专利名称：来自芳族新陈代谢/i的物质的微生物制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物制备物质的方法，所述物质特别是按照权利要求1-23、36和37的芳族氨基酸，涉及按照权利要求24-29的基因结构，和涉及按照权利要求30-35的转化细胞。
由于例如对氨基酸的需求持续增加，故微生物制备诸如精细化学药品的物质，特别是芳族氨基酸，有巨大的经济利益。因此，例如用L-苯丙氨酸制备药物，具体地说，也用于制备增甜剂天冬苯丙二肽酯(α-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯)。需要L-色氨酸作为药物和作为动物饲料的添加剂；对于L-酪氨酸，也同样有作为药物的需要，并也有作为制药工业中的原料的需要。除了从天然材料中分离，生物技术制备也是在经济许可的情况下获得希望的光学活性形式的氨基酸的很重要的方法。或者使用酶，或者使用微生物实现生物技术制备。后一种微生物制备享有以下优点即可以使用简单和价廉的原料。虽然以各种各样的方式控制在细胞中生物合成氨基酸，但是，人们已经进行大量尝试，以增加产物生成。因此，例如为了切断生物合成的调节，使用氨基酸类似物。例如，根据对苯丙氨酸类似物(GB-2,053,906)的抗性通过选择获得允许L-苯丙氨酸生产增加的大肠杆菌(E.coli)的突变体。相似的策略也产生棒状杆菌属(Corynebacterium)(JP-19037/1976和JP-39517/1978)和芽孢杆菌属(Bacillus)(EP-0,138,526)的过量生产菌株。而且，已知使用重组DNA技术构建的微生物，在所述微生物中同样消除了生物合成的调节，具有克隆并表达的编码不再受反馈抑制的关键酶的基因。作为原型，EP-0,077,196描述了一种生产芳族氨基酸的方法，其中在大肠杆菌中过量表达不再受反馈抑制的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸(arabinoheptulosonate)-7-磷酸合酶(DAHP合酶)。EP-0,145,156描述了一种大肠杆菌菌株，其中为了生产L-苯丙氨酸，另外过量表达分支酸变位酶/预苯酚盐脱水酶。
上述策略共有的特征是用于提高产量的干涉只限于对芳族氨基酸特有的生物合成途径。然而，为了更进一步增加产量，必需努力提高生产芳族氨基酸所需的初级代谢物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和赤藓糖4-磷酸(Ery4P)的供给。
PEP是糖酵解产物丙酮酸的活化前体；Ery4P是戊糖磷酸途径的中间体。
已进行不同的尝试以使初级代谢物Ery4P的供给获得明确的增加。在大肠杆菌中通过关闭磷酸葡糖异构酶，使通过戊糖磷酸途径的碳流增加；这导致色氨酸生成(Mascarenhas D.等，Appl.Environ.微生物57(1991)2995-99)。US-A-5,168,056公开了利用重组DNA技术使转酮酶过量表达，这使获得Ery4P的供给增加成为可能，从而增加了作为产物的L-色氨酸、L-酪氨酸或L-苯丙氨酸的生成。Draths K.M.等(J.Am.Chem.Soc.114(1992)3956-62)和Flores N.等(Nat.Biotechnol.14(1996)620-3)都证实了相同的结果。然而，如Feldmann指出，在没有转醛酶活性的活动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)菌株中仅仅增加转酮酶活性，导致在细胞中戊糖磷酸途径代谢物富集，并因此对细胞生长有负面影响(Feldmann S.D.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，38(1992)354-61)。该生理效应可能是由于细胞内景天庚酮糖-7-磷酸浓度过量造成的。本发明人也发现在大肠杆菌tal+菌株中由于转酮酶过量表达造成的相应的生物质生长抑制。
所以本发明的目的是使得生产物质、特别是生产芳族氨基酸的的可选方法可利用，该方法的区别在于，增加细胞内这些物质合成的代谢物中间体的供给，而没有由于只增加转酮酶的活性造成的上述方法缺点。
令人惊讶的是，按照本发明，通过利用微生物制备物质的方法达到了该目的，在所述方法中，由于在该微生物中磷酸烯醇丙酮酸(PEP)依赖性糖吸收系统活性存在、降低或消失，增加生产这些物质的微生物中的转醛酶活性。
该结果特别令人惊讶之处在于，转醛酶在微生物生长和在其生产这些物质时起重要作用决不是不证自明的。这特别适用于在己糖上生长的情况。因此，例如已知的酵母菌株，尽管在转醛酶基因中有突变，但仍然能够在葡萄糖中生长(Schaaff L.等，Eur.J.Biochem.188(1990)597-693)。所以，转醛酶对细胞生长应该没有施加任何实质影响。这有下述事实支持，即在没有转醛酶的情况下，也已知细菌物种能够生长(Feldmann S.D.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.38(1992)354-62)。
另外，与木糖和其它戊糖相比，诸如葡萄糖的己糖也可以通过与戊糖代谢途径不同的降解途径代谢。所以转醛酶在葡萄糖降解上起实质作用决不是不证自明的。
也可以注意到，在玻璃试管内，在转醛酶活性增加的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞的提取物中检测作为戊糖磷酸途径的酶流的增加(Senac T.等，Appl.Environ.Microbiol.57(1991)1701-6)。然而，在该研究中选择的实验条件不允许任何对出现在活微生物中、特别是细菌中天然的代谢生理学现象结果的转移。另外，可以注意到Liao J.C.等(Biotechn.Bioeng.52(1996)129-140)指出，当转醛酶和AroG的活性同时增加时，DAHP生成增加。该结果主要是由于AroG活性增加造成的。像由于转醛酶活性增加，物质产量增加这样的，没有公开或表明。所以一点也不希望在微生物中转醛酶活性增加和用于提高物质产量的Ery4P的供给之间有因果关系。根据本发明增加转醛酶活性(过量表达)使得可获得一种可选的方法，以实现通过戊糖磷酸途径的碳流的增加，并因此实现了所述初级代谢物Ery4P供给的增加。所以Ery4P的增加量可用于下述物质的微生物合成，在所述物质合成中，至少涉及一个戊糖磷酸途径的中间体，具体地说是Ery4P。本发明人已指出，Ery4P的利用率增加，既可以在PEP依赖性糖吸收系统的活性存在或减少的微生物中产生，也可以在不存在这样的活性的微生物中产生。因此，按照本发明不但可以使用仍然具有活性磷酸转移酶系统(PTS)或活性降低的磷酸转移酶系统(pts+菌株)的生物，而且可以使用关闭PTS的生物(pts-菌株)。
