专利名称：脱脂治疗性疫苗及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗性疫苗及一种预防性疫苗，一种制造治疗性疫苗的方法和一种制造预防性疫苗的方法，一种治疗受到含脂传染性生物体感染的人或动物，一种在治疗含脂传染性生物体所致感染的方法中使用的物质或组合物，一种用于对人或动物接种抵抗含脂传染性生物体所致感染的物质或组合物，一种在制造用于治疗含脂传染性生物体所致感染的药物时一种物质或组合物的用途，以及一种在制造用于作为疫苗治疗或预防含脂传染性生物体所致感染的药物时一种物质或组合物的用途。
背景技术：
热带非洲被认为是艾滋病(HIV/AIDS)、疟疾、丝虫病、结核以及其它无数种慢性热带及寄生性传染病的故乡。出现的问题是，为什么这些传染病是慢性的，以及为什么受感染的人的免疫系统对它们不能有效应对。
在整个人类的历史中，传染性疾病已经导致人类承受巨大、长期的痛苦和死亡。某些感染原从开始就导致慢性感染。由它们所致的人类疾病包括例如结核、麻风病、身体不同部位的真菌病、疟疾、导致“河盲症”的盘尾丝虫和微丝蚴。病毒包括有名的人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类T-淋巴白血病病毒(HLTV1)、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、引起巴克氏淋巴瘤(Burkitt′s Lymphoma)的人疱疹IV型病毒(Epstein-Barr virus，EBV)以及引起淋巴瘤和其它恶性肿瘤疾病的其它病毒。
不同的动物物种具有相同或近似的可致其慢性感染和肿瘤的微生物和病毒，例如，牛结核病、逆转录酶病毒例如猴免疫缺损病毒(SIV)、绵羊“搔痒症”或鸡、鼠、猫和牛的恶性肿瘤。这个列表并非人类或动物疾病的全部。
以下，术语“微生物”应理解为包括影响人类和动物的细菌、真菌以及寄生虫，但不包括病毒。
不受理论的限制，以下将作为理解本发明的基础。大多数导致人类慢性感染的微生物必须从外界侵入人体。侵入机体之前，它们全部在地球环境中已经单独并独立存在和进化了数百万年。在从一个人传播到另一个人的过程中，这些微生物通常不得不在获得新宿主之前再次作为独立个体在外界环境中至少生存一个短暂的时期。因此，它们在进化的某些时间点上要全部暴露并生存在外界环境中。
这些微生物所暴露的地球环境，在某些方面对所有形式的生命都是不利的，因为作为我们环境恒久不变的一部分的阳光会使所有暴露在其中有的生物脱水。具体地说，阳光对微生物不利，因为这种生物体中极小量的机体水分很容易脱水而流失，而这会导致生物体的死亡。因此，设法在阳光下地球环境中生存下来的微生物是已经获得了将水分保持和留存在其内能力的突变体。
脂质和类脂物质对脱水相对具有抵抗力，大多数暴露在太阳光线或热中的生物表面上具有脂质物质，以减少水分流失。因此，在地球环境中作为独立个体生存的微生物是获得了用于阻止或减少水分从其表面流失的脂质覆盖物的突变体。微生物脂质覆盖物的数量显然决定其在外界环境中的生存能力。具有厚脂质覆盖物的微生物可以比那些具有薄脂质覆盖物的微生物更好地存活，大多数作为独立个体的微生物在地球环境中生存的不同能力与其脂质覆盖物的厚度不同有关。例如，结核杆菌可以在尘埃中存活大约一年，其公知具有非常厚的脂质层。这种特性可以用齐耳-纳耳逊二氏(Zeihl Nilsson)染色法清楚地说明。
防止水分从微生物流失的保护性脂质层覆盖，在某些方式中最终隐藏，赋予有关微生物特性、特征或唯一性的真正抗原。当来自任何来源的真正的、可辨的抗原得以进入机体，作为第一道防线，自然杀伤细胞通常产生可以立即破坏它们的细胞因子。作为第二道防线，机体的长期免疫反应(通过抗体和细胞介导免疫反应)将决定这些真正抗原是否继续留在体内。
在正常的感染中，当具有脂质覆盖物的微生物侵入机体时，因为难以接近脂质层下的真正抗原，针对该微生物的由细胞因子做出的迅速反应，以及长期、有效的免疫反应，不会出现或出现很少。相反，由微生物表面的脂质层激发的免疫反应不涉及下面的真正抗原，不会真正影响到它们。因此，微生物作为慢性感染存活在体内。通过用脂质层掩盖真正抗原，微生物因此可以留存其机体水分并确保它们首先存活在外界环境中，然后逃过机体的免疫反应，从而作为慢性或反复感染而持续。
微生物的脂质层可以在体外以脂质溶剂，例如氯仿或醚剥离，以暴露其真正抗原。脂质溶剂的作用时间依赖于欲除去的脂质层的数量和性质。一旦暴露，微生物的真正抗原可以作为一种疫苗重新注射到未受感染的机体中。它们会引起体内具有细胞因子的自然杀灭细胞的迅速反应和随后具有抗体的长期免疫反应。当此后感染中面临相同的微生物时，这些细胞因子和免疫反应会穿透脂质层，并破坏下面的真正抗原。通过这种方式，保护接种机体不会感染微生物。
试验表明，对用于未受感染的机体获得完全免疫保护的预防性疫苗来说，需要·疫苗暴露与有关微生物相关的真正抗原，并且免疫系统可以接近这些真正抗原；·待接种的人具有正常的免疫系统；以及·待接种机体的血清中没有已有感染或有关微生物的抗体。
