间充质细胞系。该专利还描述了治疗需要特定间充质细胞系的间充质细胞的个体的方法，它包括向需要其的个体给药一种组合物，所述组合物包括已经被诱导离体分化的分离的人类间充质干细胞，其中干细胞通过与生物活性因子接触以便藉此诱导这种细胞离体分化成单一特定的间充质细胞系。
Case Western的美国专利No.5,908,784公开了用于人类间充质前体细胞体外软骨发生以及由其体外形成人类软骨细胞的组合物，该组合物包括被紧密浓缩为压缩的细胞小球的分离的人类间充质干细胞，以及与之接触的至少一种软骨诱导剂。该专利也描述了通过使间充质干细胞与软骨诱导剂体外接触诱导间充质干细胞软骨发生的方法，其中干细胞被紧密浓缩为压缩的细胞小球。
Advanced Tissue Sciences，Inc.的美国专利No.5,902,741描述了体外制备的活软骨组织，它包括产生软骨的基质细胞和该基质细胞天然分泌的结缔组织蛋白，其连接于且实质上包被由生物相容性无生命材料构成的三维构架，其形成具有通过基质细胞桥接的间质间隙的三维结构。该专利也公开了用于生长新软骨的组合物，包括间充质干细胞，其处于适合该细胞增殖并分化为软骨的聚合物载体中。
Advanced Tissue Sciences，Inc.的美国专利No.5,863,531公开了体外制备的管状的活基质组织，包含基质细胞和该基质细胞天然分泌的结缔组织蛋白，其连接于且实质上包被由生物相容性无生命材料构成的三维管状构架，所述构架具有通过基质细胞桥接的间质间隙。
Advanced Tissue Sciences，Inc.的美国专利No.6,022,743描述了基于基质细胞的三维培养系统，来自于位于活的基质组织构架上的胰腺实质细胞培养物。该基质细胞可以包括脐带细胞、胎盘细胞、间充质干细胞或胎儿细胞。该培养系统因而用于提供功能性胰腺组织和器官材料。
Osiris的美国专利No.5,811,094描述了产生结缔组织的方法，它包括通过向需要其的个体给予含有从人类骨髓中回收且基本上没有血细胞的人类间充质干细胞的细胞制备物，而在所述个体中产生结缔组织。
Thiede等的美国专利No.6,030,836描述了体外维持人类造血干细胞的方法，包括将人类间充质干细胞与该造血干细胞共培养，从而至少有些造血干细胞维持它们的干细胞表型。
Torok-Storb等的美国专利No.6,103,522描述了与人造血前体细胞组合体外培养的辐照的永生化人类基质细胞细胞系。
Torok-Storb等的WO 9602662A1和美国专利No.5,879,940描述了维持造血作用的人类骨髓基质细胞细胞系。
Morphogen的美国专利No.5,827,735描述了纯化的多能间充质干细胞，它基本上没有多核肌原细胞系定向细胞，并且它主要是星形的，其中间充质干细胞在含有10％胎牛血清的组织培养基中与肌肉形态发生蛋白接触时主要地形成成纤维细胞，并且在含有10％胎牛血清的组织培养基中与肌肉形态发生蛋白和疤痕抑制因子接触时主要地形成自发收缩的分枝的多核结构。
Hahnemann University的WO 99/43286描述了间充质干细胞用于治疗中枢神经系统的用途以及指导骨髓基质细胞分化的方法。
OSiris的WO 98/20731描述了间充质巨核细胞前体组合物以及通过分离巨核细胞而分离与分离的巨核细胞相关的MSC的方法。
Osiris的WO99/61587描述了人类CD45和/或成纤维细胞以及间充质干细胞。
Ixion Technology的WO01/079457描述了在体外培养并分化为胰腺样细胞的骨髓及血液来源的干细胞的用途。德克萨斯大学(University of Texas)的WO01/78752描述了植入胰腺的神经干细胞用于治疗胰腺疾病的用途。
不过，前述段落中所描述的技术有赖于难以获得而且使供体痛苦的前体细胞来源如骨髓。所以，本发明的目的是提供辅助治疗胰腺内分泌疾病的细胞、材料和方法。
发明概述本发明提供了分离的脂肪组织来源的基质细胞，它分离自人或其它哺乳动物，并被诱导表达至少一种胰腺细胞(且优选为内分泌胰腺细胞)的基因型或表型特征。该细胞可表现出产生胰高血糖素的α细胞、产生胰岛素的β细胞、产生胰多肽的γ细胞或产生生长抑素的δ细胞的特性。在优选的实施方案中，制备的是产生胰岛素的β细胞。本发明的细胞能够在体外或者植入患者后被诱导分化。
本发明的细胞可以掺入到二维或三维结构中，以产生可植入或植入的基质，如在下文更详细地描述的那样。例如，本发明提供了将分化的脂肪来源的成体干细胞或分化的细胞用适于移植到哺乳动物，优选人的生物材料包封。包封材料不会妨碍由脂肪来源的成体干细胞或分化细胞分泌的蛋白或激素的释放。所用的材料，包括但不限于，胶原衍生物、水凝胶、藻酸钙、琼脂糖、透明质酸、聚乳酸/聚羟基乙酸衍生物和纤维蛋白。
本发明的细胞也可以被基因改造以包括外源遗传材料。在一个实施方案中，使用能够将目的基因序列整合到宿主细胞染色体中的载体。在优选的实施方案中，引入的核酸分子被掺入到能够在受体宿主细胞中自主复制的质粒或病毒载体中。广泛种类的载体中的任何一种均可用作此目的。优选的真核载体包括，例如，痘苗病毒、SV40、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒以及本领域技术人员所熟知的多种商业上可获得的以质粒为基础的哺乳动物表达载体。一旦制备了用于表达的载体或核酸分子，该DNA构建物可以通过各种合适的方法中的任何一种，即转化、转染、病毒感染、接合、原生质体融合、电穿孔、基因枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射等被引入到合适的宿主细胞。在引入载体之后，受体细胞在选择培养基中培养，它可选择含有载体的细胞的生长。克隆基因分子的表达导致异源蛋白的产生。
本发明还提供了分化分离的脂肪组织来源的基质细胞以表达胰腺细胞如产生胰高血糖素的α细胞、产生胰岛素的β细胞、产生胰多肽的γ细胞或产生生长抑素的δ细胞的至少一种基因型或表型特征，包括使分离的脂肪组织来源的基质细胞与胰腺诱导物，优选内分泌胰腺诱导物接触的步骤。该物质处于化学成分确定的细胞培养基中，如在下文更详细地描述的那样，它可以包括足以诱导分离的脂肪组织来源的基质细胞表达至少一种内分泌胰腺细胞标志的浓度的生长因子、细胞因子、化学制剂和/或激素。
本发明还提供了治疗宿主中由产生胰高血糖素的α细胞、产生胰岛素的β细胞、产生胰多肽的γ细胞或产生生长抑素的δ细胞的胰腺功能介导的疾病的方法，其包括诱导分离的脂肪组织来源的基质细胞表达对宿主在治疗上有益的胰腺细胞的至少一种基因型或表型特征；然后将诱导的细胞移植到宿主中。本发明的优点在于脂肪组织来源的基质细胞可以直接分离自宿主，分化并自体再移植。备选地，治疗可以通过同种异体完成。
可用本发明治疗的胰腺内分泌紊乱或变性疾病的非限制性实例包括I型糖尿病、II型糖尿病、脂肪营养不良相关疾病、化学诱导疾病、胰腺炎相关疾病或外伤相关疾病。
本发明的细胞可以作为均质的或基本上均质的细胞群利用，或者作为细胞群的一部分利用，其中其它细胞分泌物质支持该内分泌胰腺样细胞的生长或分化，或者与分泌或表现出其它目的治疗因子的其它细胞一起。
本发明还包括通过处理的脂肪来源的基质细胞产生激素的方法。也包括通过将细胞培养基暴露于本发明的细胞而调节培养基的方法。然后培养基可用来培养其它脂肪来源的细胞。
