专利名称：含硒多肽及其在药物、食品等方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种含特定肽序列的自由基清除剂含硒多肽及该含硒多肽在药物、食品等方面的应用。
背景技术：
谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)是在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶，它于1957年被Mills首先发现，1973年由Flohe和Rotruck两个研究小组确立了GPX与硒之间的联系；研究表明硒是GPX催化反应的必要组份，它以硒代半胱氨酸(Sec)的形式发挥作用，催化谷胱甘肽(GSH)分解体内的氢过氧化物，分子生物学和遗传学的证据都表明许多疾病的发生、发展都和活性氧自由基(ROS)有关，如糖尿病、白内障、克山病、心脑血管疾病和炎症等，并且在发病过程中GPX的活力都不同程度的下降，而适当的补充外源的GPX可以对病情缓解或达到治疗的目的。由此看来，GPX将是一种非常有前景的抗氧化药物。但是，自然界存在的GPX来源有限，在体外条件下极不稳定易失去酶的活力，天然的GPX容易引起机体的免疫反应，编码GPX活性基团硒代半胱氨酸(Sec)的三联体密码为终止密码子很难用基因工程的方法获得，上述这些缺点极大的限制了GPX的开发和利用。因而设计合成具有清除ROS能力的抗氧化酶模拟物受到了学术界的广泛关注。高活力的GPX人工酶极有可能成为未来预防和治疗由ROS介导的疾病的有效药物。面对这样一个非常有应用前景的抗氧化物质，许多科学工作者开始进行人工模拟并对其生物学效应进行研究。
早期的GPX模拟物由于没有考虑到底物的结合作用，酶活力普遍很低，Ebselen(PZ51)就是其中一例，活力仅为0.99U/μmol。Wilson等人考虑到GSH的结合作用对酶活力的影响，在二硒键邻近处引入季胺盐，对GSH产生静电吸引，使所制备的GPX模拟物二苯基二硒化合物活力提高到11U/μmol。Hilvert等人将枯草杆菌蛋白酶硒化为GPX模拟物，此硒化枯草杆菌蛋白酶对合适巯基底物3-羧基-4-硝基苯硫酚的催化效率为二苯二硒化合物的7×104倍，而对GPX天然底物GSH的活力却很低。因此，对GPX的模拟关键是创造合适的GSH结合部位。以上结果说明模拟GPX要充分考虑产生GSH特异性结合部位，并提高对GSH的结合能力。
由于GPX具有很强的抗氧化作用，这使它的模拟物具有很大的药用潜力，但一些活力较高的模拟物都是大分子物质，分子量通常都高于30kDa，这给这些模拟物的药物开发带来了很大的困难，因此寻找一种分子量相对较小，同时又具有高活力的模拟物势在必行。
目前，有一种新兴的噬菌体展示肽库技术对于产生底物结合位点是很有帮助的。这种技术是以噬菌体颗粒为载体，利用天然蛋白质合成系统，将随机合成的编码任意顺序多肽的寡核苷酸序列插入线性噬菌体外壳蛋白基因组中，使其以融合蛋白的形式表达于噬菌体颗粒的外表面上，再通过与固定化的靶分子的相互作用来筛选靶分子的亲合配体，从而进行分子识别研究的一项新的实验技术。这种技术对于研究蛋白与蛋白、酶与底物间的相互作用是非常有用的一种工具，文献中报道了两种噬菌体展示肽库的生物体系对底物的优化，一种是单价表达载体，另一种是多价表达载体。常用的噬菌体载体是丝状噬菌体，寡核苷酸序列插入在噬菌体外壳蛋白III和VIII的N-未端。pVIII蛋白是噬菌体的主要外壳蛋白，每个噬菌体颗粒约有2700个拷贝，pIII蛋白是噬菌体的次要外壳蛋白，每个噬菌体颗粒约有5个拷贝。就pIII和pVIII蛋白而言，在基因克隆操作上，蛋白融合基本是相同的，在信号肽与成熟蛋白编码区之间设置单一的克隆位点，以便外源蛋白的插入，插入此位点的DNA片段以融合蛋白的形式被表达，并分泌到周质腔，去除N-端的信号肽后，融合蛋白就组装在成熟的噬菌体颗粒表面并释放到培养介质中，融合在N-末端的外源肽将被展示在噬菌体的外表面。在噬菌体肽库的亲和筛选过程中，pIII蛋白因其拷贝数低，降低了多结合位点的影响，有利于筛选出高亲和性的噬菌体肽，所以成为肽库构建的首选蛋白质载体。1985年，Smith等第一次证实了丝状噬菌体的基因组能通过基因工程的手段将外源抗原决定簇与其次要外壳蛋白融合并同时展示在噬菌体表面，几年后，Smith小组又证明被表达在噬菌体外壳上的抗原决定簇能够被特异性抗体所识别，1990年Smith和Parmely构建了噬菌体展示肽库。噬菌体展示肽库技术作为一种新兴的技术，它具有巨大的应用潜力，插入片段的多样性使噬菌体展示肽库可以在与分子识别、蛋白质间相互作用等相关领域广泛应用。
1976年，Atassi与他的同事共同提出了“表面模拟”合成(Surface-simulationsynthesis)的技术，利用这种技术可以将构成蛋白质结合位点的空间相连的氨基酸残基直接通过肽键结合，在构象上模拟蛋白质结合位点。
我们通过噬菌体肽库技术得到底物GSH的结合位点，结合上述的“表面模拟”合成技术的理论对短肽进行设计，并配合化学突变技术产生催化活性中心，从而获得一种新的具有GPX活力的短肽。
因此在本发明中我们使用噬菌体展示肽库技术获得一种能够识别GSH的短肽，结合上述的“表面模拟”合成技术的理论对短肽进行设计，并配合化学突变技术，从而获得新的具有GPX活力的短肽。我们通过噬菌体肽库技术得到底物GSH的结合位点，结合上述的“表面模拟”合成技术的理论对短肽进行设计，并配合化学突变技术产生催化活性中心，从而获得一种新的具有GPX活力的短肽。这种模拟物具有很强的抗氧化作用，因此具有很大的药用潜力。
发明内容
本发明的目的就是提供一种含硒多肽以及该产品在药物、食品等方面的应用。
为了更好的模拟天然GPX的活性，人们对其结构进行了研究。GPX是一种寡聚蛋白，由四个相同的亚基组成。根据X-射线晶体衍射结构分析结果，GPX一个亚基的30～40，140～150，63～70与另一亚基的63～69位氨基酸残基在表面形成一个扁平的凹槽，硒代半胱氨酸就位于这个凹槽底部，是酶的催化中心，该凹槽区是酶分子的活性部位，一个酶分子有4个这样的活性部位。从GPX的二级结构中得知，硒代半胱氨酸位于α1螺旋的N端。α1螺旋与邻近的两个平行的β折叠片(β1，β2)形成了βαβ型超二级结构，这种结构对活性部位提供了有利的空间构型，此外，硒代半胱氨酸残基附近的一些含芳香侧链的氨基酸(Phe，Trp)与Gln-7一同对硒代半胱氨酸起稳定作用。
GPX活性部位附近的氨基酸排列顺序非常保守。其中Arg-167、Arg-40、Gln-130、Trp-148在酶与底物结合的过程中起着重要的作用，GSH的γ-谷氨酰基与Arg-167吻合形成盐桥，N-末端Gly的羧基与Arg-40形成另一盐桥，Trp-148和Phe-150等一些芳香族氨基酸残基在活性中心附近形成一个局部疏水环境，促进酶分子与底物的结合，而Trp-148和Glu-70上的氮原子可以和硒氢基形成氢键，使活性中心在结构上保持某种程度的稳定，如图1所示。
我们通过噬菌体肽库技术得到对底物GSH具有较高结合能力的肽段，结合“表面模拟”合成技术的理论对短肽进行设计，并配合化学突变技术产生催化活性中心，从而获得一种新的具有GPX活力的多肽。
本发明涉及的制备含硒多肽所使用的多肽的结构通式如(I)所示Q1-Arg-Q2-Arg-Q3-Ala(Gly)-Ser(I)式中Q1表示选自Trp，Pro，Phe，Asn，Thr，Gln或Leu中的2个以上相同或不同的氨基酸残基；Q2表示至少包含Gly在内的1个以上的任意氨基酸残基；Q3表示包含1个以上的任意氨基酸残基。其中Ala(Gly)表示该位置的氨基酸可以选用Ala或Gly。
