专利名称：复合型治疗性乙肝疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种乙肝疫苗，具体是指一种复合型治疗性乙肝疫苗，同时本发明也涉及这种疫苗的制备方法。
背景技术：
传统疫苗的基本性质是预防性疫苗。虽然疫苗的免疫接种能预防许多疾病，但由于技术的有限性，现有疫苗不足以预防所有疾病；全球经济的极度不平衡使疫苗应用受到了限制；新现和再现的流行性疾病AIDS、结核和疯牛病等的出现导致了新的公共卫生问题。目前极度困扰人们的疾病主要是因病毒持续感染导致的慢性疾病，如慢性乙型肝炎，AIDS，细菌慢性感染性疾病如结核，恶性肿瘤以及不明原因的传染性疾病如疯牛病等。现有的医疗水平对这些疾病缺乏卓有成效的治疗药物和手段。传统意义上的疫苗虽然可在一个健康的人体激活特异性免疫应答，产生特异性抗体和细胞毒T淋巴细胞(CTL)，从而获得对该病原体的免疫预防能力，但对已感染的个体却不能诱生有效的免疫应答。因此，有必要研究开发新型疫苗，使其不仅具有预防疾病的作用，同时能在已经感染或已患病个体诱导特异性免疫应答，清除病原体或异常细胞，使疾病得以治愈。这类疫苗便从传统意义的预防性扩展为治疗性，治疗性疫苗的概念也便应运而生。
所谓治疗性疫苗，是指有别于传统预防性疫苗的，具有治疗作用的新型疫苗，它主要应用于发生慢性感染、肿瘤、自身免疫病、移植排斥、超敏反应等患者，发挥治疗疾病的功能，有时兼具预防功能。近年来，治疗性疫苗的研制取得了突飞猛进的发展，呈现出形式多样化、设计针对性、组成多元化、技术新颖性的特点。
感染性疾病主要包括由病毒、细菌、原虫、寄生虫等病原体感染所导致的疾病，其病程也与感染过程密切相关。如HIV病毒侵犯人体CD4 T淋巴细胞，直接破坏免疫系统而致获得性免疫缺陷；HBV持续感染导致慢性肝炎和肝损伤。感染性疾病通常伴随病原体的持续存在和Th1型免疫应答的下调。因此针对这些特点设计的治疗性疫苗重点在于清除病原体的持续性感染和上调Th1型免疫应答。这类治疗性疫苗包括病毒治疗性疫苗、细菌治疗性疫苗和原虫治疗性疫苗等。病毒治疗性疫苗的研究最为深入和广泛，研究热点有HIV、HBV、HCV、流感病毒等。细菌感染性疾病近年有抬头趋势，如结核病开始大幅回升，麻风病等仍在局域地区蔓延，1998年印度批准使用一种治疗性麻风疫苗，该疫苗源自一种迄今未确定种属的麻风分支杆菌。治疗性疫苗联合化疗，可进一步促进细菌的清除，在改善病例损害同时增强无皮肤肉芽肿症状的非特异浸润，显著缩短治疗时间，并使约60％、71％、100％的LL、BL、BB病人由麻风菌素阴性转为阳性。该疫苗已完成3期治疗性临床，并通过印度工业生产药审。原虫感染病如疟原虫等治疗性疫苗也在研究及临床实验中。
乙型病毒性肝炎是世界上广泛流行的传染病之一，严重地威胁人类的健康。慢性乙肝患者和HBV病毒携带者是主要传染源。目前人们对乙型病毒性肝炎主要采取预防手段，即接种乙型肝炎疫苗进行预防。预防疫苗主要用于从未感染过的机体，因此天然结构的病毒蛋白可直接作为疫苗抗原。但是已经开发出应用的乙型肝炎病毒疫苗，虽然能对HBV感染起到良好的预防作用，但对感染HBV的机体，却难以发挥治疗和清除病毒的作用。主要原因在于机体对乙肝病毒产生了特异性免疫耐受，免疫系统不能有效地清除病毒。对乙型肝炎的病毒携带者或感染者，尤其是慢性乙肝病毒肝炎这样的感染过的患者，目前尚无有效的治疗药物及手段。因此，研制即能对HBV起到良好的预防作用，又能对HBV感染引起的相关疾病发挥治疗作用的治疗性乙肝疫苗成了国内外研究的热点。