因为有关微生物的真正抗原从未暴露给免疫系统，人体内没有针对真正抗原的抗体，所以已形成的感染可能会持续或反复。在这种情况下，疫苗上所暴露的真正抗原会激发细胞因子和物质迅速产生，其穿透传染性微生物并在其脂质覆盖物下将其杀灭。产生的细胞因子总量和杀灭的微生物数量取决于疫苗的使用量和可用的自然杀灭细胞的数量。此外，疫苗的真正抗原会激发首次免疫反应，其会加强和消除微生物。在合适的时间间隔中将足够数量的这种疫苗直接注射到受感染人体中，可以作为治疗性疫苗使用。
然而，在所有的慢性感染中，可证实的微生物抗体通常会出现在受感染机体中。尽管有这些抗体，持续感染仍是它们不相关或无力的证据。此外，这种抗体可以使任何直接引入受感染机体中与微生物相关的疫苗固定不动。在这种情况下，必须实施一种免疫疗法的方式，激发新的有效免疫反应，其可以彻底破坏并防止被相同微生物进一步感染。
发明内容
本发明提供一种由现症感染的微生物制备的新型疫苗，其通过用脂质溶剂除去其脂质层暴露其真正抗原而制得。利用正常免疫系统，其可以在受感染人体条件下体外人工繁殖，其与那些正常未受感染人的预防性接种类似。
根据本发明的方法，将取自受感染人具有正常免疫细胞的外周血白细胞洗涤至不含所有抗体。洗涤过的白细胞包含对现症感染不定型并与新抗原自由反应的正常免疫细胞。将洗涤过的细胞在体外混悬于一种介质中，该介质包含去除了免疫球蛋白或抗体的受感染人血清。这样体外的情况与感染之前未受感染人体所见情况相同或相近(无抗原的脐带血清可以代替人血清)。将疫苗加入介质中与免疫活性细胞一起培养，然后将混合物重新注射到受感染的人体。重新注射的细胞及其子代在体内会继续其在体外的起始过程，并且，所激发的新的免疫反应会逐渐并彻底杀灭微生物。这会意想不到地得到一种受感染人体的预防性接种，与将疫苗直接注射到未受感染人体中相似。以这种方法对已形成的感染使用疫苗就是感染的免疫疗法。正常的预防性疫苗也是一种免疫疗法，其在感染之前给予未受感染人体，并通过杀灭而赋予免疫，其为任何最终感染接种人体的微生物的免疫疗法的一种方式。
因此，本发明可以使用疫苗预防及治疗已被任何具有在体外去除了脂质层而暴露其真正抗原的微生物所形成的感染。
病毒公认是起源于原生细胞的核物质。虽然它们作为独立个体存在，病毒的生理机能和存活完全依赖于活细胞。因此，它们不像游离生存的微生物那样暴露在阳光的不利影响中。这些演变成人和动物慢性感染的病毒，例如HIV和其它逆转录酶病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、EBV、CMW、单纯疱疹病毒以及人和动物致肿瘤病毒都为包膜病毒。病毒的包膜在它们的进化过程中从其宿主细胞获取，以保证其在体内存活。
DNA病毒例如EBV、CMV以及B型肝炎病毒在离开其生长的核时，从宿主细胞的核膜中获取其包膜。RNA病毒例如逆转录酶病毒和C型肝炎病毒在成熟病毒最终从其生长的宿主细胞中离开时，从细胞壁膜获取其各自的包膜。因为它们携带的包膜源于宿主细胞，所以包膜病毒被认为是“杂交”病毒，其结合了对机体来说是外来的病毒核心和源于宿主的包膜。由于此原因，宿主免疫系统将包膜病毒认作是“部分自体”。
宿主杀灭病毒及其包膜的有效免疫反应也会杀灭所有那些病毒包膜所源自的宿主细胞。在B型和C型肝炎的情况中，肝细胞也会被同样杀灭。在HIV的情况中，所有的CD4+细胞会被清除。在这样的情况下，这会导致严重和致命的自身免疫性疾病。为了避免连同病毒一起杀灭机体，宿主的免疫反应因而被迫效率低下。在从宿主取得其包膜的过程中，这些病毒“有意”取得“人质”，并以其“胁迫”机体免疫系统使其反应效率低下。这些效率低下的免疫反应确保包膜病毒作为慢性感染在体内持续。
像其所源自的细胞膜一样，病毒包膜包含可以很容易被脂质溶剂例如氯仿或醚破坏的磷脂蛋白。当包膜被破坏之后，将作为疫苗的残留病毒抗原注射到未受感染的人体中时，会被免疫系统认为是非自体并且完全异质。激发适当免疫反应，其仅有效破坏与疫苗中所用病毒抗原一致的病毒核或病毒非包膜部分。任何由相同包膜病毒造成的对接种机体的后续感染将仅使其核遭到破坏，而留下其完整的包膜。空包膜在人体内没有生物学价值。接种人体将对有关包膜病毒免疫。通过破坏包膜病毒的包膜，残留病毒抗原形成有力高效的用于有关病毒的疫苗。这种疫苗给予未受感染的人体后，其将通过仅破坏后续感染机体的同类包膜病毒的病毒核获得持久的免疫力。
在由包膜病毒形成的感染中，病毒包膜上的宿主特性胁迫自然杀伤细胞并阻断所有能有效杀灭病毒的长期免疫反应。然而，当病毒包膜在体外被破坏，残留抗原作为疫苗重新注射到已形成感染的人体中时，其被认为是完全异质并且非自体。疫苗激发快速细胞因子，其穿透容纳包膜病毒的病毒包膜和细胞膜，并杀灭其中的病毒。所产生的细胞因子的数量取决于疫苗的使用量以及患者自然杀伤细胞的状态和数量。当感染消除或减少到无显著意义的水平时，患者的长效预防性接种或免疫疗法如下获得。
