新的人胚胎肝源性因子的制作方法

专利名称：新的人胚胎肝源性因子的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有促肝细胞增殖活性的细胞生长因子，特别是涉及衍生于人胚胎肝组织的新的人胚胎肝源性因子，其分离和纯化方法，以及所说的因子在维持胎肝细胞扩增和传代培养、促进肝细胞再生和治疗损伤相关疾病以及构建人工肝脏中的应用。
背景技术：
从受精开始，胚胎的发育始终是细胞内合成活性物质的直接或间接结果。胚胎发育最重要的一个方面就是调节这些特殊的蛋白质和其他大分子物质的合成。寻找到这些特殊的发育信号，对它们进行组织定位，确定它们出现的时间，对深入了解胚胎的发育与组织再生都有着非常重要的意义。在胚胎发育过程中，最重要的不是个别基因的表达，而是这些表达产物、即各种蛋白质在时间和空间上的联系与配合。
胚胎从一个细胞(受精卵)发育为(5～7)×1012个细胞构成的足月胎儿，是一个极其复杂的动态变化的过程。在这个过程中，各脏器并非是从开始即呈现出该器官成熟状态下的典型结构与功能，它们经历从细胞到组织到成体结构器官这样一个从量变到质变的发育过程。
肝脏作为人体的一个重要器官，其发育过程是一个多阶段的连续的复杂变化过程，并且受到激素、生长因子和细胞外基质等多种因子的调节和控制。目前已知有多种因子与肝脏的形成及损伤修复过程密切相关。这些因子可以出现在组织发生发育的不同阶段，或促进细胞增殖，或促进细胞分化或诱导肝细胞凋亡，从而对肝组织的生理和病理性再生发挥严格的调控作用。
研究结果表明，人们多年来所寻找的促进肝组织再生的活性物质并不只是最初所预料的单一物质，而是多种因子的集合体，这些因子通过不同的作用方式或途径，在肝组织发生和再生的不同阶段发挥各自的作用(Imai K et al.，Hepatol.Res.27(4)302-308，2003；Kusaka K etal，J.Physiol.248273-284，1975)。目前已知的参与肝细胞增殖分化过程的物质包括肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子α(TGF-α)、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素6(IL-6)，以及胰岛素、地塞米松、制瘤素M(OSM)和去甲肾上腺素等，这些物质通过内分泌、自分泌或旁分泌途径调节并控制肝细胞的增殖与分化(Richman，R.A.et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1976，733589-3593；Kang YH，et al.Exp Cell Res.2004；293(2)239-47；George K.et al.，1997，276(5309)60)。
虽然目前对发育完善的成熟肝组织细胞的增殖与分化过程及相关调控因子已有了比较深入的了解，但人们对胚胎肝脏特别是发育早期肝脏功能和结构以及肝细胞增殖与分化过程和相关调控因子的却知之甚少。
因此，深入了解胚胎发育期间肝细胞群落形成的影响因素以及这些因素对肝细胞自身和其他细胞、组织和器官发育的作用将是十分必要的。特别是，进一步发现并深入研究影响肝细胞生长和分化的可能因子，必将有利于认识肝组织和器官形成、发育的调控机理，同时也可能为肝细胞损伤相关疾病的治疗提供新的治疗剂。
发明目的本发明的一个目的是提供一种新的人胚胎肝源性因子(hELF)，特征在于所说的因子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中测得的表观分子量为大约30KD，具有极好的耐热和耐酸碱能力和极好的促进肝细胞及其他组织来源细胞的体外增殖和分化活性。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的耐热和耐酸碱能力是指于60℃放置2小时或于100℃加热15分钟，或于pH 1.0至pH 12.0条件下处理，该因子均不丧失其生物学活性。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的肝细胞是指人肝细胞和肝肿瘤细胞。
