专利名称：制备光学活性的n－苄基－3－吡咯烷醇的方法
背景技术：
本发明涉及一种制备可用作合成β-内酰胺抗生素和二氢吡啶化合物等药用化合物的中间体的光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇的方法。
背景技术：
光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇可用作合成药用化合物的中间体。在光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇的制备方法中，已知一种包括由光学活性的化合物进行合成的技术和一种由前手性化合物出发进行非对称合成或光学拆解的技术。例如，日本特许公开公报1994年第141876号公开了这样一种方法在可催化N-苄基-3-吡咯烷酮的立体选择性还原反应的酶的存在下，对N-苄基-3-吡咯烷酮进行立体选择性还原，由此制备光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇。然而，该方法不适合实际使用，部分地是因为用作酶源的真菌难以以工业规模进行培养，从而使以下的工序难以进行下去，部分地还由于底物的装料浓度及从底物转换成产物的比率较低。发明概要鉴于上述问题，本发明的目的是，提供一种高效率的通过酶反应来制备光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇的方法，该方法包括将N-苄基-3-吡咯烷酮立体选择性地还原。
本发明的制备光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇的方法包括用微生物细胞或培养物或由它们得到的物质处理N-苄基-3-吡咯烷酮并由此得到反应混合物的步骤和从该反应混合物中回收光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇的步骤，在该方法中，所述微生物是属于Depodascus属、Debaryomyces属(德巴利酵母属)、Cryptococcus属(隐球酵母属)、Pichia属(毕赤氏酵母属)、Rhodosporidium属(红冬孢属)、Trichosporon属(毛孢子菌属)、Micrococcus属(微球菌属)、Komagataella属、Ogataea属或Zygosaccharomyces属(结合酵母属)的微生物。发明的详细描述下面对本发明作详细描述。
在本发明中，将底物N-苄基-3-吡咯烷酮先用微生物的细胞或培养物或由它们得到的物质进行处理，得到反应混合物。
所述N-苄基-3-吡咯烷酮可用日本特许公开公报1979年第16466号所公开的方法进行合成。即，使苄胺与丙烯酸乙酯进行迈克尔加成反应，然后在碱的存在下将所得β-丙氨酸衍生物与氯乙酸乙酯反应。在金属钠的存在下，将所得混合物环化，得到N-苄基-4乙酯基-3-吡咯烷酮，接着，用盐酸使该混合物脱去羧基，由此可得到N-苄基-3-吡咯烷酮。
在本发明中，所用的微生物是属于Depodascus属、Debaryomyces属、Cryptococcus属、Pichia属、Rhodosporidium属、Trichosporon属、Micrococcus属、Komagataella属、Ogataea属或Zygosaccharomyces属的微生物。这样的微生物可立体选择性地将上述N-苄基-3-吡咯烷酮的3位羰基还原。
这些微生物的具体例子包括(但不限于)属于Depodascus tetrasperma CBS765.70、Debaryomyceshanseniivar.hanseniiIFO 0728、Cryptococcus albidus var.albidus IFO 0378、Pichia membranaefaciens IFO 0189、Rhodosporidiumtoruloides IFO 0413、Trrchosporon fermentans ATCC 10675、Micrococcus luteusIFO 13867、Komagataella pastoris IFO 0948、Ogataea polymorpha IFO 1476、Zygosaccharomyces bailii IFO 0519等。
这些微生物可由能容易得到的或购得的原培养物得到。它们还可从天然界分离出来。也可通过使这些微生物突变而得到具有对本发明有利的特性的微生物菌株。此外，也可使用通过DNA重组和细胞融合等基因工程(生物工程)技术而由这些微生物衍生的菌株。
这些微生物可用含营养成分的培养基进行培养。所用的培养基通常是固体培养基(如琼脂培养基)或液体培养基。为大量培养这些微生物，以使用液体培养基为宜。在这些培养基中，所用的碳源例如可以是糖类(如葡萄糖、蔗糖和麦芽糖)、有机酸(如乳酸、乙酸和柠檬酸)、醇(如乙醇和丙三醇)和它们的混合物，所用的氮源例如可以是硫酸铵、磷酸铵、尿素、酵母浸膏、肉汁浸膏、蛋白胨等。此外，视需要，也可使用其它无机盐、维生素和其它营养源。
