核酸复合物及核酸多糖复合物的制作方法【专利摘要】本发明的课题在于提供一种即使在生物体内也不会在DNA与RNA的连结部被分解的核酸复合物，作为该课题的解决手段，提供一种核酸复合物，所述核酸复合物为单链DNA的3'侧末端的脱氧核糖核苷酸残基的3'位与双链RNA中的一条核糖核苷酸链的5'侧末端的核糖核苷酸残基的5'位结合的核酸复合物，其中，与单链DNA结合的核糖核苷酸链的5'侧末端核苷酸的2'位的羟基被烷氧基或卤素基团置换，和/或与单链DNA结合的最初的核糖核苷酸的3'位与和其相邻的核糖核苷酸的5'位之间的磷酸二酯基被硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基中的任一个置换。【专利说明】核酸复合物及核酸多糖复合物【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种提高包含DNA与RNA的核酸复合物的血清中稳定性的技术。【
背景技术：
】[0002]人类基因组的解读，已经在距离发现DNA双螺旋结构的1953年之后的第50年、即2003年完成。目前，正在进行阐明各种蛋白质的活性机理以及蛋白质间的相互作用。并且最近逐渐了解到，不编码蛋白质的RNA控制着基因的转录、翻译。作为应用这样的成果的方法之一，提出了使用具有生理活性的短人工核酸（核酸药物）操控生物体功能的技术。[0003]小干扰RNA(smallinterferingRNA，即siRNA)是由21?23个喊基对构成的低分子双链RNA。siRNA参与被称为RNA干扰（RNAi)的现象（参照非专利文献1)、序列特异性地阻遏信使RNA(mRNA)，抑制蛋白质表达。通常认为，该现象是生物体作为应对病毒感染等的防御机制的一环节而逐渐进化形成的。由于仅基于基因序列信息就能够设计出，因此不需要如此前的低分子药物那样的大规模筛选，此外，由于能够特异性地阻遏特定基因，因此认为副作用小，预期将成为新一代治疗药。[0004]但是，作为天然型核酸的磷酸酯型RNA，在生物体内由于核酸酶、与蛋白质的非特异性吸附会在极短时间内失活。因此，天然型核酸药品在人类临床研宄中并未带来有意义的效果。为了解决天然型核酸这样的在生物体环境内和培养液中短时间内失活的问题，提出了多种对天然型核酸进行化学修饰而成的化学修饰核酸。尤其已知的是：例如将核糖的2'-位的羟基用甲氧基（2'-0_甲基）（参照非专利文献2)、氟（F)(参照非专利文献3)、锁式核酸（lockednucleicacid)(LNA)(参照非专利文献4)进行化学修饰而得到的化学修饰核酸。此外，还报道了这样的化学修饰使得siRNA与靶mRNA的结合亲和性提高。[0005]将这样的化学修饰核酸称为核酸类似物。核酸类似物与天然型核酸相比成功地大幅度延长了失活时间。这是由于核酸酶无法识别核酸类似物。但是，产生了在生物体内与蛋白质发生非特异性吸附、无法预期的生理活性、引起重度肝损伤等由非天然所带来的毒性问题。[0006]还提出了如下技术：将天然型核酸包封至具有生物体适合性的化合物中，保护核酸不被分解，并且改善膜透过性从而将核酸导入细胞内。逆转录病毒（参照非专利文献5)或腺病毒（参照非专利文献6)等虽然已经获知作为基因载体在体外是极有前途的，但是这些天然来源的病毒的炎症性、免疫原性、以及诱导突变及重组到细胞基因组中风险性也备受指摘，这些使其在体内的使用受到限制。[0007]因此，提出了一种作为天然来源的基因载体的代替物的、不仅操作比病毒系统简单而且能够使DNA切实向细胞高效率集中的、人工材料作为非病毒载体的用途（参照非专利文献7)。迄今为止，作为非病毒性的人工核酸载体，已经开发出聚乙二醇修饰的多聚阳离子（参照非专利文献8)、聚乙烯亚胺（参照非专利文献9)、阳离子性聚合物的嵌段共聚物(参照非专利文献10)、树枝状高分子（参照非专利文献11)等。但是，这样的阳离子性高分子的安全性尚未确认。为了具有阳离子性，氨基的存在是必不可少的，但是氨基的生理活性高，存在体内毒性等风险。