通过检验患者的免疫系统正常，并且病毒已明显消除或减少(在HIV的情况中，CD4+量约为400-500，病毒量小于50复制数/毫升)之后，从患者体内抽取肝素血。将血中的外周血白细胞洗涤至不含所有痕量的病毒抗体。将未定型病毒的已洗涤白细胞中的免疫活性细胞混悬于介质中，该介质包含已除去免疫球蛋白和抗体的患者血清(无病毒抗体的脐带血清可以代替患者的无抗体血清。混合物中的血清确保疫苗的抗原可以适当地呈现给免疫系统。)。将疫苗加入该混合物中，培养之后重新注射到患者体内。这就是对患者的免疫疗法，其类似于将预防性疫苗注射到具有正常免疫系统，且无感染或无病毒抗体的未受感染的人体中。
重新注射的混合物将在体内继续体外的起始过程，被免疫疗法激发的新免疫反应从机体中消除所有病毒残留，并防止未来任何由相同包膜病毒造成的再感染。因而可以通过破坏给定包膜病毒的包膜制备一种疫苗，其可以用于预防或治疗由相同包膜病毒造成的感染。
所生物体内的免疫反应利用特定补体的一种或另一种形式。即使免疫反应效率很低时，像由微生物及包膜病毒造成的大多数慢性感染，也同样使用补体。此时，特定的微生物或病毒补体耗尽造成的补给短缺，无法消除慢性感染。
始于体外的免疫疗法激发患者新的有效免疫反应也需要补体。这种对补体的新需求只会使已有的慢性短缺加重并使患者的临床状况恶化。因此，有必要使患者的病毒载量或微生物以其它方式实质上减少，以使之后产生的补体可以用于完成新的由上述体外开始的免疫疗法所激发的有效免疫反应。
一种用于减少如上所述微生物病毒载量的方法，开始首先给予患者简单直接注射适当大剂量除去了病毒包膜而暴露真正抗原的疫苗。这发生在新系统仍正常时。其对患者并不真正接种，但激发自然杀伤细胞产生能杀灭大量病毒或微生物的细胞因子。这样疫苗就与药品类似。如果在合适的时间间隔里重复，这种杀灭可以显著减少病毒载量或微生物和其对补体的需要，使其达到无显著意义的水平。此后体内产生或游离的补体可用于后续始于体外的免疫疗法，其激发体内有效的免疫反应。该后一步骤仅在有证据表明患者体内微生物病毒载量不能造成明显的补体需求时才实施。
当免疫系统削弱时，对已给予疫苗患者的洗涤过的患者白细胞和疫苗进行一段时间的培养会提供细胞因子，其在注射到患者体内时会激发病毒数量或微生物下降。此步骤可以在一个月内重复2或3次。
另一种确保始于体外的免疫疗法在正在慢性感染的患者体内有效的快速方法为，通过对患者输入新鲜血液提供额外的补体。在新免疫反应开始出现时，通常在紧接免疫疗法之后的10-14天，输血是最有用的。输血应反复进行，直到病毒或微生物完全清除。
具体实施例方式
因此，根据本发明的第一方面，提供一种制造疫苗的方法，该方法包括步骤
以含脂溶剂提取生物体液，该生物体液从受到含脂传染性生物体感染的人或动物获取，该生物体液包含含脂传染性生物体和提取物，提取产生水相和含脂有机相，该水相包含实质上已除去脂质的传染性生物体，以及分离水相。
脂质提取溶剂可以为氯仿或醚。
生物体液可以为全血、血浆、胸膜液、脑脊髓液、培养液或其它局部体液。含脂传染性生物体可以为病毒、细菌、例如结核或麻风菌、原生动物、真菌或细胞壁中包含脂质或类脂物质的一类霉菌。具体地说，其可以为包膜病毒，例如免疫缺陷病毒如人类免疫缺陷病毒或HIV。可替换的地，其可以为包膜病毒，例如B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人疱疹IV型病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、人类T-淋巴白血病病毒(HTLV1)、癌症病毒及其它任何类似的包膜病毒。
包含含脂传染性生物体的生物体液的提取工艺可以采用混合、旋流、涡流、旋转或其它所属技术领域的技术人员所熟悉的合适工艺。提取时间应足够长，以使氯仿溶解所有、或实质上所有传染性生物体中所含的脂质，并且因提取工艺而不同。例如，在旋流混合的情况中，例如为HIV的情况，旋流可以进行30-60分钟的时间，典型地为30分钟。
该方法还可以包括浓缩水相生成包含传染性生物体的浓缩物，或者，通过例如冷冻干燥法或所属技术领域的技术人员所熟悉的技术分离实质上已除去脂质的传染性生物体的步骤。
通过这种方式生成的疫苗可以作为自体疫苗用于生物体液所提自的人体。可替换地，该方法可以包括分离和培养来自居住在特定地理区域、受到感染的人的传染性生物体的附加步骤。在该方式中，疫苗可以用于预防(作为真正疫苗)或用于治疗来自该地理区域的人。本发明的这一方面在例如HIV在不同地理区域有不同形式的病毒的情况下十分重要。
该方法可以包括稀释生物体液或稀释水提物的步骤，其目的为获取每ml约100-200个病毒粒子的抗原疫苗。
在提取步骤中所用的氯仿与生物体液的比例(体积∶体积)可以为3∶1至5∶1。最好为约3∶1。
根据本发明的另一方面，提供一种制造第一治疗性疫苗的方法。该方法包括步骤以脂质提取溶剂提取从受到含脂传染性生物体感染的人或动物中获取的生物体液，该生物体液包含含脂传染性生物体，提取产生水相和含脂相，该水相包含实质上已除去脂质的传染性生物体，将水相从含脂相中分开，将白细胞部分从人或动物血中分离，控制分离使白细胞部分实质上不含血浆、游离含脂传染性生物体或含脂传染性生物体的游离抗体，以及将至少部分水相与至少部分白细胞部分结合生成疫苗。
