有用微生物和目标物质的制备方法
【专利摘要】本发明的课题在于提供一种菌株，所述菌株可以减少由作为中间代谢物的化合物P向代谢物M的转换量，而且在未添加代谢物M或由代谢物M生成的最终产物的培养基中可以高效率地蓄积化合物P。根据本发明，提供一种原核生物，所述原核生物具有本说明书中规定的(a)～(d)所述的所有性质，以调节将由碳源生成生长所必须的代谢物M的生物合成途径中作为中间代谢物的化合物P转换成代谢物M的酶X的表达量，从而使化合物P蓄积。
【专利说明】有用微生物和目标物质的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及用于高效率地制备有机酸或氨基酸等有用物质的微生物和使用了该 微生物的有用物质的制备方法。
【背景技术】
[0002] 有人开发了通过导入营养需求突变或代谢调节突变、或利用重组DNA技术等，获 得高效率地制备有机酸、氨基酸、核酸、维生素等有用化合物的微生物的方法。如图1所示， 在由碳源经由作为中间代谢物的化合物P生成生长所必须的代谢物M的生物合成途径或代 谢途径中，为了高效率地生产化合物P，经常采用获得营养需求突变株的方法，所述营养需 求突变株使将化合物P转换成代谢物M的酶X的活性缺损。但是，使用该突变株来生产目 标化合物P时，需要向培养基中添加代谢物M或由代谢物M生成的最终产物，存在着制造成 本升高的问题。
[0003] 例如，有报道称；使用缺损了莽草酸激酶活性的大肠杆菌肢cAericAiaCO")，可 W高效率地生产作为图2所示的莽草酸途径的中间代谢物的莽草酸（专利文献1、非专利文 献1)。但是，使用该微生物时，除了产生色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的需求性W外，还产生对 轻基苯甲酸、对氨基苯甲酸和2, 3-二轻基苯甲酸的需求性，所W存在着需要在培养基中添 加该6种化合物的问题。另外，还有报道称：使用缺损了莽草酸脱氨活性的大肠杆菌，可W 高效率地生产作为莽草酸途径的中间代谢物的3-脱氨莽草酸，但该微生物也存在着产生 上述6种化合物的需求性的问题（专利文献2、非专利文献2)。
[0004] 还可W通过使用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基脈或己基甲賴酸等突变剂的处理 或UV或放射线的照射等突变处理、或自然突变等导入突变，从而导入减少由化合物P转换 成代谢物M的酶X的量的突变，W减少代谢物M的生成量，由此增加化合物P的量。该种情 况下，因残留酶X的活性，使得一部分化合物P常常会转换成代谢物M，所W不易找到使化合 物P的生产量最大化的条件。
[0005] 在本发明中，公开了下述方法；通过人为地将编码酶X的基因X的转录置于抑制物 的控制下W控制代谢物M的生成量，不用在培养基中添加代谢物M或由代谢物M生成的最 终产物，而高效率地生产化合物P，但尚未报道通过利用不是基因X的本来的启动子、而是 通过抑制物进行转录抑制的其他启动子来控制基因X的转录量，来提高化合物P的生产量 的事例。
[0006] 使用微生物来制备有用化合物时，在由碳源经由作为中间代谢物的化合物P生成 生长所必须的代谢物M的生物合成途径或代谢途径中，往往采用由该途径上的化合物P通 过分支的途径生产该有用化合物的方法。采用该方法时，也经常采用获得缺损了上述酶X 的活性的营养需求突变株的方法，但需要在培养基中添加代谢物M或由代谢物M生成的最 终产物，存在着制造成本升高的问题。
[0007] 关于采用具有多个分支途径的莽草酸途径（图2)的目标物质的生产，例如，已知 为了使作为中间代谢物的分支酸不流入酪氨酸或苯丙氨酸的合成途径，大多数的色氨酸生 产菌株具有酪氨酸和苯丙氨酸的需求性（专利文献3、非专利文献3和4)。另外，已知苯丙 氨酸生产菌具有酪氨酸的需求性（专利文献4和5、非专利文献5)。因此，制备目标芳族氨 基酸时，需要在培养基中添加其他的芳族氨基酸。
[0008] 还有报道称；通过制作使由3-脱氨莽草酸（W下简记为D服）转换成莽草酸（代 谢物M)的酶缺损、而且使作为莽草酸途径的起始物质的3-脱氧-D-阿糖基庚糖丽酸-7-磯 酸（W下简记为DAHP)的生成量增加的突变株，可W生产约40g/L的原儿茶酸（非专利文 献6)。但是，使用该突变株时，除了产生色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的需求性W外，还产生对 轻基苯甲酸、对氨基苯甲酸和2, 3-二轻基苯甲酸的需求性，因此存在着需要在培养基中添 加该6种化合物的问题。另外，通过向棒状杆菌似知属细菌（专利文献6) 或短杆菌脉'Wi知C妃riw?)属细菌（专利文献7和8)中导入突变，也获得了原儿茶酸生 产菌，但对于原儿茶酸的生产，该些突变株需要酪氨酸等营养源。而且，该些突变株的原儿 茶酸生产量的最高值为约13g/l，低于上述的芳族氨基酸营养需求突变株的生产量（专利 文献8)。
[0009] 现有技术文献 专利文献 专利文献1 ;美国专利6, 472, 169 ; 专利文献2 ;美国专利5, 821，266 ; 专利文献3 ;日本专利第4, 305, 184号公报； 专利文献4 ;日本特开平5-49489号公报； 专利文献5 ;日本特开平5-304971号公报； 专利文献6 ;日本特公昭45-39036号公报； 专利文献7 ;日本特开昭50-89592号公报； 专利文献8 ;日本特开昭60-98989号公报； 非专利文献 非专利文献 1 ;Biotechnol.Prog. 19, 808 (2003); 非专利文献 2 ;Biotechol.Bioeng. 64，61 (1999); 非专利文献 3 ;Agric.Biol.Chem. 39，343 (1975); 非专利文献 4;ApplEnvironMicrobiol. 65，2497 (1999); 非专利文献 5 ;Agric.Biol.Chem. 37，2013 (1973); 非专利文献 6J.Am.Chem.Soc. 127，2874 (2005)。
【发明内容】
[0010] 发明所要解决的课题 本发明的课题在于：提供一种获得菌株的方法，在使用具有由碳源经由作为中间代谢 物的化合物P生成生长所必须的代谢物M的生物合成途径或代谢途径的微生物来生产化合 物P时，所述菌株可减少由化合物P向代谢物M的转换量、而且在未添加代谢物M或由代谢 物M生成的最终产物的培养基中可W高效率地蓄积化合物P(图1) ;W及提供根据蓄积的 化合物P通过酶Y生产化合物Q的方法（图3)。
[0011] 用于解决课题的手段 本发明人在使用谷氨酸棒状杆菌似3T网e/?<3c妃ri"?知ATCC13032株（W下简记为ATCC13032株）制作高效率地生产作为目标物质的D服的菌株的研究中，尝试着 解决上述课题。首先，增强参与从葡萄糖到DHS(化合物巧的生物合成途径的多种酶的表 达，再根据将编码促进从DHS向原儿茶酸转换的DHS脱水酶（酶Y)的基因qsuB(cg0502)基 因的转录置于tuf(cg0587)基因的启动子（W下简记为化启动子）的控制下的NSH株，制 作在编码促进从D服向莽草酸（代谢物M)转换的莽草酸脱氨酶（酶幻的aroE3(cgl835) 基因中导入了缺失突变的NSH A aroE3株时，确认到若不添加3种芳族氨基酸（色氨酸、苯 丙氨酸和酪氨酸），则NSHAaroE3株的增殖变得极慢。通过在添加了3种芳族氨基酸和莽 草酸的培养基中培养该N甜A aroE3株，确认到产生了0. 5g/L的原儿茶酸。接下来，为了通 过vanR(cg2615)基因所编码的抑制物（W下简记为VanR抑制物）控制活性型莽草酸脱氨 酶基因（aroE3基因）的表达，根据该N甜AaroE3株制作了在染色体中插入了将aroE3基 因与vanA(cg2616)基因的启动子（W下简记为VanA启动子）连接的DNA的N甜AaroE3_ vanE3株。发现该N甜A aroE3_vanE3株可W在没有添加3种芳族氨基酸和莽草酸的合成 培养基中生长，而且产生了16. 6g/L的原儿茶酸，从而解决了本发明的课题。另外还发现： 在根据该N甜AaroE3株制作通过rhcR(cgl308)基因所编码的抑制物（W下简记为化cR 抑制物）控制aroE3基因的表达的菌株时，确认到11. 2g/L的原儿茶酸的生产性，通过利用 VanR抑制物W外的抑制物，也获得了优异的原儿茶酸的生产性。