本发明的另一个目的是提供一种分离和纯化如上限定的人胚胎肝源性因子的方法，该方法包括分离6-12周龄人胚胎肝组织匀浆的上清；经用丙酮分级沉淀后收集沉淀物并超滤；收集分子量大于10,000的蛋白质，使用阴离子交换柱进行反复(两次)柱层析纯化后，得到所需的人胚胎肝源性因子。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中用于分级沉淀的丙酮浓度分别为45％和65％(V/V)。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中超滤所用透析膜的截留分子量为10,000道而顿。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中阴离子交换层析柱是Mono S。
根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所得到的胚胎肝衍生的细胞生长因子的纯度大于95％。
本发明的再一个目的是提供如上限定的人胚胎肝源性因子在构建正常人胚胎肝细胞系和人工肝脏中的应用。
本发明的再一个目的是提供如上限定的人胚胎肝源性因子在治疗肝细胞损伤性疾病中的应用。
本发明的再一个目的是提供如上限定的人胚胎肝源性因子在促进人胚胎肝细胞增殖和人胚胎肝细胞传代培养中的应用。
附图简要说明

图1显示第一次离子交换层析的洗脱曲线。整个洗脱过程中出现两个主峰(第5-18ml)，并确定促细胞增殖活性出现在洗脱的第2峰(第16-17ml)。
图2显示第二次离子交换层析的洗脱曲线。整个洗脱过程中出现两个主峰(第13-24管)，并确定第一峰为活性峰(第15和16ml)。
图3显示本发明纯化产物的十二烷基磺酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱。其中泳道1为分子量标准品，泳道2为第一次层析后收集的活性部分，泳道3为第二次层析后收集的活性部分。
图4显示在hELF作用下HepG2细胞增殖的经时变化。
图5显示本发明的hELF对肝肿瘤细胞系增殖的影响。肝肿瘤细胞系HepG2在含有2％NBCS的DMEM培养基中平面培养5天。其中图5a显示未加hELF的对照组HepG2细胞的生长状态(100×)可见细胞增殖缓慢，多单个存在，细胞克隆形成率低，克隆体积小。图5b显示培养基中添加hELF的实验组HepG2细胞的生长状态(100×)，可见细胞增殖旺盛，克隆形成率高且克隆体积较大，部分克隆发生汇合。图5c和5d分别为对照组和实验组HepG2细胞的高倍(200×)显微镜检照片(参见实施例2)。
图6显示本发明的hELF对人胚胎肝细胞系增殖的影响。人胚胎肝细胞在含有2％NBCS的DMEM培养基中平面培养12天。其中图6a显示培养基中未加hELF的对照组人胚胎肝细胞的生长状态可见细胞多为成纤维细胞样增殖，失去肝细胞的典型形态，并且发生了细胞融合(100×)。图6b显示培养基中添加hELF的实验组人胚胎肝细胞的生长状态可见细胞仍维持肝细胞的典型形态，并有大的肝细胞克隆形成(100×)。
图7显示本发明的hELF对培养的Hela细胞增殖的影响。Hela细胞在含有0.3％NBCS的DMEM培养基中平面培养3天。其中图7a显示培养基中未加hELF的对照组Hela细胞(0.3％NBCS)的正常形态和生长状态(200×)。图7b显示培养基中加hELF的实验组Hela细胞的旺盛生长和增殖状态(200×)。
发明的具体内容本发明涉及具有肝细胞增殖活性的细胞生长因子，特别是涉及衍生于人胚胎肝组织的新的人胚胎肝源性因子(hELF)，其分离和纯化方法，以及所说的因子在促进肝细胞再生和治疗损伤相关疾病，以及构建正常人胚胎肝细胞系和人工肝脏中的应用。
