专利名称：治疗糖尿病的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用胰岛再生疗法(I.N.T.TM)和免疫抑制剂以及用胃泌素/CCK配体受体和免疫抑制剂来治疗糖尿病患者的方法和组合物。
背景技术：
在美国人中，大约800000人患有胰岛素不足糖尿病(也称为青少年糖尿病或I型糖尿病)，并且每年大约有30000例新病例产生。此外，在美国人中，按流行病比例的水平，非常大且快速增加数目的患者有导致胰衰弱和胰岛素不足的II型糖尿病(也称为成年起病型糖尿病或胰岛素抵抗性糖尿病)的形式。
表示糖尿病特征的异常高血糖(高血糖症)如果使其处于不治疗状态，则导致各种各样的病理学疾病，例如不愈合的外周血管溃疡、引起失明的视网膜损害和肾衰竭。虽然不是所有的II型糖尿病患者发展到需要胰岛素治疗，但根据由患者葡萄糖自体监测确定的血糖水平，用胰岛素注射液来治疗I型糖尿病和II型糖尿病。一般每天给患者提供多剂的胰岛素。糖尿病的严重病理学后果与血糖水平的不太严格控制相关。
实施方案的概述在一个方面，本发明的一个实施方案是制备供治疗糖尿病患者用的药物的方法，所述方法包括给予所述患者胰岛再生疗法的组合物以及免疫应答抑制剂。所述方法另外利用一种包含EGF受体的配体的胰岛再生疗法组合物。所述方法进一步利用一种包含至少两种免疫应答抑制剂的胰岛再生疗法组合物。适合于所述方法的胰岛再生疗法组合物包含胃泌素/缩胆囊素(CCK)受体的配体。该EGF受体的配体是重组人EGF，例如所述EGF受体的配体是EGF51N。所述胃泌素/CCK受体的配体是人胃泌素17。在相关的实施方案中，所述免疫应答抑制剂是药物，例如，所述免疫应答抑制剂是至少一种选自以下的药物雷帕霉素、皮质类固醇、硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、环孢菌素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、FK506(他克莫司(Tacrolimus))、15-脱氧精胍菌素、FTY 720、米托蒽醌、2-氨基-1，3-丙二醇、盐酸2-氨基-2[2-(4-辛基苯基)乙基]丙-1，3-二醇、6-(3-二甲基-氨基丙酰基)弗司扣林和demethimmunomycin。所述雷帕霉素是依维莫司(Everolimus)或西罗莫司(Sirolimus)。所述皮质类固醇是地塞米松。所述免疫应答抑制剂是蛋白质，例如所述蛋白质包含抗体的氨基酸序列。抑制免疫应答的示例性抗体可以是至少一种选自以下的药物hul 124、BTI-322、allotrap-HLA-B270、OKT4A、恩莫单抗、ABX-CBL、OKT3、ATGAM、巴利昔单抗、达珠单抗、抗胸腺细胞免疫球蛋白、ISAtx247、Medi-500、Medi-507、Alefacept、依法珠单抗(efalizumab)、英夫利昔单抗；在一个替代的实施方案中，所述蛋白是细胞因子或生长因子，例如GFAP、S100β或干扰素。
按照这些方法，将所述胰岛再生疗法组合物和所述免疫应答抑制剂配制成供序贯给药用。一个实例包括将胰岛再生疗法组合物和免疫应答抑制剂配制成供序贯给药用；并且fpr允许在给予所述抑制剂和给予所述组合物之间有至少1天的时间。另一方面，给予所述抑制剂和给予所述组合物之间的时段，至少为1周，或者至少为6周。
在以上实施方案中，将所述胰岛再生疗法组合物和所述免疫应答抑制剂中的至少一种配制成供系统给药用。另一方面，将所述胰岛再生疗法组合物和该免疫应答抑制剂中的至少一种配制成供快速浓注给药用。例如，将所述胰岛再生疗法组合物和所述免疫应答抑制剂中的至少一种配制成供选自以下的途径给药用静脉内途径、皮下途径、腹膜内途径和肌内途径。在某些实施方案中，将所述免疫应答抑制剂配制成供口服给药用。在某些实施方案中，所述免疫应答抑制剂是选自西罗莫司、他克莫司、依维莫司、ISAtx247和达珠单抗中的至少一种。
在大多数情况下，所述患者(为他们阐述使用法)是糖尿病哺乳动物，例如所述患者是人。另一方面，所述患者可以是实验动物，例如NOD小鼠。
在另一个方面，本发明的一个实施方案是一种制备供治疗糖尿病患者用的药物的方法，所述方法包括为患者配制一种由EGF受体的配体和胃泌素/CCK受体的配体中的至少一种组成的胰岛再生疗法的组合物，并且给予至少一种免疫抑制剂。在一个相关的实施方案中，所述方法另外涉及在没有EGF受体的配体的情况下配制胃泌素/CCK受体的配体和至少一种免疫抑制剂。在该方法的一个实施方案中，在没有EGF受体的配体的情况下进一步给予胃泌素/CCK受体的配体和至少一种免疫抑制剂之前，所述方法还包括一段不给予任何所述抑制剂或所述组合物的时期。所述糖尿病患者例如患有新近起病型糖尿病(recent onset diabete)。此外，在不给药的时期之后，将所述组合物和所述抑制剂配制成供序贯给药用。在某些实施方案中，以有效剂量配制EGF受体的配体、胃泌素/CCK受体的配体和所述免疫抑制剂中的每一种。此外在某些实施方中，将所述组合物或所述抑制剂与药学上可接受的缓冲剂一起配制。
本发明的又一个特征是一种制备供治疗糖尿病患者用的药物的方法，所述方法包括给予患者一种包含EGF51N和胃泌素17中的至少一种的胰岛再生疗法的组合物，并且给予至少一种免疫抑制剂。将所述至少一种抑制剂配制成对于他克莫司和西罗莫司各为有效剂量。另一方面，所述方法另外涉及配制有效剂量的EGF51N和胃泌素17中的至少一种，并且配制有效剂量的他克莫司、依维莫司、达珠单抗、ISAtx247和西罗莫司中的至少一种。另一方面，所述方法包括配制供患者使用的胃泌素/CCK受体的配体和免疫应答抑制剂。例如，所述胃泌素/CCK受体的配体是胃泌素17。所述免疫应答抑制剂是药物，例如，所述免疫应答抑制剂选自至少一种以下的药物雷帕霉素、皮质类固醇、硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、环孢菌素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、FK506、ISAtx247、15-脱氧精胍菌素、FTY 720、米托蒽醌、2-氨基-1，3-丙二醇、盐酸2-氨基-2[2-(4-辛基苯基)乙基]丙-1，3-二醇、6-(3-二甲基-氨基丙酰基)弗司扣林和demethimmunomycin。例如，所述雷帕霉素是西罗莫司或依维莫司。所述皮质类固醇例如是地塞米松。
另一方面，在该方法的实施方案中，所述免疫应答抑制剂是蛋白质，例如所述蛋白质包含抗体的氨基酸序列。例如，所述免疫应答抑制剂是至少一种选自以下的药物hul 124、BTI-322、allotrap-HLA-B270、OKT4A、恩莫单抗、ABX-CBL、OKT3、ATGAM、巴利昔单抗、达珠单抗、抗胸腺细胞免疫球蛋白、ISAtx247、Medi-500、Medi-507、Alefacept、依法珠单抗和英夫利昔单抗。所述方法涉及将所述胃泌素/CCK受体的配体和所述免疫应答抑制剂配制成供序贯给药用。此外，以快速浓注形式给予胃泌素/CCK受体的配体。例如，进一步利用选自静脉内途径、皮下途径、腹膜内途径和肌内途径的途径，来给予所述受体的配体。利用选自口服给药途径、系统给药途径、静脉内给药途径、皮下给药途径、腹膜内给药途径和肌内给药途径的给药途径，来给予所述免疫应答抑制剂。在该方法的一个实施方案中，所述免疫应答抑制剂选自他克莫司、ISAtx247、依维莫司、西罗莫司和达珠单抗中的至少一种。
在本文方法的任何实施方案中，本发明另外涉及测定患者的生理参数，例如，测定空腹血糖水平、测定胰腺胰岛素含量的水平、测定含胰腺β细胞量的水平以及测定血浆胰岛素C肽水平。所述患者是哺乳动物，例如所述患者是糖尿病哺乳动物，例如所述患者是患有新近起病型糖尿病的糖尿病哺乳动物，例如所述患者是人。