本发明还构思产生已被诱导表达至少一种胰腺细胞的基因型或表型特征的脂肪来源的基质细胞的试剂盒，它可以包括从脂肪组织残余中分离基质细胞或干细胞的说明书，并确实包括分化干细胞的培养基，其中培养基导致细胞表达至少一种胰腺细胞的基因型或表型特征或者一般来说是胰腺原性的。还公开了包括产生本发明的组织的所有必需组分的试剂盒。这种试剂盒包括本发明的细胞或细胞群、生物相容性网格(lattice)、以及由水化剂、细胞培养物质、细胞培养基、其它细胞、抗生素化合物和激素组成的组分。
本发明的其它目的和特点由于下述公开将会更加充分明显。
发明详述本发明提供了来自人或其它哺乳动物的分离的脂肪组织来源的基质细胞，其被诱导表达胰腺细胞(优选内分泌胰腺细胞)的至少一种基因型或表型特征。该细胞可以表现出产生胰高血糖素的α细胞、产生胰岛素的β细胞、产生胰多肽的γ细胞或产生生长抑素的δ细胞的特点。在优选的实施方案中，制备的是产生胰岛素的β细胞。本发明的细胞可在体外或植入患者后被诱导分化。
由本发明的方法产生的细胞可以提供部分或完全分化的具有成熟胰腺细胞特征的功能细胞的来源，用于研究、移植和研发细胞治疗产品以治疗动物疾病优选人类疾病、组织修复或改善以及矫正改变生命或威胁生命的代谢紊乱。还包括制备此类细胞的方法。
I.定义“发育表型”是细胞通过分化过程获得特定表型的潜能。
“基因型”是指与分化途径相关的基因的至少一个信使RNA转录物的表达。
“胰腺β胰岛细胞”是指能够优选以受控方式，更优选以葡萄糖浓度依赖性的方式分泌胰岛素、胰岛素类似物、胰岛素前体或胰岛素样因子的任何细胞。
“胰腺α细胞”是指能够优选以受控方式分泌胰高血糖素、胰高血糖素类似物、胰高血糖素前体或胰高血糖素样因子的任何细胞。
“胰腺δ细胞”是指能够优选以受控方式分泌生长抑素、生长抑素前体或生长抑素样因子的任何细胞。
“胰腺PP细胞”或“γ细胞”是指能够优选以受控方式分泌胰多肽、类似物、前体或相似因子的任何细胞。
“胰岛素”是指已知的各种胰岛素、胰岛素类似物或胰岛素样因子中的任一种。这包括激素原或胰岛素前体蛋白、完全加工的蛋白或者任何这些分子实体的代谢物。
“糖尿病”是指其中胰腺β胰岛细胞功能出现机能障碍从而丧失对循环的葡萄糖水平的应答的任何疾病状态。所述疾病状态可以是先天代谢缺陷、外伤损害、化学损伤、感染性疾病、慢性乙醇摄入、内分泌病、遗传病如唐氏综合征、或者是直接或间接地导致内分泌胰腺损害的任何其它病因的结果。
“青年成熟期突发型糖尿病”包括不能清楚地归类为1型或2型糖尿病表型的小百分比的糖尿病患者。其特征在于早期发病(通常在25岁以前)的β细胞功能的遗传缺陷。
“自身免疫病”涵盖导致宿主内分泌胰腺排斥和破坏的任何免疫介导的过程(体液或细胞免疫)。该过程的病因为，但不限于，针对诸如柯萨奇病毒或肺炎支原体的因子的感染的免疫应答、自身免疫机能障碍的先天代谢倾向或者化学暴露。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)根据大小实现多肽分级分离最常用的技术(虽然不是唯一的)就是聚丙烯酰胺凝胶电泳。该方法的原理在于多肽分子穿过凝胶迁移，就好像凝胶是一个筛子，它最大程度地阻滞最大分子的运动，而最小程度地阻滞最小分子的运动。多肽片段越小，在聚丙烯酰胺凝胶中的电泳条件下的运动性越大。电泳之前和期间，多肽典型地持续暴露于去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)，在此条件下多肽被变性。天然凝胶是在不存在SDS时跑胶的。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分级分离的多肽可以直接通过染色操作观看。
蛋白质转移操作蛋白质转移操作(也称之为免疫印迹)的目的是将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分级分离的多肽物理转移到硝酸纤维素滤器或另一种合适的表面上，同时保留分级分离操作产生的多肽的相对位置。然后用特异性与感兴趣的多肽结合的抗体探测该印迹。
“纯化的”蛋白或激素是已经从细胞组分中分离的蛋白或激素。“纯化的”蛋白或激素已经被纯化到天然未见过的纯度水平。“基本上纯的”蛋白或激素是仅含有实质上不影响该激素或蛋白的性质的其它组分的制备物。
“内分泌胰腺基因”是指包括但不限于任何与分化中或分化的内分泌胰腺的α、β、δ或PP细胞的表型相关的那些基因。这些基因包括但不限于pdxl、pax4、pax6、neurogenin 1、neurogenin 2、neurogenin3、neuro D、GLUT2、胰岛素、Isl1、Hlxb9、Nkx2.2。
II.脂肪来源的干细胞或基质细胞脂肪干细胞或“脂肪基质细胞”是指起源于脂肪组织的细胞。“脂肪”是指任何脂肪组织。脂肪组织可以是来自皮下、网膜/内脏、乳腺、性腺或其它脂肪组织部位的褐色或白色脂肪组织。优选地，脂肪为皮下白色脂肪组织。此类细胞可以包括原代细胞培养物或者永生化的细胞系。脂肪组织可以来自于具有脂肪组织的任何生物体。优选地，脂肪组织是哺乳动物的，最优选地该脂肪组织是人类的。脂肪组织便利的来源是来自吸脂外科手术，不过，脂肪组织的来源或分离脂肪组织的方法对于本发明不是关键性的。吸脂术是一个具有美容效果的相对非侵入性的操作，为大多数患者所接受。已经充分证明脂肪细胞是可补充的细胞群。即使是通过吸脂术或其它操作在外科手术除去后，常见个体中脂肪细胞随着时间在同一部位的重现。这提示脂肪组织含有基质干细胞，其能够自我更新为脂肪细胞。
病理证据提示脂肪来源的基质细胞能够沿着多种细胞系途径分化。最常见的软组织肿瘤脂肉瘤是从脂肪细胞样细胞发育而来的。混合起源的软组织肿瘤相对常见。这些肿瘤可能包括脂肪组织、肌肉(平滑肌或骨骼肌)、软骨和/或骨的成分。在患有被称为进行性骨发育异常的罕见疾病的患者中，皮下脂肪细胞由于未知原因形成骨。
人类脂肪组织来源的成人基质细胞能够离体扩增，沿着独特的细胞系途径分化，基因工程改造，以及作为自体或者同种异体移植物重新引入到个体中。
匹兹堡大学(University of Pittsburgh)和加州大学董事会(TheRegents of the University of California)的WO 00/53795以及转让给匹兹堡大学的美国专利申请No.2002/0076400公开了基本上没有脂肪细胞和红细胞的脂肪来源的干细胞和网格，以及结缔组织干细胞克隆群。所述细胞可以在体内和体外单独或者处于生物相容性组合物中使用，以产生分化的组织和结构。另外，细胞可以扩增并培养以产生激素并提供支持其它细胞群生长和扩增的条件培养基。在另一个方面，这些出版物公开了基本上无细胞的脂肪来源的网格，它包括来自脂肪组织的胞外基质材料。网格可用作为基质(substrate)在体内或体外促进细胞生长和分化为原基或成熟组织或结构。没有一种出版物公开被诱导表达至少一种内分泌胰腺细胞的表型或基因型特征的脂肪组织来源的基质细胞。
转让给Artecel Sciences的美国专利No.6,391,297公开了分离的人类脂肪组织来源的基质细胞的组合物，其已经被分化表现出成骨细胞的至少一种特征，能够用于体内修复骨骼和治疗骨病。这种脂肪来源的成骨细胞样细胞可任选地被遗传修饰或与基质组合。
转让给BioHoldings International的美国专利No.6,426,222公开了通过在必须含有糖皮质激素的液体营养培养基中温育脂肪组织细胞，从人类髓外脂肪组织诱导成骨细胞分化的方法。
