专利名称：甲基汞化合物作为抗癌新药在颅内恶性肿瘤治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明是涉及甲基汞化合物的新用途。
背景技术：
肿瘤是目前严重威胁人类生命的难治性疾病，中枢神经系统肿瘤是肿瘤的常见类型，据世界卫生组织1992年统计脑原发肿瘤年发病率为2-19/10万，我国的年发病率为10/10万。颅内肿瘤45-50％为高恶性度的神经胶质瘤。
中枢神经系统恶性肿瘤手术治疗为首选，其最好的结果也只能肉眼全切除，但术后因留有侵袭性增殖的肿瘤细胞而常复发，且往往遗留神经功能缺失，如偏瘫，失语，甚至出现思维，情感障碍。传统的放化疗虽然对肿瘤具有一定疗效，但因多数化疗药物不易通过血脑屏障，临床应用受到极大的限制，病人的生存期平均不足一年。有的学者认为高恶性的神经胶质瘤实际是不治之症，尽管经手术、放化疗其结果仍不可避免地导致死亡。因此，寻找和研制理想的脑靶向抗癌药物是亟待解决的的问题。
人类在寻找新药的历史长河中，利用化学物质的毒性寻找新药积累了一些经验，并取得了一些规律性的认识。目前，根据癌症治疗药物的抗癌作用机制，可分为抑制细胞效应药物和毒害细胞效应药物。抑制细胞效应的药物可阻止癌的进一步生长，但不能根除癌，而毒害细胞效应的药物具备治愈病人的潜能。有毒金属顺铂作为治疗肿瘤的抗癌药物是化疗上的一次革命。近年来，砒霜的主要成分三氧化二砷(As2O3)治疗急性早幼粒细胞白血病(Acute promyelocyticLeukemia.APL)临床基础方面取得了令人瞩目的进展，《Science》著文称之为继维甲酸(ATRA)之后又一令人震惊的发现<1>。这些都是通过毒作用来寻找新药的成功尝试。
氯化甲基汞过去主要用于农业生产作为杀真菌剂，由于其应用带来环境的污染和误服，在世界范围内曾发生几起严重的中毒事件<2-3 >。
1.氯化甲基汞脑靶向蓄积作用(1)理化特性属烷基汞化合物，结构式为CH3-Hg-CI，分子量小Mr＝251.04，碳链短，碳汞共价结合牢固，非电离，具有良好的脂溶性，极易透过血脑屏障。
(2)药代动力学(吸收、分布、排泄和转化)吸收氯化甲基汞能溶于有机溶剂和类脂质中，口服后，90％以上可由小肠吸收。呼吸道、皮肤和粘膜也极易吸收。甲基汞也能通过胎盘进入胎儿体内。
分布进入机体的氯化甲基汞，主要集中在脑、肾、肝、血和毛发。慢性给药(通过调整给药剂量和时间)脑中甲基汞的含量可占全身总含量的10％。
Berlin等人给鼠猴(squirrel monkeys)喂饲含有放射性标记甲基汞的乳汁，探讨氯化甲基汞的神经毒性及其药代动力学，结果表明甲基汞在脑中靶向蓄积，脑与血汞的比值为5.6，与Carlson等人报道的结果相一致<4-5>。Rice等人给雌猴10、25、50mg/kg/day氯化甲基汞，至少半年，观察其生物半减期，血汞生物半减期为14天，而猴脑汞生物半减期是38-56天之间，脑血汞比值为3到10。<6>
排泄氯化甲基汞在人和动物体内主要通过粪便排泄，尿中的排泄不足10％，甲基汞由胆汁排到小肠，然后几乎立即又由小肠回吸收，于是构成甲基汞在机体内的反复循环(肝肠循环)，使得其在体内长期存留，甲基汞在人体内的生物半减期为70天，每日排出量约为体内贮存量的1％，脑中的生物半减期为230天，清除更为缓慢<7 >。
转化各种有机汞在机体内可转化成无机汞(无机汞的毒性比甲基汞弱)，表明有机汞在体内可以分解。动物注射氯化甲基汞在肾和肝的转化率较高，脑中的转化率极低。氯化甲基汞在脑比在其他器官组织稳定，不易被降解，脑中的汞几乎都以甲基汞的形式存在。
综上可见氯化甲基汞在机体内的生物半减期长，尤其在脑中的半减期更长，脑中甲基汞转化成毒性低的无机汞的转化率比其他脏器的转化率低。可见，氯化甲基汞具有脑靶向蓄积特性。
2.氯化甲基汞多靶点毒害细胞效应由于氯化甲基汞具有上述特殊的理化特性，进入脑组织后，与细胞和细胞内的亚细胞结构(线粒体、内质网、高尔基体和溶酶体等)的膜、胞浆、核蛋白以及核酸相互作用，从而对神经系统产生多靶点毒害细胞效应。