这些微生物通常可在一般条件下培养，例如在pH4.0～9.5、20-45℃的条件下有氧培养10-96小时。
在用上述微生物处理N-苄基-3-吡咯烷酮时，可使用所得的含上述微生物的培养液。但当培养液中的成分会对反应产生影响时，宜使用通过对该培养液进行离心处理而得到的悬浮液。
得自这些微生物的细胞的物质包括(但不限于)干细胞、通过用表面活性剂或有机溶剂对细胞进行处理而得到的物质及通过用分解酶对细胞进行处理而得到的物质。此外。也可使用对细胞或培养物进行抽提而制得的酶制剂。
得自培养物的物质包括(但不限于)浓缩培养物、干培养物、表面活性剂或有机溶剂处理过的培养物、分解酶处理过的培养物等。此外，也可使用对培养的细胞或培养物进行纯化而得到的酶制剂。
在用上述微生物细胞、微生物培养物或由它们得到的物质处理N-苄基-3-吡咯烷酮并由此进行反应时，可在反应开始时立即将N-苄基-3-吡咯烷酮全部投入，也可分批投入。此时，反应温度通常为15-50℃(较好的为20-40℃)，pH为2.5至9.0。
反应混合物中细胞的量可根据细胞的催化能力而适当选择。底物浓度较好的为0.01-50％(w/v)，更好的为0.1-20％(w/v)。
反应通常在振荡下或在通气和搅拌下进行。反应时间可根据底物浓度、微生物的量和其它反应条件而适当选择。一般而言，在对各条件进行选择时，宜使反应可在2-168小时内完毕。为加快反应，可在反应混合物中添加1-5％的量的能源(如葡萄糖)，由此可得到良好的结果。
此外，可通过加入辅酶成分来加快反应，所述辅酶成分的例子包括通常被认为在生物方法的还原反应中必不可少的还原型辅酶Ⅰ(NADH)或还原型辅酶Ⅱ(NADPH)。在具体实施时，可将这些辅酶加入到反应体系中，也可将能形成NADH、NADPH等的反应体系加入到本发明的反应体系中。例如，可利用在甲酸脱氢酶的存在下由甲酸形成二氧化碳和水时由NAD形成NADH的反应，也可利用在葡萄糖脱氢酶的存在下由葡萄糖形成葡糖酸内酯时由NAD/NADP形成NADH/NADPH的反应。还可使用表面活性剂，如Triton(Nakalai Tesque株式会社产品)、Span(关东化学株式会社产品)或Tween(Nakalai Tesque株式会社产品)。
在本反应中，接着，从反应混合物中回收产物，即光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇。
对从反应混合物中回收N-苄基-3-吡咯烷醇的方法无特别限定，可使用任何普通的分离方法。例如，可用包含以下步骤的方法得到光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇往反应混合物中加入有机溶剂(如乙酸乙酯)进行提取，用无水硫酸钠等将所得提取液脱水，减压下除去有机溶剂。此时，可加入碳酸氢钠或氯化钠等盐以提高提取效率。需要时，可通过蒸馏、硅胶柱色谱法等技术将该粗略纯化过的产物转换成更纯的光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇。本发明的最佳实施方式下面的实施例对本发明作更详细的举例说明。但这些实施例并非是对本发明范围的限制。实施例1制备具有下述组成的液体培养基，并在各大容量试管中分别添加5ml该培养基，然后在120℃蒸汽灭菌20分钟。
培养基组成葡萄糖 4％酵母浸膏 0.3％KH2PO40.1％(NH4)2HPO40.65％NaCl0.1％MgSO4·7H2O 0.8％ZnSO4·7H2O 0.06％FeSO4·7H2O 0.09％CuSO4·5H2O 0.005％MnSO4·4～6H2O0.01％自来水pH 7.0在各试管内的培养基中分别接种一菌环的表1所示微生物中的一种。然后，在30℃振荡培养24-72小时。接着，对各培养液进行离心，收集细胞并用水进行洗涤，然后将细胞悬浮在1ml的100mM磷酸缓冲液(pH 6.5)中。将各悬浮液用作下面的反应混合物中的一个组分。
反应混合物组成(1)上述细胞悬浮液 1ml(2)葡萄糖 20mg(3)N-苄基-3-吡咯烷酮 10mg将加入到各试管中的上述组分(1)至(3)混合，让反应在振荡下在30℃进行20小时。反应之后，往各反应混合物中加入3.5ml乙酸乙酯，并将反应混合物整体充分搅拌。取出一部分有机层进行气相色谱分析，测定其N-苄基-3-吡咯烷醇含量。还用HPLC测定其光学纯度。
气相色谱分析条件分析柱 Uniport B,10％PEG-20M,4.0mm ID×1.0mm柱温 200℃载气 氮气检测 FIDHPLC分析条件分析柱 Chiralcel OB(Daicel Chemical Industries公司产品)洗脱液 正己烷/异丙醇/二乙胺=99/1/0.1检测 254nm流速 1ml/min洗脱时间 6.1分钟(R型)，7.9分钟(S型)产物转化率和产物光学纯度归纳在表1中。