列举Halvorsen等为发明人的WO00/44882和美国专利No.6,153,432公开了将分离自脂肪组织的人类前脂肪细胞分化为带有与在分离的原始脂肪细胞中所观察到的相似的生物化学、遗传以及生理学特征的脂肪细胞的方法和组合物。
Artecel Sciences的WO01/62901以及公开的美国专利申请No.2001/0033834公开了已经被诱导表达神经元、星形胶质细胞、造血先祖细胞和肝细胞的至少一种表型特征的分离的脂肪组织来源的基质细胞。另外，也公开了已经被去分化从而缺乏脂肪细胞表型标志的分离的脂肪组织来源的基质细胞。
转让给Artecel Sciences的美国专利No.6,429,013公开了涉及已经被诱导表达至少一种软骨细胞特征的分离的脂肪组织来源的基质细胞的组合物。也公开了分化这些细胞的方法。
Peterson等的美国专利No.6,200,606公开了具有产生骨骼或软骨的潜能的前体细胞可以从包括外周血、骨髓和脂肪组织在内的多种造血及非造血组织中分离。
可用于本发明的方法的脂肪组织来源的基质细胞是通过本领域技术人员公知的各种方法分离的，例如象匹兹堡大学等的WO 00/53795和Zen-Bio，Inc.的WO 00/44882和美国专利No.6,153,432中所描述的。在优选的方法中，脂肪组织分离自哺乳动物受试者，优选为人类受试者。优选的脂肪组织来源是皮下脂肪。在人类中，脂肪典型地通过吸脂术分离。如果本发明的细胞要移植到人类受试者中，优选脂肪组织分离自该同一个受试者，以便提供自体移植。备选地，移植的细胞可以是同种异体的。
作为非限制性实例，在分离脂肪组织来源的基质细胞的一个方法中，脂肪组织用0.01到0.5％之间，优选0.04到0.2％，最优选0.1％浓度的胶原酶、用0.01到0.5％之间，优选0.04到0.04％，最优选0.2％浓度的胰蛋白酶在25°到50℃之间，优选在33°到40℃之间，最优选在37℃的温度下处理10分钟到3小时，优选30分钟到1小时，最优选45分钟。细胞通过20微米到800微米之间，更优选40微米到400微米之间，最优选70微米的尼龙或粗棉布网孔过滤器。然后将细胞直接在培养基中或在Ficoll或Percoll或其它粒子梯度中进行差速离心。细胞在4°到50℃之间，优选在20°到40℃之间，最优选在25℃的温度下以100到3000Xg之间，更优选200到1500Xg，最优选以500Xg的速度离心1分钟到1小时，更优选2到15分钟，最优选5分钟。
又在另一种分离脂肪来源的基质细胞的方法中，利用了诸如在Katz等的US 5,786,207中所描述的机械系统。使用系统将脂肪组织样品引入到自动化装置中，使其进入洗涤阶段和解离阶段，其中组织被搅拌并旋转，从而在离心预备状态的容器中收集所得的细胞悬液。以这种方式，从组织样品中分离脂肪来源的细胞，保持目的细胞的细胞完整性。
III.诱导脂肪来源的基质细胞表现出胰腺细胞的至少一种特征本发明包括处理脂肪来源的基质细胞以诱导形成表达胰腺细胞的至少一种基因型或表型特征的细胞。如何诱导脂肪来源的基质细胞分化的非限制性实例包括1)细胞培养基的利用；2)支持细胞的利用；3)将未分化的细胞直接植入患者组织中；和4)细胞工程技术。
A)细胞培养基诱导虽然本发明不束缚于任何操作理论，人们相信用含有血清、胚胎提取物、纯化或重组的生长因子、细胞因子、激素和/或化学制剂的组合的培养基在二维或三维微环境中处理脂肪来源的基质细胞，将会诱导分化。
更具体地，本发明提供了将脂肪来源的细胞分化为具有胰腺细胞的基因型或表型特点的细胞的方法，包括以预期的密度平板接种分离的脂肪来源的成体干细胞，包括但不限于约1,000到约500,000细胞/cm2的密度；在化学成分确定的培养基中温育细胞，所述培养基包含从由生长因子、激素、细胞因子、血清因子、核激素受体液体或任何其它明确的化学制剂组成的组中选择的至少一种化合物。
可用于本发明的方法的基本培养基包括但不限于NeurobasalTM(补充有或未补充胎牛血清或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF))、N2、B27、Eagle极限必需培养基、ADC-1、LPM(不含牛血清白蛋白)、F10(HAM)、F12(HAM)、DCCM1、DCCM2、RPMI 1640、BGJ培养基(有或无Fitton-Jackson改良)、Eagle基本培养基(BME-添加Earle′s盐基)、Dulbecco′s改良Eagle培养基(DMEM-无血清)、Yamane、IMEM-20、Glasgow改良Eagle培养基(GMEM)、Leibovitz L-15培养基、McCoy′s 5A培养基、培养基M199(M199E-带Earle′s盐基)、培养基M199(M199H-带Hank′s盐基)、Eagle极限必需培养基(MEM-E-带Earle′s盐基)、Eagle极限必需培养基(MEM-H-带Hank′s盐基)以及Eagle极限必需培养基(MEM-NAA-带非必需氨基酸)，还有众多其它培养基，包括培养基199、CMRL 1415、CMRL 1969、CMRL 1066、NCTC 135、MB 75261、MAB 8713、DM 145、Williams′G、Neuman& Tytell、Higuchi、MCDB 301、MCDB 202、MCDB 501、MCDB 401、MCDB 411、MDBC153。优选的用于本发明的培养基为DMEM。这些及其它有用的培养基可获自GIBCO，Grand Island，纽约，美国以及Biological Industries，Beth Aemek，以色列等。许多这些培养基概述于(Academic Press，Inc.，Jakoby和Pastan编辑)Methods inEnzymology，卷LVIII，″Cell Culture″，62-72页中。
可用于将脂肪来源的基质细胞分化为表达至少一种胰腺β细胞的基因型或表型特征的培养基包括如在Ontogeny，Inc.等的WO00/47721中描述的已经证明对于先祖细胞分化为分泌胰岛素的β细胞很重要的肠促胰液素或任何肠促胰液素类似物或激动剂。可用于本发明的方法的培养基将含有牛或其它物种来源的胎血清，浓度至少1％到约30％，优选至少约5％到15％，最优选约10％。鸡或其它物种来源的胚胎提取物以约1％到30％，优选至少约5％到15％，最优选约10％的浓度存在。
可用于本发明的生长因子、细胞因子、激素包括但不限于在pg/ml到mg/ml水平之间浓度的生长激素、促红细胞生成素、血小板生成素、白介素3、白介素6、白介素7、巨噬细胞集落刺激因子、c-kit配体/干细胞因子、osteoprotegerin配体、胰岛素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、睫状神经营养因子、血小板衍生生长因子以及骨形态发生蛋白。例如在此浓度下，可用于本发明的方法的生长因子、细胞因子和激素在集落形成单位(CFU)测定中能够诱导从脂肪来源的基质细胞高达100％形成血细胞(淋巴系、红系、髓系和血小板系)(Moore等(1973)J.Natl.Cancer Inst.50603-623；Lee等(1989)J.Immunol.1423875-3883；Medina等(2993)J.Exp.Med.1781507-1515。