本发明的特征也在于一种治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括给予患者一种包含有效剂量的胃泌素17和有效剂量的至少一种免疫抑制剂的组合物。至少一种免疫抑制剂是他克莫司或西罗莫司。所述方法可进一步涉及给予患者有效剂量的ISAtx247或达珠单抗。所给予的组合物还包括药学上可接受的缓冲剂。
本发明的特征也在于一种包括免疫应答抑制剂以及EGF受体的配体和胃泌素/CCK受体的配体中的至少一种的药用组合物。该胃泌素/CCK受体的配体是胃泌素。例如，所述胃泌素/CCK受体的配体是胃泌素17，而所述胃泌素17是胃泌素17Met15或胃泌素17Leu15。此外，所述EGF受体的配体是表皮生长因子(EGF)，例如所述表皮生长因子是重组人EGF51N。另外，所述免疫应答抑制剂是药物。例如，所述免疫应答抑制剂是至少一种选自以下的药物雷帕霉素、皮质类固醇、硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、环孢菌素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、FK506(他克莫司)、15-脱氧精胍菌素、FTY 720、米托蒽醌、2-氨基-1，3-丙二醇、盐酸2-氨基-2[2-(4-辛基苯基)乙基]丙-1，3-二醇、6-(3-二甲基-氨基丙酰基)弗司扣林和demethimmunomycin。另一方面，所述免疫应答抑制剂是蛋白质。例如，所述免疫应答抑制剂是抗体的一部分，例如，所述抑制剂是至少一种选自以下的药物hul 124、BTI-322、allotrap-HLAB270、OKT4A、恩莫单抗、ABX-CBL、OKT3、ATGAM、巴利昔单抗、达珠单抗、抗胸腺细胞免疫球蛋白、ISAtx247、Medi-500、Medi-507、Alefacept、依法珠单抗、英夫利昔单抗和干扰素。
另一方面是一种用于治疗糖尿病患者的试剂盒，所述试剂盒包括胰岛再生疗法的组合物、免疫抑制剂和容器。所述试剂盒包括至少一次剂量的本文组合物中的任何一种或更多种。所述试剂盒还可以包括使用说明书。
本发明的特征也在于一种制备供治疗糖尿病患者用的药物的方法，所述方法包括制备一种包含有效剂量的胃泌素17和有效剂量的至少一种免疫抑制剂的组合物。例如，这样的一种制备供治疗糖尿病患者用药物的方法，以致于所述药物含有有效剂量的胃泌素17以及有效剂量的他克莫司和有效剂量的西罗莫司。本发明的特征也在于有效剂量的胃泌素17和有效剂量的至少一种免疫抑制剂在制备用于治疗糖尿病患者的组合物中的用途。本发明的特征也在于有效剂量的胃泌素17以及有效剂量的他克莫司和有效剂量的西罗莫司在制备用于治疗糖尿病患者的药物中的用途。本发明的特征也在于免疫抑制剂和EGF受体的配体及胃泌素/CCK受体的配体中的至少一种在制备用于治疗糖尿病患者的药物中的用途。
与葡萄糖监测和胰岛素注射有关的糖尿病的替代疗法，先前已被胰岛素的免疫排斥和产生胰岛素的β细胞所限制。给予免疫抑制剂和胰岛再生疗法(I.N.T.TM，美国专利第5,885,956号和第6,288,301号)的组合物，对治疗糖尿病会是非常有利的。
本发明的一个特征是通过给予患者胰岛再生疗法(I.N.T.TM)的组合物和免疫应答抑制剂来治疗糖尿病患者的方法。所述抑制剂可以是蛋白质，例如整个抗体或其一部分。另一方面，所述抑制剂可以是药物，当用于本文时，是指低分子量化合物，即分子量小于约5000道尔顿、小于约2000道尔顿或小于约1000道尔顿的化合物。所述胰岛再生疗法的组合物包含EGF受体的配体，例如，所述EGF受体的配体是重组人表皮生长因子。例如，所述EGF受体的配体是EGF51N。此外，所述胰岛再生疗法的组合物包含胃泌素/缩胆囊素(CCK)受体的配体。例如，所述胃泌素/CCK受体的配体是在位置15具有一个亮氨酸残基(leu)的人胃泌素17。
所述免疫应答抑制剂可以是雷帕霉素、皮质类固醇、硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、环孢菌素(环孢多肽)、环磷酰胺、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、FK506、15-脱氧精胍菌素、FTY 720、米托蒽醌、2-氨基-1，3-丙二醇、盐酸2-氨基-2[2-(4-辛基苯基)丙-1，3-二醇、6-(3-二甲基-氨基丙酰基)弗司扣林或demethimmunomycin中的至少一种。术语“雷帕霉素”是指实质上共同具有雷帕霉素药物核心且共同具有免疫抑制活性的任何相关化学实体或衍生物。术语“皮质类固醇”是指实质上共同具有免疫抑制活性的任何相关化学实体。例如，术语雷帕霉素包括西罗莫司(它是雷帕霉素)和也称为依维莫司的SDZ-RAD。皮质类固醇的一个实例是地塞米松。
或者，作为蛋白的免疫应答抑制剂包含抗体的氨基酸序列。例如，所述抑制剂是hul 124、BTI-322、allotrap-HLA-B270、OKT4A、恩莫单抗、ABX-CBL、OKT3、ATGAM、巴利昔单抗、达珠单抗、抗胸腺细胞免疫球蛋白、ISAtx247、Medi-500、Medi-507、Alefacept、依法珠单抗、英夫利昔单抗中的至少一种。又一个可供选择的是，所述免疫应答抑制剂是非抗体的蛋白，例如是胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)，或是另一种神经胶质蛋白-S100β(Selinfreund，R.等，J CellBiol.1990，1112021-2028)，或是干扰素。在又一个实施方案中，所述免疫应答抑制剂包括一组具有随机氨基酸序列中的氨基酸残基亚群的共聚物分子。例如，所述共聚物是醋酸格拉默(也称为CopaxoneTM)。
在某些实施方案中，同时给予所述胰岛再生疗法组合物和所述免疫应答抑制剂。另一方面，序贯给予所述胰岛再生疗法组合物和所述免疫应答抑制剂。同时给予可以是以一个组合的形式将所述组合物和所述抑制剂一起地给予，或者可以是独立且彼此在大约15分钟内、大约30分钟内、或大约1小时内乃至在大约1天内给予所述组合物和所述抑制剂。序贯给药是指在给予所述胰岛再生疗法的组合物和所述免疫抑制剂之间有超过大约1天的时间消逝；例如在给予所述I.N.T.TM组合物和所述免疫抑制剂之间的大约1周、大约2周或大约6周的时间消逝。
在治疗糖尿病患者的合理实施方案中，在大约几天或大约1周的给药过程期间，给予所述免疫抑制剂，随后给予I.N.T.TM组合物，例如在既不给予所述抑制剂又不给予所述组合物的一段时期之后。可利用既不给予所述组合物又不给予所述抑制剂的时期来检查所述患者，以确定是否可观察到该患者在免疫抑制方面的改变。在一个替代的实施方案中，在大约几天或大约1周或大约几周的给药过程期间，给予I.N.TTM组合物，随后给予所述免疫抑制剂，例如在既不给予所述抑制剂又不给予所述组合物的一段时期之后。在又一个其它的实施方案中，可以既给予I.N.T.TM组合物又给予免疫抑制剂；然后，停止用I.N.T.TM组合物，而继续免疫抑制。在又一个实施方案中，给予I.N.T.TM组合物和免疫抑制剂的组合，继之以用胃泌素/CCK配体和免疫抑制剂的组合进行治疗。当用于本文时，例如为实施成功的免疫反应抑制而给予免疫抑制剂，则可以是给予两种或更多种免疫抑制剂。
系统给予所述胰岛再生疗法组合物，例如，以快速浓注形式给予，通过选自静脉内给药、皮下给药(sc)、腹膜内给药(ip)和肌内给药(im)的途径来给予。静脉内给药可以是以输注(滴注)或快速浓注给药。可以口服给予所述免疫应答抑制剂，例如所述抑制剂是口服用药的时候。另一方面，例如通过选自静脉内给药、皮下给药、腹膜内给药和肌内给药的途径，系统给予所述免疫应答抑制剂。所述免疫应答抑制剂可以例如是他克莫司、西罗莫司和达珠单抗中的至少一种。
所述方法还可以包括测定患者的生理参数，例如空腹血糖水平、胰腺胰岛素含量、胰腺β细胞含量和胰岛含量。所述患者是糖尿病非人类哺乳动物，例如所述患者是非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠。在后一患者中，所述方法还可以包括评价在没有给予胰岛素情况下的存活率的大小。另一方面，所述患者是人，例如所述患者是病人，例如糖尿病病人，例如患有一种糖尿病形式且需要治疗的病人。