应该认识到，白细胞部分的一部分会包含受感染细胞。
上述制备的第一治疗性疫苗用于从其获取生物体液和白细胞部分的患者。然而，本发明该实施例的发展例中，取自特定地理区域的受感染人的白细胞可能如上所述与疫苗结合生成第二治疗性疫苗，该疫苗从取自该同一地理区域另一个受感染人的分离培养的病毒制备而成。
因此，本发明扩展到一种制造第二治疗性疫苗的方法。该方法包括步骤分离并培养来自生物体液的传染性生物体，该生物体液从至少一个受含脂传染性生物体感染的人或动物获取，以生成包含培养的含脂传染性生物体的组合物，以脂质提取溶剂提取含脂传染性生物体的水溶液，提取产生水相和含脂相，水相包含实质上已除去脂质的生物体，将水相从含脂相中分开，将白细胞部分从另一个被含脂传染性生物体感染的人或动物的血中分离，控制分离使白细胞部分实质上不含血浆、游离含脂传染性生物体或含脂传染性生物体的游离抗体，以及将至少部分水相与至少部分白细胞部分结合生成第二治疗性疫苗。
脂质提取溶剂可以是任何合适的溶剂，可以是氯化的碳氢化合物例如氯仿。可替换地，其可以是碳氢化合物或醚。具体地说，值得注意的是，氯仿适合用于本发明的方法，即使申请号为PCT/IB01/01099的专利清楚地表明氯仿会使很多血浆蛋白质变性，不适用于后续将给回到动物或人类的液体中。
白细胞部分可以这样得到从人或动物抽取血液样本，通过沉降从血浆中分离血红细胞，通过例如离心从血浆中分离白细胞，以及洗涤白细胞使其不含残留血浆以及带有生理盐水的抗体。
第二治疗性疫苗用于从其取得白细胞部分的患者。
在本发明的另一实施方式中，从提取培养的含脂传染性生物体产生的水相可以作为预防性疫苗直接用于正常未受感染的人，其生活在生物体液所取自的人或动物所生活、以及含脂传染性生物体流行的地理区域。
根据本发明的另一方面，提供一种疫苗，其通过一种方法制备，该方法包括步骤以氯仿提取从受到含脂传染性生物体感染的人或动物中获取的生物体液，该生物体液包含含脂传染性生物体，提取产生水相和含脂相，水相包含实质上已除去脂质的传染性生物体，以及分离水相。
根据本发明的另一方面，提供一种第一治疗性疫苗，其通过一种方法制备，该方法包括以脂质提取溶剂提取从受到含脂传染性生物体感染的人或动物中获取的生物体液，该生物体液包含含脂传染性生物体，提取产生水相和含脂相，水相包含实质上已除去脂质的传染性生物体，将水相从含脂相中分开，将白细胞部分从人或动物血中分离，控制分离使白细胞部分实质上不含血浆、游离含脂传染性生物体和含脂传染性生物体的游离抗体，以及将至少部分水相与至少部分白细胞部分结合生成疫苗。
根据本发明的另一方面，提供一种第二治疗性疫苗，其通过一种方法制备，该方法包括分离并培养来自生物体液的传染性生物体，该生物体液从一个受含脂传染性生物体感染的第一人或第一动物获取，以生成包含培养的含脂传染性生物体的组合物，以脂质提取溶剂提取含脂传染性生物体的水溶液，提取产生水相和含脂相，水相包含实质上已除去脂质的生物体，将水相从含脂相中分开，将白细胞部分从受到含脂传染性生物体感染的第二人或第二动物的血中分离，控制分离操作，使白细胞部分实质上不含血浆、游离含脂传染性生物体或含脂传染性生物体的游离抗体，以及将至少部分水相与至少部分白细胞部分结合生成第二治疗性疫苗。
根据本发明的另一方面，提供一种治疗受到含脂传染性生物体感染的人或动物的方法，该方法包括步骤以氯仿提取生物体液，该生物体液从受到含脂传染性生物体感染的人或动物获取，该生物体液包含含脂传染性生物体和提取物，提取产生包含实质上已去除脂质的传染性生物体的水相和含脂有机相，分离水相，以及将有效量的水相给予人或动物。
该方法还可以包括上述浓缩水相生成浓缩物，或相反，分离实质上已除去脂质的传染性生物体的步骤，并将所得物质，可选择地，与药剂学上可接受的辅料或载体一起给予人或动物。
根据本发明的另一方面，提供一种治疗受到含脂传染性生物体感染的人或动物的方法，该方法包括步骤以脂质提取溶剂提取从人或动物中获取的生物体液，该生物体液包含含脂传染性生物体，提取产生包含实质上已除去脂质的传染性生物体的水相和含脂相，
将水相从含脂相中分开，将白细胞部分从人或动物血中分离，控制分离使白细胞部分实质上不含血浆、游离含脂传染性生物体或含脂传染性生物体的游离抗体，将至少部分水相与至少部分白细胞部分结合生成一种组合物，以及将有效治疗量的该组合物给予人或动物。
根据本发明的另一方面，提供一种治疗受到含脂传染性生物体感染的人或动物的方法，该方法包括步骤分离并培养来自生物体液的传染性生物体，该生物体液从一个受含脂传染性生物体感染的第一人或第一动物获取，以生成包含培养的含脂传染性生物体的组合物，以脂质提取溶剂提取含脂传染性生物体的水溶液，提取产生包含实质上已除去脂质的生物体的水相和含脂相，将水相从含脂相中分开，将白细胞部分从被含脂传染性生物体感染的第二人或第二动物的血中分离，控制分离使白细胞部分实质上不含血浆、游离含脂传染性生物体或含脂传染性生物体的游离抗体，将至少部分水相与至少部分白细胞部分结合生成一种组合物，以及将有效治疗量的该组合物给予人或动物。