[0012] 接下来，在制作除了导入N甜AaroE3株的aroE3基因缺失突变W外、还在编码促 进从D服向莽草酸（代谢物M)转换的莽草酸脱氨酶的qsuD (cg0504)基因和编码D服脱水 酶的qsuB基因中导入了缺失突变的N甜A aroE3 AqsuB AqsuD株时，确认到若不添加3种 芳族氨基酸、维生素K2和对氨基苯甲酸，则N甜A aroE3 A qsuB A qsuD株无法增殖。通过在 加入了该些添加物的培养基中培养该N甜A aroE3 A qsuB A qsuD株，确认到产生了7. 7g/L 的D服。按照与N甜A aroE3 A qsuB A qsuD株的构建相同的顺序，根据N甜A aroE3_va址3株， 制作了在qsuD基因和qsuB基因中导入了缺失突变的N甜A aroE3_va址3 A qsuB A qsuD株。 根据该N甜A aroE3_va址3 A qsuB A qsuD株制作在染色体中插入了连接有benA (cg2637)基 因的启动子和编码VanR抑制物的VanR基因的DNA的化en-vanR株时，发现化en-vanR株 可W在不含该些添加物的合成培养基中生长，而且可W生产15. 4g/L的DHS，从而解决了本 发明的课题。
[0013]目P，本发明涉及W下的（1)?（24)。
[0014] (1)原核生物，该原核生物具有下述的（a)?（d)所述的所有性质，W调节将由碳 源生成生长所必须的代谢物M的生物合成途径中作为中间代谢物的化合物P转换成代谢物 M的酶X的表达量，从而使化合物P蓄积， (a)在与从该原核生物所能利用的碳源到化合物P的生物合成有关的酶群中，任意一 个W上的酶的活性较该原核生物的野生株有所增强； 化）通过在编码酶X的蛋白的野生型基因X的翻译区、该基因的翻译调节区或促进基 因X转录的启动子区中具有1个W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突变，酶X的活性缺损 或降低； (C)利用与促进上述基因X转录的本来的启动子不同、且转录被抑制物R的蛋白抑制 的启动子A，控制编码活性型酶X的DNA的转录； (d) 具有I拷贝W上的编码抑制物R的蛋白的基因Z，该基因的转录被该基因的本来的 启动子和/或不同于该启动子的诱导启动子B控制。
[0015] (2) (1)所述的原核生物，其特征在于：性质化）所述的促进基因X转录的启动子 区中的取代突变是将该启动子的整个区域或一部分区域取代成性质（C)所述的启动子A的 DNA的突变。
[0016] (3) (1)或（2)所述的原核生物，其特征在于；在上述原核生物所具有的代谢化合 物P的酶中，酶XW外的任意一个W上的代谢酶的活性缺损或降低。
[0017] (4) (1)?（3)中任一项所述的原核生物，其特征在于：上述启动子B是通过添加 选自阿魏酸、香草酸、香兰素、苯甲酸、3-轻基苯甲酸、间苯二酷、4-轻基苯甲酸、2, 4-二轻 基苯甲酸、果糖和藏糖的化合物而诱导的启动子。
[0018] (5) (1)?（4)中任一项所述的原核生物，其特征在于：编码上述抑制物R的蛋白 的基因Z为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株的vanR(cg2615)基因、pcaR(cg2624)基因、或 rhcRkgl308)基因。
[0019] (6) (1)?巧）中任一项所述的原核生物，其特征在于：上述启动子A为谷氨酸 棒状杆菌ATCC13032株的VanA(cg2616)基因的启动子、PObA(cgl226)基因的启动子、 PC址(cg2631)基因的启动子、或rh地(cgl309)基因的启动子。
[0020] (7)化合物P的制备方法，其特征在于：在抑制了启动子A转录的状态下、在碳源 的存在下培养（1)?化）中任一项所述的原核生物。
[0021] (8)化合物P的制备方法，其特征在于：在抑制了启动子A转录的状态下、在碳源 的存在下培养（1)?（6)中任一项所述的原核生物，之后施加诱导启动子B转录的处理，使 抑制物R的蛋白表达量增加，从而减少代谢物M的生成量。
[0022] (9)化合物P的制备方法，其特征在于：在解除了启动子A的转录抑制的状态下、 在碳源的存在下培养（1)?化）中任一项所述的原核生物，之后施加诱导启动子B转录的 处理，使抑制物R的蛋白表达量增加，从而减少代谢物M的生成量。
[002引 （10) (7)?（9)中任一项所述的化合物P的制备方法，其特征在于：上述化合物P和上述代谢物M的组合为下述（f)?（i)中的任意一个， (f) 化合物P为3-脱氨莽草酸、代谢物M为莽草酸； (g) 化合物P为谷氨酸、代谢物M为N-己醜谷氨酸或Y-谷氨醜磯酸； 化）化合物P为天冬氨酸、代谢物M为目-天冬氨醜磯酸； (i)化合物P为丝氨酸、代谢物M为甘氨酸。
[0024] (11) (1)?做中任一项所述的原核生物，其特征在于：除了具有（a)?（d)所 述的性质W外，还具有下述的性质（e)，W通过酶Y将蓄积的化合物P转换成化合物Q， (e) 通过在编码酶Y的蛋白的基因y的翻译区、该基因的翻译调节区或促进基因y转 录的启动子区中具有1个W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突变，从化合物P向化合物Q 转换的能力增强、或者基因y的表达受到不同于野生型的控制。
[002引（11)所述的原核生物，其特征在于：在上述原核生物所具有的代谢化合物Q的酶中，任意一个W上的代谢酶的活性缺损或降低。
[002引（蝴（11)或所述的原核生物，其特征在于：性质（e)所述的促进基因y转 录的启动子区中的取代突变是将该启动子的整个区域或一部分区域取代成不同于促进该 基因转录的本来的启动子和启动子A的启动子C的DM的突变。
[0027] (14)(蝴所述的原核生物，其特征在于：上述启动子C与启动子B相同、或者上 述启动子C受到控制启动子B转录的蛋白的转录控制。
[0028] (15) (13)或（14)所述的原核生物，其特征在于：上述启动子C为诱导启动子。
[0029] (16) (15)所述的原核生物，其特征在于：上述启动子C是通过添加选自阿魏酸、 香草酸、香兰素、苯甲酸、3-轻基苯甲酸、间苯二酷、4-轻基苯甲酸、2, 4-二轻基苯甲酸、果 糖和藏糖的化合物而诱导的启动子。
[0030] (17)化合物Q的制备方法，其特征在于：在抑制了启动子A转录的状态下、在碳源 的存在下培养（11)?（16)中任一项所述的原核生物。
[0031] (18)化合物Q的制备方法，其特征在于：在抑制了启动子A转录的状态下、在碳源 的存在下培养（11)?（16)中任一项所述的原核生物，之后施加诱导启动子B转录的处理， 使抑制物R的蛋白表达量增加，从而减少代谢物M的生成量、并增加化合物Q的生成量。 [003引（19)化合物Q的制备方法，其特征在于：在解除了启动子A的转录抑制的状态下、 在碳源的存在下培养（11)?（16)中任一项所述的原核生物，之后施加诱导启动子B转录 的处理，使抑制物R的蛋白表达量增加，从而减少代谢物M的生成量、并增加化合物Q的生 成量。
[003引 （20) (17)?（19)中任一项所述的化合物Q的制备方法，其特征在于：在碳源的 存在下培养（11)?（16)中任一项所述的原核生物，之后施加诱导上述启动子C转录的处 理，使上述酶Y的表达量增加，从而增加化合物Q的生成量。
[0034] (21) (17)?（20)中任一项所述的化合物Q的制备方法，其特征在于：上述化合 物P、上述化合物Q和上述代谢物M的组合为下述（j)?（W)中的任意一个， (j)化合物P为3-脱氨莽草酸、化合物Q为原儿茶酸、代谢物M为莽草酸； 化）化合物P为分支酸、化合物Q为氨茵酸、代谢物M为预苯酸； (l) 化合物P为预苯酸、化合物Q为4-轻基苯基丙丽酸、代谢物M为苯基丙丽酸； (m) 化合物P为预苯酸、化合物Q为前酪氨酸、代谢物M为苯基丙丽酸； (n) 化合物P为预苯酸、化合物Q为苯基丙丽酸、代谢物M为4-轻基苯基丙丽酸或前 酪氨酸； (O) 化合物P为2-氧代异戊酸、化合物Q为2-异丙基苹果酸、代谢物M为额氨酸； (P) 化合物P为2-氧代异戊酸、化合物Q为额氨酸、代谢物M为2-异丙基苹果酸； (q) 化合物P为谷氨酸、化合物Q为Y-谷氨醜磯酸、代谢物M为N-己醜谷氨酸； (r) 化合物P为谷氨酸、化合物Q为N-己醜谷氨酸、代谢物M为Y-谷氨醜磯酸； (S)化合物P为天冬氨酸、化合物Q为天冬醜胺、代谢物M为目-天冬氨醜磯酸； (t)化合物P为天冬氨酸目-半酵、化合物Q为2, 3-二氨化巧二駿酸、代谢物M为高 丝氨酸； (U) 化合物P为高丝氨酸、化合物Q为0-己醜高丝氨酸、代谢物M为高丝氨酸磯酸； (V) 化合物P为高丝氨酸、化合物Q为高丝氨酸磯酸、代谢物M为0-己醜高丝氨酸； (W) 化合物P为丝氨酸、化合物Q为0-己醜丝氨酸、代谢物M为甘氨酸。
[00巧](22) (21)的（j)所述的原儿茶酸的制备方法，其特征在于；上述酶X为莽草酸脱 氨酶，并且上述酶Y为3-脱氨莽草酸脱水酶。
[0036] (23) (22)所述的原儿茶酸的制备方法，其特征在于，选自编码原儿茶酸2, 3-双 加氧酶的基因、编码原儿茶酸3, 4-双加氧酶的基因、编码原儿茶酸4, 5-双加氧酶的基因 和编码原儿茶酸脱碳酸酶的基因的至少一个基因的性质为：通过向该基因的翻译区或其转 录?翻译调节区中导入1个W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突变，原儿茶酸的代谢活性 缺损或降低。