按照本发明的定义，物质可以理解为例如精细化学药品，诸如芳族氨基酸、靛蓝、吲哚乙酸、己二酸、黑色素、醌和苯甲酸，也包括它们的潜在衍生物和次级产物，或者在一般意义上说，为戊糖磷酸途径的中间体的次级产物。然而，这也应当包括供给4-磷酸赤藓糖促进其生物化学合成的所有化合物，例如吡哆醇及其衍生物。在本发明范围内，也认为所有这些物质是来自芳族新陈代谢的物质。可以注意到在该范围内，除用于制备靛蓝、己二酸和其它非天然次级产物的新干涉之外，还需要对产生该物质的微生物做进一步的遗传改变。按照本发明的方法特别适合于用微生物制备物质，所述微生物在增加所述转醛酶活性之前，没有从预先含有磷酸转移酶系统(pts+菌株)的菌株作为磷酸转移酶系统关闭(pts-菌株)的菌株进行选择。在这方面可以注意到，未预先公开的专利说明书WO-96/34961描述了这样一个从先前的pts+菌株中的选择，但是在该研究中，该选择在增加转酮酶和转醛酶活性之前。
关于增加转醛酶活性，提供的优选是增加大肠杆菌转醛酶活性，特别是增加大肠杆菌转醛酶B(TalB)活性。当使用相应的talB基因时，该基因优选来源于大肠杆菌K12或由其衍生的菌株。然而，除此之外，任何其基因产物催化下述反应的基因也是合适的，所述反应相当于转醛酶催化的由7-磷酸景天庚酮糖加3-磷酸甘油醛向Ery4P和果糖-6-磷酸的转化的反应。
在本发明特别优选的实施方案中，除了增加转醛酶活性，也增加转酮酶活性。在存在戊糖的情况下，转酮酶基因自身的表达导致在戊糖磷酸途径中累积代谢物(Feldmann S.D.，Appl.Microbiol.Biotechnol.，38(1992)354-61)。这对所述细胞有有害作用，特别是对以递减速率生长的转化细胞有有害作用。在葡萄糖中生长并显示转酮酶活性增加的大肠杆菌菌株中，本发明人也观察到同样的效果。然而，现在发现在增加转醛酶活性的同时增加转酮酶活性，对提供Ery4P很有利，也没有显示出仅过量表达转酮酶的负面影响。由于增加转醛酶活性，所以增加转酮酶活性时发生的戊糖磷酸途径代谢物的累积不能实现，其结果是对细胞生长的损害不仅停止，而且转变成生长增加。因此，结果是特别是在转醛酶活性增加的菌株中按照本发明增加转酮酶活性，是明智的方法。
关于增加转酮酶活性，优选增加大肠杆菌转酮酶活性，特别是增加大肠杆菌转酮酶A(TktA)活性。当使用相应的tktA基因时，该基因优选来源于大肠杆菌K12或由其衍生的菌株。然而，除此而外，任何其基因产物催化下述反应的基因也是合适的，所述反应对应于转酮酶催化的由5-磷酸核糖加5-磷酸木酮糖向7-磷酸景天庚酮糖加3-磷酸甘油醛转化，或者由5-磷酸木酮糖加Ery4P向6-磷酸果糖加3-磷酸甘油醛转化的反应。
在本发明另一个特别优选的实施方案中，除了增加转醛酶活性或增加转醛酶和转酮酶的活性，也增加用于PEP不依赖性糖吸收的转运蛋白的活性和/或使相应的糖磷酸化的激酶的活性。在转运蛋白的情况下，将该蛋白的活性理解为是蛋白介导吸收速率。额外增加后面这些蛋白(即转运蛋白和所述激酶)中一种或这两种的活性，由于增加PEP的提供量，用于同Ery4P缩合，以形成生物合成芳族化合物(即脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶(DAHP))的通用途径的初级代谢物，使得获得甚至更高的物质(特别是芳族氨基酸)的产量成为可能。
使用易化蛋白(facilitator)作为PEP不依赖性糖吸收的转运蛋白是合理的，易化蛋白是按照蛋白介导的易化扩散的原理起作用的转运蛋白。特别是，使用来自活动发酵单胞菌的葡糖易化蛋白(Glf)是合适的。当使用后者时，从例如活动发酵单胞菌ATCC 10988、ATCC29191或ATCC 31821中获得蛋白编码基因glf。然而，下述其它细菌糖转运蛋白基因也适合于新方法，所述转运蛋白基因的基因产物转运例如葡萄糖、果糖或蔗糖，并在这样做时不使用任何PEP，例如来自大肠杆菌的GalP系统。一般也可以使用来自诸如酿酒酵母、(pichiastipitis)或克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)的真核微生物的糖转运系统的基因(诸如HXT1至HXT7)或来自其它生物的糖转运基因，只要这些基因在所述微生物中以功能方式表达，以及所述基因产物可以在前后序列中起作用，而不使用PEP转运糖。在氨基酸生产微生物(氨基酸生产者)中表达糖转运基因可能特别合理。
所以，在按照所述新方法制备芳族氨基酸时，使用由活动发酵单胞菌ATCC 31821分离的易化基因glf吸收诸如葡萄糖、果糖或甘露糖是特别合适的。(Parker C.等，Mol.Microbiol.15(1995)795-802；Weisser P.等，J.Bacteriol.177(1995)3351-4)。按照本发明的方法特别适用于用微生物制备芳族氨基酸，在所述微生物中，PTS系统的活性降低或完全没有。在这种情况下，不但在增加转醛酶活性之前，而且在此之后，可以降低或关闭PTS系统。
特别是，为了避免由于膜蛋白的过量表达产生的对细胞的有害影响，应当优选将glf基因以低基因拷贝数插入。因此例如对于glf基因，优选的基因拷贝数是2-5。将glf基因插入到ptsHI-crr操纵子基因中，例如插入到ptsI基因中是特别有利的。
当使用糖磷酸化激酶时，使用优选的激酶己糖磷酸化激酶，特别是来自活动发酵单胞菌的葡糖激酶是合适的。当使用后者时，该蛋白编码基因glk得自例如活动发酵单胞菌ATCC 10988、ATCC 29191或ATCC 31821。来自细菌的己糖-磷酸化激酶的其它基因也适用于新方法，所述基因的基因产物(诸如果糖激酶或甘露糖激酶)在消耗ATP的同时使己糖磷酸化。此外，例如来自诸如酿酒酵母的真核微生物的激酶的基因，或以一般方式来自其它生物的糖磷酸化激酶的基因也是合适的，只要它们可以在所述微生物(具体地说是在氨基酸生产者中)可以以功能方式表达，并在不使用PEP使所述糖磷酸化时所述基因可以起作用。使葡萄糖磷酸化的葡糖激酶基因glk特别适合于按照所述新方法制备芳族氨基酸，所述基因从活动发酵单胞菌ATCC 29191中分离。