[0008]本发明人着眼于此前作为基因载体的β-1，3-葡聚糖，已经发现了β-1，3-葡聚糖与核酸药物（反义DNA、CpGDNA)形成新型的复合物的现象（参照专利文献1、2,非专利文献12、13、14)。[0009]我们发现，将天然以3螺旋存在的β-1，3-葡聚糖溶解于二甲基亚砜（DMSO)等非质子性极性有机溶剂、或0.IN以上的碱溶液使其解离为单链后，加入单链的核酸，使溶剂变为水或恢复至中性，由此形成了由1分子核酸与2分子多糖构成的3螺旋复合物。我们认为，此时，3螺旋复合物中的多糖分子与核酸分子主要是通过氢键与疏水性相互作用而形成分子间结合的（参照非专利文献15)。[0010]如上所述，已经报道了与β-1，3-葡聚糖复合化的核酸为单链核酸，尤其聚脱氧腺嗓呤（polydA)、聚胞喃啶（polyC)与以西佐喃（sizofiran，SPG)为首的β-1，3-葡聚糖显示出强亲和性。[0011]对于以β-1，3-葡聚糖作为SiRNA的载体应用于RNAi也进行了研宄。但是，SiRNA为双链核酸，因此不能直接与β-1，3-葡聚糖形成复合物。因此，为了与SPG等β-1，3-葡聚糖复合化，准备了对siRNA的正义链附加poly(dA)而成的DNA-RNA杂化核酸，使其与siRNA的反义链退火，从而制作了poly(dA)-siRNA。然后，利用poly(dA)部分与SPG进行复合化。[0012]现有技术文献[0013]专利文献[0014]专利文献1:国际公开第01/34207号小册子[0015]专利文献2:国际公开第02/072152号小册子[0016]非专利文献[0017]非专利文献I:siRNAs:applicationsinfunctionalgenomicsandpotentialastherapeutics(小干扰RNA用于基因治疗的研究进展）.Y.Dorsett，T.Tuschl，Nat.Rev.DrugDiscovery(药物的发现）3(2004)318-329.[0018]非专利文献2:Evaluationof29-modifiedoligonucleotidescontaining29-deoxygapsasantisenseinhibitorsofgeneexpression(含有29-脱氧空隙的29-改性寡聚核苷酸作为基因表达的反义阻遏剂的评价）.B.Monia，E.Lesnick，C.Gonzalez,W.Lima,D.McGee,C.GuinossojA.Kawasaki,P.Cook,S.FreierjJ.Biol.Chem.(^物化学）268(1993)14514-14522.[0019]非专利文献3:Potentgene-specificinhibitorypropertiesofmixed-backboneantisenseoligonucleotidescomprisedof2'-deoxy-2J-fluoro-D-arabinoseand2J-deoxyribosenucleotides(包括-脱氧-2'-氟代-D-阿拉伯糖和2'-脱氧核糖核苷酸的骨架混合的反义寡聚核苷酸的潜在基因特异性阻遏性研究）.C.N.Lok，E.Viazovkine，K.LMin，C.J.Wilds，M.J.Damha，M.A.Parniak，Biochemistry(生物化学）41(2002)3457-3467.[0020]非专利文献4:2'-〇,4'-C-ethylene-bridgednucleicacids(ENA):highlynuclease-resistantandthermodynamicallystableoligonucleotidesforantisensedrug(2'-0,4'-C-乙稀桥联的核酸（ENA):用作反义药物的高耐核酸性和热动力学稳定寡聚核苷酸）·Κ·Morita，C.Hasegawa，Μ·Kaneko,S.Tsutsumi，J.Sone，Τ·Ishikawa，Τ·ImanishiandΜ·Koizumi，Med.Chem.Lett.