[0037] (24) (1)?（6)中任一项或（11)?（16)中任一项所述的原核生物，该原核生物 为谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌。
[00測发明效果 根据本发明，可W根据葡萄糖等碳源获得高效率地生产DHS或原儿茶酸等有用有机化 合物的微生物。另外，使用本发明的微生物时，可W使用不含芳族氨基酸的培养基高效率地 制备DHS或原儿茶酸等。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1显示通过利用作为基因Z的产物的抑制物R控制酶X(使从化合物P向代谢 物M转换的酶）的表达，制备从碳源到生长所必须的代谢物M的生物合成途径上的中间代 谢物即目标化合物P的方法。
[0040] 图2显示关于从碳源开始的芳族氨基酸的生物合成的莽草酸途径。
[0041] 图3显示通过用作为基因Z的产物的抑制物R控制酶的表达，制备从碳源到生长 所必须的代谢物M的生物合成途径上的目标化合物P，同时通过表达使从化合物P向化合物 Q转换的酶Y，制备目标化合物Q的方法。
[0042] 图4显示通过抑制物R对启动子A的转录抑制将酶X的表达维持在低水平、并限 制代谢物M的生产量，从而可W高效率地生产化合物P。
[0043] 图5显示在培养前期通过解除抑制物R对启动子A的转录抑制使酶X正常生产， 但在培养后期通过恢复抑制物R对启动子A的转录抑制，酶X的表达量大幅减少，化合物P 蓄积。
[0044] 图6显示在培养前期由于抑制物R的量少，所W通过启动子A的转录使酶X正常 生产，但在培养后期由于抑制物R的量增加，所W酶X的表达量大幅减少，化合物P蓄积。
[0045] 图7显示通过处于启动子B的控制下的基因Z所编码的抑制物R来抑制启动子的 转录，所W酶X的表达量大幅减少，化合物P蓄积，进而通过作为基因Z的产物的酶Y的作 用将化合物P转换成化合物Q。
[0046] 图8显示在培养前期通过解除抑制物R对启动子A的转录抑制而使酶X正常生产， 但在培养后期通过恢复抑制物R对启动子A的转录抑制，酶X的表达量大幅减少，蓄积的化 合物P通过酶Y的作用转换成化合物Q。
[0047] 图9显示在培养前期由于抑制物R的量少，所W通过启动子A的转录使酶X正常 生产，但在培养后期由于抑制物R的量增加，所W酶X的表达量大幅减少，蓄积的化合物P 通过酶Y的作用转换成化合物Q。
[0048] 图10显示在培养前期利用抑制物R对启动子A的转录抑制使酶X的表达维持在 低水平、并限制代谢物M的生产量，从而可W在使微生物增殖的同时生产少量的化合物P， 但在培养后期通过诱导表达将化合物P转换成化合物Q的酶Y使酶Y的表达量增加，从而 使化合物Q的生产量增加。
[0049] 图11显示在培养前期通过抑制物R对启动子A的转录抑制使酶X的表达维持在 低水平、并限制代谢物M的生产量，从而可W在使微生物增殖的同时生产少量的化合物P， 但在培养后期通过使抑制物R诱导表达W增加化合物P的蓄积量，同时诱导表达将蓄积的 化合物P转换成化合物Q的酶YW增加酶Y的表达量，从而使化合物Q的生产量增加。
【具体实施方式】
[0050] W下，利用图1和图3,对本发明进行详细说明。
[0051] 本发明的微生物是用于高效率地制备从碳源到生长所必须的代谢物M的生物合 成途径上的中间代谢物即目标化合物P的微生物，其具有W下所示的4个性质（a)?（d)。 该微生物优选为抑制物R的转录抑制系统发达W进行基因表达控制的原核生物。
[0052] (a)在与从该微生物所能利用的碳源到化合物P的生物合成有关的酶群中，任意 一个W上的酶的活性较该原核生物的野生株有所增强。
[0053] 化）通过在编码将化合物P转换成代谢物M的酶X的蛋白的野生型基因X的翻译 区、该基因的翻译调节区或促进基因X转录的启动子区中具有1个W上的核巧酸的取代、缺 失或添加的突变，酶X的活性缺损或降低。
[0054] (C)利用与促进上述基因X转录的本来的启动子不同、且转录被抑制物R的蛋白 抑制的启动子A，控制编码活性型酶X的DNA的转录。
[0055] (d)具有1拷贝W上的编码抑制物R的蛋白的基因Z，该基因的转录被该基因的本 来的启动子和/或不同于该启动子的诱导启动子B控制。
[0056] 对于与从葡萄糖等碳源到化合物P的生物合成途径有关的酶群中的任意一个W 上的酶，通过如下操作进行酶活性的增强和/或酶蛋白量的增加，可W对本发明中利用的 微生物赋予性质（a)。目P，通过利用向编码该酶蛋白的基因的翻译起始区导入突变、向该基 因的启动子区导入突变、将该启动子取代成其他强的启动子、对多拷贝质粒通过克隆等扩 增该基因、增加正向控制该基因转录的蛋白的表达和/或减少?缺损负向控制该基因转录 的蛋白的表达等方法，进行该酶活性的增强和/或该酶蛋白量的增加，可W增加化合物P的 生成量。或者，当为受到下游代谢物的反馈抑制的酶时，通过向酶蛋白中导入解除其反馈抑 制的氨基酸的突变，也可W增加化合物P的生成量。关于向该些DNA或蛋白中导入突变，可 W通过诱变处理等来进行，但也可W利用重组DNA技术或同源重组技术来进行。
[0057] 关于性质化）的赋予，可W利用诱变处理或重组DNA技术等使酶X的活性缺损，但 优选利用同源重组技术向野生型基因X的翻译区内导入缺失突变。该种情况下，若缺失整 个翻译区，则有时会因极性效果而抑制下游的基因表达，由此希望留下翻译区的5'侧部分 和3'侧部分，符合读框地向翻译区内导入缺失突变。另外，通过向基因X的翻译起始区周 边或促进基因X转录的启动子区中导入1个W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突变，也可 W使酶X的活性缺损。另外，通过将促进基因X转录的本来的启动子区取代成性质（C)所 述的启动子A的DNA，可W同时赋予性质化）和性质（C)。
[0058] 通过将编码活性型酶X的蛋白的DNA置于转录被抑制物R抑制的启动子A的控制 下，可W赋予性质（C)。启动子A是不同于促进上述基因X转录的本来的启动子的启动子， 并且只要转录被抑制物R抑制，则可W是任何的启动子。优选地，作为在大肠杆菌K-12株内 被抑制物R抑制的启动子A,可W列举；受到A瞻菌体的CI857基因产物的转录抑制的pL启动子或PR启动子、受到IacI基因产物的转录抑制的Iac启动子、或受到galR基因产物 的转录抑制的gal操纵子的启动子。另外，作为在ATCC13032株内被抑制物R抑制的启动 子A，可W列举；受到vanR(cg2615)基因（W下称作VanR基因）的产物（W下简记为VanR 抑制物）的转录抑制的VanA启动子、受到rhcR(cgl308)基因（W下称作rhcR基因）的产 物（W下简记为化CR抑制物）的转录抑制的rhcH(cgl309)基因（W下称作rhcH基因） 的启动子（W下简记为rhcH启动子）、或受到pcaR(cg2624)基因（W下称作pcaR基因） 的产物（W下简记为化aR抑制物）的转录抑制的pcal(cg2623)基因（W下称作pcal基 因）的启动子（W下简记为pcal启动子）。需要说明的是，基因X可W使用来自本发明的 微生物的基因，也可W使用来自不同于本发明的微生物的原核生物或真核生物的基因。
[0059] 本发明的微生物因赋予性质化）和性质（C)，使得在通常状态下酶X的表达量低。 但是，该微生物通过赋予性质（a)，而具有增加化合物P的量的突变，因此可W生产生长所 必需的量的代谢物M。当化合物P的生成量极低、生长差时，可W解除基于抑制物R的转录 抑制，使酶X的表达量上升，从而使该微生物的生长良好。
[0060] 不仅是通过制作编码抑制物R的蛋白的基因Z的野生型表达单元可W赋予性质 (d)，通过制作将基因Z置于不同于该基因的启动子的诱导启动子B的控制下的基因Z的表 达单元，也可W赋予性质（d)。在本发明的微生物中除了插入基因Z的野生型表达单元W 夕F，还可W插入置于诱导启动子B的控制下的基因Z的表达单元。关于抑制物R，只要是来 自原核生物的抑制物，则可W使用任何的抑制物，但优选使用通过添加诱导物质或温度变 化等可W解除抑制的抑制物。具体而言，当使用大肠杆菌K-12株作为本发明的微生物时， 例如，可W使用下述基因所编码的抑制物等；通过38CW上的培养而诱导的A瞻菌体的 CI857基因、通过添加乳糖而诱导的IacI基因、通过添加半乳糖而诱导的galR基因、或者通 过添加四环素而诱导的tetR基因。当使用ATCC13032株作为本发明的微生物时，例如可W 使用；通过添加阿魏酸、香草酸或香兰素来解除抑制的VanR抑制物、通过添加间苯二酷或 2, 4-二轻基苯甲酸来解除抑制的化CR抑制物、或者通过添加4-二轻基苯甲酸来解除抑制 的化aR抑制物。