一般说来，肝脏在胚胎第12周才由前体细胞发育为分化良好的器官，此时它并不具备成熟肝脏的功能。肝脏在胚胎发育20周之后构建其自身的结构，并在此时才开始逐渐发育出成熟肝脏的复杂的代谢功能。成年人的肝脏具有血浆蛋白的合成、脂肪生成、解毒功能、尿素合成等许多的代谢功能。然而，目前人们对胚胎发育早期肝脏的功能和结构以及发生和发育却了解甚少。
为了深入了解和分析胚胎肝组织发育和再生的机理，进一步找出受损肝组织的强大再生能力的影响因素和生物化学基础，本发明人基于长期从事组织再生特别是肝组织再生学研究的实践，从6-12周龄人胚胎肝组织中分离并纯化得到了一种我们称之为“人肝胚胎肝源性因子”(hELF)的蛋白质物质。在此基础上，本发明人进一步分析了该物质的理化性质、制备了相应的单克隆抗体并深入研究了该物质的体外生物学活性和其可能的临床应用，从而完成了本发明。
首先，我们使用从健康人6-12周龄人工流产胚胎分离的肝组织作为材料来源，以常规的化学和生物化学方法由所述的材料分离并纯化得到一种对热和强酸强碱环境均异常稳定的，分子量大约30 KD的蛋白质物质(参见实施例1)。对该物质的进一步生物学活性分析结果显示，在含新生牛血清(NBCS)的DMEM基本培养基中，本发明得到的这种蛋白质不仅可以显著地促进体外培养的原代人胚胎肝细胞的增殖和分化，而且对肝癌HepG2细胞和SSMC-7721细胞、小鼠乳腺癌D2F2细胞以及人宫颈癌Hela细胞等肿瘤细胞系均有显著地生长促进作用(参见实施例2，3，5)。因此，本发明人将该蛋白质定名为“人胚胎肝源性因子”(hELF)。
另外，我们使用肝癌HepG2细胞和SSMC-7721细胞作为靶细胞，以常规噻唑蓝比色法(MTT法)检测本发明的人胚胎肝源性因子对肝癌HepG2细胞和SSMC-7721细胞(作为靶细胞)增殖的影响，结果令人惊奇地发现，由第7至12周龄胚胎肝组织分离的粗提物可以刺激和促进靶细胞的生长，而由大于12周龄胚胎肝组织分离的粗提物则表现有明显地抑制靶细胞生长并促进细胞凋亡活性。这些实验结果表明，本发明的hELF在胚胎发育的不同阶段可能有不同的表达水平。
为了制备本发明的人胚胎肝源性因子，例如可以首先将胚胎肝组织剪碎制备组织匀浆并离心收集上清。分别用45％和65％(V/V)的丙酮分级沉淀后收集沉淀物。然后使用截留分子量为10,000道尔顿的超滤膜进行超滤。收集分子量大于10,000道尔顿的蛋白质，使用Mono S阳离子交换层析柱进行反复(两次)层析纯化，最终得到纯度大于98％、总活性回收率约为9.3％的本发明的人胚胎肝源性因子(hELF)。
使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对如此得到的生物学活性蛋白质的分析结果表明，该蛋白质的表观分子量约为30KD。进一步的理化性质分析显示，本发明的hELF在60℃下放置2小时或于100℃加热处理15分钟后，该蛋白质仍保留其固有的活性。另外，分别用1M HCL(pH 1)或1M NaOH(pH 12)处理24小时后，本发明的hELF亦不丧失其活性。因此可以认为，本发明的hELF对热和极端酸性或碱性条件均表现有良好的稳定性。
体外生物学鉴定结果显示，在含不同浓度新生牛血清(NBCS)的DMEM基本培养基中，本发明的hELF具有显著地增加人胚胎肝细胞的数目、维持正常肝细胞形态和细胞生长活力的作用。另外，我们实验还发现，本发明的hELF还可显著地促进肿瘤细胞系(例如肝癌HepG2细胞和SSMC-7721细胞、小鼠乳腺癌D2F2细胞以及人宫颈癌Hela细胞等)生长增殖的能力(参见实施例2和5)。
因此，可以将本发明的hELF所具有的独特理化性质和生物学活性总结如下(1)在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中，显示其表观分子量约为30KD。
(2)是一种热稳定的物质，60℃放置2小时或于100℃加热15分钟均不丧失活性。
(3)具有较强的耐酸碱能力，在pH1.0至pH12.0范围内都具有活性，并且在碱性条件下活性增强。
