微生物在将物质定向递送到消化道的特定部分中的用途的制作方法

专利名称：微生物在将物质定向递送到消化道的特定部分中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物、尤其是乳杆菌(Lactobacilli)和双歧杆菌(Bifidobacteria)的用途，用于将对接受者有益的物质递送到接受者的胃肠道的特定预定的部分。尤其是，本发明涉及含有在消化道的特定位置裂解的微生物的可摄取的载体及其用途，用于维持个体的健康或者治疗和/或预防疾病。
胃肠道是个体为保持其健康而摄取有用物质的主要器官。这些物质包括任何能量来源，如蛋白质、脂类或糖类，还包括必需成分，如维生素、精油等。为了完成这项工作，胃肠道被设计成在其不同位置进行不同的工作。例如，在胃中酸性pH使得消化的物质被早一些分解，而在肠中，该物质将被存在的细菌所分泌的酶进一步降解并最终被再吸收。
肠道中定居有微生物如拟杆菌(Bacteroides)、乳杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌(E.Coli)，这些细菌的一个主要作用是保护个体免受病原的攻击。这主要通过与病原争夺粘附位点并最终争夺生长位置而完成。这些细菌还支持个体摄取的食物物质的进一步降解。
在过去，益生菌生物引起了人们的大量关注，因为已经发现某些菌株在摄入后对人和动物显示出有益的性质。认为益生菌是活的微生物，其通过保持肠中的天然菌群而促进个体的健康。益生菌可以附着到胃肠粘膜，至少可暂时定居在胃肠道并防止有害微生物粘附在其上。它们作用的一个关键前提是它们必须以适当和存活的形式到达肠粘膜并且在胃肠道的上面部分不会被破坏，特别是不会被胃中低pH的影响所破坏。尤其是，申请人已经发现乳杆菌属和双歧杆菌属的某些菌株在传代后还能抗拒胃环境的酸性pH而幸存下来并且能够在肠粘膜定居，它们在消化道中的短暂或长期保持对摄入它们的个体的健康具有许多积极的效果。这些有益效果基本上归因于益生菌在它们停留在消化道期间产生和分泌的特定化合物/代谢物。
在这方面，EP0 577 903公开了能够将胃细胞中的幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)驱逐出去的乳酸细菌，幽门螺旋杆菌是公认的导致产生胃溃疡和胃癌的原因。认为在这方面使用的乳酸细菌释放某些对螺旋杆菌的生长有害的化合物，从而这些病原的随后繁殖或过度繁殖被减少，甚至被防止了。
WO 97/00078公开了命名为鼠李乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG(ATCC 53103)的特定益生菌菌株。该微生物被特别用于防止或治疗食物引起的过敏反应的方法中，其中该微生物和用胃蛋白酶和/或胰蛋白酶水解处理的食物一起被施用与接受者。所选用的乳杆菌显示出粘附和定居的性质，并且显示具有蛋白酶酶系统，从而所要施用的包含在食物中的蛋白物质被该特定乳杆菌菌株分泌的蛋白酶进一步水解。在该文献中讨论的方法将最终使消化道摄取蛋白物质而不再具有大量的变应原物质。
EP 0768 375还公开了双歧杆菌属的特定菌株，其能够植入到肠内菌群并且可以附着到肠细胞上。
据报道这些双歧杆菌帮助免疫调节，能够竞争性阻止病原细菌对肠细胞的粘附，从而帮助保持个体的健康。
因此，在过去几年里，研究集中于提供其他具有这种共同特征的微生物，即它们将植入在胃肠道菌群，居住在胃肠道一定的时间并在该区域或者它们居住的位置发挥它们的作用。
尽管益生菌对摄入它们的个体产生了许多有益作用，但是存在一个缺点，因为所述微生物只有在定居于消化道中并分泌发挥所述作用的化合物时才能显示它们的效果。此外，因为各种化合物的分泌是一种生物过程，受到各种不同参数的影响，所以得到的化合物/代谢物的量将变化较大。而且，由于微生物只在为它们的生长提供有利条件的消化道的有限部分定居，所以它们只在那些地方发挥作用。