已被证明能够辅助制备胰岛素产生细胞的生长因子包括肽GLP-1、extendin-4以及具有基本上同源的氨基酸序列的类似物，如Egan等的WO 00/09666中所描述的。
已进一步确认可以向培养基中添加额外的组分。此类组分可以是抗生素、白蛋白、氨基酸及本领公知的用于培养细胞的其它组分。另外，可以添加组分以促进分化过程。其它化学制剂可以包括但不限于，类固醇、类视黄醇及相对于阳性对照诱导脂肪来源的基质细胞分化至少25-50％的其它化学化合物或制剂。
已确认上文所述的细胞培养基条件产生表达单一类型的胰腺细胞即胰腺α、β、δ或PP细胞的至少一种基因型或表型特征的细胞。该特定的细胞类型通过本领域技术人员公知的任何方法分离。尤其有用的是利用该分化细胞表达的基因型或表型特征的方法。如下文所列的目的细胞的表型标志是本领域普通技术人员所熟知的，并已在文献中充分地公开。额外的表型标志继续有待公开或无需过度实验即可鉴定。这些标志中的任何一种都可用来确认脂肪来源的成体干细胞已经被诱导至分化状态。
细胞系特异性表型特征可包括但不限于细胞表面蛋白、细胞骨架蛋白、细胞形态学和/或分泌产物。胰腺α细胞特别表达胰高血糖素及其它标志。胰腺β胰岛细胞特征包括表达包括但不限于巢蛋白、pdx1(也被称之为IDX-1、IPF-1和STF-1)、GLUT2、NeuroD、neurogenin和胰岛素的标志。而且，胰腺β细胞含有大量锌。利用无毒性锌敏感荧光探针将选择性地标记活β细胞中不稳定的锌，并在可见光谱中表现出激发和发射波长，使得该技术可通过标准仪器使用(Lukowiak B等，JHistochem Cytochem.2001 Apr；49(4)519-28)。解离的NewportGreen-标记的细胞的细胞分选导致β细胞的完全分离，如通过胰岛素含量(per DNA)和免疫细胞化学分析所判断的那样。利用流式细胞仪或相似的细胞分选工具，本领域技术人员将能够运用这种或相当的技术高纯度地纯化β细胞。
胰腺δ细胞特别表达生长抑素及其它标志，而胰腺PP细胞表达胰多肽。这些细胞类型的其它标志包括胆囊收缩素受体(CCKA)和KIT受体酪氨酸激酶(Schweiger等Anat Histol Embryol.2000年12月；29(6)357-61；Rachdi等Diabetes 2001年9月；50(9)2021-8)。
备选的方法利用特异性地针对见于多种细胞类型上的标志的抗体通过许多本领域技术人员公知的充分证明的技术用于纯化。这些技术包括但不限于，免疫化学流式细胞仪分析和细胞分选以及免疫磁性纯化。免疫磁性纯化的非限制性实例包括利用为包被有特异性抗体(即胰岛素、胰高血糖素、生长抑素或胰多肽)的均一顺磁颗粒的dynabeads。
本领域技术普通人员将会意识到已知的量热、荧光、免疫化学、聚合酶链式反应、化学或放射化学方法可容易地确定细胞系特异性标志的存在或不存在。
在另一个实施方案中，本发明提供了去分化的、分离的脂肪来源的成体干细胞，其能够在能够进行此类分化的培养基中被诱导表达胰腺细胞的至少一种基因型或表型特征。去分化的脂肪来源的成体干细胞通过成熟脂肪细胞标志的缺失进行鉴定。
B)利用支持细胞促进脂肪来源的基质细胞分化在本发明的另一个实施方案中，支持细胞被用来促进脂肪来源的基质细胞分化。支持细胞可以是人源或非人动物源的细胞。如果利用非人动物支持细胞，所得的分化细胞通过异种移植植入。
本发明的脂肪来源的细胞被分离并培养在细胞群中，该群最优选是确定的群。该细胞群是异质的，包括为本发明的细胞提供因子的支持细胞。支持细胞包括促进目的细胞分化、生长和维持的其它细胞类型。作为非限制性实例，如果需要表达至少一种胰腺β细胞的基因型或表型特征的脂肪来源的基质细胞，首先通过上文所述的任何方法分离脂肪来源的基质细胞，并在存在其它支持细胞时在培养中生长。例如，这些支持细胞优选具有其它胰腺细胞类型即α、δ、γ、PP的特征。在另一个实施方案中，支持细胞来自于从培养的胰腺组织中取得的这些细胞类型的原代培养物。又在另一个实施方案中，支持细胞来自于永生化的细胞系。在一些实施方案中，支持细胞是自体获得的。在其它实施方案中，支持细胞是同种异体获得的。
本发明也构思用于支持目的细胞分化的细胞可被基因工程改造为支持细胞。细胞通过下文所述的或者本领域技术人员公知的任何方法被基因改造以表达外源基因或阻遏内源基因的表达。
C)植入在另一方面，本发明提供了可用于自体及同种异体移植的表达至少一种胰腺细胞基因型或表型特征的脂肪来源的基质细胞和分化细胞。分化在体内通过环境中天然存在的因子或引入的因子而发生。在一个实施方案中，移植部位是患病的胰腺。在其它实施方案中，移植部位是皮下或腹膜内。优选地，受试者为哺乳动物，更优选地，受试者为人类。在另一个实施方案中，细胞与或不与附加的生长因子一起植入到需要胰高血糖素、胰多肽、生长抑素或胰岛素的区域。本发明的细胞可以在体外或在植入患者后被诱导分化。
因此，又在另一个方面，本发明公开了向受试者提供能够表达至少一种胰腺细胞的基因型或表型特征的分化细胞的方法，包括
a)分离脂肪组织来源的基质细胞；b)在适于该细胞分化的培养基中平板接种并培养该细胞；c)将分化细胞引入到受试者中。
在本发明的另一个实施方案中，涉及向受试者提供未分化的脂肪来源的基质细胞的方法，包括a)分离脂肪组织来源的基质细胞；b)将该未分化的细胞引入到受试者中。
本发明构思当向受试者引入未分化的脂肪来源的基质细胞时，在一个特别的实施方案中，将它们与或不与附加的生长或分化因子一起直接引入到患病的胰腺中。又在本发明的另一方面，未分化的脂肪来源的基质细胞与如本文所述的将会提供适于该基质细胞在体内分化的环境的任何支持细胞或分化因子一起引入。例如，这些支持细胞优选具有其它胰腺细胞类型即α、β、δ、γ、PP的特征。在另一个实施方案中，支持细胞来自于从培养的胰腺组织中取出的这些细胞类型的原代培养物。又在另一个实施方案中，支持细胞来自于永生化的细胞系。在一些实施方案中，支持细胞是自体获得的。在其它实施方案中，支持细胞是同种异体获得的。
在另一个实施方案中，去分化的脂肪来源的细胞与药学上可接受的载体相组合提供用于治疗应用，包括但不限于组织修复、再生、重建或增强。脂肪来源的细胞通过美国专利No.6,153,432(特此并入作为参考)中公开的方法培养以去分化该细胞，由此该去分化的成体干细胞可然后被诱导表达不同于脂肪组织来源细胞的细胞的基因型或表型特征。去分化的脂肪来源的细胞可以被修饰以包括非内源性基因序列用以产生目的蛋白或肽。分化的脂肪来源的细胞可以，在备选的实施方案中，在二维或三维基质中向宿主给药以用于预期的治疗目的。在一个实施方案中，去分化的细胞是从患者自身细胞中自体获得的。备选地，去分化的细胞同种异体获得。
又在本发明的另一个方面，本发明的分化细胞被解聚并转移到悬浮细胞培养悬液中，与佛罗里达大学研究基金会的WO 97/15310的方法相似，其中公开了从胰腺组织来源的干细胞在体外培养功能性胰岛的方法，并培养直至观察到胰岛细胞簇形成的迹象。然后通过本领域技术人员公知的标准生物化学分析技术分析含有该细胞簇的培养基中可指示胰腺内分泌功能的胰岛素或其它激素的存在。然后可以将该细胞簇或聚集物注射或移植到宿主组织中用于组织产生或再生目的。
包封本发明提供了用适于移植到哺乳动物优选人类的生物材料包封分化的脂肪来源的细胞的方法。包封材料应当选择不妨碍由脂肪来源的成体干细胞分泌的目的蛋白的释放。所用材料包括但不限于胶原衍生物、水凝胶、藻酸钙、琼脂糖、透明质酸、聚乳酸/聚羟基乙酸衍生物和纤维蛋白。