(1)氯化甲基汞具有类放射损伤效应，可引起DNA断裂。其烷基结构能与DNA碱基相互作用，在DNA双链内形成链内链间交联，影响DNA的正常复制<8-9>。
(2)除具有烷基结构外，还具有Hg2+结构，可与生物大分子(转录因子、信号分子、巯基酶)的-SH相互作用，干扰正常生化过程，导致异常分子事件<10>。
(3)氯化甲基汞抑制神经元蛋白质和核酸合成<11-12>，影响神经元蛋白质磷酸化<13-14>，抑制神经元微管解聚，破坏微管结构，阻止细胞有丝分裂<15>。
(4)氯化甲基汞诱导细胞凋亡/坏死。线粒体是氯化甲基汞作用的主要靶点，氯化甲基汞可抑制线粒体呼吸链复合物II，导致不完全氧化产物ROS、自由基的生成<16>；同时影响细胞内Ca2+环境，升高细胞内Ca2+浓度<17>；亦可影响神经元线粒体膜电位，改变其膜透性，使细胞色素C释放至胞浆并与Apaf-1结合，引起Caspase级联反应，诱导细胞凋亡/坏死<18-20>。
(5)氯化甲基汞干扰发育阶段脑神经元细胞周期进程，诱导p21Waf1/Cip1、Gadd45、Gadd153表达，使神经元阻滞在G0/G1、G2/M期<21-23>。
基于上述氯化甲基汞脑靶向蓄积作用和对中枢神经系统多靶点毒害细胞效应，我们认为氯化甲基汞剧神经毒物具有治愈中枢神经系统恶性肿瘤的潜能，提出用氯化甲基汞治疗颅内恶性肿瘤的新观点。
技术内容本发明的目的是提供一种甲基汞化合物的新用途。
具体的是关于甲基汞化合物在治疗颅内恶性肿瘤疾病的药品中的应用。
图1是本发明氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞增殖的体外抑制作用对照组；图2是本发明氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞增殖的体外抑制作用接触0.063μM氯化甲基汞；图3是本发明氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞增殖的体外抑制作用接触0.125μM氯化甲基汞；图4是本发明氯化甲基汞对SHG44胶质瘤细胞增殖抑制作用；图5是本发明氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞的增殖抑制作用；图6是本发明氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞的体外杀伤作用未接触氯化甲基汞的C6脑胶质瘤细胞。
图7是本发明氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞的体外杀伤作用接触0.25μM氯化甲基汞的C6脑胶质瘤细胞，可见核固缩、坏死；图8是本发明氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞杀伤作用；图9是本发明氯化甲基汞对SHG44胶质瘤细胞的杀伤作用；图10是本发明氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞凋亡/坏死的影响(流式细胞仪分析)A对照组B、C、D实验组；图11是本发明氯化甲基汞诱导C6胶质瘤细胞凋亡/坏死分析；
图12是本发明氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞周期影响(流式分析)左是对照组，右是实验组；图13是本发明氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞周期影响分析图；图14是本发明大鼠脑胶质瘤动物模型左鼠左前肢不能站立，右鼠自身旋转；图15是本发明脑胶质瘤动物模型的大体病理左实验组，右对照组；图16是本发明脑胶质瘤动物模型的组织病理左对照组，右实验组，可见胶质瘤细胞数量减少、液化性坏死(HE染色中倍)；图17是本发明大鼠脑胶质瘤组织切片原位末端荧光凋亡检测上为对照组，下为实验组；图18是本发明大鼠脑胶质瘤电镜观察 A.对照组胶质瘤细胞×7500 B.实验组胶质瘤细胞空泡、核固缩×7500C.实验组胶质瘤细胞核固缩、核裂解×20K。