(药物化学通讯），12,73-76(2002)[0021]非专利文献5:Humangenetherapycomesofage(人类基因治疗时代的来临）·A.D.Miller，Nature(自然），357,455-460(1992)[0022]非专利文献6:Thebasicscienceofgenetherapy(基因治疗的基本基础科学）·R.C.Mulligan，Science(科学），14,926-932(1993)[0023]非专利文献7:Controllablegenetherapypharmaceuticsofnon-viralgenedeliverysystems(非病毒基因传输体系的可控基因治疗药物）·E.TomlinsonandA.P.Rolland，J.ControlRelease(控释杂志），39,357-372(1996)[0024]非专利文献8:BreathingLifeintoPolycations!FunctionalizationwithpH-ResponsiveEndosomolyticPeptidesandPolyethyleneGlycolEnablessiRNADelivery(注入生命多聚阳离子：具有pH响应的内溶酶体多肽的功能化和聚乙二醇使小干扰RNA的传递）·M.Meyer，A.Philipp，R.Oskuee，C.SchmidtandE.Wagner，J.Am.Chem.Soc.(美国化学会期刊），l3〇,3272_3273(2〇〇8)[0025]非专利文献9:RNAinterference-mediatedgenesilencingofpleiotrophinthroughpolyethylenimine-compIexedsmallinterferingRNAsinvivoexertsantitumoraleffectsinglioblastomaxenografts(通过与聚乙稀亚胺复合的小干扰RNA的多效性的RNA干扰介导的基因沉默在体内进行胶质母细胞瘤异体移植的抗肿瘤效果）·M.Grzelinski，B.Urban-Klein，T.Martens，K.Lamszus，ILBakowsky，S.Hobel，RCzubaykoandA.Aigner，Hum.Gene.Ther.(基因治疗），17,751-766(2006)[0026]非专利文献10:MonomolecularAssemblyofsiRNAandPoly(ethyleneglycol)-PeptideCopolymers(小干扰RNA与聚乙二醇-多肽共聚物的单分子组装）·J.DeRouchey，C.Schmidt，G.F.Walker，C.Koch，C.Plank，E.WagnerandJ.0·Raedler，Biomacromolecules(生物大分子），9,724-732(2008)[0027]非专利文献11:Tat_conjugatedPAMMdendrimersasdeliveryagentsforantisenseandsiRNAoligonucleotides(TAT共辄的PAMM树状高分子作为用于反义和小干扰RNA寡聚核苷酸的运输试剂）.H.Kang，R.DeLong，Μ.H.FisherandR.LJuliano,Pharm.Res.(药物研究），22,2099-2106(2005)[0028]非专利文献12:MolecularRecognitionofAdenine，Cytosine，andUracilinaSingle-StrandedRNAbyaNaturalPolysaccharide(通过天然多糖在单链RNA中的腺口票呤、胞啼啶和尿啼啶的分子识别：Schizophyllan.Κ·SakuraiandS.Shinkai，J.Am.Chem.Soc.