上述方法可以包括对人或动物输入新鲜血液，以增加血液中补体或类补体蛋白的步骤。补体系统由一组血清蛋白组成，其在防御性免疫反应中充当主要角色(微生物学，第2版，Prescott，Harley及Klein著)，而且输血增加免疫系统严重受损的人或动物的蛋白质水平。
根据本发明的另一方面，提供一种第三治疗性疫苗，其包括在体外暴露到疫苗的白细胞，该疫苗由实质上除去了脂质部分的含脂传染性生物体生成，暴露实质上在没有游离含脂传染性生物体存在，而有不含游离含脂传染性生物体抗体血清的介质存在时发生。
白细胞典型地在37℃暴露约4个小时。
血清蛋白提供可以使治疗性疫苗在体内发挥作用的调理素。
根据本发明的另一方面，提供一种预防性疫苗，其通过一种方法制备，该方法包括步骤培养由受到含脂传染性生物体感染的人或动物获取的生物体液，以脂质提取溶剂提取含有含脂传染性生物体的培养物，提取产生包含实质上已除去脂质的传染性生物体水相和含脂相，以及分离水相。
本发明提供一种物质或组合物，用于一种治疗含脂传染性生物体所致感染的方法，该物质或组合物包含如前所述的疫苗或第一或第二或第三治疗性疫苗。
本发明还提供一种物质或组合物，用于对人或动物接种，抵抗含脂传染性生物体所致的感染，该物质或组合物包含如前所述的分离并培养的传染性生物体。
传染性生物体可以包括实质上已除去脂质包膜的HIV、Aghbs、Acv、EBV、单纯疱疹以及肿瘤病毒。
本发明还提供一种物质或组合物，用于预防含脂传染性生物体所致的感染，该物质或组合物包含如前所述的预防性疫苗。
本发明还提供一种物质或组合物在制造用于治疗含脂传染性生物体所致感染的药品中的用途，该物质或组合物包含如前所述的疫苗或治疗性疫苗。
本发明还提供一种物质或组合物在制造作为疫苗用于预防含脂传染性生物体所致感染的药品中的用途，该物质或组合物包含如前所述分离并培养的传染性生物体。
本发明还提供一种物质或组合物在制造用于预防含脂传染性生物体所致感染的药品中的用途，该物质或组合物包含如前所述的预防性疫苗。
本发明参照以下实施例、表格和附录，通过举例的方式进行说明。
实施例1
疫苗将取自HIV病毒阳性人的新鲜空腹血(5ml)(每ml含10000至20000个病毒粒子)连同500单位肝素抽入注射器中，室温下放置30分钟。该血浆与氯仿(5ml)同置已消毒的具旋盖玻璃试管中。以旋涡混匀器混合该混合物5分钟，然后在室温下再放置25分钟。加入生理盐水(9ml)，并将混合物以旋涡混匀器混合该混合物5分钟，然后在室温下再放置10分钟。将所得混合物转移到已消毒的玻璃离心试管中，4000转/分钟离心15分钟。将浮在表面的水层转移到培养基直径为10cm的已消毒玻璃培养皿中，置排风罩中放置30分钟。所得10ml疫苗形成10个剂量，每ml疫苗含抗原1000-2000个病毒粒子。第一疫苗以单剂量在-200℃下储存。
实施例2疫苗在本发明的另一实施方式中，将取自患者的每ml含10000至20000个病毒粒子的新鲜空腹血(5ml)连同500单位肝素抽入注射器中。该血浆(1ml)与氯仿(5ml)同置已消毒的具旋盖玻璃试管中，以旋涡混匀器彻底混匀该混合物10-15分钟。然后在室温(20-25℃)下放置45分钟。将生理盐水(9ml)加入该混合物并以旋涡混匀器混合该混合物5分钟，然后在室温下放置10分钟。将所得混合物转移到已消毒的玻璃离心试管中，4000转/分钟离心15分钟。将表面层转移到培养基直径为10cm的已消毒玻璃培养皿中，置排风罩中放置30分钟。将表面层(1ml)以生理盐水(9ml)稀释，得到1/100的稀释液。该最终稀释液(1ml)所含抗原为每ml疫苗含抗原1000-2000个病毒粒子，以单剂量在-200℃下储存。
实施例3自体疫苗对病毒数量的影响(见表1，附录1)自体疫苗按照实施例1的方法制备，包含的抗原为有关患者体内病毒量的1/100。将自体疫苗(1ml)直接皮下注射给患者。除了7号患者之外，这明显的使患者病毒数量产生下降。在1号和2号患者中，自体疫苗间隔4天2次注射，病毒数量明显地分别下降91％和75％。
在另一个患者中(附录1(b))，将1ml自体疫苗作为5个样品分别在2001年4月17日、2001年4月21日、2001年6月21日、2001年8月21日和2001年10月21日进行5次简单皮下注射。病毒数量从2001年4月16日的29566(4.5log10)下降到15个月之后2002年7月2日的低于50(1.5log10)，而且HIV血清反应已经难以分辨。但是，在2002年12月17日病毒数量升高到65(1.8log10)。这提示直接注射自体疫苗会导致病毒数量下降到血清反应难以分辨的点，但是无自体疫苗时病毒复制就重新启动。