所以，本发明的一个目的是消除现有技术的缺点并提供递送对个体有益的物质的改良方法。
在得到本发明的大量研究中，本发明的发明人意识到可以通过应用一种与目前为止所使用的观念完全相反的新概念来实现上面的目的。
从而，根据本发明，并不打算使所要使用的微生物幸存于胃肠道并定居在其中(益生菌就是如此)，而是建议使用微生物将对宿主有益的物质递送到胃肠道的特定部分，而微生物处于将在胃肠道预定位置分别释放一种物质或几种物质(所谓的靶向释放)的状况下。
为了实现这种目标化合物的定向递送和/或释放，所用的微生物将处于它们将在期望的位置释放其胞内物质的状况下。


图1用图的方式显示了本发明的概念，说明了释放的附近区域和完成释放的方法。
这种状况——即能够在消化道中预定位置释放目标生物物质的能力——可能是微生物本身的内在特性，其可以是对胃肠道中特定位置环境条件的敏感性所致。在这方面，含有相应物质的微生物将在消化道的特定位置裂解并且将释放所有其胞内物质，包括目标物质。
同样地，这种释放生物学目标物质的能力也可以由在将微生物施用于接受者之前对其进行合适的预处理获得。这种预处理可以包括减弱微生物的存活力，从而减少它们的总体生长或耐受性能。另一方面，这种预处理也可以包括加强相应微生物的存活力和/或耐受性(可以通过例如包囊化完成)，从而使微生物对胃液和/或胆汁具有抗性。
例如，可以通过将微生物进行休克处理，例如将它们分别暴露于热、低温或低或高pH值的特定条件下，将它们与噬菌体一起孵育或者将重组构建体插入影响细胞早期裂解的微生物中，使用已知含有原噬菌体的微生物，将它们置于对生长不利的特定发酵条件下，引发细菌SOS应答或者使内在保护性胁迫-应答系统(其在调节水平或者基因表达水平修复受损的胞内蛋白)失活，从而所得微生物将最终显示出对消化道中的环境条件/变化具有降低的存活力和/或抗性来实现合适的预处理。
可以理解，所述对环境条件/变化具有降低的存活力和/或降低的抗性将主要依赖于所用的方法、相应微生物的敏感性和该方法应用的频率。
如前所述，也可以使微生物对特定条件更有抗性，例如通过包囊化或者引发阳性增加的内部保护性胁迫应答系统，该系统在调节水平或基因表达水平修复受损的胞内蛋白，从而所用的微生物将维持较长时间而当进入接受者的胃肠道(例如在具有低pH的胃中)时不会立即裂解，并最终将它们所携带的物质递送到离进入接受者肠时位置更远的地方(靶向释放)。
原则上，所要使用的微生物可以是对将要施用它们的个体无害的任何微生物，如通常用于制备食品的微生物，例如乳酸细菌，例如乳杆菌、双歧杆菌、链球菌(Streptococci)、片球菌(Pediococci)等，和/或通常定居于胃肠道的微生物，例如拟杆菌、大肠杆菌等。根据一个优选的实施方案，所要使用的微生物选自乳杆菌和双歧杆菌及其益生菌变体。这些微生物优选的实例是Bad 4、B128、B129或La1，它们都可以自由地从保藏机构得到，保藏号分别是CNCM I-2168、CNCM I-2169、CNCM I-2170和CNCMI-1225。
所要使用的微生物含有至少一种物质，该物质在特定位置的释放将对接受者产生有益的作用。这种物质原则上可以是已知能产生所期望的效果的任何物质，如以有益方式(例如通过刺激免疫系统或减少炎症反应)影响免疫系统的化合物，或者能防止病原在接受者的胃肠道器官或这类器官中生长或过度生长的物质，或者有利于消化道功能如吸收、蠕动的任何物质。
本发明还包括设计的或者已知的治疗疾病的任何物质，如由某种微生物产生的化合物，例如抗生素，或者其他生物活性分子，如多肽、糖类或特定脂肪。