(美国化学会期刊），l22,452〇-4521(2〇00)[0029]非专利文献13:Polysaccharide-PolynucleotideComplexes(多糖-多核苷酸配合物）·2.ComplementaryPolynucleotideMimicBehavioroftheNaturalPolysaccharideSchizophyllanintheMacromolecularComplexwithSingle-StrandedRNAandDNA(在与单链RNA和DNA复合的大分子复合物中天然多糖裂裥菌素的补充性模拟多核苷酸行为）·K.Sakurai，M.MizuandS.Shinkai，Biomacromolecules(生物大分子），2,641-650(2001)[0030]非专利文献14:Dectin_ltargetingdeliveryofTNF-aantisenseODNscomplexedwithβ-1，3-glucanprotectsmicefromLPS-inducedhepatitis(C型凝集素受体Dectin-I靶向复合有β-1，3-葡聚糖的TNF-α反义ODNs的传递保护小鼠免得LPS-诱导肝炎·S.Mochizuki,Κ.Sakurai,J.Control.Release(控释杂志），151，（2011)155-161.[0031]非专利文献15:StructuralAnalysisoftheCurdlan/Poly(cytidylicacid)ComplexwithSemiempiricalMolecularOrbitalCalculations(米用半经验分子轨道理论对凝胶多糖/聚胞苷酸复合物的结构分析评估.K.Miyoshi,K.Uezu,K.SakuraiandS.Shinkai,Biomacromolecules(生物大分子），6,1540-1546(2005)【
发明内容】[0032]发明要解决的技术问题[0033]但是，DNA-siRNA核酸复合物相对于生物体内广泛存在的核糖核酸酶并不稳定，因此与RNA同样存在在生物体内容易被迅速分解的问题。事实上，在为了评价DNA-siRNA核酸复合物的血清中稳定性而将核酸复合物在10%血清中孵育后、使用聚丙烯酰胺凝胶电泳确认分子量的变化时，确认到了在DNA与SiRNA的结合部分被切断而得到的条带。这一现象在与β-1，3-葡聚糖复合化而得的核酸复合物中也观察到过，我们认为，即使将复合物投与到生物体内，其也会被迅速切断成DNA与RNA，导致DNA-siRNA核酸复合物的细胞导入效率降低、靶基因的沉默活性降低等。[0034]本发明是鉴于上述问题而作出的，提供一种即使在生物体内也不会在DNA与RNA的结合部发生分解的核酸复合物。[0035]用于解决问题的技术方案[0036]本发明的第1方案通过提供一种核酸复合物从而解决了上述问题，所述核酸复合物为单链DNA的3'侧末端的脱氧核糖核苷酸残基的3'位与双链RNA中的一条核糖核苷酸链的5'侧末端的核糖核苷酸残基的5'位结合的核酸复合物，其中，与前述单链DNA结合的前述核糖核苷酸链的5'侧末端核苷酸的2'位的羟基被烷氧基或卤素原子置换。[0037]本发明的第2方案通过提供一种核酸复合物从而解决了上述问题，所述核酸复合物为单链DNA的3'侧末端的脱氧核糖核苷酸残基的3'位与双链RNA中的一条核糖核苷酸链的5'侧末端的核糖核苷酸残基的5'位结合的核酸复合物，其中，与前述单链DNA结合的最初的核糖核苷酸的3'位与和其相邻的核糖核苷酸的5'位之间的磷酸二酯基被硫代磷酸酯基（硫代磷酸酯基：-〇-p〇⑶-〇-，具有将磷酸基的P=〇置换成P=S的结构。）、二硫代磷酸二酯基（-O-PS(S)-O-)及三硫代磷酸二酯基（-O-PS(S)-S-)中的任一个置换。[0038]本发明的第1及第2方案中，前述单链DNA的核苷酸数可以为10以上。此外，本发明的第1及第2方案中，前述单链DNA可以为聚脱氧腺嘌呤。[0039]本发明的第1及第2方案中，可以是前述单链DNA的磷酸二酯基中的至少一部分被硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基中的任一个置换。此外，此时可以是前述单链DNA的磷酸二酯基中的至少50%以上被硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基中的任一个置换。[0040]本发明的第1及第2方案中，前述双链RNA可以为siRNA。此外，此时，前述siRNA可以为21mer型或27mer型。