作为本发明的一种优选实施方式，其中Q1是选自Trp，Pro，Phe，Asn，Thr，Gln或Leu中的2-10个相同或不同的氨基酸残基；作为本发明进一步的优选实施方式，其中Q1是选自Trp，Pro，Phe，Asn，Thr，Gln或Leu中的2-4个相同或不同的氨基酸残基。
作为本发明的一种优选实施方式，其中Q2表示至少包含Gly在内的1-126个氨基酸残基，Q3表示的是1-112个任意氨基酸残基；作为本发明进一步的优选实施方式，其中Q2表示至少包含Gly在内的1-31个氨基酸残基，Q3表示的是1-26个任意氨基酸残基。
作为本发明的更进一步优选实施方式，Q1是选自Trp，Pro，Phe和Leu中的2-4个相同或不同的氨基酸残基；Q2表示的氨基酸残基数是含有Gly的1-5个，Q3表示的氨基酸残基数是1-2个。
再进一步的优选实施方式是Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、
Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Val-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、
或Q1-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser；更再进一步的优选实施方式是Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Leu-Arg-His-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Trp-Arg-His-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Phe-Arg-His-Gly-Arg-Ala(Gly)-Ser、或Leu-Arg-Gly-Arg-Ala(Gly)-Ser；本发明最优选的实施方式是Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser。
含硒多肽结构通式如(II)所示Q1-Arg-Q2-Arg-Q3-Ala(Gly)-SerSe-SerSe-Ala(Gly)-Q3-Arg-Q2-Arg-Q1(II)式中Q1表示选自Trp，Pro，Phe，Asn，Thr，Gln或Leu中的2个以上相同或不同的氨基酸残基；Q2表示至少包含Gly在内的1个以上的任意氨基酸残基；Q3表示包含1个以上的任意氨基酸残基。
含硒多肽的结构通式(II)体现出“表面模拟”的理论对短肽进行设计的思想Q1的位置是在含硒多肽的两端，是选自Trp，Pro，Phe和Leu中的2-4个相同或不同的氨基酸残基，所选的氨基酸残基都是疏水性的氨基酸残基。因此在此部位提供了类似于天然酶的底物结合部位的疏水环境。Q2左右两端的两个Arg恰好可以和底物GSH吻合而形成盐桥，起到增加底物结合能力的效果。Q2位于两个Arg之间，所选的氨基酸残基含有柔性较好、体积最小的Gly有利于含硒多肽空间回折，使得两个Arg在空间上比较接近，象钳子一样牢牢的同底物结合。Ala(Gly)表示的Ala或Gly残基具有柔性好、体积较小的特点产生的空间位阻较小，位于和SerSe-相连接的位置，有利于两个SerSeH相互接近，在空气中氧化形成SerSe-SeSer。
作为本发明的一种优选实施方式，其中Q1是选自Trp，Pro，Phe，Asn，Thr，Gln或Leu中的2-10个相同或不同的氨基酸残基；作为本发明进一步的优选实施方式，其中Q1是选自Trp，Pro，Phe，Asn，Thr，Gln或Leu中的2-4个相同或不同的氨基酸残基。
作为本发明的一种优选实施方式，其中Q2表示至少包含Gly在内的1-126个氨基酸残基，Q3表示的是1-112个任意氨基酸残基；作为本发明进一步的优选实施方式，其中Q2表示至少包含Gly在内的1-31个氨基酸残基，Q3表示的是1-26个任意氨基酸残基。
作为本发明的更进一步优选实施方式，Q1是选自Trp，Pro，Phe和Leu中的2-4个相同或不同的氨基酸残基；Q2表示的氨基酸残基数是含有Gly的1-5个，Q3表示的氨基酸残基数是1-2个。
再进一步的优选实施方式是Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Val-Asp-His-Arg-Q1、
Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Val-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Val-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Asp Arg-Q1、Q1-Arg-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Val-Arg-Q1、
Q1-Arg-Asp-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Asp-Arg-Q1、Q1-Atg-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Arg-Q1、Q1-Atg-His-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Val-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Arg-Q1、Q1-Arg-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Arg-Q1、Q1-Arg-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Arg-Q1或Q1-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Arg-Q1；更再进一步的优选实施方式是Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro-Trp、Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro、Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Leu-Phe、Leu-Arg-His-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-Tyr-His-Arg-Leu、Trp-Arg-His-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-His-Arg-Trp、Phe-Arg-His-Gly-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Gly-His-Arg-Phe、或Leu-Arg-Gly-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Gly-Arg-Leu；本发明最优选的实施方式是Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro-Trp。
