非对映异构四氢吡啶并{2，3-d}嘧啶衍生物的制法的制作方法

专利名称:非对映异构四氢吡啶并{2，3-d}嘧啶衍生物的制法的制作方法
本发明涉及N-(4-〔2-(5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-烷基〕-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的两个单独的非对映异体，其中每个异构体基本上不含有其他所有异体;本发明还涉及它们的制备方法及其作为抗肿瘤药物的作用。
叶酸抗代谢物，氨基蝶呤(白血宁)和氨甲蝶呤(也就是通常所说的10甲氨基蝶呤或氨甲蝶呤，methotrexate)都是抗肿瘤药物。这些化合物抑制包括叶酸的代谢衍生物在内的酶转化。例如氨甲蝶呤(ameth-opterin)抑制二氢叶酸还原酶，这是一种从二氢叶酸转化为四氢叶酸所必需的酶，而二氢叶酸是在胸苷酸合成酶作用下，把2-脱氧尿苷酸盐转化为胸苷酸盐过程中形成的。
叶酸氨基蝶呤的其它衍生物已被合成，并进行抗代谢物试验。在这些化合物的分子中，亚甲基或次甲基占据了通常分别由亚氨基或三价氮基占据的位置。这些衍生物具有不同程度的抗代谢活性。10-去氮(deaza)氨基蝶呤是高活性的(Sirotak等.，CancerTreat.Rep.，1978，62，1047)，而5-去氮氨基蝶呤的活性和氨甲蝶呤相似(Taylor等，J.Org.Chem.，1983，48，4852)。据报导8，10-去氮氨基蝶呤也是有活性的(美国专利4460591号)，5，8，10-三去氮氨基蝶呤则具有抗L1210小鼠白血病的活性(Yan等，J.Heterocycl.Chem，1979，16，541)。另一方面，10-去氮叶酸则未显示明显的活性(Struck等，J.Med.Chem，1971，14，693)，5-去氮叶酸也只有轻微的细胞毒性作用。8，10-去氮叶酸只能勉强算作二氢叶酸还原酶抑制剂(DeGraw等.，“ChemistryandBiologyofPteridines”“蝶啶的化学与生物学”，Eisevier，1979，229)，5，8，10-三去氮叶酸对L1210小鼠白血病也仅有不高的活性(Oatis等，J.Med.Chem.，1977，20，1393)。Taylor等已报导了5，10-二去氮氨基蝶呤、5，10-二去氮-5，6，7，8-四氢氨基蝶呤以及相应的5，10-二去氮叶酸衍生物(J.Med.Chem.，28∶7，914，1985)。
正如南非专利86/1235号所述，化合物N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸是一种广谱抗肿瘤药物。在此化合物中存在两个手性中心在四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶环的6位上的碳原子和谷氨酸基团中的α-碳原子。理论上此化合物可以有四种形式存在，但正如南非专利86/1235所述，此类化合物在开始偶联时使用的是L-谷氨酸，因而就减少了两种可能性。但这两种形式在其后的氢化期间同时产生，因而除去保护基后，得到所需产物是(S，S)和(R，S)的非对映异构体的混合物
这些非对映异构体可以用物理法，如色层法加以分离，但由于这些化合物在大多数有机溶剂中溶解度低，因而使这种分离方法受到一定程度的阻碍，特别是在大规模生产中。这两种非对映异构体的混合物也可以用于治疗目的，二者都可作为有关叶酸酶的底物。但鉴于它们具有稍为不同的生物外形，所以更有利的是将它们相互分离最为理想，每一形式都基本上不含有另一形式，即每一形式的旋光纯度大于95%。
用一种实用的手性酸处理非对映异构体N-(4-〔2-(2-乙酰氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸二乙酯或其它带保护基衍生物的混合物溶液，于是生成盐。然后通过一步或多步分级结晶来分离所得到的非对映异构体的盐。此后通过用一种碱处理和除去保护基，使分离出的至少一种盐的阳离子部分的游离碱释放。盐的阳离子的释放，可以在除去保护基团之前或之后，以独立的步骤完成，或者，若这些基团在碱性条件下，易于脱除的话，也可以与除去保护基同时完成，即碱水解。
适宜的手性酸包括下述化合物的单个对映体。这些化合物有10-樟脑磺酸、樟脑酸、α-溴樟脑酸、
氧基乙酸、酒石酸、二乙酰酒石酸、苹果酸、吡咯烷酮-5-羧酸及其它。
这样就可得到(ⅰ)〔α〕25589nm为-21.06°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕-嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体，它基本上不含有〔α〕25589nm为+31.09°的N-(4-〔2-(2-氨基-4羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸非对映异构体;和(ⅱ)〔α〕为+31.09°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体，它也基本不含有〔α〕25589nm为-21.06°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸非对映异构体。
除去保护基可通过水解实现，水解可在常温下用酸或碱的水溶液进行。例如用碱金属氢氧化物的水溶液，还可任选地，在与水相溶的有机溶剂，诸如甲醇、乙醇、四氢呋喃、二甲基甲酰胺等存在下进行;或用酸，例如用三氟乙酸进行。当用碱时，该盐放出阳离子部分，得到二阳离子的谷氨酸盐产物，通过调节pH(例如用乙酸酸化)可以使之容易地沉淀。所得到的产物一般是高熔点的晶体或微晶状固体。