进而，前述siRNA的革El基因可以为在表达Dectin-I的细胞中表达的基因。[0041]本发明的第3方案通过提供一种核酸多糖复合物从而解决了上述问题，所述核酸多糖复合物中，1分子的本发明第1及第2方案的核酸复合物的单链DNA部位与2分子的具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖形成3螺旋结构。[0042]本发明的第3方案中，前述具有β-1，3-葡聚糖骨架的多糖优选为西佐喃。[0043]本发明的第4方案通过提供一种药物组合物从而解决了上述问题，所述药物组合物包含本发明的第3方案的核酸多糖复合物。[0044]本发明的第5方案通过提供一种核酸复合物的稳定化方法从而解决了上述问题，所述核酸复合物的稳定化方法为增大核酸复合物对于核糖核酸酶的稳定性的方法，所述核酸复合物为单链DNA的3'侧末端的脱氧核糖核苷酸残基的3'位与双链RNA中的一条核糖核苷酸链的5'侧末端的核糖核苷酸残基的5'位结合的核酸复合物；其中，用烷氧基或卤素原子置换与前述单链DNA结合的前述核糖核苷酸链的5'侧末端核苷酸中的2'位的羟基。[0045]本发明的第6方案通过提供一种核酸复合物的稳定化方法从而解决了上述问题，所述核酸复合物的稳定化方法为增大核酸复合物对于核糖核酸酶的稳定性的方法，所述核酸复合物为单链DNA的3'侧末端的脱氧核糖核苷酸残基的3'位与双链RNA中的一条核糖核苷酸链的5'侧末端的核糖核苷酸残基的5'位结合的核酸复合物；其中，用硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基中的任一个置换与前述单链DNA结合的最初的核糖核苷酸的3'位与和其相邻的核糖核苷酸的5'位之间的磷酸二酯基。[0046]发明的效果[0047]通过在单链DNA的3'侧末端的脱氧核糖核苷酸残基的3'位与双链RNA中的一条核糖核苷酸链的5'侧末端的核糖核苷酸残基的5'位结合的DNA-RNA核酸复合物中，用烷氧基或卤素原子置换与单链DNA结合的核糖核苷酸链的5'侧末端核苷酸中的2'位的羟基、或用硫代磷酸酯基、二硫代磷酸二酯基及三硫代磷酸二酯基中的任一者置换与单链DNA结合的最初的核糖核苷酸的3'位与和其相邻的核糖核苷酸的5'位之间的磷酸二酯基，聚脱氧核糖核苷酸与聚核糖核苷酸的结合部的稳定性提高，即使在生物体内也不易被水解。因此，本发明的核酸复合物在生物体内不会被迅速分解而丧失功能，能够维持原本的功能。例如，在由siRNA的5'侧末端侧结合有poly(dA)等用于与β-1，3-葡聚糖（西佐喃等）形成稳定复合物的聚脱氧核苷酸的核酸复合物、与β-1，3-葡聚糖形成的核酸多糖复合物中，应用本发明的核酸复合物时，在细胞质内不会被分解、能够切实地将siRNA递送到细胞核，可以预期会增大利用RNA干扰来抑制致病基因表达的核酸药物的有用性及治疗效果。【专利附图】【附图说明】[0048]图1为表示dA40-siRNA的血清中分解实验（实施例1)的结果的凝胶荧光图像。[0049]图2A为表示使用5'侧末端附加了FITC的反义链调制的荧光修饰dAlO-siRNA的血清中分解物的鉴定实验（实施例2)结果的凝胶荧光图像。[0050]图2B为表示使用3'侧末端附加了FITC的反义链调制的荧光修饰dAlO-siRNA的血清中分解物的鉴定实验（实施例2)结果的凝胶荧光图像。[0051]图2C为表示dA-siRNA的分解反应的图像图。[0052]图3为表示2'-0-甲基修饰对于RNA的分解产生的效果（实施例3)的凝胶荧光图像。[0053]图4为表示2'-O-甲基修饰对于单链RNA的分解产生的效果（实施例4)的凝胶荧光图像。[0054]图5为表示2'-0_甲基修饰位置对于血清中的核酸复合物的分解产生的效果（实施例5)的凝胶荧光图像。[0055]图6为表示碱基的种类对DNA的分解产生的影响（实施例6、7)的凝胶荧光图像。[0056]图7为表示硫代磷酸酯修饰对于RNA的分解产生的效果（实施例8)的凝胶荧光图像。[0057]图8为表示DNA连接在RNA的3'侧末端时的影响（实施例9)的凝胶荧光图像。【具体实施方式】[0058]以下，对用于具体实施本发明的实施方式进行说明。