表1
实施例2制备具有下述组成的液体培养基，并在各大容量试管中分别添加10ml该培养基，然后在120℃蒸汽灭菌20分钟。
培养基组成肉汁浸膏 1.0％蛋白胨1.0％酵母浸膏 0.5％NaCl 0.3％自来水pH7.0在各份液体培养基中接种一菌环的Micrococcus luteus IFO 13867并在30℃振荡培养24小时。然后，对该培养液进行离心，收集细胞并用水进行洗涤，然后悬浮在2ml的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中，按与实施例1相同的方式将悬浮液用作反应混合物中的一个组分。让反应进行20小时之后，按与实施例1相同的方式测定产物转化率和产物光学纯度。转化率为81％，光学纯度为(S)100％ee。实施例3按与实施例1相同的方式培养表2所示微生物。接着，将各培养液离心，收集细胞并用水进行洗涤，然后将细胞悬浮在1ml的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中。将悬浮液用作下面的反应混合物中的一个组分。
反应混合物组成(1)上述细胞悬浮液 0.5ml(2)葡萄糖 5.4mg(3)辅酶Ⅱ(氧化型) 0.275mg(4)葡萄糖脱氢酶(天野制药株式会社产品) 2.84单位(5)N-苄基-3-吡咯烷酮 1mg将上述组分(1)至(5)置于试管中并充分混合，让反应在振荡下在30℃进行20小时。反应之后，按与实施例1相同的方式测定产物转化率和产物光学纯度。所得结果归纳在表2中。
表2
实施例4按与实施例1相同的方式培养表3所示微生物。接着，将各培养液离心，收集细胞并用水进行洗涤，然后将细胞悬浮在1ml的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中。将悬浮液用作下面的反应混合物中的一个组分。
反应混合物组成(1)上述细胞悬浮液 0.5ml(2)葡萄糖 5.4mg(3)辅酶Ⅰ(氧化型) 0.26mg(4)葡萄糖脱氢酶(天野制药株式会社产品) 2.84单位(5)N-苄基-3-吡咯烷酮 1mg将上述组分(1)至(5)置于试管中并充分混合，让反应在振荡下在30℃进行20小时。反应之后，按与实施例1相同的方式测定产物转化率和产物光学纯度。所得结果归纳在表3中。
表3
实施例5按与实施例2相同的方式培养Micrococcus luteus IFO 13867。将所得细胞悬浮在2ml的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中，并将悬浮液用作实施例3中给出的反应混合物中的一个组分。让反应进行20小时之后，按与实施例1相同的方式测定产物转化率和产物光学纯度。转化率为78％，光学纯度为(S)100％ee。实施例6按与实施例2相同的方式培养Micrococcus luteus IFO 13867。将所得细胞悬浮在2ml的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中，并将悬浮液用作实施例4中给出的反应混合物中的一个组分。让反应进行20小时之后，按与实施例1相同的方式测定产物转化率和产物光学纯度。转化率为78％，光学纯度为(S)100％ee。实施例7制备具有实施例2中给出的组成的液体培养基，并在25个500ml容量的坂口烧瓶中分别添加100ml该培养基，然后在120℃蒸汽灭菌20分钟。在各烧瓶内的培养基中无菌接种2ml的按与实施例2相同的方式培养Micrococcus luteus IFO13867而得到的培养液，并在30℃振荡培养24小时。用离心法从所得培养液中收集细胞并将其悬浮在500ml的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中。往该悬浮液中添加5gN-苄基-3-吡咯烷酮和10g葡萄糖。让反应在搅拌下在30℃进行24小时，同时用6N氢氧化钠水溶液将反应混合物保持在pH6.5。接着，用2.5L乙酸乙酯抽提反应混合物并用1L乙酸乙酯进一步抽提水层。将有机层合并并用无水硫酸钠脱水，然后在减压下蒸去溶剂。将残渣进行蒸馏，得到3g(S)-N-苄基-3-吡咯烷醇。得率为60％，光学纯度为99.8％ee，在3mmHg下的沸点为132-137℃，旋光度〔α〕D20为-3.77°(CH3OH,c=5)。1H-NMRδ(CDCl3):1.63-1.76(1H,m),2.09-2.21(1H,m),2.26-2.37(1H,m),2.51-2.64(2H,m),2.75-2.85(1H,m),3.38(1H，宽峰),3.61(2H,s),4.24-4.33(1H,m),7.19-7.37(5H,m)。