专利名称：一种新型钩端螺旋体疫苗及其用途的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传工程领域，涉及一种新型钩端螺旋体疫苗及其用途。
背景技术：
钩端螺旋体(简称钩体)是系统发育进化上结构和遗传特征都较特殊的一类微生物，它所导致的钩端螺旋体病是在世界范围内流行的人兽共患的自然疫源性疾病。钩体的全基因组序列于2003年由中国科学家完成，对钩体的功能基因组研究具有重大意义。赖型钩体是中国独有的引起肺弥漫性出血致人死亡的强毒力菌株，但其致病分子机理和疫苗靶标尚未被阐明。因此，发现和开发其新型预防用疫苗具有重要的现实意义。
发明目的本发明的目的在于提供钩端螺旋体疫苗的抗原表位，提供亚单位疫苗，本发明的另外一个目的在于提供预防钩端螺旋体感染的DNA疫苗。本发明的第三个目的在于利用重要的预防感染用中药作为转基因植物疫苗宿主，构建表达钩端螺旋体保护性抗原及其表位的转基因植物疫苗。
技术方案和发明内容实现上述目的的基本技术路线为1.筛选保护性抗原采用的方法包括本技术领域技术人员所熟悉的收集钩端螺旋体亚单位组分，分别检测这些组分的保护效果；将钩端螺旋体的基因组片段用来进行攻击保护实验；重组表达钩端螺旋体的基因组片段，检测表达产物的攻击保护效果，选择具有保护作用的基因或者其编码产物作为保护性抗原。
2.得到适量的保护性抗原。采用的方法包括大规模重组表达，也可以采用常规方法提纯。
3.利用本技术领域技术人员熟悉的基因剔除技术，构建合理减毒的减毒株活疫苗候选株。
4.将适当的保护性抗原编码基因构建表达载体，转入适当的宿主，构建转基因植物疫苗。
5.攻击保护实验。采用适当的动物模型，检测这些保护性抗原的效果发明效果我们通过赖型钩体与双曲钩体之间的基因组差异筛选得到了一个可能与细菌表层膜蛋白有关的具有完整阅读框的表层膜蛋白新基因Lslp。鉴于细菌膜蛋白在微生物致病性、宿主相互作用、免疫保护等方面的特殊性，对Lslp基因进行克隆表达观察其是否编码完整的蛋白质，进而分析其在大肠杆菌中的表达产物是否具有免疫原性。采用上述方法，获得了具有保护性效果的新型钩端螺旋体疫苗。经动物实验，这些保护性抗原具有明显的保护攻击作用。具有良好的保护效果，适合作为预防钩端螺旋体的新型疫苗。特别地，得到了钩端螺旋体跨膜蛋白Lslp为保护抗原的疫苗系列。
实施例1.材料与方法1.1菌株与质粒赖型钩体017株，双曲钩体Patoc株，质粒pGEXλ-1T和宿主菌JM109均由本室保存。56601，56603，56607，56608，56609五株致病钩体由北京药品生物制品检定所提供。
1.2主要试剂PCR相关试剂(Takara)、、PCR纯化试剂盒(Roche)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖、(X-gal)、异丙基-β-D硫代半乳糖苷、IPTG、T4DNA连接酶、ECOR I、BamH I、TMB-Elisa(GIBICOL BRL)、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG)、丙烯酰胺、N-N’-亚甲基双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(BRL)、考马斯亮蓝R250(Sigma)、四甲基乙二胺(TEMED)(Fluka)、蛋白分子量标准(GIBCOL BRL)、GST融合蛋白纯化试剂盒(Pharmacia)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂(Roche)。
1.3钩体基因组DNA的提取参见文献1.4 PCR引物的设计与合成上游引物P15’-GACAGGATCCATGGAACTCAAACTCGTTCTTG-3’下游引物P25’-GAACGGATCCAGATTTTCGAGAAAGTTCTTA-3’上游引物和下游引物各引入一个BamH I酶切位点，引物由美国生命技术公司(BRL)合成。
1.5钩体LslP基因的扩增、重组质粒pGST-Lslp的构建以赖型钩体基因组DNA为模板，用引物P1、P2进行PCR扩增，用PCR产物纯化试剂盒(Roche)纯化PCR产物。按照常规方法进行质粒pGEX1-λT DNA的小量提取、PCR产物与质粒pGEX1-λT的酶切、连接及转化、铺板，挑取单菌落于含氨苄青霉素的液体培养基中37℃振摇培养，然后按常规碱裂解法提取质粒，电泳检测初步判断分子量大小。取较空质粒略大的质粒DNA，以内切酶BamH I单酶切鉴定是否有外源片段插入，然后用ECORI酶切鉴定插入片段的连接方向，筛选出正向重组子。另外以重组质粒DNA为模板，同时设载体质粒DNA对照和阳性基因组对照，按前述扩增条件进行PCR扩增，电泳鉴定有无阳性扩增条带。