实施例4具有洗涤过的外周血白细胞的自体疫苗的影响(见附录2)自体疫苗按照实施例1的方法制备，并稀释100倍。将血液样品连同1000单位肝素一起抽入注射器中。将该样品转移到具有直径为1cm培养基的已消毒的具旋盖长试管中，-37℃下垂直放置30分钟。吸取红细胞沉淀上方富含白细胞的血浆，在台式离心机(Jouan C312型)中2000转/分钟离心10分钟。弃去浮在上方的血浆，将生理盐水(5ml)加入白细胞沉淀，混合器中旋涡振荡1分钟后，再次2000转/分钟离心10分钟。
弃去上浮物，将新鲜的生理盐水(5ml)加入沉淀。该洗涤白细胞的步骤重复2次以上，以从细胞沉淀中除去所有痕量的抗体。然后将自体疫苗(1ml)加入洗涤过的白细胞中，立即将混合物皮下注射给有关患者。在如下表2中所示日期重复该程序。患者CD4有显著增加，而所有患者病毒数量有明显下降，34位患者中9位降到50以下。
实施例5治疗性疫苗和免疫疗法洗涤过的外周血白细胞如实施例4制备。将根据实施例1的方法制备的自体疫苗(1ml)加入细胞沉淀，该细胞沉淀接着还加入具有10％人类脐带血清的RPMI(GIBCO)(5ml)培养介质，该脐带血清代替已除去免疫球蛋白的患者血清，不含HIV及其它病毒的抗体。该混合物在37℃下培养4小时。将治疗性疫苗直接皮下重新注射到患者前臂，该患者为血液样品抽取及自体疫苗制备的来源。整个程序在5天和30天时作为加强剂重复进行。
首次免疫疗法后约10-14天，少数患者中出现轻微困倦、身体疼痛及轻微发烧形式的轻微免疫反应。这些症状通过退热和抗过敏药，例如阿司匹林和地塞米松控制。
如果这些症状一直持续，其通常通过输入新鲜血液终止，其提供额外的补体用于治疗性疫苗和免疫疗法所激发的免疫反应。CD4+和病毒数量每3-4个月重复一次，直到病毒数量低于检测水平。连续3年每年监控一次。在少数病例中，患者的血清反应阳性状态数个周期之后变成HIV血清反应阴性。
对5个患者按实施例5治疗的结果表示在下表1中。
时间指治疗后再次测定CD4和病毒载量之前的月数。病毒粒子低于50时无法计数。
第六位患者在1992年十月发现，并根据实施例5进行治疗，未测定其CD4+和病毒载量，三年后报告血清反应阴性。上述4号和5号病例以及第六位患者的血清反应阴性结果确证了HIV已完全从患者体内清除。
HIV为何不能通过免疫系统从体内清除，公认的原因是其为具有包膜的包膜病毒，该包膜在成熟病毒离开受到感染的细胞时从CD4+膜取得。关于此假设的全面讨论发表在《医学假说申请者》(Applicant in MedicalHypotheses，(1994)42，81-88)和《医学假说》Medical Hypotheses(1997)48，517-521)上，其引用于此作为参考。因为HIV的包膜源自CD4+膜，所以免疫系统将病毒认定为“部分自体”。有效的免疫反应，其忽略包膜的存在而杀灭具有包膜的病毒，也会杀灭所有的病毒包膜来源CD4+细胞。HIV以含脂包膜的形式有效取得“人质”，并以其“胁迫”宿主免疫系统使其反应效率低下。
有效的预防性疫苗为预防性免疫疗法，必须符合三个要求。这些要求为，首先，该疫苗必须激发杀灭病毒的免疫反应，第二，人体免疫系统必须正常，第三，待接种的人没有对病毒的已有抗体。为了有效，用于治疗已发生的HIV感染的免疫疗法的治疗性疫苗还必须在受到HIV感染的人体内产生预防性免疫疗法。也就是说，HIV疫苗应在受到感染的人体内激发杀灭病毒的免疫反应，该人应该具有正常免疫能力，HIV抗体不应出现在受到感染的待接种人的免疫系统部分。在HIV感染初期，以及之后可接受的时间里，人体具有正常免疫系统，其内具有数个免疫单元。这些可以成功处理任何特定时间里侵袭机体的不同感染或抗原。有关于此的证据为，在HIV感染之后的最初几年中，侵袭机体的感染原被免疫系统成功控制。
如果出现在外周血白细胞中的未定型HIV的免疫单元之一在体外经过洗涤，使其不含HIV抗体及感染原并与有效的HIV抗体结合，该免疫单元就会将疫苗认定为“非自体”及外来抗原，因为未出现病毒包膜。意识到“非自体”外来抗原的有效免疫反应会在体外启动。当混合物重新注射到受到感染的人体，已接种的免疫细胞及其子代会继续在体内该过程并仅杀灭人体内的HIV核。假如补体足够，这最终会从机体中消除病毒，就像未受到感染的正常人接种所发生的一样。本发明的一个本质特点是，人体包含在其外周血白细胞中的免疫系统的一部分在重新注射到人体中之前，可以在体外不含HIV抗体和含脂感染原的介质中接种。
附录1一个剂量的自体疫苗后3-4周的病毒数变化。
*接受2个剂量的疫苗自体疫苗4周后病毒数附录1BD.B.M/男51岁19/4/01 -HIV血清反应14/4/01 -病毒数29,566(4.5log10)17/4/01 -T3 1181-T4 877-T8 344-T4/T8 2.2(CPC N°13502)1ml血浆/白细胞@40℃24小时氯仿11/2小时+9ml mlN/S15分钟离心。上层漂浮物1/100＝疫苗17/4/01-1ml疫苗s/c.
21/4/01-1ml疫苗s/c.
21/6/01-每2个月给予4个剂量疫苗21/8/0121/10/01.