在增加朝向Ery4P的物质流的微生物中可以限制用于生产芳族氨基酸代谢物的第一个中间体的PEP的利用率。在这些情况下，减少或完全关闭在所述新陈代谢中的其它PEP消耗反应是有利的，所述反应诸如PEP糖磷酸转移酶系统(PTS)的反应，如果存在该系统，则其催化PEP依赖性糖吸收。按照本发明，仍然具有活性PTS基因的微生物(pts+菌株)和pts的活性降低(在本例中也认为是pts+)或所述pts关闭(pts-菌株)的pts突变体都可以用于进一步改进所述方法？。或者可以在酶水平上实现这种性质的减少，或者通过使用遗传方法实现这种性质的减少，例如将glf和/或glk基因插入到染色体中，特别是插入到ptsI基因的基因座中，该方法同时在所述染色体中使重组DNA稳定(分离稳定性)，并因此意味着无需使用载体。本发明人的经验表明，在增加所述转醛酶活性之前，优选不应发生所述PTS活性的降低或消除。
按照本发明的定义，可以将对增加活性的措施理解为适用于对增加所述转醛酶、所述转酮酶、所述转运蛋白和所述激酶的活性的所有措施。下述措施尤其适用于该目的-引入基因，例如使用载体或温和噬菌体；-增加基因拷贝数，例如为了将按照本发明的基因以增加的拷贝数引入到所述微生物中，使用质粒，所述增加的拷贝数是稍微(例如2-5次)增加的拷贝数至大幅(例如15-50次)增加的拷贝数；-增加基因表达，例如通过提高转录速率，例如通过使用诸如Ptac、Ptet或其它调节核苷酸序列的启动子元件，和/或通过提高翻译速率，例如通过使用共有核糖体结合位点；-增加现存酶的内源活性，例如利用通过常规方法(例如使用紫外照射或激发突变的化学药品)以随机方式产生的突变，或者利用诸如缺失、插入和/或核苷酸交换的突变，所述突变是用遗传工程方法以特异性方式产生；-通过改变酶的结构增加酶的活性，例如利用使用物理、化学或分子生物学或其它微生物学方法的诱变；-用去调节的酶，例如不再受反馈抑制的酶；-引入相应的编码所述去调节酶的基因。
也可以使用上述方法和其它类似方法的组合增加所述活性。例如通过使用上述方法克隆所述基因，或者例如通过选择显示增加底物转运的突变体，可以增加转运蛋白的内源或引入的活性。
最好是通过将所述一种或多种基因整合到一个或几个基因结构中，并将一种或多种基因的每一个以单拷贝或以增加的拷贝数引入到所述基因结构中。按照本发明的定义，可以将基因结构理解为一个基因或具有按照本发明的基因的任何其它核苷酸序列。合适的核苷酸序列可以是，例如质粒、载体、染色体、噬菌体或不是环状闭合的其它核苷酸序列。
按照本发明定义的染色体是已插入至少一个按照本发明的基因的染色体，产生的核酸序列带有至少一个基因或比该染色体中天然含有的拷贝多一个基因拷贝。另一方面，例如在基因基因座内的同源重组产生不必与天然形式不同的染色体。所以，如果不超过同源基因的自然数目，就认为通过同源重组制备的染色体与本发明不一致。
按照本发明的定义，也将基因结构理解为诸如载体、染色体和温和噬菌体的上述基因载体的组合，在所述基因载体上分布按照本发明的基因。例如，可以用载体将两个tal基因引入到所述细胞中，或可以将两个tal基因插入到染色体中。另外，例如可以用噬菌体将另一个基因引入到所述细胞中。这同样适用于按照本发明的其它基因。这些例子不是将其它基因分布组合排除在本发明之外。在任何情况下，包含在按照本发明的微生物中的基因数超过相应基因的天然数目是决定性的。例如，为了实现按照本发明的活性的增加，最好glf基因数增加2-5倍。在这些浓度下没有出现细胞毒性作用。然而，也可以设想将按照本发明的基因以最高达50个基因拷贝的更高拷贝数的具有同样作用的形式引入到所述微生物中。
在所述生产物质的新方法中，优选使用另外参与合成所述物质的一种或多种酶被去调节和/或活性增加的微生物。
这些酶特别是芳族氨基酸新陈代谢的酶，尤其是DAHP合酶、莽草激酶和分支酸变位酶/预苯酚盐脱水酶，也是参与合成芳族新陈代谢中间体及其次级产物的所有其它酶。
除了按照本发明的酶，特别是去调节和过量表达DAHP合酶对制备诸如己二酸、胆汁酸和苯醌化合物以及它们的衍生物的物质很重要。另外，为了实现超高水平合成例如色氨酸、酪氨酸、靛蓝以及羟基苯甲酸和氨基苯甲酸和萘醌和蒽醌和它们次级产物的衍生物，应当去调节莽草激酶，并增加其活性。去调节和过量表达的分支酸变位酶/预苯酚盐脱水酶对有效生产苯丙氨酸和苯丙酮酸以及它们的衍生物也额外或特别重要。然而，这也将包括其酶活性有助于下述物质生物化学合成的所有其它酶，所述物质是通过供给4-磷酸赤藓糖增加其产量的化合物，例如吡哆醇及其衍生物。可以注意到除了新干涉之外，为了制备靛蓝、己二酸和其它非天然次级产物，需要对产生物质的微生物做进一步遗传改变。
具体而言，所述新方法特别适用于制备芳族氨基酸，特别是苯丙氨酸。在后一种情况下，最好是增加去调节的DAHP合酶(例如大肠杆菌中的AroF或AroH)和/或同样去调节的分支酸变位酶/预苯酚盐脱水酶(PheA)的基因表达和/或酶活性。
埃希氏菌属(Escherichia)物种，还有沙雷氏菌属(Serratia)、芽孢杆菌属(Corynebacterium)、棒状杆菌属(Brevibacterium)或短颈细菌属的微生物，和由常规氨基酸方法可知的其它菌株，适合用作生产微生物。大肠杆菌特别适合。
本发明的另一个目的是提供合适的基因结构和携带这些结构的转化细胞，这些使得能够以特别成功的方式完成所述方法。在本发明的范围内，现在可以得到新基因结构，所述重组形式的基因结构包括a)编码转醛酶的基因或编码转醛酶的基因和编码转酮酶的基因，以及b)至少一个编码PEP不依赖性糖吸收的转运蛋白、或编码使糖磷酸化的激酶的基因。在这些基因结构中，最好是所述转运蛋白的基因编码易化蛋白，而所述激酶的基因编码己糖-磷酸化激酶。具体而言，所述转醛酶和所述转酮酶的基因得自大肠杆菌，而所述转运蛋白和所述激酶的基因得自活动发酵单胞菌。
下述基因结构特别有利，所述转醛酶的基因是大肠杆菌talB，所述转酮酶的基因是大肠杆菌tktA，而所述转运蛋白的基因是活动发酵单胞菌glf，所述激酶的基因是活动发酵单胞菌glk。