(4)对尿素不敏感。
(5)活性分布具有阶段性，受到胎龄的限制。在我们收集的不同胎龄来源的样本中，只有胎龄小于12周的组织提取物表现出极强的促肝肿瘤细胞系增殖作用。但hELF对人胚胎肝细胞增殖的促进作用不存在这种阶段性，即hELF对胎龄12周以上的人胚胎肝细胞和胎龄12周以下的人胚胎肝细胞均有促增殖作用。
(6)其生物学活性表现为促进体外培养的人胚胎肝细胞、人源性肝肿瘤细胞株的增殖。但对体外培养的原代大鼠肝细胞的增殖无影响。
(7)活性不具有种属特异性。虽然该因子对体外培养的成年大鼠肝细胞没有增殖促进作用，但可明显地促进小鼠乳腺癌细胞系D2F2细胞的增殖。
(8)活性不具有组织特异性，例如不仅可促进人肝肿瘤来源的细胞系HepG2细胞、SSMC-7721细胞和人胚胎肝细胞的增殖，还可明显促进乳腺癌来源的细胞系D2F2细胞和人宫颈癌来源的细胞系Hela细胞的增殖。
(9)该因子促进胚胎肝细胞的生长表现为促进胚胎肝细胞的增殖和分化。
(10)在胚胎肝细胞体外传代培养中发挥关键性细胞生长促进作用。加入此因子后，胚胎肝细胞可连续传3-5代，并能维持肝细胞正常形态。而未加入此因子的对照组人胚胎肝细胞在传代培养过程中迅速失去肝细胞的典型形态，不能够传代培养。
目前已公布的具有肝细胞增殖与肝组织再生促进功能的因子包括HGF、HSS、ALR、抑瘤素-M(OSM)、表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，转化生长因子-α(TGF-d)等。为了进一步说明本发明的hELF是一种不同于所有目前已知的肝细胞增殖与肝组织再生促进因子的新的蛋白质，现仅就本发明的hELF在理化性质和生物学活性方面与这些已知因子的主要区别简要比较如下。
(1)hELF与HSS及ALR的区别HSS与ALR的均来源于肝脏，但这两种因子究竟是否为同一种物质目前还缺乏统一的认识。虽然本发明的hELF在理化性质与HSS和ALR存在有某些相同之处(例如热稳定性，对酸碱不敏感等)，但hELF在生物学功能和分子大小上与HSS及ALR则存在很大差别。
hELF与HSS的区别HSS的分子量在12～20kD之间(LaBrecque DR.Hepatic stimulator substanceDiscovery.characteristics and mechanism of action.Dig Dis Sci.1991；36(5)669-73.)。HSS的生物活性最大特点就是具有组织特异性，即这种因子的活性作用仅限于肝源性细胞，对其它组织来源的细胞无作用。而本发明的hELF不仅可以促进肝源性细胞的增殖，同时对乳腺癌来源的细胞系和人宫颈癌来源的细胞系亦有明显的增殖促进作用。
ALR分子的天然结构为二聚体，非还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中的表观分子大小为30KD，还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳时分子大小为15KD。而hELF无论是在还原还是在未还原的条件下电泳，分子量都是30KD。对于HSS与ALR的研究虽然尚存在某些不确定性，但它们之间公认的最大共同点是生物活性具有组织特异性，即这两种因子的仅对肝源性细胞有活性，对其它组织来源的细胞无作用(Francavilla A，Hagiya M，Porter A，et al.Augmenter of Liver RegenerationItsPlace in the Universe of Hepatic Growth Factor.Hepatology，1994，20(3)747-757)。