D)遗传操作本发明的脂肪来源的细胞又在另一个实施方案中，表达胰腺细胞的至少一种基因型或表型特征的脂肪组织来源的细胞被基因改造以表达外源基因或阻遏内源基因的表达。本发明提供了基因改造此类细胞和细胞群的方法。
可以将包含启动子和感兴趣序列的核酸构建体作为非复制型DNA(或RNA)分子引入到受体原核或真核细胞中，它可以是线性分子，或者更优选地为闭合共价环状分子。由于此类分子没有复制起点不能自主复制，所述基因的表达可通过瞬时表达引入的序列而发生。备选地，永久表达可通过引入的DNA序列整合到宿主染色体中而发生。
在一个实施方案中，使用能够将目的基因序列整合到宿主细胞染色体中的载体。在其染色体中稳定整合了引入的DNA的细胞可以通过还引入一个或多个允许选择含有目的核酸序列的宿主细胞的标记进行选择。如果期望，标记可以向营养缺陷型宿主提供原养、生物杀灭剂抗性如对抗生素或者重金属如铜等的抗性。所述可选择标记基因序列可以直接连接于待表达的DNA基因序列，或者通过共转染引入到同一个细胞中。优选地，标记的表达可以定量并线性作图。
在优选的实施方案中，引入的核酸分子被掺入到能够在受体宿主中自主复制的质粒或病毒载体中。广泛种类的载体中的任何一种均可用作此目的。选择特定质粒或病毒载体的重要因素包括含有载体的受体细胞能够被识别并从不含载体的受体细胞中选择的容易性；特定宿主中期望的载体拷贝数；以及是否期望能够在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”该载体。
优选的真核载体包括，例如，痘苗病毒、SV40、逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒以及本领域技术人员所熟知的多种商业上可获得的以质粒为基础的哺乳动物表达载体。
一旦制备了用于表达的含有所述构建体的载体或核酸分子，该DNA构建体可以通过多种合适的方法中的任何一种，即转化、转染、病毒感染、接合、原生质体融合、电穿孔、基因枪技术、磷酸钙沉淀、直接微注射等被引入到合适的宿主细胞。在引入载体之后，受体细胞在选择培养基中培养，它可选择含有载体的细胞的生长。克隆基因分子的表达导致异源蛋白的产生。
引入的DNA被“维持”在细胞内应当理解为引入的DNA在所关注细胞继续生长和增殖的时候继续存在于基本上所有的细胞中。也就是说，引入的DNA不随着多轮的细胞分裂而被稀释出大多数细胞。相反，它在细胞增殖期间复制，并且引入的DNA的至少一个拷贝保留在几乎每一个子细胞中。引入的DNA可能以两种方式中的任何一种维持在细胞中。其一，它可能直接整合到细胞的基因组中。这以相当低的频率发生。其二，它可能作为染色体外元件或游离体存在。为使游离体在细胞增殖期间不被稀释掉，可以在引入的DNA中包括可选择标记基因，并使细胞在需要表达标记基因的条件下生长。即便是在引入的DNA被整合到基因组中的情况下，也可以包括可选择标记基因以防止DNA从染色体切除。
可以通过许多方法在转基因在体内表达的条件下将遗传改变的细胞引入到生物体中。因而，在本发明优选的实施方案中，转基因可以编码胰岛素的产生。然后可以将含胰岛素转基因的细胞引入到患病人类或其它哺乳动物的胰腺中。备选地，含转基因的细胞被腹膜内注射或注射到其它合适的器官贮库部位。
E)细胞表征对所得的分化细胞的“表征”旨在鉴定可指示基质细胞细胞系定型到特定终末分化状态的表面及胞内蛋白、基因和/或其它标志。这些方法可包括但不限于(a)利用用第二荧光标记连接的蛋白特异性单克隆抗体通过免疫荧光法检测细胞表面蛋白，包括利用流式细胞计数法；(b)利用用第二荧光标记连接的蛋白特异性单克隆抗体通过免疫荧光法检测胞内蛋白，包括利用流式细胞计数法；(c)通过聚合酶链式反应、原位杂交和/或RNA印迹分析检测细胞基因。终末分化细胞可以通过鉴定可指示基质细胞细胞系定型到特定终末分化状态的表面及胞内蛋白、基因和/或其它标志来表征。这些方法如上所述，包括但不限于(a)通过对脂肪来源的基质细胞表面蛋白例如碱性磷酸酶、CD44、CD146、整联蛋白β1或骨桥蛋白(Gronthos等1994 Blood 844164-4173)、胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、胰多肽、巢蛋白、PDX1、GLUT2、neuroD和neurogenin进行免疫荧光测定例如流式细胞计数或者原位免疫染色而检测细胞表面蛋白，(b)通过对脂肪来源的基质细胞利用特异性单克隆抗体进行免疫荧光测定法例如流式细胞计数或者原位免疫染色而检测胞内蛋白；(c)通过诸如聚合酶链式反应、原位杂交和/或其它印迹分析的方法检测细胞系选择性mRNA的表达，例如HNF3β、Isl-1、Brain-4、Pax-6、Pax-4、Beta2/NeuroD、PDX-1、Nkx6-2、Ngn-3、胰岛素和Glut-2(参见Gimble等1989 Blood74303-311)。
F)利用本发明的细胞作为治疗剂本发明的细胞和细胞群可作为治疗剂使用。一般而言，此类方法包括将细胞转移到期望的组织或贮库。细胞通过任何合适的方法被转移到期望的组织中，这通常根据组织类型而变化。例如，可通过用含有细胞的培养基浸泡移植物或者灌注移植物而将细胞转移到移植物上。备选地，细胞可被种植在组织内期望的部位上以建立细胞群。细胞可利用本领域技术人员熟知的装置，例如种植有细胞的导管、套针、套管或支架而转移到体内部位。
本发明的细胞可用于治疗许多疾病。尤其是，与胰腺内分泌机能障碍相关的紊乱或者能够用胰高血糖素、胰岛素、胰多肽或生长抑素治疗的紊乱是令人感兴趣的。
i)胰岛素相关紊乱转化的细胞可用于治疗任何胰岛素相关紊乱，例如糖尿病，尤其是I型糖尿病、II型糖尿病以及青年成熟期突发型糖尿病(MODY)。本发明的细胞用于治疗的糖尿病状况可由任何病因引起，包括但不限于遗传、感染、外伤或化学。本发明的细胞治疗的其它疾病包括脂肪营养不良相关疾病、化学诱导疾病、胰腺炎相关疾病或外伤相关疾病。疾病状态可以是例如自身免疫机能障碍或者病毒或某些其它感染因子感染的结果。
ii)胰高血糖素相关紊乱产生胰高血糖素的细胞可用于治疗作为系统地或按需要释放胰高血糖素的植入物治疗慢性低血糖症患者；肠易激综合征或者需要平滑肌松驰的相似疾病；以及通过胰高血糖素刺激脂肪细胞脂解作用以降低脂肪组织量而治疗肥胖。
iii)胰多肽相关紊乱分泌胰多肽的细胞可被植入并用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病、肥胖或任何导致胰腺β胰岛细胞肥大、胰岛素抗性或肝异常葡萄糖产生的疾病。
iv)生长抑素相关紊乱转化的细胞可用于治疗给予生长抑素有益的任何紊乱。因而，本发明构思表达至少一种胰腺δ(即生长抑素产生)细胞的特征的分化细胞用于治疗和预防涉及生长抑素本身或其调控的生理过程的紊乱。这些紊乱包括内分泌、胃肠道、CNS、PNS、血管和免疫系统的紊乱以及癌症。因而分化的生长抑素产生细胞可用于1)抑制哺乳动物中多种激素分泌和营养因子；2)治疗涉及例如营养因子自分泌或旁分泌的紊乱，包括乳腺癌、脑癌、前列腺癌和肺癌(小细胞和非小细胞表皮样瘤)以及肝细胞瘤、成神经细胞瘤、结肠和胰腺腺癌(导管型)、软骨肉瘤以及黑素瘤。在一个实施方案中，本发明的生长抑素产生细胞被用于直接治疗癌症或者致敏癌细胞用于使用其它方案包括放射疗法或化疗的联合治疗。