本发明含硒多肽具有广泛地清除自由基等活性，可以广泛应用于药物、食品或饲料等领域。因而，作为本发明应用的一个优选形式，含硒多肽可以提供作为药物使用的抗氧化剂。本发明的含硒多肽作为药物使用时，可以根据给药途径配制为适当的剂型，具体地说，主要可以配制为静脉注射、肌肉注射等的注射剂；胶囊剂、包衣片剂、滴剂、片剂、颗粒剂、散剂、丸剂、细粒剂、糖锭、锭剂等的口服制剂；直肠给药制剂；油脂性栓剂等任意的剂型。另外，该抗氧化剂可根据需要制成液体制剂或包封液体制剂的胶囊剂等的形式。
这些制剂可以进一步使用通常使用的赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、分散剂、缓冲剂、抑菌剂、增溶剂、防腐剂、矫味剂、镇痛剂、稳定剂等药学上可接受的制剂用添加剂来制备。即本发明的抗氧化剂还可以含有药学上可接受的制剂用添加剂。
可以使用的添加剂例如有乳糖、果糖、葡萄糖、淀粉、明胶、碳酸镁、合成硅酸镁、滑石粉、硬脂酸镁、甲基纤维素或其盐、阿拉伯胶、聚乙二醇、糖浆、凡士林、甘油、乙醇、丙二醇、枸椽酸、氯化钠、亚硫酸钠、磷酸钠等。
本发明的含硒多肽作为药物使用时，给药方式可以采用经口给药、非经口给药、吸入、经直肠给药、局部给药等各种方式。其中，非经口给药包括皮下注射、静脉给药、肌内给药、鼻腔给药或灌注等。因此例如可以是通过鼻、口腔、舌下、直肠等的粘膜给药或经皮给药、植入剂等的给药。通过上述的任意的给药途径，可以将本发明的抗氧化剂给予选自人和人以外的动物的患者。
给药量可以考虑用法、患者的年龄、性别、症状的程度等适当决定，换算为抗氧化剂的含硒多肽的量。
如上所述，以药物的形式提供的本发明的抗氧化剂可以有效地应用于心脑血管疾病、肝脏损伤、糖尿病、呼吸系统疾病、风湿与类风湿性疾病、皮肤病、肿瘤等由氧自由基诱发的疾病的治疗。其中，心脑血管疾病是指心肌缺血、心肌梗塞、心绞痛、心律失常、高血脂、高血压、冠心病、动脉粥样硬化、脑出血、脑梗塞以及其联合症状；肝脏损伤疾病是指酒精肝、各种原因引起的肝纤维化、各型肝炎、脂肪肝等肝病；呼吸系统疾病是指由各种原因引起的肺部感染、肺炎、肺气肿、慢性支气管炎、支气管哮喘等呼吸道疾病；皮肤病是指白癜风、鱼鳞病、牛皮癣、黄褐斑、红斑狼疮或带状疱疹。
如上所述，本发明的含硒多肽以食品形式提供，可以对于老年人、病后患者等补加抗氧化剂、增进健康。
本发明的抗氧化剂作为饲料使用时，可以以乳牛用饲料、猪用饲料、鸡用饲料等禽畜用饲料；宠物食品；各种复合饲料等的形式提供。
与现有技术相比，本发明有如下特点1.制备方法相对简单，合成步骤少，产率高，可扩大生产；2.本发明制备的含硒多肽清除自由基能力较强；3.含硒多肽作为药物应用，可克服天然GPX不稳定、来源有限、分子量大会引起人体免疫反应、不易跨膜等缺点。
综上所述，本发明所述的含硒多肽制备工艺简单，产率高，可大量生产。并且含硒多肽清除自由基能力较强、稳定性好、能有效预防和治疗由自由基诱发的疾病。同时可克服天然酶用作药物产生的免疫原性大，跨膜困难，不稳定等缺点。因此，在医药上具有巨大的应用潜力。
图1天然GPX活性部位附近的氨基酸排列图。
具体实施例方式
下面通过制备及药效实施例进一步说明本发明，应该理解的是，本发明实例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明进行简单改进都属于本发明要求保护的范围。
制备实施例一以Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala-SerSe-SeSer-Ala-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro-Trp为例(1)、NaHSe的制备将81.1mg NaBH4溶解在装有1ml水的小瓶中，再将79mg硒粉缓慢加入到NaBH4的溶液中，盖上一插有针头的胶盖，此时可以看到水中产生大量气体，并伴随有热量放出。由于反应过于剧烈，所以需在冰浴中进行，以控制反应速度，其反应方程式如下
由于NaBH4与H+反应，还伴有少量H2Se气体产生，为防中毒，必须在通风橱中反应。反应结束后，有大量盐析出，即为NaHSe，但NaHSe极易氧化，故应通入N2保存；(2)、含硒多肽的制备将多肽(Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser，由我们将上述设计好的氨其酸序列提供给合成公司，由公司合成，可以得到纯度高于98％的肽段)1mg溶于1ml pH7.0，50mM PBS中，加入PMSF(10mg/ml乙腈溶液)50-500μl，分多次加入，每隔15min加一次，室温反应3小时。然后通高纯氮约20min以排除体系内氧气。用微量注射器加入10-100μl 1M NaHSe溶液，氮气保护下37℃反应40小时，取出，开盖使其充分氧化，离心(15,000rpm，30min)，上清液用pH7.0，50mM PBS透析(MW3KDa)，透析后冻干，即得含硒多肽Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro-Trp。
制备实施例二以Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro为例(1)NaHSe的制备与制备实施例一相同(2)含硒多肽的制备将多肽(Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser，由我们将上述设计好的氨其酸序列提供给合成公司，由公司合成，可以得到纯度高于98％的肽段)1mg溶于1ml pH7.0，50mM PBS中，加入PMSF(10mg/ml乙腈溶液)40-440μl，分多次加入，每隔15min加一次，室温反应3小时。然后通高纯氮约20min以排除体系内氧气。用微量注射器加入10-100μl 1M NaHSe溶液，氮气保护下37℃反应38小时，取出，开盖使其充分氧化，离心(15,000rpm，30min)，上清液用pH7.0，50mM PBS透析(MW3KDa)，透析后冻干，即得含硒多肽Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro制备实施例三以Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Leu-Phe为例(1)NaHSe的制备与制备实施例一相同(2)含硒多肽的制备将多肽(Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser，由我们将上述设计好的氨其酸序列提供给合成公司，由公司合成，可以得到纯度高于98％的肽段)1mg溶于1ml pH7.0，50mM PBS中，加入PMSF(10mg/ml乙腈溶液)40-440μl，分多次加入，每隔15min加一次，室温反应2.5小时。然后通高纯氮约20min以排除体系内氧气。用微量注射器加入10-80μl 1M NaHSe溶液，氮气保护下37℃反应38小时，取出，开盖使其充分氧化，离心(15,000rpm，30min)，上清液用pH7.0，50mM PBS透析(MW3KDa)，透析后冻干，即得含硒多肽Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Leu-Phe制备实施例四