具体实施例方式氯化甲基汞对脑胶质瘤抗癌作用的实验研究(一).体外实验研究1.氯化甲基汞对胶质瘤细胞增殖的抑制作用材料方法主要试剂氯化甲基汞购于德国Merck公司纯度99％以上，RpmI1640，和IMDM培养基(Gibco，美国)，胰蛋白酶(sigma)，MTT(sigma)，DMSO(sigma)
细胞株SHG44细胞系(由卫生部重点实验室提供)C6细胞株购自美国ATCC(pockvi，MD)方法SHG44和C6胶质瘤细胞分别在含10％胎牛血清的RpmI1640和IMDM培养基中，5％CO2，37℃条件下培养，细胞处于对数生长期，加入0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度，在含有不同浓度(20、10、5、2.5、1.25、0.63、0.31和0.16μM)氯化甲基汞的96孔平底培养皿中，每孔中含1×103个SHG44或C6胶质瘤细胞，培养3d。采用MTT法用Microplat reader(Bio-Rad 550型美国)测量细胞光密度值。观察不同浓度氯化甲基汞对其增殖能力的影响，见表1和图1-5。同时用上述氯化甲基汞相应浓度的三氧化二砷(As2O3)和顺氯氨铂对C6胶质瘤细胞增殖进行对照研究，结果见表2。
表1.氯化甲基汞对SHG44和C6胶质瘤细胞增殖的抑制作用浓度(μM) SHG44 C610.00 10.6±2.1* 10.5±0.6*5.00 39.6±1.1* 17.2±4.2*2.50 48.2±8.0 59.0±1.7*1.25 94.2±8.0 74.6±3.9*0.63 101.1±21.080.6±3.30.31 128.0±6.3 83.6±1.20.16 118.8±4.7 81.6±6.20.08 91.0±20.0 85.1±3.70.00(对照)100.0±4.2 100.0±2.2X±S(n＝3)，数据为占对照组细胞数的百分数，*p＜0.05 **p＜0.01表2.氯化甲基汞、三氧化二砷和顺氯氨铂对C6胶质瘤细胞增殖的抑制作用浓度(μM) 氯化甲基汞 三氧化二砷顺氯氨铂
5.0041.7±17.1** 45.8±7.6**48.9±3.8**2.5049.1±26.4*69.6±11.8** 80.9±4.1*1.2561.8±17.1*85.5±5.7 87.4±3.90.6373.0±15.0 87.9±5.7 86.8±4.50.3198.3±15.5 86.4±7.4 93.2±7.40.1694.8±22.0 86.2±6.50 89.6±12.50.0895.4±11.0 90.3±0.7 89.9±5.70.00(对照) 100.0±12.0100.0±12.0100.0±12.0X±S(n＝3)，数据为占对照组细胞数的白分数，*p＜0.05 **p＜0.01实验结果从表1和图4、5显示当SHG44和C6胶质瘤细胞接触不同浓度(10、5、2.5、1.25μM)氯化甲基汞作用3d后，SHG44组的细胞存活数分别为对照组的10.6％、39.6％、48.2％和94.2％；C6胶质瘤细胞存活数仅为对照组的10.5％、17.2％、59.0％和74.6％，并存在剂量反应关系，结果表明氯化甲基汞对SHG44和C6胶质瘤细胞增殖具有明显的抑制作用。从表2中可看出C6胶质瘤细胞分别接触0.08μM-5.00μM浓度氯化甲基汞、三氧化二砷和顺氯氨铂，发现三者对其细胞增殖的抑制作用大致相同。