这些细胞的其它用途还包括抑制某些内分泌的分泌，例如胰岛素、胰高血糖素、催乳素和GH，这接着可进一步抑制多种营养因子例如IGF-1的分泌。本发明的细胞因此可用于治疗具有包括或与过量GH和营养因子分泌相关的病因学的紊乱。抑制这些分泌的能力可用于治疗诸如肢端肥大症的紊乱。这种活性也可用于治疗神经内分泌肿瘤，例如类癌、VIP瘤、胰岛素瘤和胰高血糖素瘤。本发明的生长抑素产生细胞也可用于治疗糖尿病和糖尿病相关病变，包括血管病、黎明现象、神经病、肾病和视网膜病(Grant等，Diabetes Care 2000，23，504-509)。
在另一个实施方案中，本发明的生长抑素产生细胞被用于治疗血管疾病，包括胃肠道系统的出血性疾病，例如涉及内脏血流和与疾病如肝硬化相关的食道静脉曲张的那些疾病。生长抑素介导血管收缩的能力也使得生长抑素产生细胞可用于治疗群集性头痛和偏头痛。
本发明的生长抑素产生细胞也可用于抑制血管内皮细胞增殖，因而指示可用于治疗移植血管疾病，例如在血管损害例如血管成形术之后的再狭窄或血管闭塞、同种或异种移植血管病、移植血管动脉粥样硬化症以及用于器官移植中(如心脏、肝、肾脏或胰腺移植(Weckbecker等，Transplantation Proceedings 1997，29，2599-2600))。本发明的生长抑素产生细胞也可用于抑制血管生成，并指示可用于伤口愈合以及治疗转移阶段癌症，包括但不限于肺癌、乳腺癌和前列腺癌。
本发明的生长抑素产生细胞也可用于抑制胃及外分泌和内分泌胰腺分泌以及胃肠道多种肽的释放。因而，生长抑素产生细胞可用于治疗胃肠疾病，例如治疗胃溃疡、NSAID诱导的溃疡、溃疡性结肠炎、急性胰腺炎(如ERCP后患者)、肠皮肤和胰腺皮肤瘘、GI动力障碍、肠梗阻、慢性萎缩性胃炎、非溃疡性消化不良、硬皮病、肠易激综合征、局限性回肠炎、倾倒综合征、水样泻综合征以及与诸如AIDS和霍乱的疾病相关的腹泻(参见O’Dorisio等，Advances inEndocrinology Metabolism 1990，1175-230)。
在具体的实施方案中，本文公开的生长抑素产生细胞在需要生长抑素作为中枢神经系统中的神经调质时也具有功能，可应用于神经变性疾病例如中风、多发性硬化、阿尔茨海默氏病及其它形式的痴呆、精神健康障碍(例如焦虑、抑郁和精神分裂症)，以及其它神经疾病例如疼痛和癫痫的治疗(A.Vezzani等，European Journal ofNeuroscience 1999，11，3767-3776)。
生长抑素产生细胞也可以和其它治疗剂联合应用。例如，在治疗器官移植的情况下，其它治疗剂的实例包括环孢菌素和FK-506。对于治疗肿瘤，其它治疗剂的实例包括他莫昔芬和α干扰素。对于糖尿病，其它化合物的实例包括二甲双胍或其它双胍、阿卡波糖、磺酰脲、噻唑烷二酮或其它胰岛素敏化剂，包括但不限于，对过氧化物酶体增殖剂激活的受体γ(PPAR-γ)起激动剂作用的化合物、胰岛素、胰岛素样生长因子I、胰高血糖素样肽I(glp-I)以及可用的饱感促进剂例如右旋酚氟拉明或苗条蛋白。
IV.组织工程本文所述的细胞可以在组织工程中使用。本发明提供了产生动物物质的方法，包括在足以使其扩增并分化为期望物质的条件下维持本发明的细胞。所述物质可以包括，例如胰腺的一部分，甚至于整个胰腺。对此，本文所述的细胞可与任何已知的组织工程技术联合应用，所述组织工程技术包括但不限于下面描述的那些技术AdvancedTissue Sciences，Inc.的美国专利No.5,902,741和5,863,531；Vacanti等的美国专利No,6,139,574；Vacanti等的美国专利No.5,759,830；Vacanti的美国专利No.5,741,685；Vacanti等的美国专利No.5,736,372；Vacanti等的美国专利No.5,804,178；Vacanti等的美国专利No.5,770,417；Vacanti等的美国专利No.5,770,193；Griffith-Cima等的美国专利No.5,709,854；Atala等的美国专利No.5,516,532；Vacanti等的美国专利No.5,855,610；Vacanti等的美国专利No.5,041,138；Vacanti等的美国专利No.6,027,744；Vacanti等的美国专利No.6,123,727；Kemp等的美国专利No.5,536,656；Skjak-Braek等的美国专利No.5,144,016；Vacanti的美国专利No.5,944,754；Tubo等的美国专利No.5,723,331以及Sittinger等的美国专利No.6,143,501。
为产生这样的结构，本发明的细胞和细胞群在适于其扩增并分裂形成器官的条件下维持。这可以通过将它们转移到动物中典型地期望新物质的部位而实现。因此，本发明能够在其中这样的组织中植入了该细胞的动物中促进胰腺的再生。
又在其它实施方案中，细胞在体外被诱导分化并扩增为组织。就此，细胞在促进形成有助于组织发育形成的三维结构的基质上培养。因此，例如，细胞可以培养于或者种植在生物相容性网格上，例如包括胞外基质材料、合成聚合物、细胞因子、生长因子等的网格上。这样的网格可以被塑造成期望的形状以促进组织类型的发育形成。
因此，本发明提供了包括细胞和细胞群以及生物相容性网格的组合物。网格可以从聚合材料形成，具有作为网孔或海绵的纤维，典型地具有在100μm和约300μm之间数量级的空间。这种结构提供细胞能够在上面生长和增殖的充足面积。期望地，网格随着时间可生物降解，这样它将随着动物物质的形成而被其吸收。合适的聚合物可从单体例如羟基乙酸、乳酸、延胡索酸丙酯、己内酯等形成。其它聚合物材料可包括蛋白、多糖、多羟基酸、聚原酸酯、聚酐、聚磷腈或合成聚合物，尤其是生物可降解聚合物，或其任何组合。而且，根据需要，网格可以包括激素，例如生长因子、细胞因子、形态发生素(如视黄酸等)、期望的胞外基质材料(如纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原等)或其它材料(如DNA、病毒、其它细胞类型等)。
为形成该组合物，细胞被引入到网格中，从而它们渗进其中的间质间隙。例如，基质可以用含有细胞的溶液或悬液浸泡，或者该细胞溶液或悬液可以注入或注射到基质中。优选地，利用通过交联包括聚合物并且其中分散有本发明细胞的悬液而形成的水凝胶。这种形成方法允许细胞分散在整个网格中，促进网格更加均匀地被细胞渗透。当然，组合物还可以包括期望表型的成熟细胞或其前体，特别地增强对网格内本发明细胞的诱导，或者促进网格内激素例如胰岛素或胰高血糖素的产生。
本领域技术人员将会理解适于包括在组合物中的网格可来自任何合适的来源，如基质凝胶(matrigel)，并且当然可以包括合适网格的商业来源。另一种合适的网格可来自于脂肪组织的无细胞部分，例如基本上没有细胞的脂肪组织胞外基质。典型地此类脂肪来源的网格包括蛋白例如蛋白聚糖、糖蛋白、hyaluronin、纤连蛋白、胶原等，它们全部作为细胞生长的出色基质。另外，此类脂肪来源的网格可以包括激素、细胞因子、生长因子等。本领域技术人员将会知晓分离这种脂肪来源的网格的方法，例如匹兹堡大学的WO 00/53795中所公开的，特此并入作为参考。