[0061] 作为启动子B，只要是来自原核生物的诱导启动子，则可W使用任何的启动子。具 体而言，在大肠杆菌K-12株中表达基因Z时，可W使用A瞻菌体的pL启动子或PR启动 子、Iac启动子、gal操纵子的启动子、trp操纵子的启动子、或araBAD启动子等。另外，在 ATCC13032株中表达基因Z时，可W使用下述启动子：通过添加阿魏酸、香草酸或香兰素而 诱导的VanA启动子、通过添加间苯二酷或2, 4-二轻基苯甲酸而诱导的rhcH启动子、通过 添加4-轻基苯甲酸而诱导的pcal启动子、通过添加3-轻基苯甲酸而诱导的nagl(c的351) 基因（W下称作nadl基因）的启动子（W下简记为nagl启动子）、通过添加苯甲酸而诱导 的benA(cg2637)基因（W下称作benA基因）的启动子（W下简记为benA启动子）、或通 过添加果糖或藏糖中的任一种而诱导的cg2118基因的启动子或ptsS(cg2925)基因（W下 称作PtsS基因）的启动子。
[0062] 当本发明的微生物具有除了酶X W外的代谢化合物P的酶活性，在化合物P的制 备中该化合物的蓄积量有可能减少时，优选通过诱变处理或重组DNA技术，使该微生物所 具有的化合物P的代谢酶中任意一个W上的代谢酶的活性缺损或降低。
[006引本发明的微生物优选为属于棒状杆菌属似巧^^/^弘^^扣'^/曲^短杆菌属 脉沁riuffl)、节杆菌属地-化TO知C沁r)、类诺卡氏菌属（Abcar出oit/aceae)、微杆 菌属泌/cro知C沁ritt?)、链霉属菌（化re/7f(9化Fees)、拟无枝酸菌属C^fco7<3崎7sis)、红 球菌属（化0沁COCC化)、动球菌属体ineococc化)、不动杆菌属C^cinez^i^cz^r)、假单 胞菌属（/?^化/offlimas)、泛菌属（化/7拉6<3)、克雷伯氏菌属体7e如ie77a)和埃希氏菌属 肢'cAericAia)中的任一个属的原核生物。进一步优选，本发明的微生物为在氨基酸的发酵 生产中经常使用的谷氨酸棒状杆菌或性状已详细解析的大肠杆菌。
[0064] 使用了本发明的微生物的化合物P的制备方法例如可W列举；通过在含有碳源的 培养基中、在抑制了启动子A的转录的状态下进行培养，来制备目标化合物P的方法。在本 发明的微生物中，由于控制酶X的表达的启动子A的转录量被抑制物R抑制在低水平，所W 代谢物M的生产量受到限制，可W高效率地生产化合物P(图4)。
[0065] 在本发明的制备方法中，由于控制酶X的表达的启动子A的转录量低而导致该微 生物的生长缓慢时，还可W通过将化合物P的制备步骤分成培养前期和培养后期该两期来 制备目标化合物P。目P，在含有碳源的培养基中接种该微生物后，根据抑制物R的性质添加 诱导物质或者升高或降低培养温度等W解除转录抑制，从而增加酶X的表达量，继续培养。 之后，在适当的时期恢复抑制物R的抑制，W抑制酶X的表达，从而可W增加化合物P的生 产量（图5)。使用通过添加诱导物质而诱导的启动子A时，通过调节该诱导物质的添加量 使在培养后期该诱导物质耗尽，可W恢复基于抑制物R的抑制。使用通过升高或降低培养 温度而诱导的启动子A时，通过将培养温度恢复至抑制物R产生抑制的温度，可W恢复基于 抑制物R的抑制。
[0066] 优选通过使用将抑制物R的表达置于诱导启动子B的控制下的本发明的微生物， 将化合物P的制备步骤分成培养前期和培养后期该两期，来制备目标化合物P。目P，在含有 碳源的培养基中接种该微生物使菌体增殖，之后根据诱导启动子B的性质添加诱导物质或 者升高或降低培养温度，由此激活诱导启动子B，W增加抑制物R的生成量，从而抑制代谢 物M的生产，增加化合物P的生产量（图6)。
[0067] 如上所述，当采用利用了本发明的微生物的制备方法时，根据该微生物的增殖状 态或化合物P对该微生物的影响，使用相同的微生物来改变培养方法，从而可W容易地使 化合物P的生产量最大化。
[0068] 作为碳源，只要是本发明的微生物所能利用的碳源，则可W使用任何的碳源。例 女口，可W使用；葡萄糖、藏糖、果糖等糖类；己醇、甲醇等醇类；构稼酸、苹果酸、玻巧酸等有 机酸类；甘油、废糖蜜等。
[0069] 化合物P只要是由碳源生成生长所必须的代谢物的生物合成途径上的代谢物即 可，可W是任何的有机化合物。例如，可W列举DHS、谷氨酸、天冬氨酸和丝氨酸等。
[0070] D服可W通过控制生成莽草酸（代谢物M)的莽草酸脱氨酶（酶幻的表达来生产。 DHS除了可W用作抗氧化剂W外（美国专利5, 821，266)，还可用作使用微生物来制备原儿 茶酸或莽草酸等时的原料。
[0(m] 作为有用氨基酸的谷氨酸可W通过控制生成N-己醜谷氨酸（代谢物M)的N-己 醜转移酶（酶幻或生成Y-谷氨醜磯酸（代谢物M)的Y-谷氨醜激酶（酶幻的表达来 生产。
[0072] 作为有用氨基酸的天冬氨酸可W通过控制生成目-天冬氨醜磯酸（代谢物M)的 天冬氨酸激酶（酶幻或生成天冬醜胺（代谢物M)的天冬醜胺合成酶（酶幻的表达来生 产。
[0073] 作为有用氨基酸的丝氨酸可W通过控制生成甘氨酸（代谢物M)的丝氨酸轻甲基 转移酶（酶幻或生成0-己醜丝氨酸（代谢物M)的丝氨酸转移酶（酶幻的表达来生产。
[0074] 该里，作为更具体的例子，对来自高效率地生产D服的ATCC13032株的菌株进行详 述。需要说明的是，关于ATCC13032株的基因组序列，可W从美国国立生物技术信息中也 (^tionalCenterforBiotechnologyInformation,W下简记为NCBI)的GenBank(W下 简记为GB)数据库中，作为GB登录号BX927147而获得。另外，与其基本相同的基因组序列 也可W作为GB登录号NC_003450而获得，但在本说明书中，根据GB登录号BX927147的核 巧酸编号和基因名称而记作核巧酸的位置和基因名称。
[00巧]来自生产D服的ATCC13032株的菌株是指具有下述性质（aa)?（dd)的微生物。
[0076] (aa)在与从该菌株所能利用的碳源到DHS(化合物巧的生物合成有关的酶群中， 任意一个W上的酶的活性较野生株有所增强。
[0077] 化b)通过在编码将D服转换成莽草酸（代谢物M)的莽草酸脱氨酶（酶幻的蛋 白的野生型基因（基因X)的翻译区或翻译调节区、或者促进该基因转录的启动子区中具有 1个W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突变，由DHS向莽草酸转换的能力缺损或降低。就 ATCC13032株而言，作为编码活性型莽草酸脱氨酶的基因，有aroE3(cgl835)基因（互补链 核巧酸编号1，726, 078?1，726, 908的DNA区）、aroEl(cgl283)基因（互补链核巧酸编号 1，182, 337 ?1，183, 143 的DNA区）和qsuD(cg0504)基因（核巧酸编号 446, 537 ?447, 388 的DNA区）该3种，但通过向在由D服向莽草酸转换中发挥主要作用的aroE3基因中导入 突变，使该基因的活性型莽草酸脱氨酶的表达缺损或降低，也可W赋予性质化。而且，除了 aroE3基因的突变W外，对于qsuD基因和/或aroEl基因，通过导入使该基因的活性型莽草 酸脱氨酶的表达缺损或降低的突变，也可W赋予性质化。
[0078] (CC)通过不同于促进上述基因X转录的本来的启动子、且转录被抑制物R的蛋白 抑制的启动子A来控制编码活性型酶X的DNA的转录。
[0079] (dd)具有1拷贝W上的编码抑制物R的蛋白的基因Z，该基因的转录受到该基因 的本来的启动子和/或不同于该启动子的诱导启动子B的控制。
[0080] 如上所述，作为抑制物R，可W使用通过添加阿魏酸、香草酸或香兰素来解除抑制 的VanR抑制物、通过添加间苯二酷或2, 4-二轻基苯甲酸来解除抑制的化CR抑制物、或通 过添加4-二轻基苯甲酸来解除抑制的化aR抑制物。
[00則作为启动子A，作为在ATCC13032株内被抑制物R抑制的启动子A，可W列举读到VanR抑制物的转录抑制的VanA启动子、受到化cR抑制物的转录抑制的rh地启动子、或者 受到化aR抑制物的转录抑制的pcal基因的启动子。
[0082] 作为启动子B，可W使用；通过添加阿魏酸、香草酸或香兰素而诱导的VanA启动 子、通过添加间苯二酷或2, 4-二轻基苯甲酸而诱导的rhcH启动子、通过添加4-轻基苯甲 酸而诱导的pcal启动子、通过添加3-轻基苯甲酸而诱导的nagl启动子、通过添加苯甲酸 而诱导的benA启动子、或者通过添加果糖或藏糖中的任一种而诱导的cg2118基因的启动 子或PtsS启动子。
[0083] 通过将促进编码莽草酸脱氨酶（酶幻的蛋白的aroE3基因（基因X)转录的本来 的启动子区取代成性质（CC)所述的启动子A的DNA，可W同时赋予性质化b)和性质（CC)。
[0084] 关于上述性质（aa)的赋予，根据公知的经验，只要导入强化由DAHP生成畑S的途 径的突变、或增加DAHP的生成量的突变即可。
[00财 DAHP通过3-脱氨奎尼酸合成酶转换成3-脱氨奎尼酸（W下简记为D册)，D册再 通过D册脱水酶转换成D服。因此，通过向编码D册合成酶的基因aroB(cgl827)基因 下称作aroB基因）和/或编码D册脱水酶的aroD(cg0503)基因（W下称作aroD基因）的 转录?翻译调节区中导入突变，可W增强D册合成酶和/或D册脱水酶的表达量，增加D服 量。例如，通过将促进aroB基因和/或aroD基因的转录的本来的启动子取代成启动子活 性强的化启动子，可W增加D服量。