另一个实施方案提供一种治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括给予患者一种由有效剂量的EGF51N和有效剂量的胃泌素17中的至少一种组成的胰岛再生疗法的组合物，并且给予有效剂量的至少一种免疫抑制剂。又一个实施方案提供一种治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括给予患者一种由有效剂量的EGF51N和有效剂量的胃泌素17中的至少一种组成的胰岛再生疗法的组合物，并且给予有效剂量的他克莫司和有效剂量的西罗莫司。又一个实施方案提供一种治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括给予患者一种由有效剂量的EGF51N和有效剂量的胃泌素17中的至少一种组成的胰岛再生疗法的组合物，并且给予有效剂量的他克莫司、达珠单抗和西罗莫司中的至少一种。所述组合物或抑制剂还可以包含药学上可接受的缓冲剂。
本文也提供一种用于治疗糖尿病患者的试剂盒，所述试剂盒包括免疫抑制剂、I.N.T.TM组合物和容器。所述试剂盒还可以包括使用说明书。
提供一种用于治疗糖尿病的、包含胃泌素/缩胆囊素(CCK)受体的配体和免疫应答抑制剂的药用组合物。在一个实施方案中，所述胃泌素/CCK受体的配体是胃泌素，例如胃泌素17Met15或胃泌素17Leu15。
将所述药用组合物例如配制成供肠胃外给药用。另一方面，将所述药用组合物配制成供口服给药用、配制成供肠胃外给药用或者配制成供选自以下的途径给药用皮下注射、腹膜内(i.p.)注射、静脉内(i.v.)注射和肌肉注射。将所述组合物配制成供系统给药用。将所述组合物配制成供选自透皮递药和粘膜递药的给药途径用。
本发明的一个特征是通过给予患者包含胃泌素/CCK配体受体的组合物以及免疫应答抑制剂来治疗糖尿病患者的方法。所述抑制剂可以是蛋白质，例如整个抗体或其一部分。另一方面，所述抑制剂可以是药物，当用于本文时，是指低分子量化合物，即分子量小于约5000道尔顿、小于约2000道尔顿或小于约1000道尔顿的化合物。
此外，所述胃泌素/CCK受体包括胃泌素17，例如所述胃泌素/CCK受体的配体是在位置15具有亮氨酸残基(leu)或在位置15具有甲硫氨酸残基(met)的人胃泌素17。
所述免疫应答抑制剂可以是雷帕霉素、皮质类固醇、硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、环孢菌素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、FK506、ISAtx247、15-脱氧精胍菌素、FTY 720、米托蒽醌、2-氨基-1，3-丙二醇、盐酸2-氨基-2[2-(4-辛基苯基)乙基]丙-1，3-二醇、6-(3-二甲基氨基丙酰基)弗司扣林或demethimmunomycin中的至少一种。例如所述雷帕霉素是SDZ-RAD。例如所述皮质类固醇是地塞米松。和胃泌素/CCK受体的配体一起使用、能抑制免疫应答的其它抑制剂被认为在所述组合物的范围之内。另一方面，所述抑制剂是包含抗体的氨基酸序列的蛋白质。例如，所述抑制剂是hul 124、BTI-322、allotrap-HLA-B270、OKT4A、恩莫单抗、ABX-CBL、OKT3、ATGAM、巴利昔单抗、达珠单抗、抗胸腺细胞免疫球蛋白、ISAtx247、Medi-500、Medi-507、Alefacept、依法利昔单抗或英夫利昔单抗中的至少一种。在一个不同的实施方案中，所述免疫应答抑制剂可以是天然存在的细胞因子或趋化因子，例如干扰素或神经胶质蛋白例如GFAP或S100β。在又一个实施方案中，所述免疫应答抑制剂包括一组具有随机氨基酸序列中的氨基酸残基亚群的共聚物分子。例如，所述共聚物是醋酸格拉默，或是另一种包含氨基酸的共聚物(参见例如Fridkis-Hareli等，2002，J.Clin.Inves.1091635-1643)。
在某些实施方案中，同时给予所述胃泌素/CCK受体的配体和所述免疫应答抑制剂。另一方面，序贯给予所述胃泌素/CCK受体的配体和所述免疫应答抑制剂。同时给药可以是以一个组合的形式一起给予所述胃泌素/CCK受体的配体和所述抑制剂，或者可以是独立且彼此在多少分钟内(例如15分钟、30分钟)或多少小时内(例如1小时、4小时)乃至在1天内地给予所述胃泌素/CCK受体的配体和所述抑制剂。序贯给药是指在给予所述胃泌素/CCK受体的配体和所述免疫应答抑制剂之间有超过1天的时间消逝。在治疗糖尿病患者方法的一个实施方案中，在几天或大约1周的过程期间给予所述免疫抑制剂，随后给予所述胃泌素/CCK受体的配体，例如在一段既不给予所述抑制剂又不给予所述受体的配体的时期之后。
用既不给予所述抑制剂又不给予所述受体的配体的时期来监测所述患者，以确定是否可以观察到所述患者在免疫抑制方面的变化。在一个替代的实施方案中，可以首先以组合形式既给予所述胃泌素/CCK受体的配体又给予所述免疫应答抑制剂；然后，停止给予所述胃泌素/CCK受体的配体，而继续给予所述免疫应答抑制剂。本文中的另一个实施方案是治疗糖尿病患者的、包括给予一种I.N.T.TM组合物达一段时期的方法。所述一段时期可以是至少1天，例如几天，例如至少1周，例如几周，例如至少6周；继之以给予至少一种免疫抑制剂。
系统给予胃泌素/CCK受体的配体，例如，以快速浓注形式给予，通过选自静脉内给药、皮下给药、腹膜内给药和肌内给药的途径来给药。静脉内给药可以是以输注(滴注)或快速浓注给药。可以口服给予所述免疫应答抑制剂，例如所述抑制剂是口服用药的时候。另一方面，例如通过选自静脉内给药、皮下给药、腹膜内给药和肌内给药的途径，系统给予所述免疫应答抑制剂。所述免疫应答抑制剂可以例如是他克莫司、西罗莫司、ISAtx247和达珠单抗中的至少一种。
所述方法还可以包括测定患者的生理参数，例如空腹血糖水平、胰腺胰岛素含量、胰腺β细胞含量和胰岛含量。所述患者是糖尿病非人类哺乳动物，例如所述患者是非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠。在后一患者中，所述方法还可以包括在没有给予胰岛素的情况下评价存活率的大小。另一方面，所述患者是病人，例如有糖尿病的一种形式的适应征并且需要治疗的病人。
本文中的另一个实施方案提供一种治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括给予患者一种由有效剂量的胃泌素17组成的胃泌素/CCK受体的配体，并且给予有效剂量的至少一种免疫抑制剂。又一个实施方案是一种治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括给予患者一种由有效剂量的胃泌素17中的至少一种组成的胃泌素/CCK受体的配体的组合物，并且给予有效剂量的他克莫司和有效剂量的西罗莫司。又一个实施方案提供一种治疗糖尿病患者的方法，所述方法包括给予患者一种由有效剂量的胃泌素17组成的胃泌素/CCK受体的配体，并且给予有效剂量的他克莫司、达珠单抗、ISAtx247和西罗莫司中的至少一种。本文中的所述组合物或抑制剂还可以包括药学上可接受的缓冲剂。
在本文中，也提供一种治疗糖尿病患者的试剂盒，所述试剂盒包括免疫抑制剂、胃泌素/CCK受体的配体和容器。所述试剂盒还可以包括使用说明书。本文中所述的任何试剂盒(bits)还可以包括单位剂量即有效剂量的所述组合物和至少一种药物的任一种或它们两者。
附图简述
图1是纵坐标为实施例1中所描述四组中之每一组NOD小鼠的存活百分率对横坐标为以天计的时间所作的的曲线图。自第4周开始，把I.N.T.TM组合物(胃泌素和EGF)和免疫抑制药(西罗莫司和他克莫司)同时给予组1的动物(●)，仅把I.N.T.TM组合物给予组2的动物(■)，仅把免疫抑制药给予组3的动物(□)，仅把溶媒给予组4的动物(○)。