以Leu-Arg-His-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-Tyr-His-Arg-Leu为例(1)NaHSe的制备与制备实施例一相同(2)含硒多肽的制备将多肽(Leu-Arg-His-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser，由我们将上述设计好的氨其酸序列提供给合成公司，由公司合成，可以得到纯度高于98％的肽段)1mg溶于1mlpH7.0，50mM PBS中，加入PMSF(10mg/ml乙腈溶液)40-500μl，分多次加入，每隔15min加一次，室温反应3.5小时。然后通高纯氮约20min以排除体系内氧气。用微量注射器加入20-80μl 1M NaHSe溶液，氮气保护下37℃反应36小时，取出，开盖使其充分氧化，离心(15,000rpm，30min)，上清液用pH7.0，50mM PBS透析(MW3KDa)，透析后冻干，即得含硒多肽Leu-Arg-His-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-Tyr-His-Arg-Leu制备实施例五以Trp-Arg-His-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-His-Arg-Trp为例(1)NaHSe的制备与制备实施例一相同(2)含硒多肽的制备将多肽(Trp-Arg-His-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser，由我们将上述设计好的氨其酸序列提供给合成公司，由公司合成，可以得到纯度高于98％的肽段)1mg溶于1ml pH7.0，50mM PBS中，加入PMSF(10mg/ml乙腈溶液)40-600μl，分多次加入，每隔15min加一次，室温反应3.5小时。然后通高纯氮约20min以排除体系内氧气。用微量注射器加入20-100μl 1M NaHSe溶液，氮气保护下37℃反应36小时，取出，开盖使其充分氧化，离心(15,000rpm，30min)，上清液用pH7.0，50mM PBS透析(MW3KDa)，透析后冻干，即得含硒多肽Trp-Arg-His-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-His-Arg-Trp制备实施例六以Phe-Arg-His-Gly-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Gly-His-Arg-Phe为例(1)NaHSe的制备与制备实施例一相同(2)含硒多肽的制备将多肽(Phe-Arg-His-Gly-Arg-Ala(Gly)-Ser，由我们将上述设计好的氨其酸序列提供给合成公司，由公司合成，可以得到纯度高于98％的肽段)1mg溶于1ml pH7.0，50mM PBS中，加入PMSF(10mg/ml乙腈溶液)40-520μl，分多次加入，每隔13min加一次，室温反应3.1小时。然后通高纯氮约25min以排除体系内氧气。用微量注射器加入20-100μl 1M NaHSe溶液，氮气保护下37℃反应36小时，取出，开盖使其充分氧化，离心(15,000rpm，30min)，上清液用pH7.0，50mM PBS透析(MW3KDa)，透析后冻干，即得含硒多肽Phe-Arg-His-Gly-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Gly-His-Arg-Phe制备实施例七以Leu-Arg-Gly-Arg-Ala(Gly)SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Gly-Arg-Leu为例(1)NaHSe的制备与制备实施例一相同(2)含硒多肽的制备将多肽(Leu-Arg-Gly-Arg-Ala(Gly)-Ser，由我们将上述设计好的氨其酸序列提供给合成公司，由公司合成，可以得到纯度高于98％的肽段)1mg溶于1ml pH7.0，50mMPBS中，加入PMSF(10mg/ml乙腈溶液)64-520μl，分多次加入，每隔17min加一次，室温反应3.1小时。然后通高纯氮约25min以排除体系内氧气。用微量注射器加入20-100μl 1M NaHSe溶液，氮气保护下37℃反应36小时，取出，开盖使其充分氧化，离心(15,000rpm，30min)，上清液用pH7.0，50mM PBS透析(MW3KDa)，透析后冻干，即得含硒多肽Leu-Arg-Gly-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Gly-Arg-Leu。
即采用与制备实施例一几乎同样的方法，将多肽Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser换成Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Leu-Arg-His-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Trp-Arg-His-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Phe-Arg-His-Gly-Arg-Ala(Gly)-Ser、或Leu-Arg-Gly-Arg-Ala(Gly)-Ser，得到以下含硒多肽Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro、Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Leu-Phe、
Leu-Arg-His-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-Tyr-His-Arg-Leu、Trp-Arg-His-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-His-Arg-Trp、Phe-Arg-His-Gly-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Gly-His-Arg-Phe、或Leu-Arg-Gly-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Gly-Arg-Leu；本发明所述其它含硒多肽序列完全可以采用同样的方法制备得到，即将我们设计好的氨基酸序列提供给任一家合成公司(如晶美生物工程有限公司；生工生物工程(上海)有限公司；吉尔生化(上海)有限公司；西安蓝晶生物科技有限公司等)，由公司合成，同样可以得到纯度高于98％的肽段，再将得到的肽段按照上述方法则可制备成本发明通式(II)所描述的含硒多肽，该含硒多肽具备上面所述的相同或相近的效果，在药物、食品等方面具有广泛的应用。
药效实施例实验准备DMEM培养液，Gibco公司；胎牛血清，Hyclone公司；Dispase，Sigma公司；1∶250 trypsin，Difco公司；SOD、MTT、TEMED、其它试剂均为国产分析纯。实验用Wistar大鼠乳鼠自吉林大学基础医学院动物部购买1.试剂配制1.1 D-Hank’s液(无Ca2+、Mg2+的平衡盐溶液)8g NaCl，0.4g KCl，0.06g KH2PO4，0.06g Na2HPO4·H2O，0.02g酚红，0.35gNaHCO3，溶于1000ml水中，高压灭菌，4℃保存。
1.2 0.25％胰蛋白酶(Trypsin)称取0.25g tryptin溶于100ml D-Hanks液中，磁力搅拌混匀，使其完全溶解，过滤除菌，分装备用。
1.3 Dispase液0.125g dispase溶于0.9％生理盐水50ml中，过滤除菌，-20℃保存。
1.4 MDA反应液称TBA(苯巴比妥)0.8g，TCA(三氯乙酸)16g，加浓盐酸8.33ml，用水定容至100ml。