2.氯化甲基汞对SHG44和C6胶质瘤细胞的杀伤作用方法在96孔平底培养皿中分别加入1×103个C6或SHG44细胞，培养3d后，在培养基中加入含有不同浓度氯化甲基汞(10、5、2.5、1.25、0.62、0.31和0.16μM)，分别作用4、8、16、32h后，采用MTT法测定其细胞数。用Microplat reader(Bio Rad 550型美国)测细胞光密度，观察不同浓度氯化甲基汞对SHG44和C6胶质瘤细胞的杀伤作用，同时用上述氯化甲基汞相应浓度的三氧化二砷(As2O3)和顺氯氨铂对C6胶质瘤细胞的杀伤作用进行对照研究，试验结果如表3、4、5和图6、7、8、9。
表3.氯化甲基汞对SHG44细胞的杀伤作用浓度(μM) 4h8h 16h 32h10.00 15.4±2.7*18.9±11.7*37.2±0.9*13.4±5.6*5.0050.5±8.7*32.1±7.2* 35.6±9.9*20.7±2.9*2.5056.9±9.9*33.2±18.3*57.1±4.8*22.2±0.9*1.2578.4±7.9 80.9±1.5 78.6±1.3 42.6±17.3*0.6279.5±9.7 79.8±0.6 96.3±2.8 68.3±18.5*0.3177.9±8.2 98.6±2.9 92.6±1.4 94.8±17.60.1681.8±0.4 91.6±13.5 102.0±7.1103.5±9.30.00(对照) 100.0±19.7 100.0±19.1100.0±10.4 100.0±14.3X±S(n＝3)，数据为占对照组细胞数的百分数，*p＜0.05 **p＜0.01表4.氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞的杀伤作用浓度(μM) 4h 8h 16h 32h10.00 36.7±10.9**45.7±11.2** 20.6±3.7** 14.9±2.3**5.0036.7±10.2**53.1±5.4* 23.4±3.3** 14.6±2.8**2.5044.8±2.5* 59.7±9.0* 45.9±17.7* 11.8±7.6**1.2565.7±2.5* 76.8±4.4 60.8±9.0 52.8±5.4*0.6278.3±2.2* 83.5±4.5 77.5±8.2 67.8±4.2*0.3182.9±3.9 100.1±22.089.9±17.398.2±0.50.1696.0±2.8 113.3±7.7 97.5±12.899.1±1.40.00(对照) 100.0±10.3 100.0±4.4 100.0±8.0100.0±3.0X±S(n＝3)，数据为占对照组细胞数的百分数，*p＜0.05 **p＜0.01表5 氯化甲基汞、三氧化二砷和顺氯氨铂对C6胶质瘤细胞杀伤作用浓度(μM)氯化甲基汞 三氧化二砷 顺氯氨铂5.00 57.8±8.4* 61.2±16.1*103.3±2.82.50 90.6±8.8 92.0±11.3 120.9±15.81.25 103.0±14.6102.2±13.4145.4±31.90.62 119.2±6.5 96.4±10.4 126.5±26.20.31 110.7±10.396.9±6.2 112.6±29.40.16 110.3±12.099.5±7.4 126.3±28.10.08 121.5±14.2108.0±13.2128.4±36.0
0.00(对照)100.0±24.5100.0±24.5100.0±24.5X±S(n＝3)，数据为占对照组细胞数的百分数，*p＜0.05 **p＜0.01，实验结果当SHG44和C6胶质瘤细胞分别接触5.00μM浓度的氯化甲基汞与对照组相比细胞杀伤达50％以上，氯化甲基汞对上述两种细胞杀伤作用存在剂量效应关系，并随时间的延长有逐渐增强的趋势。C6胶质瘤细胞分别接触0.08μM-5.00μM的氯化甲基汞、三氧化二砷和顺氯氨铂作用4h后，发现氯化甲基汞和的杀伤活性大致相同，而顺氯氨铂则没有明显杀伤活性。