[0086] 另外，还可W通过增加DAHP量来增加D服量。作为增加DAHP量的方法，可W列举 下述方法；解除芳族氨基酸对DAHP合成酶的反馈抑制、增强DAHP合成酶的表达量、或者增 加作为DAHP合成酶底物的赤薛糖-4-磯酸（W下简记为E4巧或磯酸帰醇式丙丽酸（W下 简记为阳巧的量。
[0087]DAHP合成酶往往会受到色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的反馈抑制。已知通过向DAHP 合成酶中导入氨基取代突变等可W解除反馈抑制，因此向aroF(cgll29)基因（W下称作 aroF基因）和aroG(cg2391)基因（W下称作aroG基因）等DAHP合成酶基因中导入突变， 可W使DAHP量增加。
[008引作为增强DAHP合成酶的表达量的方法，可W列举向编码DAHP合成酶的基因的转 录?翻译调节区导入突变的方法。例如，通过将促进编码DAHP合成酶的基因转录的本来的 启动子取代成化启动子，可W增加DAHP量。
[0089] 作为增加DAHP合成酶底物即E4P的量的方法，可W列举：向编码转丽醇酶的 tkt(cgl774)基因（W下称作tkt基因）、编码转酵醇酶的tal(cgl776)基因（W下称作 cgl776基因）、或编码葡萄糖-6-磯酸1-脱氨酶的ZWf(cgl778)基因等与戊糖磯酸途径有 关的酶基因的转录?翻译调节区导入突变W增强该基因的表达的方法。
[0090] 另外，作为增加DAHP合成酶底物即阳P的量的方法，可W列举；向编码阳P合成酶 的pps(cg0644)基因或编码PEP駿激酶的pck(cg3169)基因的转录?翻译调节区导入突变 W增强该基因的表达的方法。
[0091] 而且，通过向编码丙丽酸激酶的pyk(cg2291)基因、编码阳P駿化酶的 ppc(cgl787)基因、或编码参与葡萄糖等糖的摄入的磯酸转移酶的基因组（cg2117基因等） 的任一个基因的翻译区或该基因的转录?翻译调节区导入突变，并抑制PEP的转换，也可W 增加阳P的量。
[0092] 可W向单独的基因中导入突变W赋予上述性质（aa)，但为了进一步提高畑S的生 成量，优选向上述基因中的多个基因中导入突变。
[0093] 来自具有上述的性质（aa)?（dd)的ATCC13032株的菌株根据葡萄糖等碳源可W 生产D服。由于编码D册脱水酶的aroD基因与编码将D服转换成原儿茶酸的D服脱水酶的 qsuB(cg0502)基因（W下称作qsuB基因）形成操纵子，所W为了赋予性质（aa)而通过启 动子取代来增加aroD基因的表达时，qsuB基因的表达也增加，从而导致蓄积的一部分DHS 转换成原儿茶酸。抑制向原儿茶酸转换时，优选向qsuB基因的翻译区或该基因的转录?翻 译调节区导入突变。
[0094] 当本发明的微生物除了具有上述的4个性质（a)?（d)还具有下述的性质（e)时， 通过使用该微生物，将从碳源到生长所必须的代谢物M的生物合成途径上的化合物P转换 成化合物Q，从而可W高效率地制备目标化合物Q。
[0095] (e)通过在编码由化合物P转换成化合物Q的酶Y的蛋白的基因y的翻译区、该 基因的翻译调节区或促进基因y转录的启动子区中具有1个W上的核巧酸的取代、缺失或 添加的突变，由化合物P到化合物Q的转换能力增强、或者基因y的表达受到不同于野生型 的控制。
[0096]关于性质（e)，由于在野生型的状态下酶Y的表达量往往不充分，所W通过向该基 因y的翻译调节区或促进基因y转录的启动子区中导入1个W上的核巧酸的取代、缺失或 添加的突变，使酶Y的表达量增强、或者将基因y的转录置于不同于野生型启动子的控制的 控制下，从而可W赋予性质（e)。另外，分支途径的最初的酶往往会受到最终产物的反馈抑 巧||，所W通过向基因y的翻译区内导入突变来解除该反馈抑制，使酶Y的活性增强，从而也 可W赋予性质（e)。
[0097] 优选通过将促进基因y转录的启动子的整个区域或一部分区域取代成不同于促 进该基因转录的本来的启动子和启动子A的启动子C的DNA，可W赋予性质（e)。
[0098] 作为启动子C，可W使用不同于基因y的本来的启动子、且不同于启动子A的启动 子。作为启动子C，还可W使用构成的表达启动子，但优选使用诱导启动子。作为诱导启动 子，还可W使用作为在上述性质（d)的赋予中使用的启动子B的例子而列举的启动子的任 意一种。
[0099]目P，作为启动子C，可W使用：A瞻菌体的pL启动子或pR启动子、Iac启动子、gal 操纵子的启动子、trp操纵子的启动子、或araBAD启动子等；或者通过添加阿魏酸、香草酸 或香兰素而诱导的VanA启动子、通过添加间苯二酷或2, 4-二轻基苯甲酸而诱导的rh地 启动子、通过添加4-轻基苯甲酸而诱导的pcal启动子、通过添加3-轻基苯甲酸而诱导的 nagl启动子、通过添加苯甲酸而诱导的benA启动子、或通过添加果糖或藏糖中的任一种而 诱导的cg2118基因的启动子或PtsS启动子。
[0100] 在性质（e)的赋予中使用的启动子C可W和在性质（d)的赋予中使用的启动子B 相同。另外，该启动子C还可W是：受到基于控制该启动子B转录的蛋白的转录控制的启动 子。
[0101] 由于本发明的微生物具有代谢化合物Q的酶活性，所W在化合物P的制备中该化 合物的蓄积量有可能减少的情况下，优选通过诱变处理或重组DNA技术，使该微生物所具 有的化合物P的代谢酶中的任意一个W上的代谢酶的活性缺损或降低。
[0102] 使用了本发明的微生物的化合物Q的制备方法例如可W列举；通过在含有碳源的 培养基中、在抑制了启动子A的转录的状态下进行培养，来制备化合物Q的方法。在本发明 的微生物中，由于控制酶X的表达的启动子A的转录量被抑制物R抑制在低水平，所W代谢 物M的生产量受到限制，可W由化合物P高效率地生产化合物Q(图7)。
[0103] 在本发明的制备方法中，由于控制酶X表达的启动子A的转录量低而导致该微生 物生长缓慢时，优选通过将化合物Q的制备步骤分成培养前期和培养后期该两期来制备化 合物Q。目P，将该微生物接种在含有碳源的培养基中，之后根据抑制物R的性质通过添加 诱导物质或升高或降低培养温度等来解除转录抑制，从而增加酶X的表达量W继续进行培 养。之后，在适当的时期恢复基于抑制物R的抑制，W抑制酶X的表达，从而可W增加由化 合物P生成化合物Q的量（图8)。使用通过添加诱导物质而诱导的启动子A时，调节该诱 导物质的添加量，W使该诱导物质在培养后期耗尽，从而可W恢复基于抑制物R的抑制。使 用通过升高或降低培养温度而诱导的启动子A时，通过将培养温度恢复至发生基于抑制物 R的抑制的温度，可W恢复基于抑制物R的抑制。
[0104] 优选使用将抑制物R的表达置于诱导启动子B的控制下的本发明的微生物，通过 将化合物Q的制备步骤分成培养前期和培养后期该两期来制备化合物Q。目P，将该微生物接 种在含有碳源的培养基中使菌体增殖，之后根据诱导启动子B的性质通过添加诱导物质或 者升高或降低培养温度来激活诱导启动子B，W增加抑制物R的生成量，从而可W抑制代谢 物M的生产，增加由化合物P生成化合物Q的量（图9)。
[0105] 在本发明的制备方法中，当化合物Q对本发明的微生物的增殖产生影响时，优选 使用将酶Y的表达置于诱导启动子C的控制下的微生物，通过将化合物Q的制备步骤分成 培养前期和培养后期该两期来制备化合物Q。目P，将该微生物接种在含有碳源的培养基中 使菌体增殖，之后根据诱导启动子C的性质，通过添加诱导物质或者升高或降低培养温度 来激活诱导启动子C的转录，W增加酶Y的生成量，从而可W增加由化合物P生成化合物Q 的量（图10)。而且，可W通过在培养后期激活诱导启动子C的转录W增加酶Y的生成量， 同时激活诱导启动子BW增加抑制物R的生成量，来抑制代谢物M的生产，增加由化合物P 生成化合物Q的量（图11)。
[0106] 该种情况下，通过使启动子C和启动子B成为相同的启动子，可W在同一时期进行 启动子C的诱导和启动子B的诱导。另外，当从受到同一控制蛋白的转录控制的启动子组 中选择启动子C和启动子B时，即使各自是不同的启动子，也可W在同一时期进行启动子C 的诱导和启动子B的诱导。
[0107] 如上所述，采用通过本发明的微生物进行的制备方法时，根据该微生物的增殖状 态或化合物Q对该微生物的影响，通过使用相同的微生物来改变培养方法，可W容易地使 化合物Q的生产量最大化。
[010引关于可W使用本发明的微生物来制备的化合物Q，在由碳源经由化合物P生成生 长所必须的代谢物M的生物合成途径或代谢途径中，只要可W由化合物P通过分支的途径 生成化合物Q，则也可W制备任何的化合物。