13/12/01 -T3 1496-T4 1007-T8 453-T4/T8 2.4-病毒数＜50(1.7log10)-血清反应模糊(CPC22,443)17/12/02 -T3 1664-T4 1091-T8 539-T4/T8 2.0-病毒数65(1.8log10)
附录2具有已洗涤外周血白细胞的自体疫苗
权利要求书(按照条约第19条的修改)根据19条(1)所做的声明在国际检索单位2006年3月2日邮寄的书面意见中，认为权利要求1-5、7以及13-29按照PCT条约33条(2)缺乏新颖性，已被“有效HIF疫苗及其免疫疗法初步报告”(D1)所公开。此外，认为权利要求6以及8-12按照PCT条约33条(3)对D1是显而易见的，缺乏创造性。
附件为修改替换页33和34页。
D1(实际上，所有的对比文件)没有提供关于将水液部分(疫苗)从脂质部分(包膜)中分离的细节。而且，公知技术实质上没有讲解、暗示或者汇报明显使用整个病原体，而是说明了使用病原体片断，例如病毒的一部分而非整个病毒。
具体地说，独立权利要求1已做了修改，其清楚地指明使用脂质提取溶剂提取生物液体，通过将上述脂质溶剂加入上述生物液体并将上述破坏包膜组分和上述生物液体机械结合，从而影响脂蛋白的破坏。
权利要求7也做了修改，将“提取”改变为一机械结合—更清楚地将本发明与公知技术进行区分。
以下签名的发明人认为引用的已有技术不影响本发明的专利性。
对权利要求的修改权利要求1修改如下1.一种制造疫苗的方法，其特征是包含步骤从受到含脂传染性有机体感染的人或动物获取包含含脂传染性有机体的生物液体；以含脂溶剂提取上述生物液体，其通过将上述脂质溶剂加入上述生物液体并将上述破坏包膜组分和上述生物液体机械结合，从而影响脂蛋白的破坏，上述提取操作产生水相和含脂有机相，上述水相包含上述传染性有机体，以及分离上述水相。
权利要求7修改如下7.根据权利要求1所述的方法，其特征是机械结合步骤通过任一选自包含混合、旋流、涡流以及旋转的组合的工艺完成。
替换页权利要求1.一种制造疫苗的方法，其特征是包含步骤从受到含脂传染性有机体感染的人或动物获取包含含脂传染性有机体的生物液体；以含脂溶剂提取上述生物液体，其通过将上述脂质溶剂加入上述生物液体并将上述破坏包膜组分和上述生物液体机械结合，从而影响脂蛋白的破坏，上述提取操作产生水相和含脂有机相，上述水相包含上述传染性有机体，以及分离上述水相。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是上述生物液体选自包含全血、血浆、胸膜液、脑脊髓液、培养液以及局部体液的组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是上述含脂传染性有机体选自包含病毒、细菌、原生动物、真菌或细胞壁中包含脂质或类脂物质的一类霉菌的组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是上述传染性有机体为包膜病毒。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是上述包膜病毒选自包含人类免疫缺陷病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人疱疹IV型病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、人类T-淋巴白血病病毒以及癌症病毒的组合。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征是上述传染性有机体为细菌，选自包含结核菌和麻风病菌的组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是[提取]机械结合步骤通过任一选自包含混合、旋流、涡流以及旋转的组合的工艺完成。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是包括浓缩上述水相生成包含实质上已除去脂质的传染性有机体浓缩物的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征是包括通过冷冻干燥法浓缩水相的步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征是包括稀释上述生物液体和稀释上述水提物的步骤，其目的为获取每ml约100-200个病毒粒子的抗原。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征是上述脂质提取溶剂为氯仿，其中提取步骤所用的氯仿与生物液体的比例(体积∶体积)可以为约3∶1至约5∶1。
权利要求
1.一种制造疫苗的方法，其特征是包含步骤从受到含脂传染性生物体感染的人或动物获取包含含脂传染性生物体的生物体液；以含脂溶剂提取上述生物体液，上述提取产生水相和含脂有机相，上述水相包含上述传染性生物体，以及分离上述水相。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是上述生物体液选自包含全血、血浆、胸膜液、脑脊髓液、培养液以及局部体液的组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是上述含脂传染性生物体选自包含病毒、细菌、原生动物、真菌或细胞壁中包含脂质或类脂物质的一类霉菌的组合。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是上述传染性生物体为包膜病毒。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征是上述包膜病毒选自包含人类免疫缺陷病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人疱疹IV型病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒、人类T-淋巴白血病病毒以及癌症病毒的组合。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征是上述传染性生物体为细菌，选自包含结核菌和麻风病菌的组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是提取步骤通过任一选自包含混合、旋流、涡流以及旋转的组合的工艺完成。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征是包括浓缩上述水相生成包含实质上已除去脂质的传染性生物体浓缩物的步骤。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征是包括通过冷冻干燥法浓缩水相的步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征是包括稀释上述生物体液和稀释上述水提物的步骤，其目的为获取每ml约100-200个病毒粒子的抗原。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征是上述脂质提取溶剂为氯仿，其中提取步骤所用的氯仿与生物体液的比例(体积∶体积)为约3∶1至约5∶1。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征是上述脂质提取溶剂为氯仿，其中提取步骤所用的氯仿与生物体液的比例(体积∶体积)为约3∶1。