实施例8制备具有实施例1中给出的组成的液体培养基，并在50个500ml容量的坂口烧瓶中分别添加50ml该培养基，然后在120℃蒸汽灭菌20分钟。在各烧瓶内的培养基中无菌接种1ml的按与实施例1相同的方式培养Trichosporon fermentansATCC 10675而得到的培养液，并在30℃振荡培养24小时。用离心法从所得培养液中收集细胞并将其悬浮在500ml的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中。往该悬浮液中添加5gN-苄基-3-吡咯烷酮、10g葡萄糖、275mg氧化型辅酶Ⅱ(Kohjin株式会社产品)和1,420单位的葡萄糖脱氢酶(天野制药株式会社产品)，并让反应在搅拌下在30℃进行48小时，同时用6N氢氧化钠水溶液将反应混合物保持在pH6.5。接着，用2.5L乙酸乙酯抽提反应混合物并用1L乙酸乙酯进一步抽提水层。将有机层合并并用无水硫酸钠脱水，然后在减压下蒸去溶剂。用硅胶柱色谱法(洗脱液乙酸乙酯/甲醇=2/1)对残渣进行纯化，得到2.5g(S)-N-苄基-3-吡咯烷醇。得率为49％，光学纯度为96％ee，在3mmHg下的沸点为132-137℃，旋光度〔α〕D20为-3.73°(CH3OH,c=5)。1H-NMRδ(CDCl3):1.63-1.76(1H,m),2.09-2.21(1H,m),2.26-2.37(1H,m),2.51-2.64(2H,m),2.75-2.85(1H,m),3.38(1H，宽峰),3.61(2H,s),4.24-4.33(1H,m),7.19-7.37(5H,m)。实施例9制备具有实施例1中给出的组成的液体培养基，并在50个500ml容量的坂口烧瓶中分别添加50ml该培养基，然后在120℃蒸汽灭菌20分钟。在各烧瓶内的培养基中无菌接种1ml的按与实施例1相同的方式培养Trichosporon fermentansATCC 10675而得到的培养液，并在30℃振荡培养24小时。用离心法从所得培养液中收集细胞并将其悬浮在500ml的100mM磷酸缓冲液(pH6.5)中。在冰冷却下用布朗氏细胞破裂器使细胞破裂，用离心法得到的上清液(即无细胞抽提物)并将其用作下面的反应混合物中的一个组分。
反应混合物组成(1)上述细胞悬浮液 0.5ml(2)葡萄糖 5.4mg(3)辅酶Ⅰ(氧化型) 0.26mg(4)葡萄糖脱氢酶(天野制药株式会社产品) 2.84单位(5)N-苄基-3-吡咯烷酮1mg将上述组分(1)至(5)置于试管中并充分混合，让反应在振荡下在30℃进行20小时。反应之后，按与实施例1相同的方式测定产物转化率和产物光学纯度。转化率为19％，光学纯度为(S)96％ee。
工业上应用的可能性具有上述构成的本发明的制备光学活性的N-苄基-3-吡咯烷酮的方法可以工业规模高效率地生产光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇。根据本发明而得到的光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇的光学纯度高，是生产β-内酰胺抗生素和二氢吡啶化合物等药用化合物的重要中间体。
权利要求
1．一种制备光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇的方法，它包括用微生物细胞或培养物或由它们得到的物质处理N-苄基-3-吡咯烷酮并由此得到反应混合物的步骤和从该反应混合物中回收光学活性的N-苄基-3-吡咯烷醇的步骤，其中，所述微生物是属于Depodascus属、Debaryomyces属、Cryptococcus属、Pichia属、Rhodosporidium属、Trichosporon属、Micrococcus属、Komagataella属、Ogataea属或Zygosaccharomyces属的微生物。
全文摘要
本发明提供一种高效率的通过将N－苄基－3－吡咯烷酮立体选择性地还原的酶反应来制备光学活性的N－苄基－3－吡咯烷醇的方法，该方法包括包括用微生物细胞或培养物或由它们得到的物质处理N－苄基－3－吡咯烷酮并由此得到反应混合物的步骤和从该反应混合物中回收光学活性的N－苄基－3－吡咯烷醇的步骤，其中，所述微生物是属于Depodascus属、Debaryomyces属、Cryptococcus属、Pichia属、Rhodosporidium属、Trichosporon属、Micrococcus属、Komagataella属、Ogataea属或Zygosaccharomyces属的微生物。
文档编号C12R1/265GK1238808SQ9718001
公开日1999年12月15日 申请日期1997年11月26日 优先权日1996年11月26日
发明者八十原良彦, 长谷川淳三 申请人:钟渊化学工业株式会社