[0109] 化合物P只要是由碳源生成生长所必须的代谢物的生物合成途径上的代谢物即 可，可W是任何的有机化合物。例如，可W列举DHS、分支酸、预苯酸、2-氧代异戊酸、谷氨 酸、天冬氨酸、天冬氨酸目-半酵、高丝氨酸和丝氨酸等。化合物Q只要是通过用酶Y转换 化合物P而获得的物质即可，可W是任何的有机化合物。例如，可W列举原儿茶酸、氨茵 酸、4-轻基苯基丙丽酸、前酪氨酸、苯基丙丽酸、2-异丙基苹果酸、额氨酸、Y-谷氨醜磯酸、 N-己醜谷氨酸、天冬醜胺、2, 3-二氨化巧二駿酸和0-己醜高丝氨酸等。
[0110] 当化合物P为D服时，通过莽草酸脱氨酶（酶幻生成莽草酸（代谢物M)，但可W 通过D服脱水酶（酶Y)生产原儿茶酸（化合物巧。原儿茶酸除了作为医药、农药、香料等 的原料W外，还可用作使用微生物来制备被期待作为新的塑料原料的2-化喃丽-4, 6-二甲 酸时的原料。
[0111] 当化合物P为分支酸时，通过分支酸变位酶（酶幻生成预苯酸（代谢物M)，但可 W通过氨茵酸合成酶（酶巧生产氨茵酸（化合物巧。氨茵酸成为作为芳族氨基酸的色氨 酸等的合成原料，当该微生物具有色氨酸的生物合成途径时，还可W直接生产色氨酸。
[0112] 当化合物P为预苯酸时，通过预苯酸脱水酶（酶幻生成苯基丙丽酸（代谢物M)， 但本发明的微生物在大肠杆菌K-12株等中通过预苯酸脱氨酶（酶巧可W生产4-轻基苯 基丙丽酸（化合物曲。4-轻基苯基丙丽酸成为作为芳族氨基酸的酪氨酸的合成原料，当该 微生物具有由4-轻基苯基丙丽酸生成酪氨酸的生物合成途径时，还可W直接生产酪氨酸。
[0113]当化合物P为预苯酸时，通过预苯酸脱水酶（酶幻生成苯基丙丽酸（代谢物M)，但 本发明的微生物在谷氨酸棒状杆菌等中通过预苯酸转氨酶（酶巧可W生产前酪氨酸（化 合物曲。前酪氨酸成为作为芳族氨基酸的酪氨酸的合成原料，当该微生物具有由前酪氨酸 生成酪氨酸的生物合成途径时，还可W直接生产酪氨酸。
[0114] 当化合物P为预苯酸时，本发明的微生物在大肠杆菌K-12株等中通过预苯酸脱氨 酶（酶幻生成4-轻基苯基丙丽酸（代谢物M)，且本发明的微生物在谷氨酸棒状杆菌等中 通过预苯酸脱氨酶（酶幻生成前酪氨酸（代谢物M)，但通过预苯酸脱水酶（酶巧可W生 产苯基丙丽酸（化合物曲。苯基丙丽酸成为作为芳族氨基酸的苯丙氨酸的合成原料，当该 微生物具有苯丙氨酸的生物合成途径时，还可W直接生产苯丙氨酸。
[0115] 当化合物P为2-氧代异戊酸时，通过支链氨基酸氨基转移酶（酶幻生成额氨酸 (代谢物M)，但通过2-异丙基苹果酸合成酶（酶巧可W生产2-异丙基苹果酸（化合物 Q)。2-异丙基苹果酸成为亮氨酸的合成原料，当该微生物具有亮氨酸的生物合成途径时，还 可W直接生产亮氨酸。
[0116] 当化合物P为2-氧代异戊酸时，通过2-异丙基苹果酸合成酶（酶幻生成2-异 丙基苹果酸（代谢物M)，但通过支链氨基酸氨基转移酶（酶巧还可W生产额氨酸（化合物 曲。
[0117] 当化合物P为谷氨酸时，通过氨基酸-N-己醜转移酶（酶幻生成N-己醜谷氨酸 (代谢物M)，但通过Y-谷氨醜激酶（酶Y)可W生产Y-谷氨醜磯酸（化合物曲。Y-谷 氨醜磯酸成为脯氨酸的合成原料，当该微生物具有脯氨酸的生物合成途径时，还可W直接 生产脯氨酸。
[0118] 当化合物P为谷氨酸时，通过Y-谷氨醜激酶（酶幻生成Y-谷氨醜磯酸（代谢 物M)，但通过氨基酸-N-己醜转移酶（酶Y)可W生产N-己醜谷氨酸（化合物曲。N-己醜 谷氨酸成为精氨酸的合成原料，当该微生物具有精氨酸的生物合成途径时，还可W直接生 产精氨酸。
[0119] 当化合物P为天冬氨酸时，通过天冬氨酸激酶（酶幻生成目-天冬氨醜磯酸（代 谢物M)，但通过天冬醜胺合成酶（酶Y)可W生产天冬醜胺（化合物曲。
[0120] 当化合物P为天冬氨酸目-半酵时，通过高丝氨酸脱氨酶（酶幻生成高丝氨酸 (代谢物M)，但通过二轻基焦磯酸合成酶（酶巧可W生产2, 3-二氨化巧二駿酸（化合物 Q)。2, 3-二氨化巧二駿酸成为赖氨酸的合成原料，当该微生物具有由2, 3-二氨化巧二駿酸 生成赖氨酸的生物合成途径时，还可W直接生产赖氨酸。
[0121] 当化合物P为高丝氨酸时，通过高丝氨酸激酶（酶幻生成高丝氨酸磯酸（代谢物 M)，但通过高丝氨酸己醜转移酶（酶Y)可W生产0-己醜高丝氨酸（化合物曲。0-己醜高 丝氨酸成为甲硫氨酸的合成原料，当该微生物具有甲硫氨酸的生物合成途径时，还可W直 接生产甲硫氨酸。
[0122] 当化合物P为高丝氨酸时，通过高丝氨酸己醜转移酶（酶幻生成0-己醜高丝氨 酸（代谢物M)，但通过高丝氨酸激酶（酶幻可W生产高丝氨酸磯酸（化合物曲。高丝氨 酸磯酸成为苏氨酸或异亮氨酸的合成原料，当该微生物具有异亮氨酸的生物合成途径时， 还可W直接生产苏氨酸或异亮氨酸。
[0123]当化合物P为丝氨酸时，通过丝氨酸轻甲基转移酶（酶幻生成甘氨酸（代谢物M)， 但通过丝氨酸转移酶（酶Y)可W生产0-己醜丝氨酸（化合物曲。0-己醜丝氨酸成为半脫 氨酸的合成原料，当该微生物具有半脫氨酸的生物合成途径时，还可W直接生产半脫氨酸。
[0124] 编码与上述化合物Q的生产有关的酶Y的基因可W使用来自本发明的微生物的基 因，也可W使用来自不同于本发明的微生物的原核生物或真核生物的基因。例如，使用本发 明的微生物制备原儿茶酸时，由于ATCC13032株携带D服脱水酶基因，所W只要在原儿茶酸 的生产中使用该基因产物即可，但由于大肠杆菌K-12株未携带D服脱水酶基因，所W需要 使用来自其他微生物的DHS脱水酶基因。
[01巧]该里，作为更具体的例子，对高效率地生产原儿茶酸的菌株进行详述，所述原儿茶 酸可W通过对来自上述ATCC13032株的D服生产菌株赋予性质（ee)来制备。
[0126] 来自生产原儿茶酸的ATCC13032株的菌株，是指除了具有上述的性质（aa)?（dd) 还具有下述的性质（ee)的微生物。
[0127] (ee)利用不同于促进qsuB基因（基因y;核巧酸编号444, 184?446, 040)转录 的本来的启动子、并且不同于启动子A的启动子C来控制qsuB基因的转录，所述qsuB基因 编码由D服转换成原儿茶酸的D服脱水酶（酶Y)的蛋白 来自具有上述的性质（aa)?（ee)的ATCC13032株的菌株根据葡萄糖等碳源可W生 产原儿茶酸，但由于该菌株具有原儿茶酸双加氧酶，所W有可能分解所生成的原儿茶酸W 减少原儿茶酸的量。因此，优选通过向编码原儿茶酸4, 5-双加氧酶?a亚单元.蛋白的 pcaG(cg2630)基因（互补链核巧酸编号2, 511，382?2, 511，996))和/或编码原儿茶酸 4, 5-双加氧酶?目亚单元?蛋白的PC址(cg2631)基因（互补链核巧酸编号2, 512, 008? 2, 512, 700)的翻译区或该基因的转录?翻译调节区中导入1个W上的核巧酸的取代、缺失 或添加的突变，使该酶所具有的分解活性缺损或降低。
[0128]另外，该菌株具有将原儿茶酸的5位氨氧化、并催化向没食子酸转换的对轻基苯 甲酸轻化酶，所W有可能将生成的一部分原儿茶酸转换成没食子酸。因此，通过向编码对轻 基苯甲酸轻化酶?蛋白的PObB(cgl226)基因（互补链核巧酸编号1，126, 301?1，127, 488) 的翻译区或该基因的转录?翻译调节区中导入1个W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突 变，使该对轻基苯甲酸轻化酶所具有的氨氧化活性缺损或降低。
[0129] W下，在制备本发明的微生物时，对DNA克隆和突变导入株的制备方法进行阐述。 需要说明的是，如上所述，如果本发明的微生物是属于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、 类诺卡氏菌属、微杆菌属、链霉菌属、拟无枝酸菌属、红球菌属、动球菌属、不动杆菌属、假 单胞菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属和埃希氏菌的微生物，则可W使用任一种微生物，但对向 ATCC13032株进行突变导入的方法进行详细说明。需要说明的是，作为用于DNA克隆和导入 突变的宿主菌，主要使用大肠杆菌K-12株。
[0130] 上述的大肠杆菌K-12株和ATCC13032株分别通过通常用于培养大肠杆菌和棒状 杆菌属细菌的公知方法进行培养。培养后，利用公知的方法（例如化rrentprotocolsin molecularbiology中记载的方法）分离、纯化该微生物的染色体DM。利用限制酶消化法、 聚合酶链反应（PCR)法、或使用了合成DNA的杂交法等，可W由该染色体DNA获得包含编码 上述启动子或代谢酶等的DNA的片段。
[013。 作为用于连接DNAW进行DNA克隆或突变导入的大肠杆菌用载体，只要是在大肠 杆菌K-12株等中能够自主复制的载体，则可W使用质粒载体、瞻菌体载体等任一种，具体 而言，可W使用pUC19 [Gene, 33，103 (1985)]、pUC18、地R322 等。