3.氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞凋亡/坏死的影响。
方法试验选用C6胶质瘤细胞系，在含10％胎牛血清的IMDM培养基中，5％CO2，37℃条件下培养。待C6胶质瘤细胞处于对数生长期，用0.25％胰蛋白酶消化，制备单细胞悬液，调至细胞浓度为1×107/ml，台盼兰检测细胞存活率＞98％以上，用于细胞凋亡/坏死和细胞周期的研究。
细胞凋亡/坏死检测上述细胞接种于24孔平底培养板中，每孔为1×106细胞，接触不同浓度氯化甲基汞(0.00、0.16、0.32、0.63、1.25、2.50、5.00和10.00μM)，培养24h后，用0.25％胰蛋白酶消化，用PBS洗涤后加入Hochest33258 150μl(100mg/ml)，37℃温育30min，再加入100μl PI(不含tritonX100)，4℃条件下避光放置30min，Hochest 33258用氩离子激光激发，波长352 nm，PI激发波长488nm，用FACScan流式细胞仪，收集1×104细胞，用Cellguest软件进行分析处理。见图10、11，表6。
结果表明从图11中可看出C6胶质瘤细胞分别接触0.32、0.63、2.50、5.00和10.00μM氯化甲基汞作用24h其细胞凋亡/坏死率明显高于对照组(P＜0.05)。C6胶质瘤正常细胞率也明显低于对照组(P＜0.05)。结果表明氯化甲基汞可诱导C6胶质瘤细胞的凋亡/坏死。
表6.C6胶质瘤细胞接触不同浓度氯化甲基汞24h后凋亡/坏死率浓度(μM)正常细胞(％)凋亡/坏死细胞(％)0.00 48.49±3.34 51.72±3.360.16 38.73±8.52*61.49±8.570.32 34.99±5.27*65.18±5.26*0.63 33.69±4.82*66.60±4.82*1.25 38.74±8.95 61.52±8.992.50 38.08±10.17* 65.20±6.93*5.00 29.52±11.30* 70.68±11.27*10.0024.97±6.87*75.21±6.89*X±S(n＝3)，数据为细胞群的百分数，*p＜0.054.氯化甲基汞对C6胶质瘤细胞周期的影响方法C6胶质瘤细胞处理同上，培养72h后，收获细胞，经PBS洗涤后，每孔加入RNA酶(0.1mg/ml)100μl，PI(0.05mg/ml)100μl(含0.01％TritonX100)，4℃条件下避光放置30min，用FACScan流式细胞仪进行测定，氩离子激发波长488nm，每孔收集1×104细胞，采用HodFlit软件进行分析处理。见表7和图12、13。
表7 C6胶质瘤细胞接触不同浓度氯化甲基汞72h后对细胞周期的影响浓度(μM) G0/G1期细胞(％)s期细胞(％)0.0042.78±9.9254.77±8.230.1645.41±5.0453.47±5.060.3242.90±2.4955.39±2.470.6345.06±2.7348.51±7.721.2555.56±2.79* 43.34±3.78*
2.5057.09±1.49* 41.65±0.81*5.0069.45±3.28**27.52±5.11**X±S(n＝3)，数据为细胞群的百分数，*p＜0.05 **p＜0.01结果表明从表7和图13中可看出C6胶质瘤细胞分别接触5.00、2.50和1.25μM氯化甲基汞，其G0/G1期细胞百分数明显高于对照组(P＜0.05)，S期明显低于对照组(P＜0.05)。结果表明氯化甲基汞使C6胶质瘤细胞阻滞在G0/G1，减少进入S期的细胞数，抑制C6胶质瘤细胞周期进程。
(二).体内实验研究1.脑胶质瘤动物模型的建立方法(1)C6胶质瘤细胞培养C6胶质瘤细胞在含10％胎牛血清的IMDM(Gibco)培养基中，5％CO2，37℃条件下培养，每天更换一次培养液，在细胞处于指数生长期大约长满80％时，用0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集离心，用Hank’s液洗涤后，制成单细胞悬液，细胞活力用台盼蓝检测，细胞存活率＞90％，冰浴条件下存放待用。