图2是显示实施例1中描述的组1存活动物在7周和9周的空腹血糖(FBG)下降的线条图。每一条线表示来自一只存活小鼠的数据。
图3是显示胰腺胰岛素含量(ng/g体重)的图，所述胰腺胰岛素含量即以实施例1存活小鼠(■)的血糖浓度(mM)的函数形式绘制的胰腺胰岛素含量。对照数据点包括一只来自经胰岛素治疗的非糖尿病NOD小鼠的4周之点、一只12-15周急性前驱糖尿病NOD小鼠(之点)和来自一只慢性糖尿病小鼠的15周之点(▲)。所述数据显示，每单位重量的、I.N.T.TM/免疫抑制的小鼠的血糖水平比慢性糖尿病小鼠的所述血糖水平低。
图4是分别显示血浆C-肽含量和胰腺胰岛素含量的两幅一组的柱状图，血浆C-肽含量和胰腺胰岛素含量即实施例3中描述的经治疗的四组中之每一组中新近起病型糖尿病NOD小鼠的血浆C-肽含量和胰腺胰岛素含量，用取自治疗0天和治疗28天的所述小鼠的样品。把I.N.T.TM组合物(胃泌素/EGF)和免疫抑制药(西罗莫司和他克莫司)同时给予组1的动物，仅把I.N.T.TM组合物给予组2的动物，仅把免疫抑制药给予组3的动物，仅把溶媒给予组4的动物。
发明详述在一个方面，本发明的特征在于胰岛再生疗法(I.N.T.TM)组合物和方法，例如，配合免疫抑制剂的胃泌素和EGF，在体内刺激新的β细胞生长，增加胰岛团，并且在糖尿病患者中导致葡萄糖耐量的改善，例如在糖尿病人中和在动物中。
可以以联合的单剂量形式给予所述胃泌素/CCK受体的配体和EGF受体的配体，或者可以按任何顺序独立给予所述胃泌素/CCK受体的配体和EGF受体的配体。这些组合物的“联合有效剂量”是导致分泌胰岛素细胞的数目增加或血液胰岛素水平升高或β细胞群增加的剂量。在一个实施方案中，该胃泌素/CCK受体的配体是长度为17个氨基酸残基的人胃泌素；在位置15的残基是亮氨酸残基(1-17Leu15，本文中称之为胃泌素17Leu15)；此外，所述EGF受体的配体是人EGF51N。该有效剂量可相当于一种大于1的胃泌素/CCK受体的配体对EGF受体的配体的比率，例如所述有效剂量相当于大于10的胃泌素/CCK受体的配体对EGF受体的配体的比率。给予所述剂量的一种方便途径是系统注射，例如皮下快速浓注。
在另外一个实施方案中，给予接受者患者抑制免疫系统的抑制剂。例如，所述抑制剂是低分子量有机化学药品，例如是他克莫司、西罗莫司、环孢菌素和可的松以及如表1中所示其它药物中的至少一种。在一个替代的实施方案中，所述抑制剂是抗体，例如，所述抗体是抗CD11a和在表1中所列出的其它抗体。在又一个可供选择的比较方案中，所述免疫抑制剂可以是由患者按照免疫接种方案从简单成分合成的抗体，例如对GFAP或对S100β。所述患者可以是糖尿病患者，例如所述患者是非肥胖型糖尿病小鼠(NOD小鼠)，或是经链脲菌素(streptozoticin)治疗的小鼠。所述患者可以是人，例如，患有I型糖尿病或II型糖尿病的糖尿病病人，或者患有妊娠糖尿病的糖尿病病人，或者曾患糖尿病例如在过去的怀孕过程中患有糖尿病的糖尿病病人。
此外，测定新近阐述的分泌胰岛素之β细胞或胰岛的大小与功能是测定选自以下的参数胰岛β细胞群、胰岛β细胞数、胰岛β细胞百分数、血糖、血清葡萄糖、血液糖基化血红蛋白、胰腺β细胞群、胰腺β细胞数、空腹血浆C肽含量、血清胰岛素和胰腺胰岛素含量。
当糖尿病在某些病例中为自身免疫病时，I.N.T.TM的一个实施方案是例如把治疗有效剂量的EGF受体的配体和胃泌素/CCK受体的配体，例如胃泌素和EGF的组合，系统给予同样用一种或更多种抑制免疫系统剂即免疫抑制剂治疗的实验对象或患者。能像为治疗糖尿病患者所描述的那样，系统给予胃泌素和EGF的组合；这里的目的是刺激胰腺内从头形成的胰岛的再生(参见美国专利第5,885,956号和第6,288,301号)。
可以用许多不同的终点来确定是否胃泌素和EGF的治疗、或用胃泌素和EGF与免疫抑制剂之组合的治疗增加胰岛移植物中β细胞的功能性物质。这些包括在给小鼠注射β细胞刺激剂例如葡萄糖或精氨酸后，测定循环的人C肽和人胰岛素的升高的血浆水平；由人胰岛素的增强的免疫反应性、或由提取自胰岛移植物的mRNA水平证明的对胃泌素/EGF治疗的反应；以及通过所治疗动物之胰岛的形态测定法测定而确定的增加的β细胞数。通过在患有链脲菌素诱发性糖尿病或遗传性(NOD)糖尿病的接受者小鼠中逆转高血糖症，也能证明人胰岛β细胞的增强的功能。在本文的实施例中，由停止服用胰岛素时的改善的存活率，以及由空腹血糖水平所表明的制止高血糖，来证明在用胃泌素、用EGF和用一种或更多种免疫抑制剂治疗患糖尿病的接受者患者后的增强的β细胞功能。此外，既观察到胰腺胰岛素的增加，又观察到血浆C-肽的增加。
表1 示例性的免疫抑制剂以及商品来源
本文中的方法和组合物增强用胃泌素和EGF以及免疫抑制剂来治疗的临床试验的可靠程度则将表明在I型和II型糖尿病患者的胰腺内刺激内源β胰岛细胞的生长。
本文所用的术语“胃泌素/CCK受体的配体”包括刺激胃泌素/CCK受体的化合物，这样的刺激，以致于当同一组织或相邻组织中的、或者同一个体中的EGF受体也受到刺激时，则诱导产生胰岛素的胰岛细胞再生。这样的胃泌素/CCK受体的配体的实例是美国专利6,288,301中所举出的，并且包括例如胃泌素34(大胃泌素)、胃泌素17(小胃泌素)和胃泌素8(微胃泌素)等胃泌素的不同形式，例如CCK 58、CCK 33、CCK 22、CCK 12和CCK 8等缩胆囊素的不同形式；以及其它的与EGF受体的配体一同显示同一协同作用活性的胃泌素/CCK受体的配体，而当它们与EGF受体的配体协同作用时，能诱导成熟胰腺细胞的分化而形成分泌胰岛素的胰岛细胞。也考虑了以上所述化合物的活性类似物、片段及其它修饰物，包括所述胃泌素/CCK受体的肽和非肽的激动剂或部分激动剂，例如或者单独地、或者配合EGF受体的配体地诱导成熟胰腺中细胞的分化而形成分泌胰岛素之胰岛细胞的A71378(Lin等，Am.J.Physiol.258(4 Pt 1)G648，1990)。
通过肽合成来经济地制备小规模形式的胃泌素例如胃泌素17，而合成肽是市场上买得到的。合成的人胃泌素17以及衍生物例如当用于本文实施例中时在位置15具有代替甲硫氨酸的亮氨酸的人胃泌素17，也是可以从瑞士的Bachem AG，Bubendorf和纽约的Researchplus，Nanasquan获得的。
胃泌素/CCK受体的配体也包括上述配体的活性类似物、片段及其它修饰物。这样的配体也包括增强内源胃泌素、缩胆囊素或来自组织储藏部位的类似活性肽的分泌的化合物。这些化合物的实例是胃泌肽、抑制胃酸分泌的奥美拉唑和增强CCK刺激的大豆胰蛋白酶抑制剂。
本文所用的术语“EGF受体的配体”包括刺激EGF受体的化合物，这样的刺激以致于当胃泌素/CCK受体在同一或相邻的组织中时或者在同一个体中时，则也受到刺激；从而诱导产生胰岛素的胰岛细胞的再生。这样的EGF受体的配体的实例包括全长的表皮生长因子(EGF)，它是EGF1-53；且还包括EGF1-48、EGF1-49、EGF1-52及其片段和活性类似物。EGF受体的配体的其它实例是包括1-48、1-47、1-51的转化生长因子α(TGFα)形式，以及双调蛋白与痘病毒生长因子，以及和胃泌素/CCK受体的配体一起显示同一协同作用活性的任何EGF受体的配体。这些配体包括以上所述的活性类似物、片段和修饰物。也参见Carpenter和Wahl的《肽生长因子》(PeptideGrowth Factors)((Sporn和Roberts编著)，Springer Verlag，1990)中的第4章。
作为EGF受体的配体的化合物之组还包括“修饰的EGF”，它们是正常EGF或野生型EGF的变体。已证明修饰物影响一种或更多种的生物学活性，例如EGF的清除率。该术语包括具有基本上类似于人EGF的氨基酸序列的氨基酸序列之肽，例如在不同残基位置具有一种或一些氨基酸的取代。