近年来，许多用于治疗的疫苗也相继问世，如治疗性乙肝疫苗，其治疗效果已初见端倪。就其本质而言，治疗性疫苗的最大特点应以激活细胞介导免疫为主，即以激活细胞毒性T细胞为其主要功能，因为体内病毒的清除则主要依赖特异性细胞毒性T细胞的存在；而预防注射用的疫苗一般都以诱导特异性抗体产生为主，因为病毒性疾病的预防主要依赖特异性抗体。辅助性T细胞是T细胞的亚群，其中又可分为Th1和Th2两个亚类。一般认为，Th1亚类主要介导细胞免疫，治疗性疫苗应以激活此类细胞为主；而Th2亚类主要介导体液免疫，预防接种用的疫苗主要激活此类细胞。Th2亚类所分泌的一种细胞因子即白介素-10，对于Th1亚类具有抑制效应，故白介素-10又称为细胞因子抑制因子，白介素-10的发现部分地解释了细胞免疫和体液免疫的交互抑制现象。由于Th2亚类活化的同时，伴有白介素-10的释放而抑制Th1亚类的功能，使细胞免疫受到抑制，因此，普通的乙肝疫苗如单独使用，不能发挥治疗作用。如何筛选具有T细胞刺激作用的抗原位点制备疫苗就成为治疗性疫苗成功与否的关键。目前这方面的工作开展较多，国内第三军医大学免疫室亦在进行有关工作，他们将乙肝病毒抗原位点筛选后制备以活化T细胞为主的疫苗。
另一类乙肝疫苗的研制针对巨噬细胞的活化进行。巨噬细胞是重要的抗原递呈细胞，许多乙肝患者的巨噬细胞存在不同程度的障碍。将特异性抗乙肝病毒抗体与病毒抗原偶联，其抗体Fc段可与巨噬细胞结合，促进对病毒抗原的递呈。上海医科大学分子病毒学研究室在这方面的工作亦处于领先水平。他们将乙肝表面抗原多肽与表面抗体偶联制备的复合物疫苗，已获得了初步成果。
虽然以上论述中已经阐明，治疗性疫苗应以激发机体的细胞免疫尤其是辅助性T细胞和细胞毒性T细胞为主，而预防性疫苗通常以激发体液免疫反应即抗体反应为主。但有研究表明，治疗性疫苗若同时能刺激大量抗体的产生，可有效地清除血循环中的乙肝病毒和肝细胞内过量复制而进入循环的病毒，可提高治疗效果，因此我们在疫苗研制中也注意到两种免疫应答的兼顾，实际上，此种治疗性疫苗因其能诱生强烈的抗体反应，亦可用于预防接种，对于那些常规疫苗接种失败的人群更为适用。
另据文献报道，DNA疫苗对细胞毒性T细胞有较强的激活作用，是治疗性疫苗的理想手段，相信在不久的将来，治疗性疫苗可能作为一种有效的手段，广泛应用于乙肝及其他病毒性疾病的治疗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合型治疗性乙肝疫苗，它包含有乙肝表面抗原和免疫调节分子CpG，它既能对HBV感染引起的乙型肝炎发挥有效的治疗作用，又能对HBV再感染起到良好的预防作用。
在本发明的复合型治疗性乙肝疫苗中，乙肝病毒表面抗原选自S、S+前S1、前S1+前S2、S+前S2或S+前S1+前S2，其中较佳的是S+前S2或S+前S1+前S2，更佳的是S+前S1+前S2。
在本发明的复合型治疗性乙肝疫苗中，单位剂量疫苗中含有1-80μg乙肝病毒表面抗原，较佳的含有20-30μg乙肝病毒表面抗原。
在本发明的复合型治疗性乙肝疫苗中，所述的免疫调节分子CpG选自CpG2006、CpG D1、CpG1826、CpG1826m、CpG2006K、CpG10101、CpG10103、CpG7279(3272)、CPG7909(1702)、CpG8916(1703)、CpG8954(1704)、CPG9328(2684)、CpG ODN2216(1774)，其中较佳的是CpG2006，CpG D1，CpG1826，最佳的是CpG2006。
所述的免疫调节分子CpG2006的寡脱氧核苷酸序列是TCGTCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT。