1.6重组质粒pGST-Lslp在大肠杆菌中的表达及印迹分析。
从LB平板上分别挑取含空质粒pGEX1-λT和含重组质粒pGST-Lslp的菌落接种于3ml液LB中振摇培养12小时，再以1∶500转种于液体LB中培养至OD值0.6-0.8期间加入终浓度0.1mol/L IPTG诱导生长后1小时、2小时、3小时分别收集细菌用于制备总蛋白样品。按《分子克隆实验指南》的方法进行SDS-PAGE和Western bloting，用于western bloting的一抗和二抗分别是本室保存的兔抗钩体多价抗体血清和购置公司的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(HRP-IgG)1.7抗Lslp蛋白的兔抗血清制备用Amershan Pharmacia公司的Bulk GST purification Modules纯化，GST融合蛋白，方法参见说明书。用SDS-PAGE检查纯化效果以及用分光光度计检查融合蛋白浓度(10DA280＝0.5mg/ml)。
取上述纯化蛋白，加消毒生理盐水配制成约0.2mg/ml的混合液，加等体积弗氏完全佐剂(BRL公司)。背部皮下多点免疫4只新西兰大白兔，初次两周后注射含氟氏不完全佐剂(BRL公司)的抗原蛋白液，2周后再次加强免疫，从耳缘静脉取血用Elisa方法检查抗体效价，有合适的滴度后再过一周从股动脉放血，静置，收集血清，进行纯化。另取一只新西兰大白兔用生理盐水作对照免疫。
1.8 Elisa方法测定兔抗钩体Lslp血清IgG以碳酸钠缓冲液(0.5mmol/L，pH9.6)稀释纯化重组融合蛋白抗原至100μg/ml，100μl/孔加至聚苯乙烯酶标板中，4℃过夜饱和。弃包被液，以洗涤液(0.05％Tween-20的0.1mol/L PBS，pH7.2)洗板3×5min，加入封闭液(1％BSA/0.25％Tween-20/PBS，pH7.2)100μl/孔，37℃封闭2小时，弃封闭液，按前法洗涤，以洗涤液按1∶2等比例连续稀释待测兔血清，加至孔中100μl/孔，37℃孵育2小时，洗涤3次，加入以洗涤液1/1000稀释的酶标羊抗兔IgG 100μl/孔，37℃孵育2小时，弃二抗后洗板3次，加入底物液TMB-Elisa(GIBICOL BRL，加5μl 30％H2O2)100μl，37℃放置30-60分钟，显色充分后加入50μl 2mol/L H2SO4终止反应，用微板读数仪(Bio-Rad550型)490nm处测定OD值。
2结果2.1钩体Lslp基因在多株钩体中的PCR扩增在赖型017，56601，56603，56607，56608，56609六株致病钩体中皆扩增出一条1000bp大小的特异带，Patoc株中未扩增出相应条带。
产物纯化后用ABI3700测序仪测序，几株钩体Lslp ORF序列长度均为1062bp。利用ClustlW程序进行核苷酸序列的多重比对，发现序列极度保守，同源性高达99.6％(数据未显示)。
2.2.重组质粒的克隆及鉴定酶切分析显示BamH I单酶切重组质粒产生4.9kb和1.1kb两条酶切条带，提示该重组质粒已包含一1.1kb的插入片段。为鉴定插入子的连接方向，用EcoR I单酶切产生4.9kb和1.1kb条带的为正向连接(Lslp基因在49bp处有一个EcoR I酶切位点)，说明Lslp基因与pGEX1-λT已正确定向重组，命名为pGST-Lslp。以该重组质粒DNApGST-Lslp为模板，以引物进行PCR扩增，能扩出约1kb条带，而以空质粒为模板未扩出相应条带，进一步证实重组质粒pGST-Lslp构建成功。
2.3重组质粒pGST-Lslp在大肠杆菌中的融合表达及免疫印迹经IPTG诱导的pGEX1-λT表达产物在26kDa处出现GST蛋白带，经IPTG诱导的pGST-Lslp表达产物在66kDa处出现浓的蛋白带。由于Lslp基因编码40kDa的蛋白质，加上26kDa GST蛋白，故66kDa蛋白为包含Lslp编码蛋白质的GST融合蛋白。用不同剂量IPTG和改变IPTG诱导时间(1h、2h、3h)，可提高融合蛋白的表达量。
将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维膜上，用丽春红染色证实转移成功后，与兔抗全钩抗原血清进行免疫印迹反应。结果显示，pGST-Lslp表达产物在66kDa左右出现一棕色反应带，而空质粒载体pGEX1-λT和空宿主菌JM109表达产物无特异印迹带出现。