这些物质的例子为例如免疫调节化合物，如免疫球蛋白或白细胞介素，或者机体自身不能产生的化合物，如必需脂肪酸，已知抗病原的化合物，如antimycotika，等等。其他化合物包括杀细菌分子，例如细菌素、自溶素、脂磷壁酸质、脂多糖或机体自身不能产生的化合物，如必需脂肪酸。
特异递送到小肠的例子为例如与宿主粘液层局部相互作用、聚集病原和通过增强营养吸收的粘液冲洗物质、通过与特定营养物络合并改变它们的吸收模式而方便病原清除的物质，或者具有消化病原毒性因子(例如肠毒素)性质的物质，例如酶。
递送到盲肠的例子是例如具有解毒性质的物质、具有控制特定消化道部分的蠕动模式潜能的物质、具有有助于肠细胞分化潜能的物质、具有增强先天性免疫潜能的物质或具有恢复粘液层完整性潜能的物质。
为了提供含有一种或多种目标物质的微生物，可以选择一种本来就表达这些物质的微生物。因为微生物被设计在消化道的特定位置释放细胞内物质(包括有益物质)，所有不需要该物质被分泌到环境中。相反，根据本发明，该物质将在预定位置以较高的量存在，因为，基本上所有使用的微生物将在那儿裂解并释放该物质。为此，可以任选地预处理已经含有不同物质的相应微生物，合适的处理方式为将所述物质递送直到消化道的某个目标位置，可以将微生物施用于接受者，这些微生物将在消化道的不同位置处裂解，这取决于预处理的类型。
与益生菌的通常使用(其中有益物质主要通过分泌到环境中释放)相比，这具有很大的优势。根据本发明，所用的微生物在到达消化道的特定位置(其被设计在此裂解)时将基本上同时释放所有其所携带的有益物质。而且，将被递送给接受者的相应物质的量可以被更恰当的控制，因为施用给定量的所要使用的微生物，目标物质的含量大体上已知。
为了增加微生物递送的给定物质的量，可以使用常用技术，如应用特定发酵条件或者遗传改造微生物本身，通过例如使微生物进行随机突变并选择较大量表达所需要物质的突变株。然而，也可以使用重组方法，其中内源基因的表达被增强，这可通过例如将相应基因与比内源基因的启动子强更的启动子连接，或者通过将编码目标物质的单个基因或几个基因插入到微生物的质粒上或者插入到微生物的染色体中，任选与一种强启动子相连，该启动子驱动目标基因的表达，使得该重组微生物将含有更大量的期望物质。
应该理解，重组技术还将提供将编码目标物质的基因插入本身不含有这种物质的微生物中的可能性。因此，可以被微生物表达的的任何期望物质都可以被包括在给定微生物中，这可通过将一种或多种编码所述物质的基因插入到所选微生物中并将该重组微生物置于适于表达该物质并在细胞中扩增的培养条件下。随后，可以将该微生物进行预处理，处理的方式使它们处于递送物质到胃肠道的特定部分的条件下。
本发明还包括将微生物在含有目标化合物的肉汤中培养并任选地“处理”该微生物使得它们可以从培养基中吸收物质。以这种方法吸收的化合物的例子是复合糖类或任何类型的多肽、胨或蛋白质。
所以，可将本发明的微生物认为是携带目标物质到达接受者的胃肠道的预定位置或区域的载体。根据本发明，技术人员可以确定该物质将在何处释放，因此，本发明提供了将期望物质定向递送到胃肠道的特定部分的绝佳方法。
根据预处理的性质和持续时间，可以确定微生物的耐受性，即其在胃肠道中的存活，递送的潜在位置是嘴、喉咙、胃、十二指肠、空肠、回肠或结肠。应该理解，技术人员根据他的一般的知识和简单的实验就可以确定给定微生物在接受者的消化道中存活的时间并在将该微生物施用于接受者前应作相应的处理。
这些微生物可以以消费者可接受的产品形式如分别是可摄取的载体或支持体便利地施用。这些载体或支持体的实例为药用的、盖仑的或食物组合物。这些组合物的非限定性例子为奶、酸奶、凝乳、干酪、发酵奶、奶基的发酵制品、冰淇淋、发酵谷类基的制品、奶粉、婴儿制品、宠物食物、片剂、液体细菌混浮剂、干燥口服补充物、湿润口服补充物、干燥管饲品或湿润管饲品。