1.5 MTT反应液10mg MTT(甲基噻唑蓝)溶于2ml 0.01mol/L，PH7.4 PBS中，浓度为5mgMTT/ml。
1.6 二苯胺(DPA)反应液称DPA0.3g，加冰醋酸20ml，浓硫酸0.3ml，混匀，临用前加1.6％乙醛0.1ml。
1.7 DNA裂解液
5mMTris，1mM EDTA，0.5％Triton-100。
1.8 Dubelcoo’s缓冲液2.68mM KCl，1.47mM KH2PO4，0.49mM MgCl2，8.10mM Na2HPO4，0.90mMCaCl2，5.5mM葡萄糖药效实施例一以Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro-Trp为例1、试验名称清除自由基的作用1.1实验方法1.1.1表皮细胞的原代培养[1]取出生24小时以内的Wistar大鼠乳鼠的背部皮肤，用D-Hanks液洗三次，平铺在培养皿中，加入0.25％Dispase，4℃作用20小时以上。分离真皮层和表皮层，将表皮层用0.25％胰蛋白酶在37℃恒温箱中热消化15min，用D-Hanks液漂洗三次，用含15％小牛血清的DMEM培养液吹打分散细胞，离心，用DMEM培养液将细胞密度调整到2×105个/ml，接种于24孔板中，于5％CO2培养箱中37℃培养，48小时后(细胞接近融合状态)进行分组。阴性对照组正常细胞，不给予药物，不进行UVB照射；UVB组(阳性对照组)仅进行UVB照射，不给予药物的表皮细胞；UVB+肽组(含硒多肽组)UVB照射前4小时给予0.5μM肽。
1.2流式细胞术测定细胞周期、凋亡及活性氧自由基(ROS)(1)测定细胞周期和凋亡细胞用10mmol/L pH7.4的PBS洗2次(1500rpm离心5分钟)，弃上清，加入RNA水解酶80μl后再加入150μl Pi荧光染料染色，避光反应30分钟，于流式细胞仪上测定荧光强度的变化。
(2)测定活性氧自由基(ROS)培养板每孔加入DCFH/DA荧光染料10μl于37℃保温20分钟，加胰蛋白酶60μl置37℃保温15分钟，1500rpm离心5分钟，收细胞，用PBS洗2次(1500rpm离心5分钟)，弃上清，加200μl PBS，于流式细胞仪上测定荧光强度，ROS含量的多少同荧光强度成正比。
1.2.1结果见表1表1 100J/m2UV-B照射加0.5μM模拟物对ROS的影响
n＝6(表示进行6组平行试验)1.2.2结论以上数据表明含硒多肽对清除自由基确有较好的效果。
1.3.脂质过氧化损伤模型的建立脂质过氧化损伤模型采用UVB(290nm-320nm)进行照射。光源为UVB紫外灯管(上海金光灯具厂，6W)，剂量率为2.7kJ·m-2.min-1(由吉林大学公共卫生学院环境卫生教研室测量)。
1.3.1MTT法测细胞存活率[2，3]1.3.2原理甲基噻唑蓝(MTT)比色实验是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT的化学名是3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5，-二苯基四氮唑溴盐。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为蓝紫色结晶物，沉淀在细胞中，如果细胞受损伤，线粒体呼吸系统功能下降或丧失则不能使MTT还原。用二甲基亚砜(DMSO)溶解蓝紫色结晶，用酶联免疫检测仪在490nm下测其吸光度值，可间接反映出活细胞的呼吸功能和氧化还原状态。在一定的细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数呈正比。此方法与其它检测细胞活力方法(如细胞计数法等)有良好的相关性。
1.3.3测定方法取细胞培养液(1×106cells/ml)500μl，加入80μl MTT反应液，37℃保温4小时，离心(1500rpm，10min)，弃上清，加入DMSO，每孔加600μl，振荡10min，使结晶物充分溶解，在490nm处测定吸收值。
1.3.4结果见下表2表21.35KJ/m2UV-B照射加1U/ml模拟物对细胞存活率的影响
n＝6(同前)1.3.5结论加入含硒多肽后具有保护细胞，增加表皮细胞存活率，延长细胞寿命的作用，说明含硒多肽能有效的预防自由基对细胞的损伤。
1.4脂质过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的含量测定[3，4]1.4.1原理脂质过氧化作用由自由基引发的一系列反应所完成。首先，自由基与不饱和脂肪酸碳氢链中的甲酰基(-CH2-)发生脱氢反应，脱氢反应后遗留的未配对电子使碳原子成为自由基(-CH-)。为了使碳原子自由基稳定，与其相邻的双键发生分子重排形成共轭双键结构。这种带有碳原子自由基和共轭双键结构的脂肪酸分子很容易与氧反应生成过氧化物自由基。过氧化物自由基又可以通过脱氢反应启动另一个不饱和脂肪酸的脂类过氧化。过氧化自由基在脱氢反应中自身得氢后形成羟基过氧化物。过氧化物自由基也可以经过自身环化形成环化过氧化物。其中脂质过氧化物、环过氧化物、环内过氧化物可分解为醛类物质，包括丙二醛及其多聚体产物。具体来说是，一个不饱和脂肪酸分子通过自由基反应形成共轭双键和丙二醛。不饱和脂肪酸的氢过氧化物与自由基发生反应双键重排，形成五元氧环，导致键断裂反应，最终形成丙二醛。丙二醛作为脂质过氧化的终产物，可以来表示脂质过氧化的程度。丙二醛(MDA)与TBA在弱酸环境下生成红色物质在532nm处有特征吸收。
1.4.2测定方法取细胞(1×106cells/ml)及培养液500μl，加入MDA反应液200μl，混匀，95℃保温30min，冷却，离心(2500rpm，10min)，吸取上清，用紫外分光光度计测定OD532nm的吸收度值。
1.4.3结果见下表3表3不同模拟物对1.35KJ/m2UV-B照射引起细胞脂质过氧化变化的影响
n＝6(同前)1.4.4结论以上数据表明，加含硒多肽后MDA含量百分比明显降低，表明含硒多肽具有良好的抗脂质过氧化的作用。
1.5细胞胞浆酶-乳酸脱氢酶(LDH)含量测定[5，6]1.5.1原理细胞胞浆酶-乳酸脱氢酶(LDH)是活细胞胞浆内的一种活性酶，当细胞受外界条件损伤后，膜脂质发生过氧化，使细胞膜破坏细胞内容物渗漏，即检测细胞培养液中细胞胞浆酶-乳酸脱氢酶(LDH)的含量即可表明细胞膜脂质的受损程度。
1.5.2测定方法取各组细胞及培养液500μl，离心，1500rpm×10min，取上清在7150型生化自动分析仪上测定LDH活性。
1.5.3结果见下表4表4不同模拟物对1.35KJ/m2UV-B照射引起细胞内LDH泄漏的影响
n＝6(同前)1.5.4结论以上数据表明，加含硒多肽后LDH含量百分比明显降低，表明含硒多肽能够使细胞膜能够保持良好的通透性，有效地保护培养表皮细胞膜免受氧化损伤。
药效实施例二药效试验(一)以Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro为例1名称治疗缺血再灌注引起的损伤2方法2.1动物分组及模型建立48只健康家兔(雌雄兼有)，体重1.5～2.1kg，随机将动物分成3组，即对照组、模型组和给药组。按Pussinell′s四血管结扎法制造家兔脑急性完全性缺血再灌注模型。模型组和给药组均缺血20min，再灌注180min。但给药组缺血20min后，于再灌注10min时，经股静脉注射多肽溶液1ml/kg，继续再灌170min。对照组只进行血管分离，不进行缺血和再灌注处理。各组于180min后立即开颅取枕顶皮层标本，制备10％的组织匀浆，用Lowry法测定蛋白质含量。
2.2测定指标脑组织过氧化氢酶的活性测定，乳酸含量测定，Ca2+-ATPase活性检测。