在结构和活性方面有改变的EGF的重组形式是已基因工程化的，例如，已描述了在位置21有一个被亮氨酸残基取代的甲硫氨酸的EGF(美国专利第4,760,023号)。具有51个残基且在位置51有中性氨基酸取代的重组的人EGF(hEGF)，即在位置52和位置53缺少两个C-末端残基的hEGF；保留EGF的活性，而对微生物生产过程期间以及给予患者后的蛋白酶降解则更具有抗性。已描述了编码与EGF和TGFα有显著相似性的蛋白家族的一系列核酸分子(WO00/29438)。已描述了在残基16处有用中性氨基酸或酸性氨基酸取代的组氨酸的EGF突变蛋白(突变型EGF)(WO 93/03757)，这样的形式在低pH值时保持着活性。EGF和TGFα的化学类似物与片段保持着结合EGF受体家族各种各样成员的活性(美国专利第4,686,283号)。EGF或TGFα的各种各样的修饰则使(其)具有影响一种或更多种重组蛋白生产的有益特性——体内和体外的稳定性以及体内活性。一种优选的重组修饰的、用于本文实施例中的EGF受体的配体是C-末端缺失形式的、长51个氨基酸的、在位置51具有天冬酰胺的人EGF(本文中称之为EGF51N)，这EGF蛋白大体上保留全部的I.N.T.TM活性，并且在体内和/或体外，至少约如同正常hEGF或野生型hEGF一样地具有显著的稳定性，或者，具有大于正常hEGF或野生型hEGF之稳定性的稳定性(美国专利申请10/000,840，S.Magil等，2003年5月12日以PCT/US02/33907形式出版的，并且所述文献通过引用全部结合到本文中)。
本文所用的术语“免疫抑制剂”是指抑制免疫应答的任何(抑制)剂。示例性的免疫抑制剂示于表1，而那些抑制剂的任何衍生物或功能等同物被认为是适合于本文描述的本发明实施方案和权利要求书的。
当用于本文时，给药方案是指以各自的有效剂量、一起或独立给予I.N.T.TM组合物和一种或多种免疫抑制剂的方案，并且包括每天提供的组合物量，以及给予各组合物的持续时间或时间段。
大多数胰岛素依赖性糖尿病患者至少以每天为基础地需要胰岛素注射。在某种疾病或治疗糖尿病饮食的情况下，每天需要多剂的胰岛素；且靠频繁的葡萄糖监测结果来指示胰岛素的给予，葡萄糖监测即为了最理想的治疗所述疾病，需要糖尿病患者的另一种活动，例如每天五次地频繁进行这活动。
由降低的空腹血糖水平，以及根据随糖消费之饮食激发而升高的血糖水平的降低和持续时间的减少，来表明由于配合一种免疫抑制剂的成功胰岛再生疗法的糖尿病减轻。一实现成功的胰岛再生，就按照监测血糖水平而得到的数据所表示的，减少胰岛素的给予，例如从每天五次注射减少到两次注射，从每天两次注射减少到一次注射，以及从一次注射减少到不注射。当治疗糖尿病患者时，糖尿病学领域普通技术人员，则通晓按照空腹和其它生理条件下的血糖水平来控制胰岛素的剂量。
对于已知的从种到种的变化，则按照包括本文实施方案的受体的配体的吸收、分布、循环中的半寿期动力学、代谢、排泄和毒理学之标准的标准数据，来调整给予患者的I.N.T.TM组合物的剂量，例如，对每种灵长类动物和每种啮齿动物。通常，对于给予啮齿类动物种，则把剂量调整为比给予灵长类动物种的剂量大大约6倍到大约100倍。
当由厂商供应表1的免疫抑制药或其它等同的药物时，如同药理学领域技术人员已知的，使患者的体重归一化，来给予表1的免疫抑制药或其它等同的药物。例如，一般通过注射或口服来给予他克莫司，通常口服给予西罗莫司。
所述受体的配体组合物和免疫抑制剂的给药方式包括但不限于皮下途径、透皮途径、肌内途径、腹膜内途径、静脉内途径、鼻内途径和口服途径。可通过任何方便的途径，例如通过输注或快速浓注、通过泵、通过经上皮层或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等等)的吸收，来给予所述化合物。可配合其它的一种或许多种生物活性剂给予本文的受体的配体。例如，如果出现细菌感染，则可把一种或更多种抗生素给予本文组合物和方法的接受者；如果出现头疼，则可给予阿司匹林。最好是通过系统途径给予本文的受体的配体。
本发明也提供药用组合物。这样的组合物包含治疗有效量的治疗剂和药学上可接受的无菌载体或赋形剂。这样的载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。所述制剂应该适合给药方式。
如果需要，所述组合物也可以包括少量的湿润剂或乳化剂，例如吐温或pH缓冲剂。所述组合物可以是液体溶液制剂、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂。可以用传统的粘合剂和载体例如甘油三酯，将所述组合物配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体例如药品级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。
在一个实施方案中，按照常规步骤，将所述组合物配制成适合于静脉内给予人的药用组合物。系统给药用组合物一般是无菌等渗的缓冲水溶液。必要时，所述组合物也可以包括另外的组分，例如增溶剂。通常，或者独立提供所述成分，或者用单位剂型预先混合地提供所述成分。除溶液形式之外，可以以冻干粉针剂的形式提供所述组合物；或者以无水浓缩物形式提供所述组合物，例如在指示出活性剂之量的一种密闭容器中，所述容器例如安瓿或小药囊。在准备通过输液给予所述组合物的地方，可以用一种装有药品级无菌水或盐水的输液瓶，来配制所述组合物。在通过注射给予所述组合物的地方，可提供用于注射的无菌水安瓿或盐水安瓿，以便可在给予前混合所述成分。
可以将本发明组合物的具体实例治疗剂配制成不带电的形式或盐形式。药学上可接受的盐包括与游离氨基形成的那些盐，例如由盐酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等而来的那些盐，以及与游离羧基形成的那些盐，例如由氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等而来的那些盐。
本文组合物的每一种治疗剂的量及其在治疗特定疾病或病症方面将有效的彼此有关的相对量，将取决于所述疾病或病症的性质；且可以用标准的临床技术来确定这些量。用于制剂中的精确剂量也取决于给药途径和具体患者之疾病或紊乱的严重程度，并且应该按照开业医师的判断和患者各自的情况来决定。然而对于胃肠外给药，对于EGF受体的配体，适宜的剂量范围通常是每千克体重约0.01微克或1微克的所述活性化合物到约100微克、到约200微克或到约500微克的所述活性化合物。所述EGF受体的配体的剂量范围最好是每千克体重0.01微克至100微克。此外，对于胃泌素受体的配体，胃肠外给药的适宜剂量范围通常是每千克体重约0.1微克或约0.2微克或约0.5微克到约2毫克或约3毫克或约5毫克。所述胃泌素受体的配体的剂量范围最好是每千克体重约0.1微克到2毫克。
可以根据来源于体外试验系统或动物模型试验系统的剂量-反应曲线，来外推有效剂量。以单剂量形式，给予每天的剂量；或者以所分成的许多小的分剂量的形式，每天几次地给予，来给予每天的剂量。
栓剂通常包含约0.5％(重量)到约10％(重量)范围内的活性成分；口服制剂最好包含约10％(重量)至约95％(重量)的活性成分。
本文中，本发明的实施方案也提供一种包括一个或多个装有本发明药用组合物的一种或更多种成分的容器的药品包装或试剂盒，例如，一种有单位剂量的胃泌素/CCK受体的配体加单位剂量的EGF受体的配体或单位剂量的它们两者、加上一种或更多种免疫抑制剂的容器。可与这样的容器有关的是由管理药品或生物制品的制备、使用或销售的政府机构规定之形式的标志，这标志反映由政府机构批准的用于人给药的制备、使用或销售。在某些实施方案中，所述药品包或试剂盒可包括一个或多个容器，例如有待给予的胰岛素的容器；所述待给予的胰岛素则例如待在诱导胰岛再生和减轻糖尿病前的给药日程期间给予的胰岛素。