分离合适的基因，并按照通用的方法转化所述细胞来自大肠杆菌K12的talB和tktA的完整的核苷酸序列是已知(Yura T.等，Nucl.Acid Res.20(1992)3305-8；Sprenger G.A.，Biochim.Biophys.Acta 1216(1993)307-10；Sprenger G.A.等，J.Bacteriol.177(1995)5930-9)，并储存在诸如Heidelberg中的EMBL的数据库中。当克隆大肠杆菌talB基因时，聚合酶链式反应(PCR)方法适用于例如用大肠杆菌K12菌株的染色体DNA特异性扩增所述基因(Sprenger G.A.等，J.Bacteriol.177(1995)5930-9)。例如，当克隆大肠杆菌tktA基因时，转酮酶缺陷型突变体的同源互补是适合的(SprengerG.A.，Bisswanger H.等，Biochemistry and physiology ofthiamine diphosphate enzymes，VCH(1991)322-6)。
例如，当克隆活动发酵单胞菌转运基因glf或活动发酵单胞菌葡糖激酶基因glk时，PCR例如适于用活动发酵单胞菌菌株ATCC 29191或ATCC 31821的染色体DNA特异性扩增所述基因，PTS功能有缺陷并因此例如不能转运葡萄糖的大肠杆菌突变体的异源互补也是合适的(Snoep J.L.等，J.Bacteriol.174(1994)1707-8；Parker C.等，Mol.Microbiol.15(1995)795-82；Weisser P.等，J.Bacteriol.177(1995)3351-4)。在分离所述基因并在体外将其同已知低拷贝数的载体(诸如pACYC184、pACYC177、pSC101或pZY507(Weisser P.等，J.Bacteriol.177(1995)3351-4))重组后，使用化学方法、电穿孔、接合或转导来转化所述宿主细胞。
可以将分离的转醛酶基因与在本发明正文所述内的一个或多个基因，以任何组合一起整合到一个或几个基因结构内。不考虑对基因结构的精确定位，这产生了诸如talB、talB+tktA、talB+glf、talB+glk、talB+glf+glk、talB+tktA+glf、talB+tktA+glk或talB+tktA+glf+glk的组合。
包括至少一个分配给所述基因之一的调节基因序列的基因结构是有利的。因此，最好可以在转录水平上，特别是通过强化转录信号实现调节元件的强化。这可以例如通过提高一个或多个启动子的活性而实现，而提高一个或多个启动子的活性通过改变位于结构基因上游的启动子序列，或通过用更有效的启动子完全替换所述启动子而实现。也可以通过在分配给所述基因的调节基因上施加合适的影响强化转录；然而，除此之外，例如通过提高信使RNA(mRNA)的稳定性，也可能强化翻译。
最合适的基因结构是那些基因结构，在这些基因结构中插入至少一个所述基因，以使所述基因处于诱导型启动子控制之下。当在按照本发明的基因结构上布置所述基因时，启动子可以位于基因上游，或作为共用启动子在几个基因的上游定位，或者可以使用两个方向相反的启动子，在这两个启动子之间布置所述基因，使得以相反的方向读取所述基因。在该前后序列中，例如可以将glf基因定位于相对较弱的启动子(例如Ptet)的下游，而其它基因可以处于tac启动子控制之下。可以将一个或多个DNA序列定位于包含在基因结构中的所述基因的上游和/或下游，所述基因有或没有上游启动子，或有或没有分配的调节基因。通过使用诱导型启动子元件，例如lacl/Ptac，例如通过加入诸如异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的化学诱导剂，可能开通新功能(诱导酶合成)。
通过提供带有可复制形式的本发明基因结构的转化细胞也可以达到本发明的目的。
按照本发明的定义，将转化细胞理解为具有按照本发明的基因结构的任何微生物，所述基因结构在所述细胞中引起物质生成增加。利用化学方法(Hanahan D.，J.Mol.Biol.166(1983)557-580)，也可以利用电穿孔、接合或转导转化所述宿主细胞。
对于所述转化，最好使用另外参与所述物质合成的一个或多个酶去调节和/或活性增加的宿主细胞。用包含所述相关基因的基因结构转化生产芳族氨基酸或按照本发明的另一物质的微生物菌株，特别是大肠杆菌。对于用所述基因结构转化，最好是使用PEP依赖性糖吸收系统的活性(如果存在)降低或消除的宿主细胞。
具体而言，提供能够生产芳族氨基酸的转化细胞，芳族氨基酸优选是L-苯丙氨酸。
使用所述新方法和按照本发明的内容转化的微生物，可以用范围广泛的底物生产物质。在本发明所述范围内，因此也提供微生物制备物质的方法，在所述方法中，培养按照本发明转化的细胞，在所述细胞中存在一个基因结构，所述基因结构包含至少一个分配给一个所述基因中的调节基因系列，并在至少两次细胞分裂后(指数生长期的开始)，在所述微生物中诱导酶的合成。因此，所述微生物的生产的增加可以独立于其生长。
在所述新方法的特别优选的实施方案中，使用下述转化细胞，除了戊糖磷酸途径的中间体以外，所述转化细胞也含有利用率增加的中心新陈代谢的其它代谢物。这些代谢物包括，例如来自糖酵解或葡糖异生作用的丙酮酸，或来自柠檬酸循环的草酰乙酸。此外，可以利用相关的化合物或其前体以通过喂养使细胞生长，所述化合物是丙酮酸前体或柠檬酸循环代谢物的前体，诸如延胡索酸或苹果酸。
下文通过一些实行实施例更加详细地解释了本发明。下述菌种根据布达佩斯条约的条款，保藏在德意志微生物保藏中心(DSM)DSM11210大肠杆菌AT2471/pZYTT7talDSM11209大肠杆菌AT2471/pZY557tkttalDSM11206大肠杆菌AT2471GP704glfint PTS+DSM11205大肠杆菌AT2471glfint PTS-使用的宿主细胞，即AT2471，已由Taylor和Trotter(Bacteriol.Rev.13(1967)332-353)保藏于CGSC中，保藏号为4510，并可免费得到。
在表1中详细描述了本专利申请范围内使用的所有微生物的特征和出处。
接下来的正文将表明使用的材料和方法，并以实验实施例和比较实施例支持本发明一般方法在所述遗传研究中，除非另有说明，否则一般在由Difco细菌培养用胰蛋白胨(10g/l)、Difco酵母提取物(5g/l)和NaCl(10g/l)组成的LB培养基中培养大肠杆菌菌种。根据所使用的菌种的抗性特性，如果必要，向所述培养基中加入羧苄青霉素(20-100mg/l)和/或氯霉素(17-34mg/l)。为此，首先将羧苄青霉素全部溶解在水中，将氯霉素溶解在乙醇中，在过滤除菌后，将所述溶液加入到预先高压灭菌的培养基中。向所述LB培养基中加入Difco细菌培养用琼脂(1.5％)，以制备琼脂平板。使用市售的系统(Quiagen，Hilden)通过碱裂解法从大肠杆菌中分离质粒DNA。如Chen和Kuo所述(Nucl.AcidRes.21(1993)2260)从大肠杆菌和活动发酵单胞菌中分离染色体DNA。