(2)hELF与HGF的区别hELF对HepG2的生物活性作用与HGF完全相反。已知HGF抑制HepG2细胞的增殖，促进HepG2的迁移。在HepG2细胞培养物中加入HGF，可以观察到细胞不再呈典型的克隆样生长，而是分散单个存在，且细胞不增殖(Shiota G，Nakamura T，Schmidt EV.Hepatocyte growth factor regulates transforming growth factor alpha inHepG2 hepatic cells.Biochem Biophys Res Commun，1994，200(2)1 099-1104.)。这一现象与我们观察到的hELF促进HepG2呈典型克隆样增殖的现象完全相反。另外，本发明的hELF对体外培养成年大鼠肝细胞无促增殖活性，HGF具有很强的促进体外培养成年大鼠肝细胞增殖的作用。
理化性质上看，本发明的hELF具有大约30KD的分子量并且于100℃条件下加热15分钟不失活；而HGF的分子量约为82～85kD并且于100℃加热3分钟即失去活性。因此可以确定，hELF与HGF是完全不相同的两种因子。
(3)hELF与抑瘤素-M(OSM)的区别OSM为一种28kDa的糖蛋白，对热和酸稳定，是IL-6家族的成员。OSM可以促进胚胎肝细胞的分化，并可抑制多种肿瘤细胞的生长(低剂量OSM即可抑制乳腺癌细胞的生长)。这与hELF对乳腺癌细胞D2F2的促增殖作用相反。因此可以确定，hELF是一种不同于OSM的物质。
(4)hELF与其它生长因子的区别从以下几方面可以明显看出本发明的hELF与表皮生长因子(EGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，转化生长因子-α(TGF-α)和激素类物质胰岛素等因子的区别(a)从分子量和理化性质上看，EGF分子量6KD，FGF分子量16～17KD，TGF-α分子量6KD，胰岛素分子量5773。其中，FGF在60℃加热5分钟或pH＜4.0条件下将失去活性。
(b)这些因子虽然都有促进肝细胞增殖的活性，但它们的作用强度均小于hELF。
(c)胰岛素主要是与其它生长因子发挥协同作用，其本身并没有单独促进肝细胞增殖的活性。
通过以上的比较可以看出，本发明的hELF在理化特征和生物学活性上完全不同所有已知的肝细胞特别是胚胎肝细胞增殖促进因子，是一种此前未知的生物学活性物质。
鉴于本发明的hELF的特有生物学活性，有可能将该因子作为一种关键性因子应用于人胚胎肝细胞系的建立、生物肝的构建、恶性肿瘤疾病的诊断或作为肝组织再生促进剂用于促进肝组织因肝切除、创伤或病原体(例如病毒)感染造成的肝组织严重损伤后的再生和修复。例如，可以基于本发明的人胚胎肝源性因子的刺激和促进人胚胎肝细胞生长增殖的能力，将该因子用于人胚胎肝细胞系的建立和/或扩增。在构建人工肝脏中，可以使用本发明的hELF作为外源性因子用于促进人工肝脏内肝细胞的快速生长并长期维持其典型表型。另外，在某些肝源性或非肝源性恶性肿瘤发生的情况下，可以通过检测hELF的分布或病变组织中hELF的水平作为一种肿瘤诊断的辅助手段。特别是，在肝组织遭受各种物理、化学或生物学损伤导致肝细胞大量破坏的情况下，可以使用本发明的hELF作为治疗剂，用于促进受损肝组织的尽快再生和修复。再者，也可以使用本发明的hELF作为防止或减轻肝脏损伤的有效保护剂。
下列实施例旨在结合附图进一步举例描述而不是限制本发明。本领域技术人员可以理解到，在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明的任何平行改变和改动都将落入本发明的待批权利要求范围内。
实施例实施例1hELF的提取与纯化从得自健康母体人工流产的约10周龄胚胎中无菌分离完整肝脏并称重。将肝脏剪碎成3mm3大小的组织块，然后将组织块移至手动玻璃匀浆器中，加入D-Hanks溶液，温和地将其破碎，直至匀浆器中无肉眼可见的肝组织块。将匀浆液移入离心管中，4℃，3,000rpm离心15分钟。弃去沉淀，留取组织提取物的上清(SA)，4℃保存。以上操作均在无菌条件下进行(参见D.R.马歇克，J.T.门永，R.R.布格斯等，蛋白质纯化与鉴定实验指南，科学出版社，2000，第一版，p24-31)。