本发明的另一目的是提供一种复合型治疗性乙肝疫苗的制备方法，其中使用市售的乙肝病毒表面抗原，所有的寡脱氧核苷酸CpG都采用DNA合成仪合成，并采用耐核酸酶的硫化磷酸骨架。
乙肝表面抗原分子与CpG分子的结合方法包括①振荡混合；②搅拌；③脂质体(参阅专利公开号为CN 1364644A)；④蛋白载体。
用乙醇沉淀寡脱氧核苷酸的钠盐，然后重悬于10mM Tris(pH7.0)，1mM EDTA，-20℃贮存。注射时用盐水稀释。寡脱氧核苷酸中的脂多糖浓度用Limulus方法检测不到(低于1ng/ml)。
本发明的复合型治疗性乙肝疫苗采用皮下注射，给药剂量在1ml以内。
本发明的复合型治疗性乙肝疫苗于2-8℃避光保存和运输，有效期自效力检定合格之日起2年。
本产品的质量标准和工艺要求如下。
1.乙肝表面抗原的质量标准a)安全性评估；b)纯度、杂质和污染物；c)生物活性检测；d)氢氧化铝的吸附率。
2.CpG的质量标准a)保证寡核苷酸序列的正确性。寡核苷酸的序列分析方法主要包括改进的Maxam-Gilbert化学测序法、质谱法、紫外或HPLC碱基分析法；b)理化特性的测定。对寡核苷酸的长度、序列、均一性、修饰基团等理化特性进行分析，便于安全有效地使用，分析方法主要包括高效液相色谱(HPLC)法、毛细管电泳(CE)法、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法、紫外分光光度法；c)生物学活性的测定，一般包括细胞培养、转染、继续培养、评价药物作用等步骤；d)安全性的评价，除了保证无病毒、无菌、无致热原、无致敏原等一般安全要求外，还要保证无致突变、无致癌、无致畸等要求；e)稳定性的评价，要使用理化、生化和免疫化学分析技术对活性成分的理化及生物学活性等方面的变化情况进行全面的检测，并准确检测在储存过程中由于氧化、聚合或降解等所造成的变化，方法包括电泳(PAGE)、高分辨率的HPLC、CE以及MS、NMR分析等。
上述质量控制项目的标准如表1所示。
表1 CpG常规质量控制项目举例检测项目检测方法 标准规定寡核苷酸的序列分析 改进的Maxam-Gilbert化学测序法 样品应与对照品一致质谱法样品应与对照品一致与靶基因的杂交性质 紫外分光光度法50-70℃纯度分析高效液相色谱法不低于95.0％毛细管电泳法或SDS-PAGE法 不低于95.0％紫外分光光度法样品应与对照品一致修饰基团的结合率离子交换高效液相色谱法不低于90％失败序列IP-HPLC法或CE法 不超过5％PH值《中国药典》的附录方法应为6.0-8.0溶液的澄清度与颜色 《中国药典》的附录方法应符合规定水分卡氏水分测定法不超过1.0％无菌试验无菌试验方法 应符合规定热原质 《中国药典》的附录方法 应符合规定3.复合型治疗性乙肝疫苗的工艺要求a)乙肝表面抗原分子与CpG分子非共价结合，结合率大于90％。
b)复合型治疗性乙肝疫苗的成品检定包括①用酶联免疫法测试，证明为HBsAg；②外观为乳白色悬浊液体；③化学检定按2000年版《中国生物制品规程》通则的《生物制品化学及其他检定方法》进行；④无菌试验、异常毒性实验及细菌内毒素含量测定按2000年版《中国生物制品规程》通则的《生物制品无菌试验规程》进行；⑤异常毒性实验按2000年版《中国生物制品规程》通则的《生物制品异常毒性试验规程》进行；⑥细菌内毒素含量测定按2000年版《中国生物制品规程》通则的《生物制品细菌内毒素试验规程》进行。
具体实施例方式
为了更好地理解本发明的技术方案和有益效果，下面结合具体实验及实验结果对本发明做进一步的阐述。