不被任何特定模式或机制限制，预期糖尿病的早发性糖尿病特征在于胰岛破坏的不同阶段，例如与晚期糖尿病相比，有不同的胰腺细胞群。例如，早发性糖尿病患者或前驱糖尿病患者有一种功能性的β细胞群和较高水平的胰岛细胞之前体细胞是很可能的；在晚期I型糖尿患者中，这些细胞群可能是较少的或缺乏的或不足的。为此，在另一个一般的实施方案中，本发明提供一种用于预防糖尿病发作或治疗糖尿病(例如早发性糖尿病)的方法，所述方法包括给予需要治疗的哺乳动物一种包含胃泌素/CCK受体的配体和免疫应答抑制剂的组合物。此外，预期对于糖尿病患者持续很久的维持，这样的治疗可被长时期使用。
在一个方面，本发明的特征在于一种用于扩充患者胰岛内现有功能性β细胞群的方法，或者本发明的特征在于一种扩充在纯净胰岛移植的糖尿病哺乳动物接受者之胰岛移植物内的功能性β细胞群的方法。所述方法包括给予一种包含有效剂量的胃泌素/CCK受体的配体和有效剂量的免疫应答抑制剂的组合物。
与损害联合的胃泌素可刺激新的β细胞的生长(增殖)，导致增加的胰岛团(Rooman，I.等，2002，Diabetes 51(3)，686-690)。胃泌素可以使胰岛前体细胞分化产生成熟的产生胰岛素的细胞，因此，增强胰岛再生而逆转糖尿病的症状或抑制糖尿病的进程。
可以以联合的单剂量形式，给予所述胃泌素/CCK受体的配体和免疫抑制剂，或者将其按任何顺序独立给予。这些组合物的“联合有效剂量”是导致胰岛素分泌细胞数目增加或升高血液胰岛素水平或增加β细胞群的剂量。在一个实施方案中，所述胃泌素/CCK受体的配体是长度17个氨基酸残基的人胃泌素；在位置15的残基是亮氨酸(胃泌素17亮氨酸15)或甲硫氨酸(胃泌素17Met15)。一种方便的给予所述剂量的途径是系统注射，例如皮下快速浓注。
把所述胃泌素/CCK受体的配体和免疫系统抑制剂给予患者。在一个实施方案中，所述抑制剂是低分子量有机化学药品，例如是他克莫司、西罗莫司、ISAtx247、环孢菌素和可的松以及如表1所示的其它药物中的至少一种。在一个替代的实施方案中，所述抑制剂是抗体，例如所述抗体是抗CD11a及也列于表1中的其它抗体。所述患者可以是糖尿病哺乳动物，例如非肥胖型糖尿病小鼠即NOD小鼠。所述患者可以是糖尿病病人，例如患有I型糖尿病或II型糖尿病、或者患有妊娠糖尿病或者在过去患有妊娠糖尿病的糖尿病病人。此外，评价新近开发的分泌胰岛素之β细胞或胰岛的大小与功能则是测定选自以下的参数；胰岛β细胞群、胰岛β细胞数、胰岛β细胞百分数、血糖、血清葡萄糖、血液糖基化血红蛋白、胰腺β细胞群、胰腺β细胞数、空腹血浆C肽含量、血清胰岛素和胰腺胰岛素含量。
当某些病例的糖尿病是自身免疫病时，一个实施方案是把治疗有效剂量的例如胃泌素/CCK受体的配体系统给予同样用一种或更多种免疫应答抑制剂治疗的实验对象或患者(参见表1)。
可以用许多不同的终点来确定是否用胃泌素和免疫应答抑制剂的治疗增加胰岛移植物中β细胞的功能性物质。这些包括在给小鼠注射β细胞刺激剂例如葡萄糖或精氨酸后，测定循环的人C肽和人胰岛素的升高的血浆水平；由人胰岛素的增强的免疫反应性、或由提取自胰岛移植物的mRNA水平证明的对胃泌素和免疫抑制剂治疗的反应；以及通过所治疗动物之胰岛的形态测定法测定而确定的增加的β细胞数。通过在患有链脲菌素诱发性糖尿病或遗传性(NOD)糖尿病的接受者小鼠中逆转高血糖症，也能证明人胰岛β细胞的增强的功能。
本文中的方法和组合物增强用胃泌素和免疫抑制剂进行治疗的临床试验的可靠程度则将表明在I型和II型糖尿病患者的胰腺内刺激胰岛内源β细胞的生长。
在确定不同组合物的血浆水平方面，本文中的方法也是有价值的；所述组合物例如，在人体内刺激胰岛的新的、所给予的胃泌素/CCK受体的配体，或者由所给予的胃泌素/CCK受体的配体诱导的另一种内源因子。用这些方法获得的数据与I期的药代动力学数据联合在一起，则可以改进临床研究的设计；通过在受试验人方面的减少剂量的探索研究，来确定人的有效剂量范围。
在(药物)组合方面，按照足以诱导胰岛前体细胞分化成分泌胰岛素的胰岛细胞的量，长时期地提供所述免疫系统抑制剂或胃泌素/CCK受体的配体。
通常，对于用胃泌素/CCK受体的配体以及免疫抑制剂的治疗，在本文中的任何实施方案中，患者可以是哺乳动物例如人。另外，所述哺乳动物可以是啮齿类动物例如小鼠或大鼠，或者是狗、猫、绵羊、山羊、母牛、马，或者是类人猿例如大猩猩或黑猩猩。在另一个方面，本发明提供一种在哺乳动物体内诱导胰岛再生的方法，所述方法包括给予哺乳动物一种包含胃泌素/CCK受体的配体和免疫系统抑制剂(每一成分按足以增强胰岛前体细胞的细胞分化且抑制胰腺中的胰岛破坏的量)的组合物，因此，在胰岛再生方面有净增长。
对于诱导胰岛前体细胞分化成分泌胰岛素的成熟细胞，所述组合物是有效剂量的。所述组合物可以包含药学上可接受的载体、药学上可接受的缓冲剂或药学上可接受的盐。
在另一个方面，本发明提供一种用于治疗或预防糖尿病的试剂盒，所述试剂盒包括包含胃泌素/CCK受体的配体和免疫系统抑制剂的组合物、容器和使用说明书。所述试剂盒的组合物可还包含药学上可接受的载体。所述试剂盒的组合物可以以至少一个单位剂量的形式出现。所述试剂盒可包含至少一个单位剂量的胰岛素。
本文所用的给药方案是指以各自的有效剂量、一起或独立给予胃泌素/CCK受体的配体和至少一种免疫抑制剂的方案，并且包括每天提供的组合物量，以及给予每种组合物的持续时间或时间段。
除非另外下定义，本文中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解意思相同的含义。虽然在实施本发明的过程中可用与本文中描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料，但下文描述合适的方法与材料。本文中所有提到的出版物、专利和专利申请通过引用全部结合到本文中。本文中的实施例和权利要求用于说明目的，并且不应认为是对本发明的进一步限制。
实施例实施例1用胰岛再生组合物和免疫抑制组合物治疗的动物的存活率用本文中的慢性糖尿病小鼠模型——NOD小鼠，进行动物试验，以测试免疫抑制剂与I.N.T.TM组合物的联合效应，所述I.N.T.TM组合物是EGF51N和胃泌素17leu15。实验设计示于表2中。当实验对象约为25周龄时开始治疗。把实验对象分成四个治疗组给予I.N.T.TM组合物的组(组2)、给予免疫抑制剂的组(组3)、给予这两者组合的组(组1)或仅用溶媒缓冲液治疗的对照组(组4)。血糖水平大于30mM的严重糖尿病(和酮病)实验对象则接受胰岛素治疗，在治疗前的3-4周且在治疗期间的6周，以每天一次皮下注射的形式给予常规(R)猪胰岛素和NPH(N)牛胰岛素(0.4U的总胰岛素)的1∶1混合物。胰岛素预先治疗后给予这些药物的方案示于表2。
表2 西罗莫司及他克莫司的免疫抑制与I.N.T.TM组合物的同时用药延长先前用胰岛素疗法治疗过的小鼠的存活率(图1组2，■)。
与仅用胰岛素治疗的实验对象(组4，○)的11％存活率相比，这些实验对象的一半生存了胰岛素和I.N.T.TM(组2)的6周过程。I.N.T.TM则得出与用胰岛素治疗加上用西罗莫司和他克莫司免疫抑制而得出的存活率大约一样的I.N.T.TM之存活率(组3，□)。在给予胰岛素后用I.N.T.TM和免疫抑制两者治疗组1的小鼠，则导致一组小鼠在治疗期间完全存活率(100％)达整个6周(组1，●)。
在停止给予胰岛素后1周，与用胰岛素治疗的溶媒对照组的11％存活率相比，用I.N.T.TM且同时免疫抑制的组，则存活率为56％。单独给予I.N.T.TM或单独给予免疫抑制，在1周后，则没有存活者。在停止胰岛素治疗后3周，接受I.N.T.TM且同时接受免疫抑制的组1动物，则存活率为31％。在接受溶媒对照的组4动物中，没有存活者。
I.N.T.TM加免疫抑制之组的组1存活小鼠的空腹血糖水平，则在停止胰岛素治疗后的3周期间出现显著下降(图2数据)。
根据用患有严重慢性糖尿病、接受胰岛素替代疗法的NOD小鼠获得的这些数据，单独给予I.N.T.TM组合物则延长存活时间，并且比单独给予免疫抑制剂更有效。在同时接受I.N.T.TM治疗和免疫抑制的组中，观察到在胰岛素替代疗法的6周期间的完全存活率。在停止胰岛素治疗后3周，仅同时给予I.N.T.TM和免疫抑制达7周的组1动物，显示出显著的存活率(31％，表3)。此外，存活小鼠显示出血糖水平超过3周显著下降。