2.4.兔抗GST-Lslp融合蛋白免疫家兔产生的抗体效价测定在第一次免疫后7天未检测到抗体，14天后即可检测到抗体，但滴度较低(1∶20)；第二次免疫后14天，重组融合Lslp蛋白免疫兔血清中抗体滴度明显升高(可达1∶320)，第三次免疫后抗体效价最高可升至1∶5120。
S-layer蛋白是许多原核生物细胞壁或细胞膜中重要的组成成分，层状排列在细胞外层，分子量变化较大，相互之间同源性较低。目前研究认为s-layer蛋白可能与细菌在不同环境包括不同宿主产生的适应能力相关，其功能特征主要与保护屏障作用、细胞粘附与表面识别、分子与离子运输通道、酶的作用底物和毒力因子有关[6]。而对胎儿弯曲菌等致病菌的研究结果显示，S-layer蛋白直接与毒力相关，能抵抗宿主的消化酶及吞噬细胞的作用而产生免疫逃逸，进而对宿主产生损伤或致病作用[7，8]。Wang等[9]在研究直肠弯曲菌S-layer蛋白与致病性的关系时证实S-layer蛋白能帮助菌体逃逸宿主的免疫反应，细菌离体传代培养15-17代，S-layer蛋白表达明显减低，使毒力减弱，提示二者可能存在正相关性。鱼类致病菌Aeromononas salmonicida的S-layer蛋白由于保护细菌不被溶解和吞噬而被认为是致病的毒力因子[10]。这些研究皆提示S-layer蛋白与毒力相关。因此，有必要对赖型钩体表面蛋白Lslp基因进行克隆、表达、免疫相关研究以及动物实验等系列生物学功能实验，以探讨该基因与钩体致病性的关系以及发展亚单位疫苗的可能。
表达一个基因编码产物可以有融合蛋白和非融合蛋白两种方式。融合蛋白因其高效、易纯化、易检测而应用得更广泛。我们选用GST融合表达载体构建重组质粒在大肠杆菌中进行表达。pGEX1-λT载体有高效的tac启动子和易于检测的谷胱甘肽S转移酶(GST)基因。重组质粒pGST-Lslp经IPTG诱导后行SDS-PAGE观察到在66kDa处出现高效表达的蛋白条带。由于GST表达蛋白分子量为26kDa，Lslp基因理论分子量为40.1kDa，因此这一相对于对照特异出现的66kDa条带很可能是GST与Lsllp基因编码产物的融合蛋白。进一步用Western blotting分析显示重组蛋白能与免疫抗血清发生反应，提示表达蛋白存在可被抗钩体血清抗体识别的表位。
用重组融合蛋白免疫家兔产生高达1∶5120的抗体，提示该蛋白具有较强的免疫原性，这与我们原来用生物信息学进行的抗原性预测结果相符，赖型钩体Lslp蛋白存在具有较强的免疫原性的抗原表位，而在其他已知的钩体外膜蛋白中，OmpL1[11]、LipL41[12]、LipL32[13]都显示一定的免疫原性，成为可能的保护性抗原。
赖型钩体Lslp是钩体表层的一个跨膜蛋白，与其它螺旋体外膜中主要是脂蛋白相比，可能有自己的独特性质。本文仅就其克隆表达和免疫原性进行了初步分析，其功能性质还不能完全加以肯定，进一步对其免疫保护性和对细胞或组织的损伤和致病等方面进行研究，将有利于钩体与宿主之间的相互作用机制的阐明，对解释钩端螺旋体的致病机制以及发展新的亚单位疫苗和血清学诊断试剂具有重要的理论意义和应用价值。
权利要求
1.一种新型钩端螺旋体的疫苗，其特征是含有钩端螺旋体的保护性抗原。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征是含有钩端螺旋体的跨膜蛋白或其编码基因。
3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征是含有钩端螺旋体的跨膜蛋白Lslp或其编码基因。
4.根据权利要求3所述的疫苗，其特征是含有钩端螺旋体的跨膜蛋白Lslp或其编码基因，疫苗可以为亚单位疫苗，也可以为DNA疫苗。
5.一种施用权利要求4所述疫苗的方法，该施用方法包括注射、气雾以及其他适合使用疫苗的方式。
6.一种含有钩端螺旋体的跨膜蛋白Lslp或其编码基因的疫苗，该疫苗可以为原核生物表达，也可以为真核生物表达。
7.一种表达钩端螺旋体的跨膜蛋白Lslp或其编码基因的转基因植物疫苗。
8.权利要求7所述的疫苗，表达所用的植物是菘蓝。
全文摘要
本发明涉及一种新型钩端螺旋体疫苗及其用途。特别的，本发明涉及包括钩端螺旋体的跨膜蛋白Lslp及其编码基因的亚单位疫苗和DNA疫苗，以及该基因缺失的合理减毒株疫苗。
文档编号A61P33/02GK1634578SQ200310104158
公开日2005年7月6日 申请日期2003年12月25日 优先权日2003年12月25日
发明者胡昌华, 张会东, 鲍朗 申请人:西南师范大学