3结果见下表5表5含硒多肽治疗缺血再灌注引起损伤实验结果
n＝6(同前)本实验结果显示，采用了Pussinell′s四血管结扎法制造家兔脑急性完全性缺血再灌注模型，模型组的过氧化氢酶和Ca2+-ATPase活性较对照组均有极显著性降低，(与对照组相比)而乳酸含量则明显升高；同时过氧化氢酶与乳酶比值和Ca2+-ATPase与乳酸比值均有极明显下降(与对照组相比)。说明在缺血再灌期，由于神经细胞缺血缺氧产生大量的自由基，消耗掉大量的谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)，造成细胞清除自由基、H2O2的能力下降，未被及时清除的氧自由基可攻击生物膜上多不饱和脂肪酸，使之发生脂质过氧化反应，使膜的抗损伤和自身稳定性下降，引起膜流动性和完整性等破坏，进而影响膜的功能和结构。因此使脂膜上Na&mdash；K+-ATPase和Ca2+-ATPase功能活动受到影响，Na+泵和Ca2+泵机制障碍，细胞内Na+和Ca2+积聚，而导致脑细胞水肿和Ca2+过载性脑损伤，以致最后死亡。
给药组过氧化氢酶、Ca2+-ATPase活性明显高于模型组，乳酸含量低于模型组。过氧化氢酶和Ca2+-ATPase与乳酸比值均显著高于模型组。说明(1)含硒多肽能有效地维持缺血再灌注大脑的GPX活性，它能直接抑制大脑MDA生成减少，GPX的消耗，刺激过氧化氢酶活性代偿性增高所致，从而减轻了缺血脑组织的脂质过氧化反应；(2)含硒多肽能通过改善缺血组织代谢和缺氧状况，减少乳酸生成，从而减轻脑组织代谢性酸中毒；(3)含硒多肽通过减轻缺血脑组织过氧化反应，减轻了缺氧及酸中毒。因此在一定程度上保护了细胞膜的完整性，以致明显改善了质膜上Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性，恢复Na+泵和Ca2+泵的正常转运，从而减轻脑细胞水肿和Ca2+超载，以达到对缺血再灌注损伤大脑的积极保护作用。
4结论由于缺血再灌注是心肌缺血、心肌梗塞、动脉粥样硬化这些心脑血管疾病很好的动物模型，因此含硒多肽能较好治疗心肌缺血、心肌梗塞、动脉粥样硬化这些疾病。
药效实施例三以Leu-Arg-Gly-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Gly-Arg-Leu为例1名称治疗脑卒中2方法2.1动物分组及模型建立由美国NIH引进，在中国北京阜外心血管病医院动物科繁殖的第38代SHRsp鼠，SHRsp是从SHR品系培育的一种药亚系，是遗传性卒中易感型自发性高血压大鼠，100％发生高血压，成年鼠收缩压达230mmHg以上；80％发生脑卒中，包括脑梗塞、脑出血及联合病变(脑梗塞+脑出血)。SHRsp是高血压卒中实验的最佳模型。SHRsp脑的主要病理学表现是脑内小动脉壁有纤维样坏死，管腔常有血栓伴管腔闭塞，也常见有微动脉瘤。损害多见于皮质，也见于小脑和基底神经节。
种鼠饲育在屏障环境中，实验大鼠笼养，每笼6只，光照12小时/日，室温为23±2℃，相对湿度为50±10％。用北京实验动物中心生产的实验动物大鼠配合饲料喂养。取104只大鼠，雌雄各半。自八周龄开始自由饮用1.0％盐水(浓度逐渐增加，最高到1.5％)，以加速高血压发展和脑卒中发生。每日至少观察大鼠两次，待出现脑卒中症状，给与评分并随机分组，开始用药灌胃治疗，疗程2周。治疗结束后继续观察10天，存活大鼠断头处死。
①A组(小剂量治疗组)16.05mg/kg②B组(中剂量治疗组)160.5mg/kg③C组(大剂量治疗组)1605mg/kg④D组(对照组)溶媒(蒸馏水)对照。
每日上午9时称重、评分，按体重调整药量灌胃治疗。
2.2测定指标(1)SBP实验前及后第4周用尾套法各测一次收缩压(SBP)。
(2)心率实验前及后第4周各测一次心率。(测血压同时测心率)(3)体重实验前及后每周称重2次。给药后每天称重，以计算喂药剂量。
(4)脑卒中临床表现评分大鼠出现脑卒中临床症状及体征，每日按本评分标准予以评分记录，每天上午一次。统计治疗后各组脑卒中表现最高分和累积平均分数平均值。大鼠脑卒中评分标准如下0----正常1----(活动少)运动量轻度减少，或轻度兴奋。
2----(活动很少)运动量明显减少，或激惹性亢进。
3----(俯卧不动)不能步行，忧郁性症状。
4----不能站立，肢体麻痹(瘫痪)，任何一侧体肢瘫痪。
(5)生存天数记录每组大鼠卒中治疗期间存活天数。如大鼠发生脑卒中后临床病情严重、全身极度衰竭则断头处死并分离脑组织及心脏。
(6)脏器官称重及脑卒中病理检查取自然死亡或断头处死大鼠的心脏和脑组织，分别称重并计算心、脑组织重量比值。器官重量比值＝(器官重量/体重)×1000(7)脑卒中病理检查脑卒中包括脑梗塞、脑出血及联合病变(梗塞+出血)。将脑组织固定于10％福尔马林溶液中，每个脑组织切成6片，经HE染色处理，光镜下进行脑卒中病理观察。
(8)脑组织透射电镜检查每组3只大鼠取左侧大脑组织约0.3mm×0.3mm×0.3mm，立即固定在2.5％的戊二醛内，在经1％的锇酸充分固定后，酒精逐级脱水，EPON812环氧树脂包埋，KLB超薄切片机切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色后，日立H-600透射电镜观察照相。
(9)颈总动脉扫描电镜检测取右颈动脉1cm左右，立即固定在2.5％的戊二醛内，在经1％的锇酸充分固定后，酒精逐级脱水，醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，IB-3型离子溅射仪镀金后，日立S-520扫描电镜观察照相。
3结果见下表表6含硒名肽治疗脑卒中实验结果
3.1脑组织电镜透射检查结果A组神经细胞核染色质轻度凝聚，胞浆内线粒体肿胀，有的嵴紊乱，内质网轻度扩张，有的细胞质和核轻度疏松。
B组神经细胞核质均匀，核膜呈连续的双层结构，胞浆内线粒体轻度肿胀，内质网轻度扩张，有的细胞在胞浆内可见到较多的溶酶体，神经细胞胞浆内细胞器较多。
C组神经细胞核染色质有的较均匀，有的核染色质脱失，胞浆内细胞器较多，线粒体轻度肿胀，嵴紊乱，内质网大致正常。
D组神经细胞核有的固缩，核膜消失，有的核染色质凝聚，有的核染色质脱失，核膜失去连续结构。胞浆内的线粒体有的明显肿胀，嵴消失，有的嵴紊乱，内质网高度扩张。
3.2颈动脉电镜扫描结果
A组血管内皮细胞排列大致正常，个别内皮细胞轻度受损，有的内皮细胞表面可见到火山口样结构。
B组血管内皮细胞排列有序，形状大致正常，内皮细胞表面的微绒毛清晰可见，内皮细胞很少粘附有血小板和红细胞。
C组血管内皮细胞排列大致正常，个别内皮细胞轻度受损，内皮细胞表面的微绒毛可见，内皮细胞未见到有较多的红细胞和血小板粘附。
D组有的血管内皮细胞严重受损，失去细胞的正常形态，内皮细胞失去正常的排序结构，受损的内皮细胞表面粘附有红细胞和血小板，有的部位内皮细胞有轻度受损脱落，有的内皮细胞表面可见到火山口样结构。
3.3体重变化见下表表7各组大鼠体重测量结果
本实验结果表明A、B、C、D四组大鼠基础脑卒中表现分数相似，说明组间基础数据是可比的。光镜病理说明四组大鼠脑卒中病理特性，是脑卒中实验的良好大鼠模型A、B、C三组联合病变(69.2％，53.8％，34.6％)较D组(100％)少，表明含硒多肽的治疗可以减轻大鼠脑卒中病变的程度。
含硒多肽治疗2周A、B、C组脑卒中临床表现评分分数均较D组低，其中B、C组与D组比较差异明显，含硒多肽治疗可以减轻的症状和体征。
脑卒中发生后生存天数A、B、C组均高于D组，C与D组比较差异明显，表明含硒多肽的治疗可延长卒中大鼠的生存期。