用丙酮分级沉淀(45％～65％)组织提取物上清(SA)搅拌下向上清中加入预冷的丙酮(终浓度为45％，V/V)，离心去掉不溶物后，继续向上清中加入终浓度为65％(V/V)的丙酮。放置30分钟后，离心弃去上清。将沉淀物重新溶解在抽出液中，用蒸馏水充分透析后冻干。然后重新溶解得到SB溶液。检测结果可知，SB具有促进HepG2细胞和SSMC-7721细胞增殖的活性。由SA溶液到SB溶液，蛋白质纯化2倍，活性回收率达到176.3％。
使用截留分子量为10,000道尔顿的透析膜，对SB溶液进行超滤处理(4℃条件下，3,000rpm，连续离心1.5小时)，直到将SB溶液的体积浓缩至原体积的1/5。然后收集超滤的溶液，得到的分子量大于10,000道尔顿的SC溶液和分子量小于10,000道尔顿的SD溶液。分别检测这些溶液对HepG2细胞增殖的影响，确定SC溶液促进HepG2细胞增殖的作用，且其作用强度与超滤前的SB溶液无差别。而SD溶液对HepG2细胞的增殖无促进作用。
由此可以认为，人胚胎肝组织的促进细胞增殖的活性物质分子量在10,000道尔顿以上，而分子量小于10,000道尔顿的物质则没有这种活性。
然后，进一步使用Mono S层析柱(50×5mm)对SC溶液进行离子交换层析(AKTA100型层析仪)。梯度洗脱条件是A溶液(0.20mM Tris-HCl溶液(pH 8.0)，含0.01％Tween)B溶液(含2M NaCl的A溶液)＝0％～50％，流速为1ml/分钟。洗脱期间分别监测各管洗脱物的214nm，254nm和280nm吸光率。
第一次层析开始洗脱前，UV-280曲线在未结合部位可见1个较大的吸收峰。洗脱过程中，有3个主峰被洗脱下来。收集第7ml至第26ml洗脱液。然后将各管洗脱液的pH值调至7.2，以96孔培养板培养的HepG2细胞为靶细胞，检测各管洗脱液的生物学活性。
第一次层析收集的洗脱液活性检测显示活性出现在被洗脱的第2个峰，位于洗脱体积的第14～18ml，洗脱的盐浓度在25％～35％之间。对HepG2细胞增殖的影响，尤以16～17ml(SE)的促增殖活性作用最强(参见图1)。
合并第一次层析得到的Mono S洗脱液(SE)的活性部分，使用Mono S离子层析柱再次进行离子交换层析分离。在未结合部位仅有1个小的280曲线吸收峰，洗脱过程中出现了2个主峰，收集为第13～24ml，经活性检测，确定活性峰为第1个主峰，生物活性出现在第15、16ml，洗脱的盐浓度与第一次层析结果重合(参见图2)。
由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱可见，纯化后的物质在分子量30kD的位置有一条明显的单一的银染色区带(参见图3)。第二次纯化后产物纯度提高11398倍，回收率约为9.3％。我们将此因子命名为人胚胎肝源性因子(hELF)。
整个分离、纯化过程中产物的总蛋白含量、活性、比活性、纯度和回收率变化情况如下列表1所示。
表1hELF产物纯化过程中的各参数变化
实施例2hELF对肝肿瘤细胞系增殖的影响分别将HepG2细胞(购自中国科学院细胞库)和SSMC-7721细胞(购自中国科学院细胞库)分为空白对照组和实验组，接种于含10％新生牛血清(NBCS)的DMEM培养基的96孔培养板的孔(8000细胞/孔)中，于5％ CO2培养箱中37℃培养。
HepG2细胞培养24小时后，将空白对照组的培养基换成含D-Hanks液(20μl)和2％新生牛血清(NBCS)的DMEM培养基，并将实验组的培养基换成含hELF溶液(20μl，终浓度5ng/ml)的上述培养基。