[0132]用作上述载体的宿主的大肠杆菌，只要是属于大肠杆菌的微生物，则均可使用，具 体而言，可W列举大肠杆菌巧scherichiacoli)XLl-BlueMRF'[义I' 3夕,一シ公司制 造、Strategies, 5, 81 (1992)]、大肠杆菌JM109、大肠杆菌I3L21 等。
[0133] 向属于棒状杆菌属、短杆菌属、节杆菌属、类诺卡氏菌属、微杆菌属、链霉菌属、拟 无枝酸菌属、红球菌属、动球菌属、不动杆菌属、假单胞菌属、泛菌属、克雷伯氏菌属和埃希 氏菌属的微生物中导入上述DNA时，使用在该些微生物中能够进行自主复制的载体。优选 可W使用在任一种该微生物和大肠杆菌K-12株该两种微生物中能够自主复制的穿梭载 体，向作为宿主的该微生物中导入重组DNAd
[0134] 作为在棒状杆菌属细菌中能够自主复制的穿梭载体，可W列举pAM330(参照日本 特开昭58-67699号公报）、P歷1519 (参照日本特开昭58-77895号公报）等。另外，从该 些载体中取出具有在棒状杆菌内能够自主复制质粒的能力的DNA片段，将其插入大肠杆 菌-棒状杆菌用穿梭载体中时，可W用作在大肠杆菌和棒状杆菌两者中能够自主复制的载 体。例如，通过在作为大肠杆菌用载体的抑56298(夕力3W才公司制造）中插入谷氨酸 棒状杆菌ATCC13058株所具有的质粒PHM1519的复制区作为用于在棒状杆菌属株中复制质 粒的复制区，可W构建该穿梭载体。可W保持该穿梭载体。ATCC13032株和谷氨酸棒状杆菌 ATCC13058株可W从独立行政法人?制品评价技术基盘机构?生物遗传资源部口（W下简 记为NITC)获得。
[013引作为DNA的导入方法，只要是向上述宿主细胞中导入DNA的方法，则均可使用，例 女口，可W列举使用巧离子的方法〔Proc.化tl.Acad.Sci.USA, 69，2110 (1972))、电穿 孔法〔NucleicAcidsRes., 16，6127 (1988))等。向谷氨酸棒状杆菌中导入DNA还可W 通过vanderRest等人的方法〔Appl.Microbiol.Biotechnol., 52, 541 (1999))来进 行。
[0136] 可W从如上操作获得的转化体中提取DNA，确定该DNA中所含的本发明的DNA的核 巧酸序列。确定核巧酸序列时可W使用通常采用的核巧酸序列分析方法、例如双脱氧法〔Proc. Acad. Sci. USA, 74，5463 (1977))或3730x1型DNA测定仪（7 F .W才合义，厶乂公司制造）等核巧酸序列分析装置。
[0137] 另外，根据上述确定的DNA的核巧酸序列，通过使用パ一*才，才W才合义 ，厶《公司制造的8905型DNA合成装置等进行化学合成，也可W制备目标DNA。
[0138] 具有目标表型的菌株可W通过使用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基脈或己基甲賴酸 等突变剂的处理或照射UV或放射线等的突变处理、或自然突变等导入突变而获得。或者， 克隆该菌株的导入突变的区的DNA，在试管内（体外）向DNA中导入突变。当导入大的取代 突变时，在构建在该菌株内能够复制的载体上担载了应该取代的DNA的质粒后，将该质粒 导入该菌株中，或者还可W通过该质粒与染色体DNA之间的同源重组导入取代突变。关于 导入的突变的种类，只要体现出目标表型，则可W是核巧酸取代突变、缺失突变、插入突变 或与大的DNA片段的取代突变的任意一种，并且关于突变的大小，当为1个核巧酸W上时， 也可W是任何大小的突变。W下，只要没有特别说明，则突变的导入方法采用上述方法。
[0139]在本发明的微生物中，当需要通过除启动子或转录控制蛋白W外的手段来调节基 因的表达量时，可W通过调整核糖体结合序列与翻译起始密码子之间的距离、改变翻译起 始密码子周围的序列、或者改变翻译区内的核巧酸序列等来调节该基因的翻译起始效率。
[0140]将如此操作而获得的用于导入突变的DNA插入通常在大肠杆菌内能够复制的质 粒中，之后利用上述的DNA导入法导入作为宿主菌的谷氨酸棒状杆菌中。当该质粒是温度 敏感性载体时，通过高温培养选择，选出一次交叉型同源重组体；而当该质粒具有在宿主菌 内能够表达的卡那霉素耐性等抗生素耐性标志物时，通过该抗生素耐性选择，选出一次交 叉型同源重组体。为了获得在与该DNA片段相同的染色体区通过二次交叉型同源重组取代 了该DNA的突变株时，通常可W采用WJager等人〔J. Bacteriol.174，5462 (1992))开 发的使用枯草芽抱杆菌妨株的果聚糖藏糖酶基因（sacB基因）的 方法。采用藏糖耐性选择。采用本方法时，表达枯草芽抱杆菌168株的sacB基因的谷氨酸 棒状杆菌在含有藏糖的培养基中死亡，所W通过藏糖耐性选择可W获得通过二次交叉型同 源重组失去了果聚糖藏糖酶基因的突变株。
[0141]本发明的微生物的培养可W在含有碳源、氮源、无机盐、各种维生素等的普通的营 养培养基中进行，作为碳源，例如使用葡萄糖、藏糖、果糖等糖类、己醇、甲醇等醇类、构稼 酸、苹果酸、玻巧酸等有机酸类、甘油、废糖蜜等。作为氮源，例如将氨、硫酸馈、氯化馈、硝酸 馈、尿素等分别单独或混合使用。另外，作为无机盐，例如使用磯酸一氨钟、磯酸二氨钟、硫 酸镇等。此外，可W在培养基中添加蛋白腺、肉提取物、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白氨基酸、 生物素等各种维生素等营养素。
[0142] 培养通常在通气揽拌、振荡等需氧条件下进行。培养温度只要是本发明的微生物 能够生长的温度即可，没有特别限定，另外，对培养过程中的抑也没有特别限定，只要是本 发明的微生物能够生长的抑即可。培养中的抑调节可W通过添加酸或碱来进行。
[0143] 关于培养结束后的培养液中的目标有机化合物，根据需要，可W通过离也分离等 从该培养液中除去菌体等不溶成分后，例如通过将基于己酸己醋等有机溶剂的提取法、使 用活性炭的方法、使用离子交换树脂的方法、晶析法、盐析等沉淀法、蒸觸法等方法单独或 组合，来采集目标有机化合物。 实施例
[0144]W下，通过实施例，对作为本发明的微生物的、高效率地生产作为化合物P的DHS 的ATCC13032株的菌株的制作和利用该微生物进行的D服的制备方法进行具体阐述。另 夕F，通过实施例，对作为本发明的微生物的、高效率地生产作为化合物Q的原儿茶酸的 ATCC13032株的菌株的制作和利用该微生物进行的原儿茶酸的制备方法进行具体阐述。需 要说明的是，本发明并不限于该些实施例。
[0145] 实施例1.Pben-vanR株与N甜AaroE3AqsuBAqsuD株的D服生产性比较 如下操作，用化的发酵缸培养下述菌株：通过qsuB基因的符合读框缺失突变，失去了 从D服向原儿茶酸转换的能力，且aroE3基因的表达被处于benA启动子控制下的VanR基 因所编码的VanR抑制物抑制的化en-vanR株（参考例11) ;W及通过qsuB基因和qsuD基 因和aroE3基因的符合读框缺失突变，失去了从D服向莽草酸转换的能力和从D服向原儿 茶酸转换的能力的N甜AaroE3AqsuBAqsuD株（参考例10)，进行D服的生产性试验。需 要说明的是，由于与由DAHP合成DHS有关的4种基因（aroF、aroG、aroB和aroD基因）的 转录被化启动子控制，所W与野生株相比该些菌株的D服生成量增加。
[0146] 作为该些菌株的W前的培养和前培养用的培养基，使用CGXII培养基（20g/L的硫 酸馈、5g/L的尿素、Ig/L的磯酸二氨钟、Ig/L的磯酸氨二钟、0. 25g/L的硫酸镇走水合物、 lOmg/L的氯化巧、lOmg/L的硫酸亚铁走水合物、lOmg/L的硫酸猛五水合物、Img/L的硫酸锋 走水合物、0. 2mg/L的硫酸铜、0. 02mg/L的氯化媒六水合物、0. 2mg/L的生物素、20g/L的葡 萄糖、30mg/L的原儿茶酸、抑7. 0)。将该些菌株的1%的W前的培养液接种在前培养液中， 之后在3(TC下培养24小时。用CGXII培养基稀释使前培养液在600nm的吸光度达到3. 0， 之后只取1%到化发酵缸（工株式会社制造BMS-03NP2)内的0.化本培养用培养基 中。作为本培养用培养基，使用含有2.Ig/L的构稼酸酢和1.Og/L的硫酸铁? 7馬0的作为 CGXII培养基的CGCF培养基。W下，只要没有特别说明，则D服W及原儿茶酸的生产实验利 用该方法来进行。
[0147] 需要说明的是，由于N甜AaroE3AqsuBAqsuD株在CGXII培养基和CGCF培养基 中生长极差，所W在该些培养基中添加0. 5g/L的色氨酸、0. 4g/L的苯丙氨酸、0. 45g/L的酪 氨酸、17mg/L的莽草酸、45mg/L的维生素K2和14mg/L的对氨基苯甲酸进行培养。在本培 养开始后的适当时期采集培养液，用5%的己膳水溶液稀释至1000倍，利用高效液相色谱法 (Waters公司、LCTPremierXE)在表1的分离条件下进行分析，之后根据W浓度已知的D服 水溶液值服从Sigma公司购入）为对照的D服峰的面积比来计算。W下，D服的定量利用 该方法进行测定。