实例11.0克N-(4-〔2-(2-乙酰氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕-嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸二乙酯和880毫克d(+)-10-樟脑磺酸的混合物，在50毫升无水乙醇中加热回流4小时。将反应混合物冷却至室温，并放置过夜。生成的白色固体经过滤收集，并在乙醇中分级结晶6次，得到37毫克N-(4-〔2-(2-乙酰氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸二乙酯非对映异构体“B”的d(+)-10-樟脑磺酸盐，熔点223-225℃，〔α〕25589nm＝-20.02°。
靠蒸发除去母液中的溶剂，生成的固体在乙醇中重结晶两次，得到N-(4-〔2-(2-乙酰氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸二乙酯非对映异构体“A”的d(+)-10-樟脑磺酸盐，〔α〕25589nm＝+29.35°。
将N-(4-〔2-(2-乙酰氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸二乙酯非对映异构体“B”的d(+)-10-樟脑磺酸盐加入含3毫升1N氢氧化钠水溶液的50毫升甲醇中，在室温下搅拌该溶液72小时。加入2毫升乙酸，接着离心，就得到N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕-嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体“B”，熔点224-227℃(分解)〔α〕25589nm＝-21.0581°(C＝0.636，0.1N NaOH);λmax278nm，222nm;NMR(CDCl3)δ1.85(m，2H)，1.98(m，1H)，2.25(m，1H)，2.45(m，1H)，2.68(m，1H)，2.92(m，5H)，3.25(t，J＝10Hz，1H)，3.82(d，J＝10Hz，1H)，513(m，1H)，7.43(d，J＝9Hz，2H)，7.84(d，J＝9Hz，2H)，旋光纯度为＞97%。
按上述程序操作，只是用N-(4-〔2-(2-乙酰氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸二乙酯非对映异构体“A”的d(+)-10-樟脑磺酸盐代替对映异构体B。这样就得到N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕-嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体“A”，熔点253-255℃(分解)〔α〕25589nm＝+31.0915°(C＝3.605，0.1N NaOH);λmax278nm，222nm;NMR(CDCl3)δ1.85(m，2H)，1.98(m，1H)，2.25(m，1H)，2.45(m，1H)，2.68(m，1H)，2.92(m，5H)，3.25(t，J＝10Hz，1H)，3.82(d，J＝10Hz，1H)，5.13(m，1H)，7.43(d，J＝9Hz，2H)，7.84(d，J＝9Hz，2H)。旋光度大于97%。
实例2在全细胞(人白血病细胞系CCRF-CEM)中测定了非对映异构体“A”和“B”的IC50值。实验结果如下化合物 IC50(微克/毫升)非对映异构体“A” 2.6×10-3非对映异构体“B” 3.4×10-3实例3在C57BL/G小鼠腋下皮下植入B-16黑素瘤肿瘤细胞。每个剂量用一个试验组，每个试验组有十只小鼠。每日腹膜内各注射N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体“A”和非对映异构体“B”。10天后测量对照组肿瘤(只接受稀释剂)的质量，并与接受试验化合物的试验组动物的肿瘤质量对比，以计算抑制百分率。结果如下化合物剂量(毫克/公斤)抑制百分率(%)存活率异构体A和B的1.6059/9混合物3.12129/96.25139/912.50509/9异构体A1.60479/93.12249/96.2509/912.5009/9异构体B1.607110/103.129110/106.259810/1012.5010010/1025.0010010/1050.001009/10100.001008/10200.001006/10
实例4以10只C3H雌性小鼠为一组，在腋下腹膜内接种6C3HED淋巴肉瘤细胞。然后将试验化合物置于0.5毫升EmulphorIP中，给药共8天。对照组动物接受同样处理，但不给试验化合物。
化合物剂量(毫克/公斤)抑制百分率(%)存活率异构体A6.007410/1012.508910/1025.0010010/1050.0010010/10100.0010010/10异构体B3.607110/106.258410/1012.508910/1025.009910/1050.0010010/10100.001008/10实例5C3H小鼠组被植入C3H乳腺癌细胞，并按如下所示方式注射给予异构体B，对照组动物只接受稀释剂。
连续输注(2毫升/天)(于1%NaHCO3溶液中，每天一次，共5天)剂量(毫克/公斤)抑制百分率(%)存活率0.62205/51.25596/62.50936/65.00中毒0/6
腹膜内给药(0.5毫升/天)(于Emulphor中，每天一次，共10天)剂量(毫克/公斤)抑制百分率(%)存活率3.607610/106.259310/1012.50998/1025.001007/1050.001008/10100.00中毒0/10腹膜内给药(0.5毫升/天)(于Emulphor中，仅第1，3，5，7，和9天)剂量(毫克/公斤)抑制百分率(%)存活率509110/101009610/1020010010/104001008/10腹膜内给药(0.6毫升/天)(于Emulphor中，仅第1，3，5，7和9天)剂量(毫克/公斤)抑制百分率(%)存活率6.253910/1012.502110/1025.005910/1050.006010/10100.009410/10