可以通过选自一种微生物制备该产品，所述微生物已经含有将要递送的物质或者将被相应的修饰以便提供足量的这种(些)物质。
然，后通过简单的实验评价所述微生物的性质，这些实验表明它们在胃肠道中的总体存活情况。在选择一种微生物的情况下，该微生物例如不抗胃液，并且将递送其所携带的物质到达消化道更下游的位置，这种微生物将优选被包囊化以便其能够通过胃。另一方面，当选择一种益生微生物时，已知其能够幸存于胃肠道中的主要环境条件，并且可以在肠中开始增殖，这种微生物的存活力和/或耐受性将被减弱，从而使其不会在期望的位置开始增殖而是在那儿裂解并将其所携带的物质递送到那儿。
一旦已经选择了一种微生物并任选的对其进行预处理，所述微生物将被包括在上面提到的产品中，其量为105-1013cfu/ml，取决于所运送的物质的性质和各种微生物中所含的这些物质的量。
所以，这些微生物和上面的产品可被用于保持摄入所述微生物的个体的健康和/或治疗和/或预防疾病。
下面的非限定性实施例进一步阐明本发明。
实施例1为了检验不同微生物对胃肠道中的不同条件的敏感性，进行了体外实验，其中模拟了消化道中的不同条件。
将22种细菌，包括11种乳酸菌菌株，10种双歧杆菌菌株和一种明串珠菌(Leuconostoc)菌株(来自Nestléculture collection(NCC))活化并在MRS-肉汤(乳酸菌和明串珠菌)或MRS-半胱氨酸(双歧杆菌)中，在厌氧条件下(厌氧广口瓶)生长16小时(双歧杆菌生长24-36小时)(表1)。
表1所研究的细菌菌株
应用不同生理实验，目的是确定这22种菌株(乳酸菌、明串珠菌、双歧杆菌)在模拟的胃液(SGJ)和胆汁盐中的表现和存活力。
a)对酸性条件的抗性将5ml模拟胃液(0.3％w/v胃蛋白酶，0.5％w/v NaCl，pH 2.0与HCl)+1.5ml 0.5％NaCl)与1ml新鲜细菌培养物混合。不同时间点(0min、1min、30min、60min、120min、180min)后取出1ml样品，稀释(序列的，10倍稀释液)并计数。
b)对胆汁盐(Oxgall，Difco)的抗性所有菌株都以1％接种物接种于具有不同浓度胆汁酸(0.0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％)MRS-肉汤中15小时。在该时间段末，取出1ml样品，稀释(序列的，10倍稀释液)并计数。
结果在下面的表2和3中概述，表2证明，某些菌株是抗酸的。例如，所有四种鼠李乳杆菌菌株(incl.Ls8＝Lb.GG)在暴露于模拟胃液(SGJ)1min后，已经降低了1log(+/-0.2logs)细菌计数(cfu/ml)，30min后，在所有鼠李乳杆菌菌株中都可以观察到降低至少2.4log(多达5log)。暴露于SGJ 60min后，所有细菌基本上都变干了(损失至少6log)。在这种情况下，很清楚所有研究的鼠李乳杆菌菌株都对低pH敏感。
约氏乳杆菌Lj3在暴露于SGJ 1min后降低了约0.6到1.0log。继续暴露30、60、120、240min并不进一步减少存活的细菌数。在这种情况下，很明显受试约氏乳杆菌菌株对低pH非常稳定。该发现已经更早在约氏乳杆菌La1(NCC533)中观察到。
表2所有22种研究的菌株对模拟胃液的抗性。
发现突出显示的菌株在pH 2.0时不稳定，认为它们是快速裂解并在胃中靶向释放期望化合物的好的备选者。
在表3中概述了胆汁盐中的实验结果。菌株在该对胆汁盐的挑战试验中的行为明显不同所有Lb.rhamnosus/casei分离株通常对不同浓度胆汁盐相当稳定。0.1％的浓度最大减少细菌数0.6log。浓度升高到0.2％导致的损失在0.5和0.9log之间。在0.3％Oxgall，减少通常在1log(+/-0.2logs)的范围内，而0.4％的胆酸盐浓度导致细菌在暴露17小时后存活细菌减少1.0到1.7log，这取决于研究的菌株。鼠李乳杆菌Ls 8(＝Lb.GG)对胆汁盐相当稳定，总损失仅是1log，这是非常重要的。