实施例1乙肝疫苗中的不同抗原成分对小鼠免疫反应的影响乙肝疫苗中所含的抗原成分可以包括白蛋白、S蛋白、前S2及前S1蛋白。将CpG2006分别与各种组合的乙肝抗原结合，给小鼠接种，观察抗体滴度及淋巴细胞增殖率，结果如表2所示。
表2 不同的乙肝抗原与CpG2006结合对小鼠免疫效果的影响组别 抗原类型 淋巴细胞增殖率(SI) 抗体滴度(HBsAb)1 S9.141∶10,0002 S+前S1 9.151∶10,0003 前S1+前S29.331∶100,0004 S+前S2 13.96 1∶100,0005 S+前S1+前S2 14.58 1∶100,0006 白蛋白 1.36＜1∶100实验结果表明，1-5组间抗体滴度无显著差异；淋巴增殖率1、2、3、组与4、5组比较有显著差异，1、2、3组间淋巴增殖率无显著差异，4和5组间淋巴增殖率无显著差异，1-5组与第6组比较都有显著性差异。
1-5组的淋巴增殖率及抗体滴度与6组比较均有显著差异。其中淋巴细胞增殖率及抗体滴度较高的是S+前S2、S+前S1+前S2，本发明最佳的乙肝表面抗原是S+前S1+前S2。
实施例2 治疗性乙肝疫苗的临床试用结果为了验证治疗性乙肝疫苗的临床效果，与国内具有完备检验条件和技术力量的防疫站、医院进行合作，对其效果进行观察。
中试样品在3个不同的医疗单位进行的观察。随机选择乙肝病毒携带患者，并且其体内乙肝病毒处于复制期，标准为血清检测表面抗原阳性、e抗原阳性、核心抗原阳性(又称“大三阳”)，HBV-DNA亦为阳性，病程2年以上，无急性发作征象，肝功正常，排除肝炎活动期和病毒变异患者。所有患者均进行定量PCR检测。对照组为裸疫苗接种。为保证观测结果的客观性，采用双份血清检测，即患者治疗前的血清与治疗后血清在相同条件下同时检测，以排除试剂、季节及操作人员的主观误差。
疫苗免疫方法如下疫苗每支含表面抗原30微克，CPG10微克，用前以生理盐水溶解至1毫升。
给药途径前上臂皮下多点注射，通常为3～4点，切忌肌肉注射。
免疫程序0，15，45天三次注射结果检测按表中日期采集受试者静脉血，分离血清后-20℃冻存，统一进行单盲检测。结果统一处理，以保证准确性。结果如表3～5所示。
表3 复合型治疗性乙肝疫苗在乙肝病毒标记治疗前后比较(邵阳卫生防疫站)组别 例 表面抗原 表面抗体 e抗原 HBV DNA数 阴转例数 阳转例数 阴转例数 阴转例数(％) (％) (％) (％)治疗结束 85 13(15)*11(13)*44(52)*40(47)*治疗后3个月 85 24(28)*22(26)*54(64)*47(55)*
治疗后6个月85 26(30)*22(26)*54(64)*52(61)*对照治疗结束 72 3(4) 3(4) 17(24) 14(19)对照治疗3个月 72 4(5) 3(4) 16(22) 15(21)对照治疗6个月 72 4(5) 4(5) 16(22) 15(21)*p＜0.05表4复合型治疗性乙肝疫苗在乙肝病毒标记治疗前后比较(安阳市中医院)组别 例表面抗原 表面抗体 e抗原 HBV DNA数阴转例数 阳转例数 阴转例数 阴转例数(％) (％) (％) (％)治疗结束 125 24(19)*24(19)*70(56)*55(44)*治疗后3个月125 42(34)*35(28)*74(59)*86(69)*治疗后6个月125 45(36)*33(26)*73(58)*81(65)*对照治疗结束 602(3) 2(3) 9(15) 10(17)对照治疗3个月 603(5) 3(5) 10(17) 10(17)对照治疗6个月 603(5) 2(3) 8(13) 