13.一种制造治疗性疫苗的方法，其特征是包括步骤从受到含脂传染性生物体感染的人或动物获取包含含脂传染性生物体的生物体液；以含脂溶剂提取上述生物体液，上述提取产生水相和含脂有机相，上述水相包含上述实质上已除去上述含脂传染性生物体的脂质的上述传染性生物体；将水相从含脂相中分开；将白细胞部分从上述人或动物血中分离，控制上述分离操作使上述白细胞部分实质上不含血浆、游离含脂传染性生物体或上述含脂传染性生物体的游离抗体；以及将至少部分上述水相与至少部分上述白细胞部分结合生成治疗性疫苗。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征是上述脂质提取溶剂选自包含氯化碳氢化合物、碳氢化合物及醚的组合。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征是上述脂质提取溶剂为氯仿。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征是上述白细胞部分通过从上述人或上述动物抽取血液样品，从血浆中分离血细胞，从血浆中分离白细胞以及将白细胞洗涤至不含残留血浆和抗体。
17.一种按照以下步骤制造治疗性疫苗的方法从一个受含脂传染性生物体感染的第一人或第一动物获取包含含脂传染性生物体的生物体液；分离并培养来自上述生物体液的传染性生物体，以生成包含培养的含脂传染性生物体的组合物；以脂质提取溶剂提取上述含脂传染性生物体的水溶液，提取产生水相和含脂相，上述水相包含实质上已除去脂质的生物体；将水相从含脂相中分开；将白细胞部分从受到与上述第一人或上述第一动物相同的含脂传染性生物体感染的第二人或第二动物的血中分离，控制分离操作，使上述白细胞部分实质上不含血浆、游离含脂传染性生物体或含脂传染性生物体的游离抗体；以及将至少部分上述水相与至少部分上述白细胞部分结合生成治疗性疫苗。
18.根据权利要求17所述的方法，其特征是上述脂质提取溶剂选自包含氯化碳氢化合物、碳氢化合物及醚的组合。
19.根据权利要求17所述的方法，其特征是上述脂质提取溶剂为氯仿。
20.根据权利要求17所述的方法，其特征是上述白细胞部分通过从上述第二人或上述第二动物抽取血液样品，从血浆中分离血细胞，从血浆中分离白细胞以及将白细胞洗涤至不含残留血浆和抗体。
21.一种疫苗，其特征是通过以下步骤制备从受到含脂传染性生物体感染的人或动物获取包含含脂传染性生物体的生物体液；提取上述生物体液，上述提取产生水相和含脂有机相，上述水相包含上述实质上已除去脂质的上述传染性生物体；以及分离上述水相。
22.一种物质或组合物在制造用于治疗含脂传染性生物体所致感染的药品中的用途，该物质或组合物包含如权利要求21所述的疫苗或治疗性疫苗。
23.一种治疗性疫苗，通过一种方法制备，其特征是包括步骤从受到含脂传染性生物体感染的人或动物获取包含含脂传染性生物体的生物体液；以含脂溶剂提取上述生物体液，上述提取步骤产生水相和含脂有机相，上述水相包含上述实质上已除去脂质的上述传染性生物体；将水相从含脂相中分开；将白细胞部分从上述人或上述动物血中分离，控制上述分离步骤使上述白细胞部分实质上不含血浆、游离含脂传染性生物体以及上述含脂传染性生物体的游离抗体；以及将至少部分上述水相与至少部分上述白细胞部分结合生成疫苗。
24.一种治疗性疫苗，通过一种方法制备，其特征是包括步骤从一个受含脂传染性生物体感染的第一人或第一动物获取包含含脂传染性生物体的生物体液；分离并培养上述传染性生物体，以生成包含培养的含脂传染性生物体的组合物；用脂质提取溶剂提取上述含脂传染性生物体的水溶液，提取产生水相和含脂相，上述水相包括上述实质上已除去脂质的生物体；将上述水相从上述含脂相中分开；将白细胞部分从受到上述含脂传染性生物体感染的第二人或第二动物的血中分离，控制上述分离步骤，使上述白细胞部分实质上不含血浆、游离含脂传染性生物体或含脂传染性生物体的游离抗体；以及将至少部分上述水相与至少部分上述白细胞部分结合生成治疗性疫苗。
25.一种治疗性疫苗，其包括在体外暴露到疫苗的白细胞，该疫苗由实质上除去了脂质部分的含脂传染性生物体生成，暴露实质上在没有游离含脂传染性生物体存在，而有不含游离含脂传染性生物体抗体血清的介质存在时发生。
26.一种预防性疫苗，通过一种方法制备，其特征是包括步骤从受到含脂传染性生物体感染的人或动物获取生物体液；培养上述生物体液；以脂质提取溶剂提取含有含脂传染性生物体的培养物，提取步骤产生水相和含脂相，上述水相包含实质上已除去脂质的传染性生物体；以及分离上述水相。
27.一种物质或组合物，用于预防含脂传染性生物体所致的感染，该物质或组合物包含如权利要求26所述的预防性疫苗。
28.一种物质或组合物在制造用于预防含脂传染性生物体所致感染的药品中的用途，该物质或组合物包含如权利要求26所述的预防性疫苗。
29.一种物质或组合物，用于一种治疗含脂传染性生物体所致感染的方法，该物质或组合物包含通过如权利要求1所述方法制备的疫苗或治疗性疫苗。
全文摘要
一种治疗性疫苗，通过一种方法制备，该方法包括下列步骤以脂质提取溶剂提取从受到含脂传染性生物体感染的人或动物中获取的生物体液，该生物体液包含含脂传染性生物体，提取产生水相和含脂相，上述水相包含实质上已除去脂质的传染性生物体，将水相从含脂相中分开。将白细胞部分从人或动物血中分离，控制分离使白细胞部分实质上无血浆、游离含脂传染性生物体和含脂传染性生物体的游离抗体，将至少部分水相与至少部分白细胞部分结合生成疫苗。
文档编号A61K39/12GK1972711SQ200580019241
公开日2007年5月30日 申请日期2005年4月8日 优先权日2004年4月12日
发明者维克托·阿诺玛·恩古 申请人:维克托·阿诺玛·恩古