表3对不同浓度Oxgall的抗性。
所有细菌菌株以1％接种于MRS并在37℃或30℃生长16h。
突出显示的菌株对各种浓度胆汁盐不稳定，是快速裂解并在肠道的位置处靶向释放的良好备选者。
应该理解，技术人员可以检查其他菌株在胃肠道的特定位置裂解的能力，这可通过将这些菌株置于上面详述的环境或其他环境中，这些环境反应了消化道中的环境。
权利要求
1.微生物在递送对宿主有益的物质到胃肠道的特定部分的用途，其中该微生物处于在消化道的预定位置释放所述物质的状况下。
2.根据权利要求1的用途，其中的微生物对胃肠道的特定部分的环境条件敏感，它将化合物递送到该特定部分。
3.根据权利要求2的用途，其中的微生物已经被预处理从而其停止抵抗胃肠道的特定部分的特定环境条件，它将化合物递送到该特定部分。
4.根据权利要求3的用途，其中的微生物已经被预处理，预处理方法为暴露于热、冷、不同pH值、噬菌体，用蛋白、碳水化合物、脂肪或任何其他有机和无机物质包囊、置于特定发酵条件或引发细菌SOS应答或者使内在的保护性胁迫应答系统失活，该系统在调节或基因表达水平上修复受损的胞内蛋白。
5.根据前面任一项权利要求的用途，其中微生物选自乳酸菌属(Lactobacilli)、双歧杆菌属(Bifidobacteria)、链球菌属(Streptococci)、片球菌属(Pediococci)，肠球菌属(Enterococci)、乳球菌属(Lactococci)、酒球菌属(Oenococci)、葡萄球菌属(Staphylococci)、拟杆菌属(Bacteroide)或它们的混合物。
6.根据前面任一项权利要求的用途，其中微生物为一种益生菌。
7.根据前面任一项权利要求的用途，其中微生物为修饰的微生物，其携带一种或多种产生至少一种对宿主有益的物质的基因。
8.根据权利要求7的用途，其中产生至少一种对宿主有益的物质的一种或多种基因被修饰从而其表达更高，或者其中一种或多种基因从外源被导入所述微生物中。
9.根据前面任一项权利要求的用途，其中微生物停止在胃、十二指肠、空肠、回肠或结肠中生长。
10.根据前面任一项权利要求的用途，其中所要递送的物质选自肽、胨、蛋白质、单糖、二糖、糖复合物或脂肪。
11.含有用于将对宿主有益的物质递送到宿主的胃肠道的特定部分的微生物的可摄入产品。
12.根据权利要求11的可摄入产品，其是药用产品、盖仑产品或食品。
13.根据权利要求12的产品，其选自奶、酸奶、凝乳、干酪、发酵奶、奶基的发酵制品、冰淇淋、发酵谷类基的制品、奶粉、婴儿制品、宠物食物、片剂、液体细菌混浮剂、干燥口服补充物、湿润口服补充物、干燥管饲品或湿润管饲品。
14.一种制备根据权利要求11到13中任何一项的可摄入产品的方法，其包括提供一种含有对宿主有益的物质的微生物，任选预处理所述微生物，预处理方式确保该微生物将目标物质递送到消化道的所选部分，还包括将所述微生物置于合适的载体中。
15.能够递送对宿主有益的物质到其胃肠道特定部分的微生物的用途，用于支持摄入所述微生物的个体的健康和/或治疗和/或预防疾病。
全文摘要
本发明涉及微生物、尤其是乳酸细菌如乳杆菌和双歧杆菌的用途，用于递送对接受者有益的物质到达其胃肠道的特定部分。本发明尤其涉及一种含有具有这些性质的微生物的可摄入载体及其用途，用于维持个体的健康或者治疗和/或预防疾病。
文档编号A61P43/00GK1599626SQ02824016
公开日2005年3月23日 申请日期2002年11月25日 优先权日2001年12月11日
发明者I·克尔塞西·托雷, B·杰曼, R·D·普里德莫尔, R·雷涅罗, R·青克 申请人:雀巢产品有限公司