9(15)*p＜0.05表5 复合型治疗性乙肝疫苗在乙肝病毒标记治疗前后比较 (濮阳人民医院)组别 例 表面抗原 表面抗体 e抗原 HBV DNA数 阴转例数 阳转例数 阴转例数 阴转例数(％) (％) (％) (％)治疗结束 56 9(17)*8(14)*29(52)*35(62)*治疗后3个月 56 15(26)*15(26)*35(63)*32(58)*治疗后6个月 56 16(28)*15(26)*36(64)*34(61)*对照治疗结束 50 2(4)3(6) 7(14) 9(18)
对照治疗3个月 50 3(6)3(6) 8(16) 8(16)对照治疗6个月 50 2(4)3(6) 9(18) 8(16)*p＜0.05结论a)复合型乙肝疫苗具有明显的清除乙肝病毒效果。病毒血清学标志阴转率高，明显高于目前报道的其它治疗手段。
b)对病毒复制标志的影响尤为明显，包括e抗原和HBV-DNA，提示该疫苗可抑制病毒复制。
c)表面抗原的阴转率较低，且出现较晚，提示病毒复制一旦停止，治疗效果受到影响，可考虑增加免疫次数。
权利要求
1.一种复合型治疗性乙肝疫苗，其特征在于，它包含有乙肝病毒表面抗原和免疫调节分子CpG。
2.根据权利要求1所述的复合型治疗性乙肝疫苗，其特征在于，所述的乙肝病毒表面抗原是选自S、S+前S1、前S1+前S2、S+前S2或S+前S1+前S2。
3.根据权利要求1所述的复合型治疗性乙肝疫苗，其特征在于，所述的乙肝病毒表面抗原是选自S+前S2或S+前S1+前S2。
4.根据权利要求1所述的复合型治疗性乙肝疫苗，其特征在于，所述的乙肝病毒表面抗原是选自S+前S1+前S2。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述的复合型治疗性乙肝疫苗，其特征在于，单位剂量疫苗中含有1-80μg乙肝病毒表面抗原。
6.根据权利要求1～4中任意一项所述的复合型治疗性乙肝疫苗，其特征在于，单位剂量疫苗中含有20-30μg乙肝病毒表面抗原。
7.根据权利要求1～6中任意一项所述的复合型治疗性乙肝疫苗，其特征在于，所述的免疫调节分子CpG选自CpG2006、CpG D1、CpG1826、CpG1826M、CpGD1、CpG2006K、CpG10101、CpG10103、CpG7279(3272)、CpG7909(1702)、CpG8916(1703)、CpG8954(1704)、CpG9328(2684)、CpG ODN 2216(1774)。
8.根据权利要求1～6中任意一项所述的复合型治疗性乙肝疫苗，其特征在于，所述的免疫调节分子CpG选自CpG2006，CpG D1，CpG1826。
9.根据权利要求1～6中任意一项所述的复合型治疗性乙肝疫苗，其特征在于，所述的免疫调节分子CpG是CpG2006。
10.根据权利要求7～9中任意一项所述的复合型治疗性乙肝疫苗，其特征在于，所述的免疫调节分子CpG2006的寡脱氧核苷酸序列是TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT。
全文摘要
本发明公开了一种复合型治疗性乙肝疫苗，它是包含乙肝表面抗原和免疫调节分子的复合制剂，它能有效地治疗HBV感染引起的慢性乙型肝炎及HBV病毒携带者，又能对HBV再感染起到良好的预防作用。本发明也提供了制备这种疫苗的工艺流程。
文档编号A61P1/16GK1522761SQ0313762
公开日2004年8月25日 申请日期2003年6月18日 优先权日2003年6月18日
发明者李求是 申请人:北京多米诺医药研究所