脑组织电镜检查提示A、B、C组脑神经细胞损害较轻。颈动脉组织电镜检查提示A、B、C组血管内皮细胞受损轻于D组。组织电镜检查说明含硒多肽治疗可减轻脑组织和颈动脉组织的损害，对神经细胞和血管内皮细胞有保护作用。
本实验结果表明，含硒多肽对SHRsp脑卒中有一定的治疗效果，可减少脑卒中临床表现评分分数，减轻脑组织和颈动脉内皮细胞的损害。
4结论含硒多肽可以治疗脑出血、脑梗塞以及其联合症状等脑血管疾病。
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附本发明所涉及的用于制备含硒多肽的多肽氨基酸序列(1)SEQ ID NO.1多肽氨基酸序列(1)<110>吉林大学<120>含硒多肽及其在药物、食品等方面的应用<160>14<210>1<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(15)<400>1Trp Pro Phe Leu Arg His Asp Val Tyr Gly Arg Pro Arg Ala Ser1 5 10 15(2)SEQ ID NO.2多肽氨基酸序列(2)<210>2<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(15)<400>2Trp Pro Phe Leu Arg His Asp Val Tyr Gly Arg Pro Arg Gly Ser1 5 10 15
(3)SEQ ID NO.3多肽氨基酸序列(3)<210>3<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(13)<400>3Pro Phe Leu Arg His Asp Tyr Gly Arg Pro Arg Ala Ser1 5 10(4)SEQ ID NO.4多肽氨基酸序列(4)<210>4<211>13<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(13)<400>4Pro Phe Leu Arg His Asp Tyr Gly Arg Pro Arg Gly Ser1 5 10(5)SEQ ID NO.5多肽氨基酸序列(5)<210>5<211>11<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>ACT_SITE<222>(11)<400>5Phe Leu Arg His Asp Tyr Gly Pro Arg Ala Ser1 5 10(6)SEQ ID NO.6多肽氨基酸序列(6)<210>6<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(11)<400>6Phe Leu Arg His Asp Tyr Gly Pro Arg Gly Ser1 5 10(7)SEQ ID NO.7多肽氨基酸序列(7)<210>7<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(9)<400>7Leu Arg His Tyr Gly Pro Arg Ala Ser1 5
(8)SEQ ID NO.8多肽氨基酸序列(8)<210>8<211>9<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(9)<400>8Leu Arg His Tyr Gly Pro Arg Gly Ser1 5(9)SEQ ID NO.9多肽氨基酸序列(9)<210>9<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(8)<400>9Trp Arg His Gly Pro Arg Ala Ser1 5(10)SEQ ID NO.10多肽氨基酸序列(10)<210>10<211>8<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(8)
<400>10Trp Arg His Gly Pro Arg Gly Ser1 5(11)SEQ ID NO.11多肽氨基酸序列(11)<210>11<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(7)<400>11Phe Arg His Gly Arg Ala Ser1 5(12)SEQ ID NO.12多肽氨基酸序列(12)<210>12<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(7)<400>12Phe Arg His Gly Arg Gly Ser1 5(13)SEQ ID NO.13多肽氨基酸序列(13)<210>13
<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(6)<400>13Leu Arg Gly Arg Ala Ser1 5(14)SEQ ID NO.14多肽氨基酸序列(14)<210>14<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>ACT_SITE<222>(6)<400>14Leu Arg Gly Arg Gly Ser1 权利要求
1.结构如(I)所示的多肽，Q1-Arg-Q2-Arg-Q3-Ala(Gly)-Ser(I)式中Q1表示选自Trp、Pro、Phe、Asn、Thr、Gln和Leu中的2个以上相同或不同的氨基酸残基；Q2表示至少包含Gly在内的1个以上的任意氨基酸残基；Q3表示包含1个以上的任意氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于Q1是选自Trp、Pro、Phe、Asn、Thr、Gln和Leu中的2-10个相同或不同的氨基酸残基，Q2表示至少包含Gly在内的1-126个氨基酸残基，Q3表示的是1-112个任意氨基酸残基。
3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于Q1是选自Trp、Pro、Phe、Asn、Thr、Gln和Leu中的2-4个相同或不同的氨基酸残基，Q2表示至少包含Gly在内的1-31个氨基酸残基，Q3表示的是1-26个任意氨基酸残基。
4.如权利要求3所述的多肽，其特征在于Q1是选自Trp、Pro、Phe和Leu中的2-4个相同或不同的氨基酸残基，Q2表示至少包含Gly在内的1-5个氨基酸残基，Q3表示的是1-2个任意氨基酸残基。
5.权利要求4所述的多肽是Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Asp-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Val-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-His-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Asp-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Q1-Arg-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-Ser或Q1-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-Ser。