实施例2用I.N.T.TM组合物和疫抑制剂治疗后慢性糖尿病小鼠的胰腺胰岛素含量表4包括显示得自雌性NOD小鼠样品中的空腹血糖(FBG)变化的时程和胰腺胰岛素含量随该小鼠品系的实验对象的龄期增加而变化的参考数据。观察出这些参数之间存在联系。
这些数据表明在观察到NOD小鼠的血糖明显升高前，显著β细胞损失已发生，正如由胰腺胰岛素含量的迅速下降所表明的。截止到10-12周龄，尽管FBG保持正常而在4.6mM的水平，胰腺胰岛素含量却减少37％。此外，在12-15周龄之间的NOD小鼠方面，仅观察到中度高血糖症(FBG 7.4mM)，尽管与胰腺胰岛素含量大于95％的减少有关的β细胞的极度破坏。此外，当血糖升高到超过30mM时，所观察到的胰腺胰岛素含量小于正常胰腺胰岛素含量的0.1％。
这些数据表明仅仅由于适中量的β细胞的再生，就可以获得血糖非常显著的降低，以致于如果也能够抑制由于自身免疫破坏引起的β细胞损失，则再生能增加不多于3％的胰腺胰岛素含量。
表5显示按照实施例1的小鼠在停止胰岛素疗法后的胰腺胰岛素含量。在3周处死存活小鼠(组1中的存活者，n＝5)，或者，如果是由于高血糖的糖尿病酮酸中毒(组1无存活者，所有小鼠都来自组2和组3)而濒死，则较早将其处死。
表5中的数据显示无存活者的组1的胰腺胰岛素含量，以及显示按照未治疗动物(12-15周龄的糖尿病NOD动物的FBG水平FBG＞30mM)的44ng/g起始值而表明没有增加的组2和组3的胰腺胰岛素含量。然而，在同时接受I.N.T.TM和免疫抑制的给药组(组1)中，存活小鼠中的胰腺胰岛素含量有显著(约30倍)增加。
在存活小鼠中，观察到胰腺胰岛素含量的增加与所观察到的血糖水平降低有关系(图3)。具有最高胰腺胰岛素含量(＞1000ng/g)的两只不同实验对象小鼠各自达到非糖尿病范围(3-6.6mM)的空腹血糖水平。
实施例3用胰岛再生组合物和用免疫抑制组合物治疗后的新近起病型糖尿病小鼠的胰腺胰岛素含量和血浆C-肽含量。
为此，用一种涉及每天早晨测试的方法，来监测初始出现糖尿病的非肥胖型糖尿病小鼠，以获得葡糖尿的证据。在10周龄时开始监测，并用Keto-Diastix(Bayer)来评价葡糖尿的症状。此外，在葡糖尿发作的时候，通过测定空腹血糖(FBG)水平，进一步监测实验对象的糖尿病发作。利用该分析，选择实验对象在连续两日达到大于6.6mmol/l的FBG水平，作为给那实验对象糖尿病发作下定义。
通过用这种每天在800-1000只雌性NOD小鼠中同时监测糖尿病的方法，在糖尿病发作后的2-5天内，收集NOD小鼠。有16-22周龄且FBG水平为15-17mmol/l(平均值15mmol/l)的这些小鼠，被随机分配到四个治疗组中。然后，这些组接受如下治疗
组1溶媒(未治疗对照，n＝9)组2IS(免疫抑制药西罗莫司和他克莫司，n＝12)组3I.N.T.(EGF和胃泌素，n＝8)组4I.N.T.和IS(EGF和胃泌素以及西罗莫司和他克莫司，n＝7)用管饲法，一天一次，在早晨给予溶于MCT油(中链甘油三酯油，作为食品补充剂被利用)的西罗莫司(0.1mg/kg/天)和他克莫司(0.1mg/kg/天)。在糖尿病发作时开始治疗方案，在14天后结束。经由腹膜内途径(ip)，用含有0.1％BSA的无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)，每天两次，分别以半剂量1.5μg/kg/天和5μg/kg/天给予EGF(EGF51N，3μg/kg/天)和胃泌素(胃泌素17leu15，10μg/kg/天)中的每一种，给予14天。自该病发作时开始治疗，共治疗14天，然后停止治疗。在该项研究期间，不给予胰岛素疗法。
对各治疗组中的实验对象，进行血浆C-肽水平和胰腺胰岛素含量的各自测定。这些数据的分析显示，虽然用EGF和胃泌素的治疗导致血浆C-肽含量和胰腺胰岛素含量两者均增加，显著大于溶媒治疗组或西罗莫司/他克莫司治疗组的这些含量；但在糖尿病发作后的这些NOD小鼠中，在增加血浆C-肽水平和胰腺胰岛素含量方面，用EGF和胃泌素以及西罗莫司和他克莫司的联合治疗是最有效的。参见图4。
权利要求
1.一种制备供治疗糖尿病患者用的药物的方法，所述药物包括胰岛再生疗法的组合物和免疫应答抑制剂。
2.权利要求1的方法，其中所述胰岛再生疗法的组合物包含EGF受体的配体。
3.权利要求1的方法，所述药物还包括至少两种免疫应答抑制剂。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述胰岛再生疗法的组合物包含胃泌素/缩胆囊素(CCK)受体的配体。
5.权利要求2的方法，其中所述EGF受体的配体是重组人EGF。
6.权利要求2的方法，其中所述EGF受体的配体是EGF51N。
7.权利要求4的方法，其中所述胃泌素/CCK受体的配体是人胃泌素17。
8.权利要求1的方法，其中所述免疫应答抑制剂是药物。
9.权利要求1的方法，其中所述免疫应答抑制剂是至少一种选自以下的药物雷帕霉素、皮质类固醇、硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、环孢菌素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、FK506(他克莫司)、15-脱氧精胍菌素、FTY 720、米托蒽醌、2-氨基-1，3-丙二醇、盐酸2-氨基-2[2-(4-辛基苯基)乙基]丙-1，3-二醇、6-(3-二甲基-氨基丙酰基)弗司扣林和demethimmunomycin。
10.权利要求9的方法，其中所述雷帕霉素是依维莫司或西罗莫司。
11.权利要求9的方法，其中所述皮质类固醇是地塞米松。
12.权利要求1的方法，其中所述免疫应答抑制剂是蛋白质。
13.权利要求12的方法，其中所述蛋白质包含抗体的氨基酸序列。
14.权利要求1的方法，其中所述免疫应答抑制剂是至少一种选自以下的药物hul 124、BTI-322、allotrap-HLA-B270、OKT4A、恩莫单抗、ABX-CBL、OKT3、ATGAM、巴利昔单抗、达珠单抗、抗胸腺细胞免疫球蛋白、ISAtx247、Medi-500、Medi-507、Alefacept、依法珠单抗、英夫利昔单抗和干扰素。
15.权利要求1的方法，其中在所述药物的制备中，将所述胰岛再生疗法组合物和所述免疫应答抑制剂配制成供序贯给药用。
16.权利要求15的方法，其中在所述药物的制备中，将所述组合物和所述抑制剂配制成在给予所述抑制剂和给予所述组合物之间可保存至少1天的时间。
17.权利要求15的方法，其中在所述药物的制备中，将所述组合物和所述抑制剂配制成在给予所述抑制剂和给予所述组合物之间可保存至少1周的时间。
18.权利要求15的方法，其中在所述药物的制备中，将所述组合物和所述抑制剂配制成在给予所述抑制剂和给予所述组合物之间可保存至少6周的时间。
19.权利要求1的方法，其中在所述药物的制备中，将所述胰岛再生疗法组合物和所述免疫应答抑制剂中的至少一种配制成供系统给药用。
20.权利要求19的方法，其中在所述药物的制备中，将所述胰岛再生疗法组合物和所述免疫应答抑制剂中的至少一种配制成供快速浓注给药用。
21.权利要求1的方法，其中在所述药物的制备中，将所述胰岛再生疗法组合物和所述免疫应答抑制剂中的至少一种配制成供选自以下的途径给药用静脉内途径、皮下途径、腹膜内途径和肌内途径。
22.权利要求1的方法，其中在所述药物的制备中，将所述胰岛再生疗法组合物和所述免疫应答抑制剂中的至少一种配制成供口服给药用。
23.权利要求1的方法，其中在所述药物的制备中，将所述免疫应答抑制剂配制成含有至少一种选自以下的药物西罗莫司、他克莫司、依维莫司、ISAtx247和达珠单抗。
24.权利要求1的方法，其中在所述药物的制备中，将所述免疫应答抑制剂配制成供糖尿病哺乳动物给药用。
25.权利要求1的方法，其中在所述药物的制备中，将所述免疫应答抑制剂配制成供病人给药用。