按照生产商的说明(Boehringer，Mannheim，德国或Promega，Heidelberg，德国)使用限制酶、DNA聚合酶I、碱性磷酸酶、RNA酶和T4 DNA连接酶。对于限制性分析，在琼脂糖凝胶(0.8％)中分离DNA片段，并使用市售的系统(Jetsorb Genomed，Bad Oeynhausen，德国)通过提取从所述琼脂糖中分离DNA片段。
对于DNA分析，用限制酶消化染色体DNA(10μg)，通过凝胶电泳按大小对染色体DNA分级分离，并通过真空介导的扩散(VacuGene系统，Pharmacia，弗雷堡，德国)将其转移到尼龙膜(Nytran 13，Schleicher and Schuell，Dassel，德国)上。分离合适的DNA片段，以洋地黄毒苷-DUTP对其标记，并将其用做探针。通过市售的标记探测系统(Boehringer，Mannheim，德国)进行标记、杂交、清洗步骤和探测。
对于转化，在LB培养基中(5ml试管)于37℃和200rpm培养所述细胞2.5-3小时。在光密度(620nm)大约为0.4时，将所述细胞离心下来，并将其悬浮于十分之一体积的TSS(含有10％(w/v)PEG 8000、5％(v/v)DMSO和50mM MgCl2的LB培养基)中。于4℃同0.1-100ng的DNA温育30分钟后，接着于37℃温育1小时后，在包含合适抗生素的LB培养基上将所述细胞铺平板。实施例1制备pZY557tal、pBM20tal和pZY557tkttal，作为以质粒为基础的按照本发明的基因结构的原型和制备pZY557tat用限制酶BamHI和HindIII打开质粒pZY507(Weisser等，1995 J.Bacteriol 1773351-3345)，并分离较大的片段(10.1KB的DNA)。用BamHI和HindIII从载体pUCBM20(Boehringer Mannheim，德国)切下一部分多克隆位点，并将其同大pZY507 BamHI/HindIII片段连接在一起，这产生载体pZY557，除了其它限制性切割位点之外，载体pZY557同载体pZY507相似。通过PCR由载体pGSJ451(Sprenger G.A.等，J.Bacteriol.177(1995)5930-36)扩增talB基因。为此，使用寡核苷酸I5′CCGCATGCTGTTTAAAGAGAAATA3′(此处带有下划线的碱基对对应于Sprenger G.A.等，J.Bacteriol.177(1995)5930-6所述talB序列的84至101碱基对)，所述寡核苷酸I具有限制酶SphI的切割位点，并使用市售的M13/pUC测序引物(Boehringer Mannheim，德国，第1010093号)作为寡核苷酸II。产生的扩增DNA片段在每个末端包含一个SphI的切割位点，并用限制酶SphI切割。然后将该片段分别同载体pZY557和pUCBM20连接在一起，所述载体也已用SphI线性化。在用两种连接溶液转化大肠杆菌并克隆所述转化体后，分别获得重组质粒pZY557tal和pBM20tal。通过PCR由载体pGSJ427(Sprenger G.A.等，Eur.J.Biochem.230(1995)525-32)扩增tktA基因，所述基因在5′末端插入限制酶NotI的切割位点和在3′末端插入SphI酶的切割位点。在此情况下，使用寡核苷酸III5′TTAGCGGCCGCCCTTCATCATCCGATCT3′(此处带有下划线的碱基对对应于Sprenger G.A.，Biochim.Biophys.Acta.1216(1993)307-10所述tktA序列的126至146碱基对)，所述寡核苷酸III具有限制酶NotI的切割位点，和使用寡核苷酸IV5′ATAGCATGCTAATTACAGCAGTTC3′(此处带有下划线的碱基对对应于Sprenger G.A.，Biochim.Biophys.Acta.1216(1993)307-10所述tktA序列的2018至2036碱基对)，所述寡核苷酸IV具有SphI的切割位点。用NotI和SphI切割所得的PCR片段，并将其连接入以同样方式处理的载体pZY557tkt，这产生载体pZY557tkt。然后用SphI打开pZY557tkt，并将其同包含talB的SphI-切割PCR片段连接在一起。在转化大肠杆菌并克隆所述转化体之后(参见上文)，获得包含tktA基因和talB基因的质粒，所述tktA基因和talB基因在tac启动子的下游以相同的方向定位，并因此作为基因结构pZY557tkttal使用。
将产生的转化体以甘油培养物(30％)的形式于-80℃在LB培养基中储存。在需要时，使用前直接融化所述甘油培养物。实施例2增加转醛酶活性对也增加转酮酶活性的菌株生长的影响在无机培养基中研究大肠杆菌菌株AT2471、AT2471/pZY557tkt、AT2471/pZY557tal和AT2471/pZY557tkttal在葡萄糖上的生长。所述无机培养基包括柠檬酸钠·3H2O(1.0g/l)、MgSO4·7H2O(0.3g/l)、KH2PO4(3.0g/l)、K2HPO4(12.0g/l)、NaCl(0.1g/l)、(NH4)2SO4(5.0g/l)、CaCl2·2H2O(15.0mg/l)、FeSO4·7H2O(0.75g/l)和L-酪氨酸(0.04g/l)。以微量元素溶液(1ml/l)的形式加入另外的无机物，所述溶液由Al2(SO4)3·18H2O(2.0g/l)、CoSO4·6H2O(0.7g/l)、CuSO4·5H2O(2.5g/l)、H3BO3(0.5g/l)、MnCl2·4H2O(20.0g/l)、Na2MoO4·2H2O(3.0g/l)、NiSO4·3H2O(2.0g/l)和ZnSO4·7H2O(15.0g/l)组成。在水中溶解维生素B1(5.0mg/l)，并通过过滤除菌后，将其加入到已高压灭菌的培养基中，也加入羧苄青霉素和/或羧苄青霉素和氯霉素作为需要的arose。单独将葡萄糖(30g/l)高压灭菌，也将其加入到已高压灭菌的培养基中。