6.权利要求5所述的多肽是Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Leu-Arg-His-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Trp-Arg-His-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser、Phe-Arg-His-Gly-Arg-Ala(Gly)-Ser或Leu-Arg-Gly-Arg-Ala(Gly)-Ser。
7.权利要求6所述的多肽是Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-Ser
8.结构式如(II)所示的含硒多肽，Q1-Arg-Q2-Arg-Q3-Ala(Gly)-SerSe-SerSe-Ala(Gly)-Q3-Arg-Q2-Arg-Q1(II)式中Q1表示选自Trp，Pro，Phe，Asn，Thr，Gln和Leu中的2个以上相同或不同的氨基酸残基；Q2表示至少包含Gly在内的1个以上的任意氨基酸残基；Q3表示包含1个以上的任意氨基酸残基。
9.如权利要求8所述的含硒多肽，其特征在于Q1是选自Trp、Pro、Phe、Asn、Thr、Gln和Leu中的2-10个相同或不同的氨基酸残基，Q2表示至少包含Gly在内的1-126个氨基酸残基，Q3表示的是1-112个任意氨基酸残基。
10.如权利要求9所述的含硒多肽，其特征在于Q1是选自Trp、Pro、Phe、Asn、Thr、Gln和Leu中的2-4个相同或不同的氨基酸残基，Q2表示至少包含Gly在内的1-31个氨基酸残基，Q3表示的是1-26个任意氨基酸残基。
11.如权利要求10所述的含硒多肽，其特征在于Q1是选自Trp、Pro、Phe和Leu中的2-4个相同或不同的氨基酸残基，Q2表示至少包含Gly在内的1-5个氨基酸残基，Q3表示的是1-2个任意氨基酸残基。
12.权利要求11所述的含硒多肽是Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-Hls-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Prc-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Val-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Val-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Val-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Asp-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Asp-His-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Val-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Val-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Val-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Val-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Val-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-Tyr-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Tyr-Arg-Q1、Q1-Arg-His-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-His-Arg-Q1、Q1-Arg-Val-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Val-Arg-Q1、Q1-Arg-Asp-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Asp-Arg-Q1、Q1-Arg-Tyr-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Tyr-Arg-Q1、Q1-Arg-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Arg-Q1、Q1-Arg-Gly-Arg-Pro-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Pro-Arg-Gly-Arg-Q1或Q1-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Arg-Gly-Arg-Q1。
13.权利要求12所述的含硒多肽是Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro-Trp、Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro、Phe-Leu-Arg-His-Asp-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-Tyr-Asp-His-Arg-Leu-Phe、Leu-Arg-His-Tyr-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-Tyr-His-Arg-Leu、Trp-Arg-His-Gly-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Gly-His-Arg-Trp、Phe-Arg-His-Gly-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Gly-His-Arg-Phe、或Leu-Arg-Gly-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Gly-Arg-Leu。
14.权利要求13所述的含硒多肽是Trp-Pro-Phe-Leu-Arg-His-Asp-Val-Tyr-Gly-Arg-Pro-Arg-Ala(Gly)-SerSe-SeSer-Ala(Gly)-Arg-Pro-Arg-Gly-Tyr-Val-Asp-His-Arg-Leu-Phe-Pro-Trp。
15.权利要求8-14任何一项所述的含硒多肽在药物及食品中的应用。
16.一种含有权利要求8-14任何一项所述含硒多肽的自由基清除剂。
全文摘要
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种含特定肽序列的自由基清除剂含硒多肽及该多肽在药物、食品等方面的应用。本发明所公开的含硒多肽具有天然谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的底物GSH结合位点和利于催化的疏水微环境结构，通式为Q
文档编号A61K38/16GK1603338SQ200410011058
公开日2005年4月6日 申请日期2004年8月24日 优先权日2004年8月24日
发明者罗贵民, 孙晔, 吕绍武, 牟颖, 阎岗林 申请人:吉林大学