[0059]本发明的第一实施方式的核酸复合物为单链DNA的3'侧末端的脱氧核糖核苷酸残基的3'位与双链RNA中的一条核糖核苷酸链的5'侧末端的核糖核苷酸残基的5'位结合的核酸复合物，其中，与单链DNA结合的核糖核苷酸链的5'侧末端核苷酸中的2'位的羟基被烷氧基或卤素原子置换。即，本实施方式的核酸复合物相当于下述通式（I)中的R2为烷氧基或卤素原子的情况。其中，式（I)中，R1为腺嘌呤（A)、鸟嘌呤（G)、尿嘧啶（U)及胞嘧啶（C)中的任一种，R3及R5为磷酸酯基（-PO2-O-)。这里，作为烷氧基的具体例子，可以列举碳数1?5的直链或支链烷氧基、碳数5?15的芳烷基、0-烯丙（allyl)基等烯基烷基等，优选碳数1?3的烷氧基、特别优选甲氧基。此外，作为卤素原子的具体例子，可以列举氟原子（F)、氯原子（Cl)、溴原子（Br)及碘原子（I)，特别优选氟原子。[0060][化学式1][0061]【权利要求】1.一种核酸复合物，其为单链DM的3'侧末端的脱氧核糖核巧酸残基的3'位与双链RNA中的一条核糖核巧酸链的5'侧末端的核糖核巧酸残基的5'位结合的核酸复合物，与所述单链DNA结合的所述核糖核巧酸链的5'侧末端核巧酸中的2'位的哲基被烧氧基或面素原子置换。2.-种核酸复合物，其为单链DNA的3'侧末端的脱氧核糖核巧酸残基的3'位与双链RNA中的一条核糖核巧酸链的5'侧末端的核糖核巧酸残基的5'位结合的核酸复合物，与所述单链DNA结合的最初的核糖核巧酸的3'位与和其相邻的核糖核巧酸的5'位之间的磯酸二醋基被硫代磯酸醋基、二硫代磯酸二醋基二硫代磯酸二醋基及=硫代磯酸二醋基中的任一个置换。3.根据权利要求1或2所述的核酸复合物，其中，所述单链DNA的核巧酸数为10W上。4.根据权利要求1?3中的任一项所述的核酸复合物，其中，所述单链DNA为聚脱氧腺嚷岭。5.根据权利要求1?4中的任一项所述的核酸复合物，其中，所述单链DNA的磯酸二醋基中的至少一部分被硫代磯酸醋基、二硫代磯酸二醋基及=硫代磯酸二醋基中的任一个置换。6.根据权利要求5所述的核酸复合物，其中，所述单链DNA的磯酸二醋基中的至少50%W上被硫代磯酸醋基、二硫代磯酸二醋基及=硫代磯酸二醋基中的任一个置换。7.根据权利要求1?6中的任一项所述的核酸复合物，其中，所述双链RNA为siRNA。8.根据权利要求7所述的核酸复合物，其中，所述siRNA为21mer型或27mer型。9.根据权利要求7或8所述的核酸复合物，其中，所述siRNA的祀基因为在表达Dectin-1的细胞中表达的基因。10.-种核酸多糖复合物，其中，1分子的权利要求1?9中的任一项所述的核酸复合物的单链DNA部位与2分子的具有0-1，3-葡聚糖骨架的多糖形成3螺旋结构。11.根据权利要求10所述的核酸多糖复合物，其中，所述具有0-1，3-葡聚糖骨架的多糖为西佐喃。12.-种药物组合物，包含权利要求10或11所述的核酸多糖复合物。13.-种核酸复合物的稳定化方法，其为增大核酸复合物对于核糖核酸酶的稳定性的方法，所述核酸复合物为单链DNA的3'侧末端的脱氧核糖核巧酸残基的3'位与双链RNA中的一条核糖核巧酸链的5'侧末端的核糖核巧酸残基的5'位结合的核酸复合物；其中，用烧氧基或面素原子置换与所述单链DNA结合的所述核糖核巧酸链的5'侧末端核巧酸中的2'位的哲基。14.一种核酸复合物的稳定化方法，其为增大核酸复合物对于核糖核酸酶的稳定性的方法，所述核酸复合物为单链DNA的3'侧末端的脱氧核糖核巧酸残基的3'位与双链RNA中的一条核糖核巧酸链的5'侧末端的核糖核巧酸残基的5'位结合的核酸复合物；其中，用硫代磯酸醋基、二硫代磯酸二醋基及S硫代磯酸二醋基中的任一个置换与所述单链DNA结合的最初的核糖核巧酸的3'位与和其相邻的核糖核巧酸的5'位之间的磯酸二醋基。【文档编号】C12N15/113GK104471063SQ201380032032【公开日】2015年3月25日申请日期:2013年6月19日优先权日:2012年6月20日【发明者】樱井和朗,望月慎一,田中素子,樋口贞春申请人:独立行政法人科学技术振兴机构