26.一种制备供治疗糖尿病患者用的药物的方法，所述药物包括一种胰岛再生疗法的组合物和至少一种免疫抑制剂，所述组合物由EGF受体的配体和胃泌素/CCK受体的配体中的至少一种组成。
27.权利要求26的方法，其中在没有EGF受体的配体的情况下，将所述药物配制成包含所述胃泌素/CCK受体的配体和所述至少一种免疫抑制剂。
28.权利要求27的方法，其中将所述药物配制成在没有EGF受体的配体的情况下给予所述胃泌素/CCK受体的配体和所述至少一种免疫抑制剂，并且所述方法还包括一段不给予任何所述抑制剂或所述组合物的时期。
29.权利要求26的方法，其中将所述药物配制成供患有新近起病型糖尿病的糖尿病患者用。
30.权利要求28的方法，其中将所述药物配制成供序贯给予所述组合物和所述抑制剂用。
31.权利要求26的方法，其中将所述药物配制成致使EGF受体的配体、胃泌素/CCK受体的配体和所述免疫抑制剂各为有效剂量。
32.权利要求1和26中任一项的方法，其中将所述组合物或抑制剂进一步配制成包含药学上可接受的缓冲剂。
33.一种制备供治疗糖尿病患者用的药物的方法，所述药物包括一种由EGF51N和胃泌素17中至少一种组成的胰岛再生疗法的组合物和至少一种免疫抑制剂。
34.权利要求33的方法，其中将所述药物配制成致使所述抑制剂是有效剂量的他克莫司和有效剂量的西罗莫司。
35.权利要求33的方法，其中将所述药物配制成包含有效剂量的EGF51N和胃泌素17中的至少一种以及有效剂量的他克莫司、依维莫司、达珠单抗、ISAtx247和西罗莫司中的至少一种。
36.一种制备供治疗糖尿病患者用的药物的方法，所述药物包括胃泌素/CCK受体的配体和免疫应答抑制剂。
37.权利要求36的方法，其中所述胃泌素/CCK受体的配体是胃泌素17。
38.权利要求36的方法，其中所述免疫应答抑制剂是药物。
39.权利要求36的方法，其中所述免疫应答抑制剂选自以下药物中的至少一种雷帕霉素、皮质类固醇、硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、环孢菌素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、FK506、ISAtx247、15-脱氧精胍菌素、FTY 720、米托蒽醌、2-氨基-1，3-丙二醇、盐酸2-氨基-2[2-(4-辛基苯基)乙基]丙-1，3-二醇、6-(3-二甲基-氨基丙酰基)弗司扣林和demethimmunomycin。
40.权利要求39的方法，其中所述雷帕霉素是西罗莫司或依维莫司。
41.权利要求39的方法，其中所述皮质类固醇是地塞米松。
42.权利要求36的方法，其中所述免疫应答抑制剂是蛋白质。
43.权利要求42的方法，其中所述蛋白质包含抗体的氨基酸序列。
44.权利要求43的方法，其中所述免疫应答抑制剂是至少一种选自以下的药物hul 124、BTI-322、allotrap-HLA-B270、OKT4A、恩莫单抗、ABX-CBL、OKT3、ATGAM、巴利昔单抗、达珠单抗、抗胸腺细胞免疫球蛋白、ISAtx247、Medi-500、Medi-507、Alefacept、依法珠单抗和英夫利昔单抗。
45.权利要求36的方法，其中序贯给予所述胃泌素/CCK受体的配体和所述免疫应答抑制剂。
46.权利要求36的方法，其中将所述胃泌素/CCK受体的配体配制成供快速浓注给药用。
47.权利要求36的方法，其中将所述受体的配体配制成通过选自以下的途径给药用静脉内途径、皮下途径、腹膜内途径和肌内途径。
48.权利要求36的方法，其中将所述免疫应答抑制剂配制成通过选自以下的途径给药用口服给药途径、系统给药途径、静脉内给药途径、皮下给药途径、腹膜内给药途径和肌内给药途径。
49.权利要求36的方法，其中所述免疫应答抑制剂选自他克莫司、ISAtx247、依维莫司、西罗莫司和达珠单抗中的至少一种。
50.权利要求1、26、33和36中任一项的方法，所述方法还包括测定患者的选自以下的生理参数空腹血糖水平、胰腺胰岛素含量、胰腺β细胞含量和血浆胰岛素C肽水平。
51.权利要求36的方法，其中将所述药物配制成供患者用，所述患者是哺乳动物。
52.权利要求36的方法，其中将所述药物配制成供患者用，所述患者是糖尿病哺乳动物。
53.权利要求36的方法，其中将所述药物配制成供患者用，所述患者是患有新近起病型糖尿病的糖尿病哺乳动物。
54.权利要求36的方法，其中将所述药物配制成供患者用，所述患者是人。
55.一种制备供治疗糖尿病患者用的药物的方法，所述药物具有包含有效剂量的胃泌素17和有效剂量的至少一种免疫抑制剂的组合物。
56.权利要求55的方法，其中所述至少一种免疫抑制剂是他克莫司或西罗莫司。
57.权利要求56的方法，所述药物还包含有效剂量的ISAtx247或达珠单抗。
58.权利要求55-57中任一项的方法，其中所述药物还包含药学上可接受的缓冲剂。
59.一种药用组合物，所述组合物包含免疫应答抑制剂以及EGF受体的配体和胃泌素/CCK受体的配体中的至少一种。
60.权利要求59的组合物，其中所述胃泌素/CCK受体的配体是胃泌素。
61.权利要求59的组合物，其中所述胃泌素/CCK受体的配体是胃泌素17。
62.权利要求61的组合物，其中所述胃泌素17是胃泌素17Met15或胃泌素17Leu15。
63.权利要求59的组合物，其中所述EGF受体的配体是EGF。
64.权利要求59的组合物，其中所述EGF是重组人EGF51N。
65.权利要求59的组合物，其中所述免疫应答抑制剂是药物。
66.权利要求59的组合物，其中所述免疫应答抑制剂至少是一种选自以下的药物雷帕霉素、皮质类固醇、硫唑嘌呤、麦考酚酸吗乙酯、环孢菌素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、FK506(他克莫司)、15-脱氧精胍菌素、FTY 720、米托蒽醌、2-氨基-1，3-丙二醇、盐酸2-氨基-2[2-(4-辛基苯基)乙基]丙-1，3-二醇、6-(3-二甲基-氨基丙酰基)弗司扣林和demethimmunomycin。
67.权利要求59的组合物，其中所述免疫应答抑制剂是蛋白质。
68.权利要求59的组合物，其中所述免疫应答抑制剂是抗体的一部分。
69.权利要求59的组合物，其中所述免疫应答抑制剂是至少一种选自以下的药物hul 124、BTI-322、allotrap-HLA-B270、OKT4A、恩莫单抗、ABX-CBL、OKT3、ATGAM、巴利昔单抗、达珠单抗、抗胸腺细胞免疫球蛋白、ISAtx247、Medi-500、Medi-507、Alefacept、依法珠单抗、英夫利昔单抗和干扰素。
70.一种治疗糖尿病患者的试剂盒，所述试剂盒包括胰岛再生疗法的组合物、免疫抑制剂和容器。
71.一种试剂盒，所述试剂盒包括至少一剂权利要求59-69中任一项的组合物。
72.权利要求70-72中任一项的试剂盒，所述试剂盒还包括使用说明书。
73.一种制备供治疗糖尿病患者用的药物的方法，所述方法包括制备一种包含有效剂量的胃泌素17和有效剂量的至少一种免疫抑制剂的组合物。
74.一种制备供治疗糖尿病患者用的药物的方法，所述方法包括制备一种包含有效剂量的胃泌素17以及有效剂量的他克莫司和有效剂量的西罗莫司的药物。
75.有效剂量的胃泌素17和有效剂量的至少一种免疫抑制剂在制备用于治疗糖尿病患者的组合物中的用途。
76.有效剂量的胃泌素17以及有效剂量的他克莫司和有效剂量的西罗莫司在制备用于治疗糖尿病患者的药物中的用途。
77.免疫抑制剂以及EGF受体的配体和胃泌素/CCK受体的配体中的至少一种在制备用于治疗糖尿病患者的药物中的用途。
全文摘要
提供供胰岛再生疗法用、配合免疫抑制、包含EGF和胃泌素并且用胃泌素/CCK受体的配体和免疫抑制剂治疗或预防早期糖尿病的组合物和方法。
文档编号A61K38/00GK1671407SQ03818526
公开日2005年9月21日 申请日期2003年6月9日 优先权日2002年6月7日
发明者S·J·布兰德, A·克鲁兹 申请人:瓦拉塔药品公司