继续培养期间，实验组HepG2细胞在加入hELF因子后的第2～3天便开始明显增殖，细胞很快形成较多克隆。从HepG2细胞的生长过程可见，hELF对HepG2细胞的促增殖作用非常显著。到第7天结束培养时，实验组OD490数值达到对照组的2倍以上(参见图4)。然而，此时对照组的细胞未见明显增殖，几乎没有克隆形成。高倍镜下可见，实验组HepG2细胞生长状态非常典型，细胞形态不规则，克隆内的细胞界限不清，连接紧密。培养至第5天时，镜下可见对照组的细胞增殖缓慢，多为单个细胞或几个细胞组成的小克隆，而实验组的细胞克隆形成率非常高，并且克隆体积较大，部分克隆间发生汇合。实验组与对照组的增殖状况相比较，差异非常明显(参见图5a-5d)。
SSMC-7721细胞培养24小时后，将空白对照组的培养基换成含D-Hanks液(20μl)和0.3％新生牛血清(NBCS)的DMEM培养基，并将实验组的培养基换成含hELF溶液(20μl，终浓度5ng/ml)的上述培养基。
在含0.3％ NBCS的DMEM培养基中，SSMC-7721细胞的增殖相对比较缓慢。培养第3天，对照组细胞只形成少量克隆。而培养基中添加了本发明的hELF的实验组细胞则可见增殖迅速，并形成较大的克隆。实验组细胞的形态与对照组细胞相近。培养7天后细胞基本长满培养板的底部。
实施例3hELF对体外原代培养的人胚胎肝细胞增殖的影响取大约10周的胚胎，采用已知的体外胶原酶消化与机械分离相结合的方法分离肝细胞。细胞总数在5×105～7×106之间，并且多为5个细胞左右的小细胞团(细胞存活率约为60％～70％)。
所得人胚胎肝细胞悬液按比例稀释后，以3.5×104/cm2的细胞密度接种于胶原被覆的96孔培养板和24孔培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。培养24小时后，更换培养液。
在常规培养条件下平面培养8小时后，人胚胎肝细胞完全贴壁，呈多边形，可见较多双核细胞且核仁清晰。其中30％～40％的细胞处于有丝分裂状态。培养的第8天，细胞长满培养板底部。培养12天后，镜下可见培养基(含2％ NBCS的DMEM)中添加hELF(20μl，终浓度5ng/ml)的实验组胚胎肝细胞形成大片细胞克隆，细胞轮廓清晰，细胞间连接紧密并保持肝细胞的典型形态。培养皿内细胞以典型肝细胞形态的细胞为主，肝细胞克隆间偶而可见一些成纤维样细胞的增殖。相反，此时对照组细胞发生融合，形成体积较大的融合体，每个融合体内含有多个细胞核，并且很难发现具有典型肝细胞形态特征的细胞。大片的肝细胞克隆消失，取而代之的是成纤维细胞样细胞增殖旺盛，在培养细胞中占较大比例(参见图6a和6b)。另外，培养5天后，在含10％NBCS的DMEM培养基中培养的实验组细胞的数量明显高于对照组。
以上的实验结果表明，本发明的hELF作为人胚胎肝细胞传代培养的一个关键性因子，可以在维持肝细胞的表型特征的前提下显著地促进细胞的增殖，可使体外培养的人胚胎肝细胞连续传代培养3-5代。相反，未加hELF的对照组细胞传代后失去了肝细胞的典型形态，并主要表现为成纤维样细胞增殖。
在多次重复实验中还发现，尽管hELF来源于胎龄小于12周的胚胎肝脏，但其对胚胎肝细胞增殖的促进作用并没有受到胎龄的限制。hELF对实验中所取不同胎龄的多个样本的胚胎肝细胞均表现出明显的促增殖作用。胎龄小于和大于12周龄的胚胎肝细胞在hELF作用下的生长状态没有明显差别。
实施例4hELF对体外原代培养成年大鼠肝细胞增殖的影响采用两步原位胶原酶灌流法(Seglen PO.Exp.Cell Res.，1973；82391.)分离大鼠肝细胞。形态学检查可见，体外培养的成年大鼠肝细胞呈典型肝细胞形态，细胞体积较大，呈多边形，细胞核大而圆，核仁清晰可见，有双核细胞，并且某些细胞正处于分裂状态。将大鼠肝细胞悬液按比例稀释后，以3.5×104/cm2的细胞密度接种于胶原被覆的96孔培养板和24孔培养板中，置于37℃，5％CO2培养箱中培养。培养24小时后，将96孔培养板中的培养液更换为含8％NBCS的Williams培养液。将96孔培养板中培养的肝细胞分为对照组和实验组，实验组加入hELF，终浓度为5ng/ml。培养5天后，以MTT法检测各组细胞的增殖状况。
结果如下列表2所示。
表2 hELF对原代培养成年大鼠肝细胞增殖的影响(x±s)