对于所述实验，以2ml甘油培养物接种摇瓶(1000ml，包含100ml无机培养基)，并于37℃和150rpm在定轨摇床中培养72小时。在光密度(620nm)达到约等于1后，通过加入15-100um IPTG诱导所述细胞。直到此时以固定的间隔检测所述培养物的光密度。在上述条件下，宿主生物大肠杆菌AT2471的光密度在7.25小时后达到1.2。在突变体AT2471/pZY557tkt中增加所述转酮酶活性导致生长速率明显降低；该菌株在7.25小时后光密度只达到0.49，而其在实验开始时和大肠杆菌AT2471具有相同的光密度。生长抑制效应可能是因为合成抑制浓度的戊糖磷酸途径的代谢中间体造成的。
在突变体AT2471/pZY557tal中增加所述转醛酶活性也导致生长速率明显降低(几乎和在转酮酶情况下一样明显)；在7.25小时后光密度达到0.52。除了增加转酮酶活性，还增加转醛酶活性，在7.25小时后光密度可能达到1.1，这在大肠杆菌AT2471/pZY557tkttal中实现。该结果使下述事实变得清楚了，即在转酮酶活性增加的菌株中另外增加转醛酶活性，消除了只增加转酮酶活性的负面影响，实质上允许非抑制生长。实施例3测定所述转醛酶的酶活性为了测定所述转醛酶活性，如上所述培养大肠杆菌AT2471、AT2471/pZY507、AT2471/pZY557tal和AT2471/pZY557tkttal细胞，但向所述培养基加入3-(吗啉代)丙磺酸(MPOS，16.7g/l)，而磷酸盐浓度降到在生长实验中使用的磷酸盐浓度的十分之一。为了检查所述细胞的诱导，建立平行的实验混合物，通过在7次细胞分裂(OD≈1)后加入IPTG(20μm)，诱导所述混合物之一。在向相关摇瓶加入诱变剂之前和在诱导后3小时，直接从所有混合物中取出20ml培养液，于4℃以6000g沉淀所述细胞10分钟。
在50mM、pH8.5的甘氨酰甘氨酸缓冲液中洗涤收获的细胞，所述缓冲液包括1mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2和0.5mM二磷酸硫胺素。利用超声处理(装有微端(microtip)的Branson 250超声波仪)，以25％超声处理循环和40瓦强度，对每毫升细胞悬浮液处理4分钟，破碎沉淀中的细胞。在以18,000g于4℃离心30分钟后，使用上清液(粗提物)检测所述转醛酶活性。
使用酶试验测定所述粗提物中的转醛酶活性，所述酶试验与NAD的生成光耦合。为此，在总体积为1ml的包含0.8mM 6-磷酸果糖、4mM 4-磷酸赤藓糖和0.3mM NADH的缓冲液(50mM、pH8.5的甘氨酰甘氨酸、1mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2和0.5mM二磷酸硫胺素)中温育所述粗提物。所得的3-磷酸甘油醛和也加入的丙糖磷酸异构酶(9U)和3-磷酸甘油脱氢酶(3U)反应，生成NAD。在340nm(ε＝6.3×103l/mol.cm)下分光光度监视NADH的OD，1μmol NADH的转化相等于消耗1μmol6果糖-磷酸。将每分钟1μmol NADH的转换定义为1U。
如Bradford所述(Anal.Biochem.72(1976)248-254)，使用市售的着色剂，测定粗提物中的蛋白浓度。使用牛血清白蛋白作为标准。
表2显示了在使用带有质粒pZY557、pZY557tal或pZY557tkttal之一的宿主菌株大肠杆菌AT2471及其突变体时酶检测的结果。在诱导时，发现宿主菌株和所述具有载体pZY557的菌株的转酮酶活性大约为0.65U/毫克蛋白。如大肠杆菌AT2471/pZY557所示，由于生理性生长，该值在3小时内增加到0.8U/毫克蛋白。由于在使用的载体中不存在所述tal基因，因此预期在此实验中进行的诱导将没有任何影响。
在平行的实验混合物中，发现在诱导时，大肠杆菌AT2471/pZY557tal的转酮酶活性分别为0.53和0.61U/毫克蛋白。通过诱导，转醛酶活性值达到1.06U/毫克蛋白，而在没有诱导所述培养物时，转醛酶活性值在3小时时只增加到0.6U/毫克蛋白。在其它实验混合物中，在其它相同的实验中使用大肠杆菌AT2471/pZY557tkttal；在此情况下，转醛酶活性在诱导所述细胞后的前3小时内，由0.8增加至1.16U/毫克蛋白，和对应的使用宿主菌株的实验相比，所述转醛酶活性相当于其一倍。实施例4使用菌株生产物质，所述菌株除了转醛酶活性增加外，还显示转酮酶活性增加使用用于生长实验的培养基检测合成效率。在光密度为1时诱导大肠杆菌AT2471和AT2471/pZY557tkttal的培养物，并将培养周期延长至72小时。24小时和48小时后，检测所述培养物的pH值，如果需要，通过加入KOH(45％)，使其恢复到7.2的起始值。另外，在24、48和72小时后取样(2ml)，检测光密度以及葡萄糖和L-苯丙氨酸的浓度。
通过高压液相层析(HPLC，Hewlett Packard，慕尼黑，德国)和荧光检测(消光335nm，发射570nm)共同测定苯丙氨酸浓度。使用Nucleosil-120-8-C18柱(250×4.6毫米)作为固相；利用梯度洗脱所述柱(洗脱液A90％50mM磷酸，10％甲醇，pH2.5；洗脱液B20％50mM磷酸，80％甲醇，pH2.5；梯度0-8分钟100％A，8-13分钟0％A，13-19分钟100％A)。将洗脱速率设定在1.0ml/分钟；将柱温设定在40℃。在室温下于反应毛细管(14米×0.35毫米)中使用邻苯二醛进行柱后衍生。在所述条件下发现L-苯丙氨酸的保留时间为6.7分钟。
用酶测试条(strip)(Diabur，Boehringer Mannheim，德国)检测葡萄糖浓度，并根据其结果，接着加入2ml浓缩的葡萄糖溶液(500g/l)，确保在实验混合物中葡萄糖限制没有提高。培养48小时后，诱导宿主菌株大肠杆菌AT2471后(苯丙氨酸)指示值达到119；此值是与未诱导的宿主菌株的苯丙氨酸值100相比得出。仅仅将质粒pZY557tkttal引入到所述宿主菌株中，导致甚至在未诱导细胞中，描述苯丙氨酸浓度的该指示值增加到167。如本实验所示，诱导菌株大肠杆菌AT2471/pZY557tkttal导致指示值进一步增加到204。这和诱导的宿主菌株相比，相当于增加71％。