(2)大鼠脑胶质瘤动物模型实验动物选用中科院上海实验动物中心提供的Wistar系大鼠20只，体重在150±10g选取大鼠右侧脑尾状核区为靶点，其定位前囟门点前1.0mm，矢状缝右旁开3.5mm，硬膜下5.0mm，大鼠腹腔注射10％水合氯醛。麻醉后，固定于大鼠脑立体定向仪上(自制的)见图剪去头皮的毛，强力碘消毒，正中切口，手术暴露颅骨标志，前囟门中点前1.0mm，矢状缝旁开3.5mm，硬膜下5.0mm处，微型电钻(直径为1mm)钻孔，用微量注射器吸20μl单细胞悬液使其达到1×106个细胞，垂直延伸至硬膜下6mm，然后后退1mm，将其细胞悬液以1μl/min速度注入靶区。除针前停留5min，避免反流。颅骨钻孔用骨蜡封闭，缝合头皮。
2.氯化甲基汞对大鼠脑胶质瘤的抗癌作用上述模型动物随机分为实验组和对照组，实验组大鼠脑注射C6胶质瘤细胞一周后，每天灌胃10mg/kgBW MMC，连续5d，对照组给予相同体积的生理盐水。
观察指标a 观察大鼠试验期间的一般状态b 肿瘤病理学研究大体(肿瘤大小计算，脑针刺点横断面，以肿瘤长径×短径2×0.5236)、光镜、电镜、原位末端荧光标记凋亡检测c 脑汞含量测定(采用Varian Spectr AA220原子吸收分光光度计，用氢化物原子吸收法测定)d 荷瘤动物存活时间脑汞含量测定表8 脑胶质瘤大鼠脑汞含量
结果大鼠脑接种C6胶质瘤细胞7d后，出现各种神经症状，表现为活动能力减弱，肢体肌力减退，癫痫样发作、自身旋转、蹒跚步态等症状。图14示大鼠(左)左前肢不能直立，大鼠(右)自身旋转。病理学检查实验组和对照组大鼠脑大体病理见图15，对照组肿瘤体积为231.24±215.10mm3，实验组肿瘤体积为7.56±3.81mm3，实验组肿瘤体积小于对照组，p＜0.05。组织病理学检查见图16，实验组肿瘤细胞密度明显减少伴有液化坏死。图17示，实验组肿瘤细胞凋亡明显高于对照组。电镜病理见图18，实验组肿瘤细胞发生固缩，染色质周边化，核断裂，空泡变性等改变。脑汞含量测定结果见表8，实验组脑汞含量为1.95±0.57μg/g，对照组脑汞含量均小于0.010μg/g。荷瘤动物存活时间，对照组大鼠在接种C6脑胶质瘤细胞后共死亡5只(第13d死亡1只，15d死亡2只，19d死亡1只，21d死亡1只)，实验组于第18d死亡1只。除自然死亡外，其余两组存活大鼠在第24d全部计划处死，实验组荷瘤动物存活时间大于对照组。
综上通过体内、体外实验研究证实氯化甲基汞对C6脑胶质瘤具有明显的靶向抗癌作用。
四、实施方案1.剂量我们根据氯化甲基汞急性中毒、慢性中毒实验和人群甲基汞每日摄入量的允许值，人群甲基汞中毒的体内负荷量与中毒症状发生的剂量关系以及甲基汞在动物人体中的药代动力学资料，可确定其抗癌治疗剂量。
2.用法可通过口服或静脉途径给予。
3.毒副作用病人可有不同程度的神经衰弱症候群，如不时头痛失眠、记忆力减退等症状，该药可能对部分人有心、肾、肝功能轻度损害，停药后可恢复，故有严重的心、肾、肝患者慎用。
4.对副作用的处理①采取对症治疗②用抗氧化剂维生素C、E③驱汞药物治疗
权利要求
1.甲基汞化合物在治疗颅内恶性肿瘤疾病的药品中的应用。
全文摘要
氯化甲基汞在治疗颅内恶性肿瘤疾病的药品中的应用。涉及氯化甲基汞的新用途。氯化甲基汞具有脂溶性等特殊理化特性，极易透过血脑屏障，具有脑靶向蓄积作用，对肿瘤细胞有多靶点毒害细胞效应，具有治愈肿瘤的潜能，是治疗颅内恶性肿瘤的理想抗癌药物。可通过口服或静脉途径给予。
文档编号A61K31/28GK1568962SQ20041001082
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月29日 优先权日2004年4月29日
发明者李志杰 申请人:李志强