又在本发明的另一个实施方案中，利用固体自由形式的制造方法产生胰腺样组织以允许组织再生和生长。例如，这类技术公开在Vacanti等的专利U.S.6,138,573中，并允许产生部分或完整的器官用于移植到需要其的人体中。尤其是，这些技术将允许产生部分或完整的胰腺用于移植。产生此类部分或完整的器官可用以自体方式获得的本发明的细胞实现。或者，此类部分或完整的器官由以同种异体方式获得的本发明的细胞产生。构思本领域技术人员公知的任何方法可用于改造来自本发明的细胞的组织。例如Naughton等(Advanced TissueSciences)的专利US 6,022,743和5,516,681公开了用于培养胰腺样组织的三维细胞培养系统的方法。这些技术包括将细胞种植并植入到基质上以形成可额外提供控释生物活性剂的器官组织和结构组分。基质的特征在于与天然存在的组织脉管系统功能上等同的内腔网络，其由植入的细胞形成，并且进一步衬有内皮细胞。该基质在植入时进一步与血管或其它导管偶合以在整个基质中形成血管或导管网络。自由形式的制造技术是指本领域公知的构建作为一系列二维层的复杂三维物体的任何技术。该方法可被改造利用许多聚合、无机及复合材料产生具有明确组成、强度和密度的结构。因而，利用此类方法，可在基质内产生精确的通道和孔，以控制随后一种或多种具有明确功能的细胞类型在基质内的细胞生长和增殖。以这种方式，本发明的分化细胞，相应于各种类型的胰腺细胞(即具有至少一种胰腺α、β、γ或δ细胞的基因型或表型特征的细胞)可被组合以形成部分或完整的器官。此类细胞在基质中组合以提供散布于整个细胞中的衬有内皮的血管网络。也可以形成其它结构用作为淋巴管、胆管及器官内的其它外分泌或排泄管。
本发明的细胞、细胞群、网格和组合物可用于组织工程和再生。因此，本发明涉及合并任何公开的本发明的特征的可植入结构。植入物的确切性质将根据期望的用途变化。植入物可以包括成熟组织或可以包括未成熟组织或网格。因此，例如，植入物可以包括正在经历胰腺分化的本发明的细胞群，任选地种植在适当大小和维度的网格内。这样的植入物被注射或移植到宿主内，以促进患者体内成熟胰腺组织的产生或再生。
脂肪来源的网格可便利地作为细胞培养试剂盒的一部分使用。因此，本发明提供了试剂盒，其包括本发明的脂肪来源的网格和一种或多种其它组分，例如水化剂(如水、生理相容性盐溶液、制备的细胞培养基、血清或其组合或衍生物)、细胞培养基质(如皿、板、瓶等)、细胞培养基(无论液体还是粉末形式)、抗生素、激素等。虽然试剂盒可以包括任何此类成分，优选地它包括所有在适当组合后支持目的细胞培养和生长的必要成分。期望的试剂盒也可以包括如所述种植到网格中的细胞。
现在将通过下列实施例更加充分地描述本发明。不过，本发明可具体体现为许多不同的形式，而不应当理解为限于本文所列的实施方案。确切地讲，提供这些实施方案，从而使公开更加彻底和完整，并将充分地向本领域技术人员传达本发明的范围。
实施例实施例1体外诱导方法脂肪来源的肝细胞按照描述分离自吸脂术废物材料(Sen等，2001，J.Cell Biochem.81312-319)。这些细胞在存在(但不限于)下列培养基的情况下继续培养补充有或未补充胎牛血清(FBS)的NeurobasalTM(InVitrogen)、N2、B27(InVitrogen)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。对培养基中的葡萄糖水平进行调节。细胞以多种密度种植，并以每3-6天的时间间隔饲喂。最优选地，它们以约1000到约500,000细胞/cm2的密度种植。
在培养期间，利用商业上可获得的放射免疫测定或酶联免疫吸附测定对条件培养基进行内分泌胰腺激素胰岛素(American LaboratoryProducts)、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽(Peninsula Labs Inc)的分析。
与各种内分泌胰腺细胞细胞系相关的表型标记的表达利用对如下(但不限于)基因HNF3β、Isl-1、Brain-4、Pax-6、Pax-4、Beta2/NeuroD、PDX-1、Nkx6.2、Nkx2.2、Ngn-3、胰岛素和Glut2特异性的引物通过RT-PCR分析mRNA进行评估。这些标记的存在以及它们与内分泌胰腺细胞的关系以前已有描述(Ramiya等，2000，Nat.Med.6，278-282；Schwitzgebel等，2000，Development 127，3533-3542；Fernandes等，1997，Endocrinology 138，1750-1762；Zulewski等，2001，Diabetes 50，521-533；Gradwohl等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97，1607-1611)。还将利用针对(但不限于)任何上文所述的表型标志的抗体进行免疫组织化学(IHC)分析。
实施例2基因治疗方法该方法包括插入和表达任何导致诱导成体干细胞分化为表达至少一种胰腺细胞的基因型或表型特征的细胞的基因。这些基因可以包括但不限于转录因子HNF3β、Isl-1、Brain-4、Pax-6、Pax-4、Beta2/NeuroD、PDX-1、Nkx6.2、Nkx2.2和Ngn-3的受控表达。将核酸引入细胞的潜在方法包括但不限于电穿孔、磷酸钙、逆转录病毒、腺病毒或脂质介导的递送，如上文详细描述。细胞如在上文以及在实施例1中所详细描述的进行分化分析。
实施例3体内移植本发明的细胞体内植入用于动物的治疗应用以及治疗因内分泌胰腺组织机能失常引起的人类疾病如1型糖尿病。用于这些应用的现有的啮齿动物模型包括胰岛素依赖型非肥胖糖尿病(NOD)小鼠，以及通过用链脲菌素处理破坏胰岛致使糖尿病的小鼠或大鼠(Lumelsky等，2001，Science 292，1389-1394；Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415)。NOD小鼠已被用来植入胰腺胰岛和由胰管干细胞产生的胰岛(Soria等，2001，Diabetologia 44，407-415；Lumelsky等，2001，Science 292，1389-1394；Stegall等，2001)。本发明表达至少一种胰腺细胞的基因型或表型特征的分化的细胞被用于植入到NOD动物中，它们通常必须靠每日注射胰岛素维持生存。移植用动物的制备包括外科手术操作，其中如以前所描述的利用27号标准针头在肾被膜的被膜下区产生小通道(Ramiya等，2000，Nat.Med.6，278-282)。起始范围为103-106的衍生自人类成人干细胞的内分泌胰腺细胞利用小套管和通道上烧灼的开口被植入。可检查备选的操作，其中在肩上制造皮下部位并植入细胞(Ramiya等，2000，Nat.Med.6，278-282)。在这两种植入模型中，假手术NOD小鼠和未经历任何操作的NOD小鼠作为对照。在手术操作后2-7天的周期内，动物被中断日常胰岛素注射。作为功能性胰岛素产生细胞的指数，在不同阶段利用AccuChek-EZ葡萄糖监测仪(Roche)监测动物的血糖水平。进行有关人类胰岛素和其它内分泌胰腺激素的ELISA分析。另外，利用针对胰岛素及由该植入物潜在地产生的其它蛋白的人类特异性抗体进行植入部位的免疫组织化学分析。