[014引关于化en-vanR株，在本培养开始时添加终浓度为5mM的苯甲酸，38小时后W 4.Og/小时的比例添加葡萄糖，再培养48小时。另一方面，关于N甜AaroE3AqsuBAqsuD 株，在本培养开始后45. 5小时的时刻W6.Og/小时的比例添加葡萄糖，再培养16. 5小时。 Pben-vanR株和N甜AaroE3AqsuBAqsuD株的D服的生产量分别在培养开始后第86小时 和第62小时达到最大，该些菌株的D服的最大生产量分别为15. 4g/L和7. 7g/L。由该结 果可知；与在含有芳族氨基酸等的培养基中培养的N甜AaroE3AqsuBAqsuD株相比，通过 VanR抑制物可W人为控制aroE基因表达的化en-vanR株即使在不含芳族氨基酸等的培养 基中培养，其D服的生产性也优异。
[0149][表1]
【权利要求】
1. 原核生物，该原核生物具有下述的（a)?（d)所述的所有性质，以调节将由碳源生 成生长所必须的代谢物M的生物合成途径中作为中间代谢物的化合物P转换成代谢物M的 酶X的表达量，从而使化合物P蓄积， (a) 在与从该原核生物所能利用的碳源到化合物P的生物合成有关的酶组中，任意一 个以上的酶的活性较该原核生物的野生株有所增强； (b) 通过在编码酶X的蛋白的野生型基因x的翻译区、该基因的翻译调节区或促进基 因x转录的启动子区中具有1个以上的核苷酸的取代、缺失或添加的突变，酶X的活性缺损 或降低； (c) 利用与促进上述基因x转录的本来的启动子不同、且转录被抑制物R的蛋白抑制 的启动子A来控制编码活性型酶X的DNA的转录； (d) 具有1拷贝以上的编码抑制物R的蛋白的基因z，该基因的转录被该基因的本来的 启动子和/或不同于该启动子的诱导启动子B控制。
2. 权利要求1所述的原核生物，其特征在于：性质（b)所述的促进基因x转录的启动 子区中的取代突变是将该启动子的整个区域或一部分区域取代成性质（c)所述的启动子A 的DNA的突变。
3. 权利要求1或2所述的原核生物，其特征在于：在上述原核生物所具有的代谢化合 物P的酶中，酶X以外的任意一个以上的代谢酶的活性缺损或降低。
4. 权利要求1?3中任一项所述的原核生物，其特征在于：上述启动子B是通过添加 选自阿魏酸、香草酸、香兰素、苯甲酸、3-羟基苯甲酸、间苯二酚、4-羟基苯甲酸、2, 4-二羟 基苯甲酸、果糖和蔗糖的化合物而诱导的启动子。
5. 权利要求1?4中任一项所述的原核生物，其特征在于：编码上述抑制物R的蛋白 的基因z为谷氨酸棒状杆菌ATCC13032株的vanR(cg2615)基因、pcaR(cg2624)基因、或 rhcR(cgl308)基因。
6. 权利要求1?5中任一项所述的原核生物，其特征在于：上述启动子A为谷氨酸 棒状杆菌ATCC13032株的vanA(cg2616)基因的启动子、pobA(cgl226)基因的启动子、 pcaH(cg2631)基因的启动子、或rhcH(cgl309)基因的启动子。
7. 化合物P的制备方法，其特征在于：在抑制了启动子A转录的状态下、在碳源的存在 下培养权利要求1?6中任一项所述的原核生物。
8. 化合物P的制备方法，其特征在于：在抑制了启动子A转录的状态下、在碳源的存在 下培养权利要求1?6中任一项所述的原核生物，之后施加诱导启动子B转录的处理，使抑 制物R的蛋白表达量增加，从而减少代谢物M的生成量。
9. 化合物P的制备方法，其特征在于：在解除了启动子A的转录抑制的状态下、在碳源 的存在下培养权利要求1?6中任一项所述的原核生物，之后施加诱导启动子B转录的处 理，使抑制物R的蛋白表达量增加，从而减少代谢物M的生成量。
10. 权利要求7?9中任一项所述的化合物P的制备方法，其特征在于，上述化合物P 和上述代谢物M的组合为下述（f)?（i)中的任意一个： (f) 化合物P为3-脱氢莽草酸、代谢物M为莽草酸； (g) 化合物P为谷氨酸、代谢物M为N-乙酰谷氨酸或Y-谷氨酰磷酸； (h) 化合物P为天冬氨酸、代谢物M为0 -天冬氨酰磷酸； (i) 化合物P为丝氨酸、代谢物M为甘氨酸。
11. 权利要求1?6中任一项所述的原核生物，其特征在于：除了具有（a)?（d)所述 的性质以外，还具有下述的性质（e)，以通过酶Y将蓄积的化合物P转换成化合物Q， (e)通过在编码酶Y的蛋白的基因y的翻译区、该基因的翻译调节区或促进基因y转 录的启动子区中具有1个以上的核苷酸的取代、缺失或添加的突变，由化合物P向化合物Q 转换的能力增强、或者基因y的表达受到不同于野生型的控制。
12. 权利要求11所述的原核生物，其特征在于：在上述原核生物所具有的代谢化合物 Q的酶中，任意一个以上的代谢酶的活性缺损或降低。
13. 权利要求11或12所述的原核生物，其特征在于：性质（e)所述的促进基因y转录 的启动子区中的取代突变是将该启动子的整个区域或一部分区域取代成不同于促进该基 因转录的本来的启动子和启动子A的启动子C的DNA的突变。
14. 权利要求13所述的原核生物，其特征在于：上述启动子C与启动子B相同、或者上 述启动子C受到控制启动子B转录的蛋白的转录控制。
15. 权利要求13或14所述的原核生物，其特征在于：上述启动子C为诱导启动子。
16. 权利要求15所述的原核生物，其特征在于：上述启动子C是通过添加选自阿魏酸、 香草酸、香兰素、苯甲酸、3-羟基苯甲酸、间苯二酚、4-羟基苯甲酸、2, 4-二羟基苯甲酸、果 糖和蔗糖的化合物而诱导的启动子。
17. 化合物Q的制备方法，其特征在于：在抑制了启动子A转录的状态下、在碳源的存 在下培养权利要求11?16中任一项所述的原核生物。
18. 化合物Q的制备方法，其特征在于：在抑制了启动子A转录的状态下、在碳源的存 在下培养权利要求11?16中任一项所述的原核生物，之后施加诱导启动子B转录的处理， 使抑制物R的蛋白表达量增加，从而减少代谢物M的生成量，并增加化合物Q的生成量。
19. 化合物Q的制备方法，其特征在于：在解除了启动子A的转录抑制的状态下、在碳 源的存在下培养权利要求11?16中任一项所述的原核生物，之后施加诱导启动子B转录 的处理，使抑制物R的蛋白表达量增加，从而减少代谢物M的生成量，并增加化合物Q的生 成量。
20. 权利要求17?19中任一项所述的化合物Q的制备方法，其特征在于：在碳源的存 在下培养权利要求11?16中任一项所述的原核生物，之后施加诱导上述启动子C转录的 处理，使上述酶Y的表达量增加，从而增加化合物Q的生成量。
21. 权利要求17?20中任一项所述的化合物Q的制备方法，其特征在于，上述化合物 P、上述化合物Q和上述代谢物M的组合为下述（j)?（w)中的任意一个： (j) 化合物P为3-脱氢莽草酸、化合物Q为原儿茶酸、代谢物M为莽草酸； (k) 化合物P为分支酸、化合物Q为氨茴酸、代谢物M为预苯酸； (l) 化合物P为预苯酸、化合物Q为4-羟基苯基丙酮酸、代谢物M为苯基丙酮酸； (m) 化合物P为预苯酸、化合物Q为前酪氨酸、代谢物M为苯基丙酮酸； (n) 化合物P为预苯酸、化合物Q为苯基丙酮酸、代谢物M为4-羟基苯基丙酮酸或前 酪氨酸； (〇)化合物P为2-氧代异戊酸、化合物Q为2-异丙基苹果酸、代谢物M为缬氨酸； (P)化合物P为2-氧代异戊酸、化合物Q为缬氨酸、代谢物M为2-异丙基苹果酸； (q) 化合物P为谷氨酸、化合物Q为Y-谷氨酰磷酸、代谢物M为N-乙酰谷氨酸； (r) 化合物P为谷氨酸、化合物Q为N-乙酰谷氨酸、代谢物M为Y-谷氨酰磷酸； (s) 化合物P为天冬氨酸、化合物Q为天冬酰胺、代谢物M为天冬氨酰磷酸； (t) 化合物P为天冬氨酸0 -半醛、化合物Q为2, 3-二氢吡啶二羧酸、代谢物M为高 丝氨酸； (u) 化合物P为高丝氨酸、化合物Q为0-乙酰高丝氨酸、代谢物M为高丝氨酸磷酸； (v) 化合物P为高丝氨酸、化合物Q为高丝氨酸磷酸、代谢物M为0-乙酰高丝氨酸； (w) 化合物P为丝氨酸、化合物Q为0-乙酰丝氨酸、代谢物M为甘氨酸。
22. 权利要求21的（j)所述的原儿茶酸的制备方法，其特征在于：上述酶X为莽草酸 脱氢酶，并且上述酶Y为3-脱氢莽草酸脱水酶。
23. 权利要求22所述的原儿茶酸的制备方法，其特征在于，选自编码原儿茶酸2, 3-双 加氧酶的基因、编码原儿茶酸3, 4-双加氧酶的基因、编码原儿茶酸4, 5-双加氧酶的基因 和编码原儿茶酸脱碳酸酶的基因的至少一个基因的性质为：通过向该基因的翻译区或其转 录?翻译调节区中导入1个以上的核苷酸的取代、缺失或添加的突变，原儿茶酸的代谢活性 缺损或降低。
24. 权利要求1?6中任一项或权利要求11?16中任一项所述的原核生物，该原核 生物为谷氨酸棒状杆菌或大肠杆菌。
【文档编号】C12P7/42GK104379729SQ201380032679
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年7月3日 优先权日:2012年7月3日
【发明者】饭田甲悟, 岩崎卓己, 西达也 申请人:株式会社吉那里斯