该结果证明了按照本发明、在转醛酶活性已经增加的菌株中又增加转酮酶活性、或在转酮酶活性已经增加的菌株中又增加转醛酶活性的正面效应，所述效应增加了芳族化合物合成。实施例5使用转醛酶活性增加的菌株生产物质在实验中培养突变体大肠杆菌AT2471/pZY557tal，所述实验在其它方面同实施例4所述实验相同。48小时后，诱导所述菌株导致(苯丙氨酸)指示值，与未诱导菌株的苯丙氨酸值100相比，为131。
该结果清楚证明增加转醛酶活性对芳族物质合成施加的正面效应，尤其是在按照本发明的诱导之后。实施例6使用PTS-突变体生产物质，在所述突变体中在引入PEP不依赖性糖吸收系统后，随着转酮酶活性增加，除了转醛酶活性增加，还表达PEP不依赖性糖吸收系统。
如Weisser P.等所述(J.Bacteriol.177(1995)3351-54)，使用PCR(Mullis K.B.等，Meth.Enzymol.155(1987)335-50)获得所述glf基因。可以得到该基因的完整核苷酸序列(Barnell W.O.等，J.Bacteriol. 172(1990)7227-40)。用质粒pZY600作为模板扩增所述glf基因(Weisser P.等，J.Bacteriol.177(1995)3351-54)。
为了将所述glf基因整合到编码大肠杆菌PTS系统元件的基因中，用BglII消化质粒pPTS1(参见表1)，并对其用克列诺片段处理。唯一的切割位点位于ptsI基因中。从质粒pBM20glfglk分离作为BamHI-KpnI片段的glf基因，并同样对其用克列诺片段处理。通过平端连接获得具有与ptsHI基因相同方向的glf的克隆。从所得的质粒pPTSglf中获得具有ptsH基因的3′区和包含整合的glf和crr的ptsI的4.6kb的PstI片段。将该片段连接入载体pGP704的EcoRV切割位点。因为该载体只能在λpir菌株中复制，所以由转化体将所述载体整合到染色体中，如果这些转化体能在羧苄青霉素中生长，则所述转化体不含有该噬菌体。通过DNA印迹分析(Miller V.L.等，J.Bateriol.170(1988)2575-83)检查所述整合。所得的转化体除了包括glf基因，还包括完整的PTS基因。
可以第二次同源交换中重组所述载体部分，导致羧苄青霉素抗性丧失。因为在这种情况下，通过插入glf基因间断pts基因，所以在这些突变体中没有以功能方式表达所述PTS。如下选择所需的PTS-突变体在没有抗生素的LB培养基中传代培养仍然是PTS+的转化突变体几次后，将等分的细胞悬浮液在包含100μg/l磷霉素(phosphomycin)的LB板上倒平板。PTS突变体能够在这些平板上生长。在包含或者磷霉素或者20μg/l的羧苄青霉素的LB平板上将生长的克隆划线接种。从在磷霉素平板上仍显示生长、但在羧苄青霉素平板上不能生长的克隆中分离染色体DNA。通过DNA分析证实了，glf基因整合到编码PTS系统的基因中。以PTS-缺陷的表型鉴别对应的突变体。选择一个克隆作为宿主生物大肠杆菌 AT2471glfintPTS-，并将其用于用质粒pZY557tal(参见上文)的转化。按照实施例4和5所述实验条件，在两个平行混合物中，在每种情况下培养PTS阴性突变体大肠杆菌AT2471glfintPTS-/pZY557tal和对应的宿主菌株AT2471glfintPTS-，并在每种情况下大约7次分裂后，诱导一种混合物的细胞。
所述诱导将所述宿主菌株的合成效率降低到56，所述宿主菌株在没有诱导时最初的指示值是100。通过对比，在转化菌株AT2471glfintPTS-/pZY557tal的培养物中，所述诱导将苯丙氨酸指示值从73增加到103，并因此高于所述宿主菌株的起始值。
该结果证实，仅仅增加转醛酶活性，甚至在那些微生物中对苯丙氨酸合成有正面效应，在所述微生物中PTS系统活性减少，或者该系统完全关闭，同时已将PEP不依赖性糖吸收系统整合到其中。实施例7用PTS-突变体生产物质，在所述突变体中除了增加转醛酶活性，在引入PEP不依赖性糖吸收系统之前，随着转醛酶活性增加，还表达PEP不依赖性糖吸收系统如实施例1所述得到大肠杆菌AT2471/pZY557tal。接着在该菌株中将glf基因整合到编码大肠杆菌PTS系统元件的基因中。如实施例6所述完成该整合。使用实施例4和5所述实验条件，培养这些PTS阴性大肠杆菌AT2471glfintPTS-/pZY557tal突变体。发现衍生突变体的生物合成效率相当于实施例6所述菌株的合成效率。实施例8在发酵容器中使用转醛酶活性增加的菌株和除了其转醛酶活性增加、转酮酶活性也增加的菌株生产物质。
在发酵容器(反应体积15升)中培养突变体大肠杆菌AT2471、大肠杆菌AT2471/pZY557tal和大肠杆菌AT2471/pZY557tkttal。为此，使用两个具有实施例2所述无机培养基(250ml)的摇瓶(2000ml)预培养。在该方法中，降低葡萄糖浓度至5.0g/l。用2ml甘油培养基接种所述摇瓶，并在定轨摇床上于37℃和150rpm培养所述摇瓶，直至光密度(600nm)达到3。
使用所述预培养物接种4.5升生产培养基。所述培养基包括MgSO4·7H2O(0.3g/l)、KH2PO4(3.0g/l)、NaCl(0.1g/l)、(NH4)2SO4(5.0g/l)、CaCl2·2H2O(15.0mg/l)、FeSO4·7H2O(0.75g/l)和L-酪氨酸(0.24g/l)。以微量元素溶液的形式(1.5ml/l)加入另外的无机物，所述溶液由Al2(SO4)3·18H2O(2.0g/l)、CoSO4·6H2O(0.7g/l)、CuSO4·5H2O(2.5g/l)、H3BO3(0.5g/l)、MnCl4·4H2O(20.0g/l)、Na2MoO4·2H2O(3.0g/l)、NiSO4·3H2O(2.0g/l)和ZnSO4·7H2O(15.0g/l)组成。将维生素B1(75.0mg/l)溶解在水中，并在过滤除菌后，将其加入到已高压灭菌的培养基中。单独将葡萄糖(15g/l)高压灭菌，并也将其加入到已高压灭菌的所述培养基中。通过加入NH4OH(25％)，将培养基的pH值控制在7，通过控制搅拌速度、供给的空气体积和发酵容器内压力将氧分压值控制在20％。通过加入葡萄糖溶液(700g/l)，将培养基中的葡萄糖浓度值控制在5g/l左右。根据发酵时间，以可变浓度向葡萄糖溶液中加入L-酪氨酸，以避免L-酪氨酸限制。