实例6C3H小鼠组被植入X5563浆细胞性骨髓瘤细胞，并按如下所示方式注射给予异构体B，对照组动物仅接受稀释剂。
腹膜内给药(0.6毫升/天)(于Emulphor中，每天一次，共10天)剂量(毫克/公斤)抑制百分率(%)存活率3.606210/106.25767/1012.509010/1025.00998/1050.00997/9100.00中毒0/10
权利要求
1.产生下述两种非对映异构体之中至少一种的方法步骤(i)[a]25589nm为-21.06°的N-(4-[2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-乙基]-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体，它基本上不含有[a]25589nm为+31.09°的N-(4-[2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-乙基]-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体，以及(ii)[a]25589nm为+31.09°的N-(4-[2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-乙基]-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体，它基本上不含有[a]25589nm为-21.06°的N-(4-[2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-乙基]-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体。此方法步骤包括用实用的手性酸处理下列结构通式的非对映异构化合物的混合物溶液以与上述混合物生成盐，
其中R1和R2是相同或不同的羧酸保护基，R3是氢或一个氨基保护基，和标有*号的碳原子的构型为L，分离出上述酸和上述化合物所生成的两种非对映异构体的盐，然后用碱处理以游离碱形式释放至少一种上述分离所得盐的阳离子部分，并除去上述保护基团，上述释放可以作为独立步骤，在上述保护基团除去之前或之后完成，也可以与除去保护基同时进行。
2.按照权利要求
1的方法，该法可获得选自下列一组中的一个化合物(ⅰ)〔α〕25589nm为-21.06°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕-嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体，它基本不含有〔α〕25589nm为+31.09°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基〕-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体，(ⅱ)其4(3H)-氧代互变异构体形式，以及(ⅲ)它在药物学上可接受的碱金属、碱土金属、无毒金属、铵或取代铵的盐，它基本上不含有〔α〕25589nm为+31.09°的那个非对映异构体的相应的盐。
3.按照权利要求
1的方法，该法所获得的化合物为〔α〕25589nm为-21.06°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体，它基本上不含有〔α〕25589nm为+31.09°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体。
4.按照权利要求
1的方法，该法可获得选自下列一组中的一个化合物(ⅰ)〔α〕25589nm为+31.09°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕-嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体，它基本不含有〔α〕25589nm为-21.06°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体，(ⅱ)其4(3H)-氧代互变异构体形式，以及(ⅲ)它在药物学上可接受的碱金属、碱土金属、无毒金属、铵或取代铵的盐，它基本上不含有〔α〕25589nm为-21.06°的那个非对映异构体的相应的盐。
5.按照权利要求
1的方法，该法所获得的化合物为〔α〕25589nm为+31.09°的N-〔4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体，它基本上不含有〔α〕25589nm为+21.06°的N-(4-〔2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并〔2，3-d〕嘧啶-6-基)-乙基〕-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体。
专利摘要
N-(4-[2-(2-氨基-4-羟基-5，6，7，8-四氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-乙基]-苯甲酰基)-L-谷氨酸的非对映异构体形式是抗肿瘤药物。通过分离相应的带保护基的谷氨酸衍生物的非对映异构体，和水解或氢解除去羧酸和/或氨基保护基，即可制备此类化合物。
文档编号A61K31/195GK87104103SQ87104103
公开日1987年12月30日 申请日期1987年6月6日
发明者爱德华·C·泰勒, 乔治·彼得·比尔兹利, 石全, 斯蒂芬·R·弗莱彻 申请人:普林斯顿大学托管委员会