P＞0.05由表2所示数据及镜下观察结果可以得知，体外平面培养5天后，实验组与对照组细胞形态及数量均无明显差异。而且，SA、SE、hELF组与对照组比较，细胞增殖无明显差异。这些结果表明，hELF对体外原代培养的成年大鼠肝细胞的增殖没有明显的促进作用。
实施例5hELF对其他组织来源的肿瘤细胞株增殖的影响人宫颈癌细胞系Hela细胞采用含10％NBCS的DMEM培养液在37℃，5％CO2培养箱中进行常规培养。每3天更换培养液。培养约4～5天，细胞长满培养皿底部的70％～80％时进行消化传代。将计数后的细胞悬液稀释为6×104细胞/ml，以6,000细胞/孔的密度均匀接种于96孔培养板中。培养24小时后，将含10％NBCS的DMEM培养液更换为含0.3％NBCS的DMEM培养液(180μl/孔)。实验组加入待测物质后，用D-Hanks溶液将每孔培养液体积补至200μl。空白对照组加D-Hanks溶液(20μl/孔)。每组设6个平行孔。结果可见，培养开始第24～48小时后，添加本发明hELF的实验组中人宫颈癌来源的Hela细胞即表现出明显地增殖状态，而且与对照组相比细胞形态无差异(参见图7a和7b)。
小鼠乳腺癌细胞系D2F2细胞采用含10％NBCS的DMEM培养液在37℃，5％CO2培养箱中进行常规培养。每3天更换培养液。培养约4～5天，细胞长满培养皿底部的70％～80％时，进行消化传代。将计数后的细胞悬液稀释为6×104细胞/ml，以6,000/孔的密度均匀接种于96孔培养板。培养24小时后，将10％NBCS的DMEM培养液更换为含0.3％ NBCS的DMEM培养液(180μl/孔)。实验组加入待测物质后，用D-Hanks溶液将每孔培养液体积补至200μl。空白对照组加D-Hanks溶液(20μl/孔)。每组设6个平行孔。
在D2F2细胞培养物中，添加hELF后也出现与Hela细胞相似的生长状态。虽然在含0.3％NBCS的DMEM培养基中培养的D2F2细胞增殖缓慢，但添加hELF后48小时内便开始迅速增殖。至培养的第4天，与对照组相比细胞数量上的差异已经非常显著。而且，实验组细胞在增殖过程中始终维持D2F2细胞的典型形态，与对照组细胞形态相近。
权利要求
1.人胚胎肝源性因子，特征在于所说的因子在聚丙烯酰胺凝胶电泳中测得的表观分子量为大约30KD，并具有极好的耐热和耐酸碱能力和促进肝细胞及其他组织来源细胞的体外增殖和分化活性。
2.根据权利要求1的因子，其中所说的耐热和耐酸碱难看、能力是指于60℃放置2小时或于100℃加热15分钟，或于pH1.0至pH12.0条件下处理，将该因子均不丧失其生物学活性。
3.根据权利要求1的因子，其中所说的肝细胞是指人肝细胞和肝肿瘤细胞。
4.分离和纯化如上限定的人胚胎肝源性因子的方法，该方法包括分离8-12周令人胚胎肝细胞悬液的上清；经用丙酮分级沉淀后收集沉淀物并超滤；收集分子量大于10,000的蛋白质，使用阴离子交换柱进行反复的柱层析纯化后，得到所需的人胚胎肝源性因子。
5.根据权利要求4的方法，其中用于分级沉淀的丙酮浓度分别为45％和65％(V/V)。
6.根据权利要求4的方法，其中超滤所用透析膜的截留分子量为10,000道而顿。
7.根据权利要求4的方法，其中阴离子交换层析柱是Mono S。
8.如权利要求1限定的人胚胎肝源性因子在人工肝脏构建中的应用。
9.如权利要求1限定的人胚胎肝源性因子在治疗肝细胞损伤性疾病中的应用。
10.如权利要求1限定的人胚胎肝源性因子在促进人胚胎肝细胞增殖和人胚胎肝细胞传代培养中的应用。
全文摘要
本发明涉及具有肝细胞增殖活性的细胞生长因子，特别是涉及衍生于人胚胎肝组织的新的人胚胎肝源性因子，其分离和纯化方法，以及所说的因子在促进肝细胞再生、治疗损伤相关疾病和构建人工肝脏中的应用。
文档编号A61P1/16GK1721441SQ200410010989
公开日2006年1月18日 申请日期2004年7月14日 优先权日2004年7月14日
发明者颜炜群, 胡春光 申请人:吉林圣元科技有限责任公司