在进行细胞诱导的实验中，按照本发明在6小时后通过加入50μMIPTG进行细胞诱导。在诱导36小时后，仅仅通过引入pZY557tal质粒使(苯丙氨酸)指示值达到120；此值是与未诱导的宿主菌株大肠杆菌AT2471的(苯丙氨酸)指示值100相比得出。通过按照本发明诱导，该值可以进一步升到153。通过单独引入pZY557tkttal质粒，并因此除了增加转醛酶活性，还增加转酮酶活性，与所述宿主菌株相比，(苯丙氨酸)指示值可以达到130。本实验进一步显示，诱导菌株大肠杆菌AT2471/pZY557tkttal能够进一步将(苯丙氨酸)指示值增加到250。这同未诱导的菌株相比，相当于增加了92％。
权利要求
1.微生物制备物质的方法，其中在生产这些物质的微生物中增加转醛酶活性，而在所述微生物中磷酸烯醇丙酮酸(PEP)依赖性糖吸收系统的活性存在、降低或消失。
2.按照权利要求1的方法，其特征在于，在下述微生物中实现物质制备，所述微生物在增加转醛酶活性之前，没有从先前带有磷酸转移酶系统(pts+菌株)的菌株中将所述微生物作为磷酸转移酶系统关闭的菌株(pts-菌株)进行选择。
3.按照权利要求1或2的方法，其特征在于，制备其合成涉及至少一个戊糖磷酸途径的中间体的物质。
4.按照权利要求3的方法，其特征在于，所述中间体是4-磷酸赤藓糖(Ery4P)。
5.按照权利要求1或4的方法，其特征在于，增加大肠杆菌转醛酶活性。
6.按照权利要求1-5之一的方法，其特征在于，增加大肠杆菌转醛酶B(TalB)活性。
7.按照权利要求1-6之一的方法，其特征在于，额外增加转酮酶活性。
8.按照权利要求7的方法，其特征在于，增加大肠杆菌转酮酶活性。
9.按照权利要求7或8之一的方法，其特征在于，增加大肠杆菌转酮酶A(TktA)活性。
10.按照权利要求1-9之一的方法，其特征在于，额外增加PEP不依赖性糖吸收系统的转运蛋白的活性和/或使相关糖磷酸化的激酶的活性。
11.按照权利要求10的方法，其特征在于，所述转运蛋白是易化蛋白(facilitator)。
12.按照权利要求11的方法，其特征在于，所述易化蛋白是活动发酵单胞菌葡萄糖易化蛋白(Glf)。
13.按照权利要求10-12之一的方法，其特征在于，所述激酶是己糖磷酸化激酶。
14.按照权利要求13的方法，其特征在于，所述激酶得自活动发酵单胞菌。
15.按照权利要求14的方法，其特征在于，所述激酶是活动发酵单胞菌葡糖激酶(Glk)。
16.按照权利要求10-15之一的方法，其特征在于，如果存在PEP依赖性糖吸收系统，则另外降低或消除其活性。
17.按照权利要求1-16之一的方法，其特征在于，a)通过引入所述基因b)和/或通过增加所述基因拷贝数c)和/或通过增加基因表达d)和/或通过增加所述酶的内源活性e)和/或通过改变酶的结构f)和/或通过使用去调节的酶g)和/或通过插入编码去调节酶的基因增加至少一个下述元件，即转醛酶、转酮酶、转运蛋白和激酶的活性。
18.按照权利要求17的方法，其特征在于，通过将一个或多个基因加入一个或几个基因结构中实现所述活性的增加，而所述一个或多个基因作为单拷贝或以增加的拷贝数引入到所述基因结构中。
19.按照权利要求1-18之一的方法，其特征在于，使用另外参与所述物质合成的一个或多个酶被去调节和/或显示活性增加的微生物。
20.按照权利要求1-19的方法，其特征在于，制备的所述物质是芳族氨基酸。
21.按照权利要求20的方法，其特征在于，所述芳族氨基酸是L-苯丙氨酸。
22.按照权利要求1-21之一的方法，其特征在于，使用的微生物属于大肠杆菌属、沙雷氏菌属、芽胞杆菌属、棒状杆菌属或短杆菌属。
23.按照权利要求22的方法，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌。
24.重组形式的基因结构，包括a)编码转醛酶的基因或编码转醛酶的基因和编码转酮酶的基因，和b)至少一个编码PEP不依赖性糖吸收的转运蛋白或编码糖磷酸化激酶的基因。
25.按照权利要求24的基因结构，其特征在于，所述转运蛋白的基因编码易化蛋白，而所述激酶的基因编码己糖磷酸化激酶。
26.按照权利要求24或25的基因结构，其特征在于，所述转醛酶和所述转酮酶的基因得自大肠杆菌，而所述转运蛋白和所述激酶的基因得自活动发酵单胞菌。
27.按照权利要求24-26的基因结构，其特征在于，大肠杆菌转醛酶的基因是talB，大肠杆菌转酮酶的基因是tktA，活动发酵单胞菌转运蛋白的基因是glf，活动发酵单胞菌激酶的基因是glk。
28.按照权利要求24-27之一的基因结构，其特征在于，所述基因结构包括至少一个分配给所述基因之一的调节基因序列。
29.按照权利要求28的基因结构，其特征在于，在所述基因结构中至少加入一个所述基因，以使所述基因处于诱导型启动子控制之下。
30.转化细胞，带有可复制形式的按照权利要求24-29的基因结构。
31.按照权利要求30的转化细胞，其特征在于，在所述细胞中，另外参与所述物质合成的一个或多个酶被去调节和/或显示活性增加。
32.按照权利要求30或31的转化细胞，其特征在于，所述细胞是大肠杆菌细胞。
33.按照权利要求30-32之一的转化细胞，其特征在于，如果存在PEP依赖性糖吸收系统，那么降低或消除所述系统的活性。
34.按照权利要求30-33之一的转化细胞，其特征在于，它能够生产芳族氨基酸。
35.按照权利要求34的转化细胞，其特征在于，所述芳族氨基酸是L-苯丙氨酸。
36.按照权利要求1-23之一的微生物制备物质的方法，其特征在于，培养含有按照权利要求29的基因结构、按照权利要求30-35之一的转化细胞，并在最初的2次细胞分裂后进行诱导。
37.按照权利要求36的方法，其特征在于，除了戊糖磷酸途径的中间体，所述转化细胞也含有利用率增加的中心新陈代谢的其它代谢物。
全文摘要
本发明通过增加细胞内代谢中间体(具体地说是赤藓糖4－磷酸)的供应,使得可获得供选择的微生物制备物质(特别是诸如L－苯丙氨酸的芳族氨基酸)的方法,在所述方法中,增加生产这些物质的微生物中的转醛酶活性。在本发明最佳实施方案中,又增加了转酮酶活性,或增加了PEP依赖性糖吸收的转运蛋白的活性和/或使相关糖磷酸化的激酶的活性。本发明也涉及基因结构,并涉及具有这些基因结构的转化细胞,这使以特别成功的方式完成这些方法成为可能。
文档编号C12R1/185GK1241214SQ97180908
公开日2000年1月12日 申请日期1997年10月17日 优先权日1996年10月26日
发明者G·斯普伦格, R·斯维, H·萨姆, M·卡鲁茨, T·松克 申请人:荷兰加甜剂公司, 于利奇研究中心有限公司