实施例4包封如上所述植入的细胞可以被免疫排斥。作为防备这种情况的努力，设计了利用包封基质的方法，所述基质允许来自包封组织的分泌激素的通过，但起着对抗宿主免疫攻击的保护屏障的作用。参见Ramiya等，2000，Nat.Med.6278282。此类屏障可以包括透明质酸为基础的凝胶RestalyneTM(Q-Med Sweden，乌普萨拉，瑞典)。对于此方法，起始范围为103-106的衍生自人类成人干细胞的内分泌胰腺细胞被包封入凝胶中。植入物被置入皮下部位，动物中断胰岛素并进行分析，如上文实施例3中所描述的。
实施例5同种异体移植检查同种异体移植的动物模型的一个实例已有描述(Stegall等，2001，Transplantation 71，1549-1555)。两个品系(品系A和品系B，例如CBA(H-2k)和BALB/c(H2-d)小鼠被用作为成体干细胞供体以及作为衍生自成体干细胞的内分泌胰腺细胞的受体。供体内分泌胰腺细胞由品系A或品系B的成体干细胞制备，所述干细胞以类似于上文所述的用于人类脂肪来源的干细胞的方法分离自鼠性腺脂肪细胞的供体群。品系A或品系B的受体通过用链脲菌素处理导致糖尿病(Stegall等，2001，Transplantation 71，1549-1555)。建立移植，使供体\受体组合为1)同基因，品系A对品系A以及品系B对品系B；2)同种异基因，品系A对品系B以及品系B对品系A；3)第三种模型利用链脲菌素诱导的糖尿病裸(免疫缺陷)鼠作为来自品系A或品系B的供体细胞的受体。接受移植的动物如实施例3所述进行监测和分析。
实施例6胰岛素检测分析在本发明的任何细胞培养物中，胰岛素的产生检测如下。简要地，如上文任一实施例中培养的细胞用含有5到25mmol/l葡萄糖的无血清培养基洗涤3次，并在3ml无血清培养基中温育至少2小时。随后，收集条件性培养基，并利用与胰岛素原或C肽无交叉反应性的检测人类胰岛素的微颗粒酶免疫分析(AXSYMTMsystem Insulin kitcodeB2D010；Abbott Laboratories)检测胰岛素水平。
实施例7胰岛簇形成例如，根据Lumelsky等的方法构建三维胰岛簇(2001，Science1389-1394)。简要地，根据本文所述的实施例1中概述的方法培养细胞。细胞最初生长以在悬液中产生高度富集的巢蛋白阳性细胞群，并补充无血清ITSFn培养基。这些条件已经证明可提高巢蛋白阳性细胞的比例。然后在bFGF存在下在N2无血清培养基中扩增细胞。为诱导分泌胰岛素的胰岛簇的分化和形态发生，然后从含有补充了烟酰胺的B27培养基的培养基中撤掉bFGF。然后鉴定所得的聚集物或簇并通过本领域技术人员公知的任何方法确认为产生胰岛素。
实施例8分离由脂肪来源的基质细胞分化的特定胰腺细胞类型单个大鼠胰岛细胞最初与β细胞表面特异性抗体(K14D10小鼠IgG)温育20-60分钟。添加包被有二抗(抗小鼠IgG)的Dynabead悬液进一步温育15分钟，之后Dynabead包被的细胞通过试管和磁体(Dynal MPC)之间的接触被瞬间沉淀。利用免疫细胞化学确认Dynabead包被的细胞含有胰岛素并对该方法的效率进行定量。对Dynabead包被和未包被的细胞进行胰岛素和胰高血糖素染色。
Dynabead免疫纯化产生纯度95％的含胰岛素的β细胞，它响应异丁基甲基黄嘌呤和胰高血糖素样多肽1而释放胰岛素。Dynabead包被的β细胞中的胰岛素含量显著高于未包被的细胞。成功的分离利用少至30个胰岛作为起始材料而实现。利用“彗星”分析，Dynabead包被的β细胞表现出与非包被细胞等同的对细胞因子诱导的DNA损伤的易感性(Hadjivassiliou等Diabetologia.2000年9月；43(9)1170-7)。
对于得益于前述说明书中呈现的教导的本发明所属技术领域的技术人员来说，本发明的修饰和其它实施方案将是显而易见的。因而，应当理解本发明不局限于所公开的具体实施方案，并且修饰和其它实施方案旨在包括在所附的权利要求书的范围之内。虽然本文使用了具体术语，它们仅仅是以通称和描述性的意义使用的，而并非用于限制目的。
权利要求
1.分离的脂肪组织来源的基质细胞，其被诱导表达内分泌胰腺来源细胞的至少一种特征。
2.权利要求1的细胞，其中细胞在体外被诱导分化。
3.权利要求1的细胞，其中细胞在体内被诱导分化。
4.权利要求1的细胞，其中该细胞中引入了外源遗传材料。
5.权利要求1的细胞，其中细胞是人类的。
6.权利要求1的细胞，其中细胞分泌激素。
7.权利要求6的细胞，其中激素从由胰岛素、胰高血糖素、生长抑素或胰多肽组成的激素组中选择。
8.权利要求7的细胞，其中激素为胰岛素。
9.分化分离的脂肪组织来源的基质细胞以展示至少一种内分泌胰腺细胞标志的方法，包括使分离的脂肪组织来源的基质细胞与内分泌胰腺诱导物质接触。
10.权利要求9的方法，其中内分泌胰腺诱导物质在化学成分确定的细胞培养基中。
11.治疗宿主中胰腺内分泌紊乱或变性疾病的方法，包括i)诱导分离的脂肪组织来源的基质细胞表达至少一种内分泌胰腺细胞标志；和ii)将诱导的细胞移植到宿主中。
12.权利要求11的方法，其中脂肪组织来源的基质细胞分离自该宿主。
13.权利要求11的方法，其中胰腺内分泌紊乱或变性疾病是I型糖尿病、II型糖尿病、脂肪营养不良相关疾病、化学诱导疾病、胰腺炎相关疾病或外伤相关疾病。
14.植入物，包含权利要求1-8中任一项的细胞。
15.权利要求14的植入物，进一步包含生物相容性聚合物。
16.权利要求15的植入物，其中生物相容性聚合物为水凝胶。
17.权利要求15的植入物，其中生物相容性聚合物为胶原衍生物、聚羟基乙酸、聚乳酸、聚羟基乙酸/聚乳酸、透明质酸盐或纤维蛋白。
18.生产激素的方法，包括(a)在足以让细胞向培养基中分泌激素的条件下在培养基中培养权利要求1-8中任何一项的细胞和(b)从培养基中分离激素。
19.权利要求18的方法，其中产生的激素选自胰岛素、胰高血糖素、生长抑素或胰多肽。
20.权利要求19的方法，其中产生的激素是胰岛素。
21.分离的脂肪组织来源的基质细胞，其在体外去分化，然后被诱导表达至少一种内分泌胰腺细胞的特征。
22.权利要求21的去分化细胞，其在体内被诱导表达至少一种内分泌胰腺细胞的特征。
23.分离的脂肪组织来源的细胞，其在培养中被诱导表达至少一种内分泌胰腺细胞的特征，其中诱导的细胞a)被解聚并转移到悬浮细胞培养物中；b)培养悬浮细胞培养物直至观察到胰岛细胞簇形成的迹象；并且，其中c)将所得的胰岛细胞簇植入到宿主中。
24.权利要求1的细胞，进一步被包封在适于移植到宿主中的生物材料中。
25.权利要求24的方法，其中包封材料选自胶原衍生物、水凝胶、藻酸钙、琼脂糖、透明质酸、聚乳酸/聚羟基乙酸衍生物以及纤维蛋白。
26.植入宿主中的权利要求1-8或21-25中任一项的细胞的用途。
27.植入宿主中的权利要求14-17中任一项的植入物的用途。
全文摘要
本发明提供了基于脂肪组织来源的基质细胞分化为表达至少一种胰腺细胞的基因型或表型特征的细胞的细胞、组合物和方法。该方法产生的细胞可用来提供分化的和功能性细胞的来源，用于研究、植入、移植和研发组织工程产品以治疗胰腺疾病以及胰腺组织修复+。
文档编号A61P3/06GK1596305SQ02823717
公开日2005年3月16日 申请日期2002年11月12日 优先权日2001年11月9日
发明者B·奇塔姆, Y－D·C·霍尔沃森, J·M·金贝尔 申请人:阿特塞尔科学公司